專利名稱：為建立人類胚胎干細(xì)胞(hESC)系進(jìn)行的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種采用非接觸式二極管激光技術(shù)，從哺乳動(dòng)物處于胚泡階段的胚胎中分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，從而建立人類胚胎干細(xì)胞系的方法。
背景技術(shù)：
人體干細(xì)胞的分離能產(chǎn)生有前景一大批新的治療方法。人們期望從此類細(xì)胞得到的生物學(xué)治療，即通過(guò)組織再生和修復(fù)以及通過(guò)遺傳物質(zhì)的靶向傳遞，能夠治療大范圍的醫(yī)學(xué)疾病。分析和評(píng)估在臨床上使用人類干細(xì)胞的安全性對(duì)于這種嘗試是至關(guān)重要的。
胚胎干(ES)細(xì)胞是特殊類型的細(xì)胞，其既能復(fù)制自身(自我更新)，又能產(chǎn)生分化的功能性特化細(xì)胞類型。這些干細(xì)胞能變成身體中幾乎所有的特異性體細(xì)胞，并因此可能產(chǎn)生一大批組織和器官如心臟、胰臟、神經(jīng)組織、肌肉、軟骨等的替代細(xì)胞。
干細(xì)胞具有在人工培養(yǎng)的條件下無(wú)限分裂和增生的能力。科學(xué)家們利用干細(xì)胞的這兩種性質(zhì)從干細(xì)胞中生產(chǎn)出幾乎是無(wú)限數(shù)量的絕大多數(shù)類型的人類細(xì)胞，這就為通過(guò)細(xì)胞替換來(lái)治療疾病的方法鋪平了道路。事實(shí)上，細(xì)胞治療具有治療任何與細(xì)胞功能障礙或損傷相關(guān)疾病的潛力，這些疾病包括中風(fēng)，糖尿病，心臟病發(fā)作，脊髓損傷，癌癥或AIDS等。干細(xì)胞所具有的修復(fù)或替代病態(tài)或受傷組織的治療潛力，引起了科學(xué)、醫(yī)學(xué)和/生物技術(shù)投資界的極大興趣。
來(lái)自于多種哺乳動(dòng)物胚胎的ES細(xì)胞已在實(shí)驗(yàn)室中被成功培養(yǎng)。Evans和Kaufman(1981)以及Martin(1981)展示了直接從小鼠胚泡中獲得的永久性的胚胎細(xì)胞系是可能的。Thomson等(1995和1996)成功地從恒河猴和狨猴獲得了永久的細(xì)胞系。多能細(xì)胞系也已經(jīng)從幾種家畜或試驗(yàn)動(dòng)物中預(yù)先植入的晶胚中得到，這樣的動(dòng)物包括牛(Evans等，1990)，豬(Evans等，1990，Notarianni等，1990)，綿羊和山羊(Meinecke-Tillmann和Meinecke，1996，Notarianni等，1991)，兔(Giles等，1993，Graves等，1993)，水貂(Sukoyan等，19992)，大鼠(Lannaccona等，1994)和Hamster(Doetschman等，1988)。最近，Thomson等(1998)和Reubinoff等(2000)報(bào)道了人類ES細(xì)胞系的獲取。這些人類的ES細(xì)胞和恒河猴的ES細(xì)胞系相類似。
在人類胚泡的ICM中發(fā)現(xiàn)了ES細(xì)胞，這是在受精后第4天到第7天，胚胎生長(zhǎng)的早期階段。胚泡是指在著床前胚胎發(fā)育的階段，它包含兩種細(xì)胞。
1.滋養(yǎng)外胚層處于外層，提供額外的胚胎膜。
2.內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)形成胚胎本身。
在正常的胚胎發(fā)育過(guò)程中，ES細(xì)胞在第7天之后消失，并開(kāi)始形成三個(gè)胚胎組織層。然而，從胚泡階段的ICM中提取的ES細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)室中能夠被體外培養(yǎng)，并在合適的條件下可以無(wú)限繁殖。在這種未分化狀態(tài)下的ES細(xì)胞保持了分化成所有三個(gè)胚胎組織層細(xì)胞的能力。最后，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞產(chǎn)生了所有的胚胎組織。在胚胎形成階段中，即接近胚泡生長(zhǎng)的第一周周末時(shí)，可從胚泡的ICM獲得ES細(xì)胞。
從胚泡中分離ES細(xì)胞并使其在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的可能性似乎主要取決于該胚泡的完整性及其條件狀況。簡(jiǎn)而言之，尺寸大且具有明顯的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的胚泡易于最有效地產(chǎn)生ES細(xì)胞。為建立胚胎干細(xì)胞系，人們已經(jīng)采用了幾種方法來(lái)分離細(xì)胞內(nèi)團(tuán)(ICM)。大多數(shù)普通的方法如下1.胚泡的天然孵育在這種方法中，將胚泡置于培養(yǎng)液上進(jìn)行天然孵育。胚泡的孵育通常發(fā)生在第6天。受孵育的胚泡的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)生長(zhǎng)出生長(zhǎng)暈(outgrowth)。采用機(jī)械方式除去該生長(zhǎng)暈，隨后使其繼續(xù)生長(zhǎng)以建立胚胎干細(xì)胞系。然而，該方法有著幾個(gè)缺點(diǎn)。首先，滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞在所提供的培養(yǎng)條件下增生非?？欤芏嗲闆r下抑制了內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的生長(zhǎng)暈。其次，當(dāng)用機(jī)械方式除去內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的生長(zhǎng)暈時(shí)，可能會(huì)將滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞分開(kāi)。第三，人類胚泡發(fā)生自然孵育的百分比非常低。
2、顯微外科方法另一種分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的方法是被稱為顯微外科的機(jī)械抽吸術(shù)。在這種方法中，采用顯微操作器系統(tǒng)，通過(guò)固定吸液管(holding pipette)夾持并放置胚泡，使內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)處于9點(diǎn)鐘的位置。采用有斜面形狀的活檢針抽吸內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)，并將其嵌入囊胚腔中。由于分離完整內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的可能性很低，且細(xì)胞多次發(fā)生解體，因此該方法的缺點(diǎn)是非常大的。其過(guò)程是非常乏味的，而且可能導(dǎo)致對(duì)胚胎的嚴(yán)重破壞。細(xì)胞水平上的操作要求采用具有微米精度的工具以減少破壞和污染。
3、免疫外科法這是一種分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)的常規(guī)方法。采用補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞溶解方法分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)。在該方法中，使胚泡曝露于酸性tyrode溶液或鏈霉蛋白酶溶液中，以除去胚泡的透明帶(殼)。然后將無(wú)帶的胚胎曝露于人類表面抗體中達(dá)30分鐘到1小時(shí)。然后將胚胎曝露于豚鼠的補(bǔ)體中以溶解滋養(yǎng)外胚層。采用精細(xì)牽引(drawn)的巴斯德吸液管重復(fù)性機(jī)械式的移液方法，從內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)中除去補(bǔ)體介導(dǎo)的已被溶解的滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞。近期文獻(xiàn)中報(bào)道的所有胚胎干細(xì)胞系都是通過(guò)該方法獲得的。然而，該方法具有幾個(gè)缺點(diǎn)。首先，胚胎長(zhǎng)時(shí)間地曝露于酸性的tyrode溶液或鏈霉蛋白酶溶液中，導(dǎo)致了對(duì)胚胎的有害作用，并因此使胚胎本身的發(fā)育能力降低。其次，該方法需要花費(fèi)1.5到2.0小時(shí)的時(shí)間，因此是一種很費(fèi)時(shí)的方法(Narula等，1996)。第三，每一胚泡的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)的收率很低。第四，該方法中采用的抗體和補(bǔ)體要求苛刻的儲(chǔ)存條件。最后，由于使用了源自于動(dòng)物的抗體和補(bǔ)體，該方法有將源于動(dòng)物的病毒和細(xì)菌傳播給人類的危險(xiǎn)。在該方法中，使用了兩種動(dòng)物血清，一種是兔的抗人類抗血清，另一種是豚鼠的補(bǔ)體血清。
直到今天，我們研究的人類細(xì)胞系主要是采用免疫外科學(xué)的方法獲得的，在該方法中采用了動(dòng)物的抗血清和補(bǔ)體。
現(xiàn)存細(xì)胞系可能存在的其它缺點(diǎn)如下1.在培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞時(shí)需要使用飼養(yǎng)層細(xì)胞，從而產(chǎn)生混合物的細(xì)胞群，因此需要將胚胎干細(xì)胞從飼養(yǎng)層細(xì)胞組分中分離出來(lái)，這一過(guò)程會(huì)影響細(xì)胞的擴(kuò)增。
2.從飼養(yǎng)層細(xì)胞中產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄污染了胚胎干細(xì)胞(ESC)，因此不能在商業(yè)規(guī)模上加以應(yīng)用，而僅能用于研究。
Geron建立了一種方法，該方法中人類胚胎干細(xì)胞(hESC)系在缺乏飼養(yǎng)層細(xì)胞的條件下進(jìn)行培養(yǎng)(XU等，2001)。在條件培養(yǎng)液(conditionedmedium)中的細(xì)胞外基質(zhì)上培養(yǎng)hESC，使其在生長(zhǎng)環(huán)境中以未分化狀態(tài)進(jìn)行擴(kuò)展。hESC不包含來(lái)自培養(yǎng)物中其它細(xì)胞的癌源的異種成分。而且，這種hESC細(xì)胞以及其衍生物的生產(chǎn)方法更適合于商業(yè)化應(yīng)用。在這種方法中，無(wú)須在支持培養(yǎng)物的工作基底(ongoing basis)上提供飼養(yǎng)層細(xì)胞，并可采用機(jī)械方法進(jìn)行細(xì)胞傳代。然而，該方法的主要缺點(diǎn)在于采用免疫外科方法分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)，該免疫外科學(xué)方法中采用含有異源成分的飼養(yǎng)層來(lái)獲得最初的胚胎干細(xì)胞。這就可能導(dǎo)致來(lái)源于動(dòng)物的病毒和細(xì)菌的污染。
為簡(jiǎn)化內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離的方法并使其安全化，本發(fā)明的科學(xué)家們提出一種采用非接觸式激光分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的新方法，該方法中未使用動(dòng)物的抗血清和補(bǔ)體。
在輔助繁殖中采用激光技術(shù)隨著輔助繁殖技術(shù)(ART)的出現(xiàn)，人們已經(jīng)采用幾種方法來(lái)提高受精質(zhì)量，促進(jìn)胚泡孵育(Cohen等，1990)并進(jìn)行卵裂球活檢(Tarin和Handyside，1993)。通常使用的方法有化學(xué)法(Gordon和Talansky，1986)，機(jī)械法(Depypere等，1988)和激光法(Feichtinger等，1992)，從而在透明帶上產(chǎn)生孔(Gordon，1988)。近來(lái)，通過(guò)顯微鏡的物鏡聚焦的紅外1.48μm的二極管激光束可對(duì)小鼠和人類的透明帶進(jìn)行快速，簡(jiǎn)易且非接觸式的顯微打孔，這種方法在常規(guī)的培養(yǎng)條件下也能有很高的精確度(Rink等，1994)。由于對(duì)透明帶糖蛋白基質(zhì)進(jìn)行高度定位的熱依賴型擊穿，從而實(shí)現(xiàn)了打孔效果(Rink等，1996)。與采用308nm氙-氯受激準(zhǔn)分子激光器對(duì)致密的小鼠胚胎造成的有害結(jié)果(Neev等，1993)相反，紅外區(qū)域的激光打孔方法并不影響小鼠(Germond等，1995)或人類(Antinori等，1994)胚胎的存活。
現(xiàn)在，激光作為幫助受精和輔助孵育的工具正被人們深入研究。近期的報(bào)道表明采用1.48μm二極管激光對(duì)小鼠透明帶進(jìn)行顯微打孔是高度安全的，且不會(huì)影響小鼠的神經(jīng)解剖學(xué)和神經(jīng)化學(xué)性質(zhì)，同時(shí)也改善了受精情況(Germond等，1996)。Obruca和他的同事們于1994年首先報(bào)道了人類體外受精(IVF)中采用激光輔助的孵育獲得了成功。在該研究中，當(dāng)胚胎處于2到4個(gè)細(xì)胞的階段時(shí)，在透明帶(ZP)中打出20到30個(gè)微孔，并立即移植。該研究中包括了來(lái)自于兩個(gè)不同中心的以前接受體外受精(IVF)失敗的病人。與對(duì)照組(6％)相比，激光輔助的孵育組中每個(gè)胚胎的移植成功率更高(14.4％)。每一移植的受孕率也得到了提高(40％比16.2％)。
在另一種研究中，采用ErYAG激光使來(lái)自于病人的胚胎變薄，胚胎學(xué)家能使ZP精確地減少50％，這在采用酸性蒂羅德溶液時(shí)是很難實(shí)現(xiàn)的。胚胎附近存在酸蒂羅德溶液也可能是有害的。激光-孵育組中的臨床受孕率為42.7％，而對(duì)照的未孵育組中的受孕率則為23.1％。由于這一數(shù)據(jù)看起來(lái)很有前景，因此激光-輔助孵育的跡象(indication)得到了擴(kuò)大。激光-處理組中首次進(jìn)行體外受精(IVF)的婦女的臨床受孕率達(dá)39.6％，而對(duì)照的未孵育組中則為19％(Parikn等，1996)。
近十年來(lái)，人們正在對(duì)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)的分離進(jìn)行研究，原因是ICM對(duì)建立胚胎干細(xì)胞系是很有用的，而胚胎干細(xì)胞系具有發(fā)展成為人體內(nèi)的大多數(shù)特異性細(xì)胞的能力，如血，皮膚，肌肉和神經(jīng)細(xì)胞。它們也具有在體外培養(yǎng)下無(wú)限分裂和增生的能力。
本發(fā)明涉及采用激光消融技術(shù)而不是繁瑣的免疫外科過(guò)程對(duì)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)進(jìn)行分離的方法。因此，本發(fā)明中并不采用來(lái)自動(dòng)物的抗體或血清，該方法是安全，簡(jiǎn)單，快速的，并可在商業(yè)上加以應(yīng)用。
本發(fā)明避免了常規(guī)的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)分離方法的相關(guān)缺點(diǎn)。采用本發(fā)明的方法分離的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)是完整的，細(xì)胞沒(méi)有受到破壞和損害。本發(fā)明因此提供了分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)的快速可靠和非損傷性的方法。該方法也完全破壞了滋養(yǎng)外胚層，因此使內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)受到的污染最小化，從而確保了內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)的純度。
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27.Thomson JA，Kalishman J，Golos TG et al(1996).Pluripotent cellline derived from common marmoset blastocyst.Biology of Reproduction.55254-259發(fā)明目的1.本發(fā)明的目的之一在于提供一種內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的分離方法，該方法采用激光消融技術(shù)而不經(jīng)歷免疫外科學(xué)的繁瑣過(guò)程。
2.本發(fā)明的另一目的在于采用激光消融技術(shù)而不采用任何動(dòng)物產(chǎn)生的抗體和血清對(duì)ICM進(jìn)行分離，因此防止了動(dòng)物有機(jī)體傳播到人類的可能性，從而能被安全地在商業(yè)規(guī)模上加以應(yīng)用。
3.本發(fā)明的另一目的在于采用非接觸式二極管激光，從處于胚泡階段的哺乳動(dòng)物胚胎中分離出內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)。
4.本發(fā)明的另一目的在于采用簡(jiǎn)單，短時(shí)且容易可行的方法分離出內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)，而不影響/破壞內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)。
5.本發(fā)明的再一個(gè)目的是通過(guò)完全清除滋養(yǎng)外胚層的方法來(lái)確保內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)的純度，且不影響/破壞內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)。
6.本發(fā)明的再一個(gè)目的在于分離出與常規(guī)方法相比，收率和純度更高的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)。
通過(guò)后續(xù)的描述，本發(fā)明的以上目的和其它目的將變得更加明顯。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及采用對(duì)透明帶(ZP)和滋養(yǎng)外胚層(TE)的激光消融法分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)，并為建立胚胎干細(xì)胞系而抽吸出內(nèi)細(xì)胞團(tuán)。在本發(fā)明中，所采用的非接觸式二極管激光對(duì)細(xì)胞的顯微外科來(lái)說(shuō)是一種高度精確和可靠的工具。該系統(tǒng)采用了最新的光纖技術(shù)而得到目前最簡(jiǎn)潔的激光系統(tǒng)。在裝配有顯微操縱器的反向顯微鏡上通過(guò)落射熒光口裝配/插入1.48μm的二極管非接觸式Saturn激光系統(tǒng)。采用引導(dǎo)激光來(lái)瞄準(zhǔn)主要的消融激光，當(dāng)激光待發(fā)和準(zhǔn)備射出時(shí)由一系列的LEDs通知使用者。采用一個(gè)二-次級(jí)-操作(two-second-operation)窗口減少意外射出激光的可能性。隨著所要求的孔大小的變化，激光的斑直徑有所不同。
進(jìn)行體外受精(IVF)治療的夫妻自愿捐獻(xiàn)出多余的人類胚胎。在征得這些夫妻的書面的自愿同意之后，將這些胚胎用于研究。在本發(fā)明中，為分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)而采用胚泡階段的胚胎。將胚泡置于35mm培養(yǎng)皿中無(wú)Ca++/Mg++的胚胎活檢培養(yǎng)液的50微升液滴中，并用礦物油覆蓋。安裝顯微操縱器來(lái)進(jìn)行胚胎活檢。將胚泡置于胚胎活檢培養(yǎng)液中，將盛有胚泡的培養(yǎng)皿置于顯微鏡的加熱臺(tái)上。使胚泡位于場(chǎng)地的中心。將胚泡固定在把持的吸液管中，使內(nèi)細(xì)胞團(tuán)處于3點(diǎn)鐘的位置。使內(nèi)細(xì)胞團(tuán)附近的透明帶和滋養(yǎng)外胚層位于激光束的目標(biāo)點(diǎn)位置上。透明帶和滋養(yǎng)外胚層的一小部分被激光消融。然后輕輕地將活檢吸液管插入穿過(guò)透明帶和滋養(yǎng)外胚層上的孔，并輕輕地抽吸內(nèi)細(xì)胞團(tuán)。在完整的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離之后，用胚胎干細(xì)胞(ESC)培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞數(shù)次。然后將細(xì)胞置于具有胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)層上以建立胚胎干細(xì)胞系。隨后對(duì)胚胎干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)記，比如SSEA-1，SSEA-3，SSEA-4，TRA-1-60，TRA-1-81，OCT-4以及堿性磷酸酯酶。同時(shí)也確定胚胎干細(xì)胞的染色體組型。
a)體外胚泡的生長(zhǎng)在開(kāi)始此項(xiàng)研究之前已經(jīng)獲得了倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。在個(gè)人捐獻(xiàn)者完成不孕治療之后，我們獲得了捐獻(xiàn)者為進(jìn)行此項(xiàng)研究而捐獻(xiàn)多余胚胎的的書面同意。
為獲得可用的胚胎而通常對(duì)不孕病人采取治療方案如下從中-黃體階段開(kāi)始，每天用gnRH激動(dòng)劑類似物抑制的方法誘發(fā)卵巢過(guò)度排卵，以500-900mg的劑量給藥9-12天。在采用合適劑量(取決于年齡和卵巢體積)的人類更年期促性腺激素(hMG)或重組的促卵泡激素(FSH)(Gonal-F，Recagon)適當(dāng)?shù)匾种坡殉仓螅賹?duì)卵巢進(jìn)行刺激。通過(guò)對(duì)劑量進(jìn)行必要的調(diào)節(jié)來(lái)產(chǎn)生可控的卵巢刺激。按要求進(jìn)行血清β-雌二醇(E2)測(cè)定試驗(yàn)。從周期的第7天開(kāi)始，每日進(jìn)行陰道超聲波檢查。當(dāng)有3或4個(gè)卵泡的最大直徑達(dá)到17mm時(shí)，采用人類絨毛膜促性腺激素5000-10000 I.U.進(jìn)行給藥。34-36小時(shí)之后通過(guò)陰道進(jìn)行抽吸。然后向卵母細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)注入精子。
采用直徑為40-60μm的玻璃固定吸液管來(lái)固定卵子。將有活力的精子置于聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)液滴中，并用礦物油覆蓋。在約3點(diǎn)鐘的位置，用外徑大致為5-6μm，內(nèi)徑為3-4μm的注射用針刺穿透明帶。用注射用顯微吸液管切掉精子的尾部以固定所選的精子。固定吸液管固定卵母細(xì)胞，而直接將精子直接注射到卵母細(xì)胞的中心。
培養(yǎng)16-18小時(shí)后對(duì)卵母細(xì)胞的受精情況進(jìn)行檢測(cè)。此時(shí)受精的卵母細(xì)胞具有生殖核(也稱為單細(xì)胞胚胎)。然后將單細(xì)胞胚胎轉(zhuǎn)移到預(yù)先平衡好的新鮮ISM-1培養(yǎng)液中，并在37℃下，中5％CO2濃度的空氣中進(jìn)行培養(yǎng)。第二天將胚胎轉(zhuǎn)移到ISM-2培養(yǎng)液中。胚胎每隔一天被轉(zhuǎn)移到新的ISM-2培養(yǎng)液中。從第5天起，檢測(cè)胚胎的胚泡生長(zhǎng)情況。在治療完成之后，多余的胚泡被夫妻們捐獻(xiàn)出來(lái)，用于本研究工作。
b)激光器的安裝本發(fā)明涉及為建立胚胎干細(xì)胞，對(duì)采用非接觸式二極管激光進(jìn)行內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離的獨(dú)特方法進(jìn)行描述。激光是用于細(xì)胞的顯微外科的高精度和高可靠性工具。該系統(tǒng)采用最新的光纖技術(shù)建立了目前可用的最簡(jiǎn)潔的激光系統(tǒng)。裝配有顯微操縱器的Zeiss反向顯微鏡通過(guò)落射熒光口裝配1.48μm的二極管非接觸式Saturn激光系統(tǒng)。
采用引導(dǎo)激光瞄準(zhǔn)主要的消融激光，當(dāng)激光待發(fā)和準(zhǔn)備射出激光束時(shí)，由一系列的LEDs顯示給使用者。采用一個(gè)二-次級(jí)-操作(two-second-operation)窗口減少意外射出激光的可能性。根據(jù)所要求切除的孔的大小改變激光的直徑。
c)激光消融和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的分離將胚泡階段的胚胎分別置入放置在35mm培替氏培養(yǎng)皿中的50μl活檢培養(yǎng)液(無(wú)Ca++/Mg++)液滴中。采用固定吸液管固定胚胎，使內(nèi)細(xì)胞團(tuán)保持在3點(diǎn)鐘的位置，并使內(nèi)細(xì)胞團(tuán)附近的透明帶和滋養(yǎng)外胚層位于靶點(diǎn)位置上。采用連續(xù)的1.48μm二極管激光對(duì)透明帶(ZP)進(jìn)行打孔，該透明帶是保護(hù)卵母細(xì)胞的糖蛋白層。在此波長(zhǎng)下，孔是由于糖蛋白基質(zhì)的熱分解而產(chǎn)生的。一旦透明帶發(fā)生了分解，就給予3個(gè)脈沖以產(chǎn)生光分解作用的，從而消融滋養(yǎng)外胚層。在透明帶和滋養(yǎng)外胚層都被消融之后，內(nèi)徑為30-35微米的抽吸吸液管通過(guò)激光融解得到的孔進(jìn)入，并輕輕地抽吸移出ICM。
d)人類胚胎干細(xì)胞(hESC)的培養(yǎng)在進(jìn)行培養(yǎng)之前，在ES培養(yǎng)液中徹底清洗抽吸出的ICM，該ES培養(yǎng)液是分離胚胎干細(xì)胞系的優(yōu)選培養(yǎng)液。
以下是當(dāng)本發(fā)明采用培養(yǎng)層的方式。在該方法中，存在小鼠的失活胚胎纖維原細(xì)胞培養(yǎng)層的條件下，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)被培養(yǎng)在96孔板中。胚胎纖維原細(xì)胞培養(yǎng)層優(yōu)選從12.5到13.5天大的C57BL/6小鼠或C57BL/6XSJLF-1小鼠或遠(yuǎn)系繁殖(out bred)的CD1小鼠或從人類羊水中獲得，并以用作培養(yǎng)層。通過(guò)γ照射(3500rads)使胚胎纖維原細(xì)胞失活。在0.5％明膠涂覆的板上，用由Dulbecco’s改性的Eagle’s培養(yǎng)液(無(wú)丙酮酸鈉，高含量葡萄糖)(70-90％)，胎牛血清(10-30％)，β-巰基乙醇(0.1mM)，非必需的氨基酸(1％)，L-谷氨酰胺2mM，基本纖維原細(xì)胞生長(zhǎng)因子(4ng/ml)組成的ES培養(yǎng)液培養(yǎng)小鼠胚胎纖維原細(xì)胞培養(yǎng)層。然后將內(nèi)細(xì)胞團(tuán)置于失活的小鼠胚胎纖維原細(xì)胞上。4-7天之后，采用消毒過(guò)的燒制打磨吸液管從生長(zhǎng)暈中移出ICM衍生的團(tuán)塊，采用機(jī)械方法進(jìn)行分離，并置于新鮮的飼養(yǎng)層細(xì)胞上。采用補(bǔ)充有1％小雞血清的0.5％胰島素-EDTA溶液進(jìn)行進(jìn)一步的分離。
按照Thomson等(1998)，Reubinoff等(2000)中所述的方法，確定得到的細(xì)胞系的染色體組型，并幾種表面標(biāo)記來(lái)表征，比如SSEA-1，SSEA-3，SSEA-4，OCT-4，堿性磷酸酯酶，TRA-1-81，TRA-1-60。
實(shí)施例下列實(shí)施例的目的在于闡釋本發(fā)明而非限定本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1采用胚泡階段的人類胚胎共24個(gè)進(jìn)行內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的分離。在胚泡培養(yǎng)培養(yǎng)液(ISM-2培養(yǎng)液，Medicult，Denmark)中多次洗滌胚胎。然后將各個(gè)胚胎放入50μl不含Ca++/Mg++的胚胎活檢培養(yǎng)液(EB 10培養(yǎng)液，Scadinavian)液滴中。用礦物油覆蓋該微小的液滴。安裝顯微操作器，采用外徑為75μm，內(nèi)徑為15μm的玻璃固定吸液管來(lái)固定胚胎。采用外徑為約49μm，內(nèi)徑為35μm的活檢吸液管抽吸內(nèi)細(xì)胞團(tuán)。采用引導(dǎo)激光定位主要的消融激光。將胚胎固定在固定吸液管上，使內(nèi)細(xì)胞團(tuán)保持在3點(diǎn)鐘的位置，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)附近的透明帶和滋養(yǎng)外胚層處于靶點(diǎn)位置。由于透明帶的局部熱分解而產(chǎn)生了小孔。通過(guò)給予3個(gè)脈沖導(dǎo)致的光分解來(lái)消融滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞。在透明帶和滋養(yǎng)外胚層的消融完成之后，引導(dǎo)活檢吸液管穿過(guò)激光消融的孔并吸出內(nèi)細(xì)胞團(tuán)。在ES培養(yǎng)液中洗滌內(nèi)細(xì)胞團(tuán)數(shù)次，并將其置于含有或不含有培養(yǎng)細(xì)胞的96孔板中。以下的數(shù)據(jù)以表格的形式列出。
表1采取本發(fā)明的激光消融技術(shù)得到，并在小鼠飼養(yǎng)層細(xì)胞存在的條件下所培養(yǎng)的hESC細(xì)胞系的概況

類似地，用分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的常規(guī)方法，如采用免疫外科方法進(jìn)行試驗(yàn)，該試驗(yàn)可如下所述實(shí)施例2采用常規(guī)的免疫外科方法并和新發(fā)明的激光消融方法相比較，目的是確定分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的效率。
為分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，采用21個(gè)胚泡階段的人類胚胎進(jìn)行試驗(yàn)。用胚泡培養(yǎng)液(ISM-2培養(yǎng)液)然后用ES培養(yǎng)液洗滌胚胎數(shù)次。然后在37℃，5％CO2濃度的空氣中，將處于胚泡階段的各個(gè)胚胎置于1∶50抗-人類抗體(δ)的50μl微小液滴中，存放30分鐘。在用ES培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)之后，將胚泡階段的胚胎洗滌4次，隨后在37℃，5％CO2濃度的空氣中，將胚泡再次置于濃度為1∶10的豚鼠補(bǔ)體的50μl微小液滴中。培養(yǎng)之后，采用細(xì)孔玻璃吸液管在ES培養(yǎng)液中洗滌胚泡階段的胚胎數(shù)次，以除去滋養(yǎng)外胚層。然后用ES培養(yǎng)液洗滌內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，并在含有或不含飼養(yǎng)層細(xì)胞的條件下在96孔板中進(jìn)行培養(yǎng)。數(shù)據(jù)列于下表

盡管采用兩種方法分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)并未表現(xiàn)出任何明顯的不同。然而，通過(guò)激光消融方法分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。該方法避免使用抗體和來(lái)源于動(dòng)物的血清。用激光消融法分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)可以進(jìn)一步在含有或不含飼養(yǎng)層的的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。然而，在無(wú)飼養(yǎng)層存在的條件下培養(yǎng)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)將進(jìn)一步消除ES細(xì)胞受到動(dòng)物病毒或細(xì)菌污染的可能性，并可在商業(yè)上用于人體移植研究。在當(dāng)前的試驗(yàn)中，人們正努力在不含飼養(yǎng)層細(xì)胞的條件下建立ES細(xì)胞系。
優(yōu)選實(shí)施方式的詳述結(jié)合顯微照片對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行闡釋。
本發(fā)明的

圖1(a)到1(g)涉及從一個(gè)胚胎的胚泡分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)，圖2(a)到2(g)涉及從另一個(gè)胚胎的胚泡分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)。圖3，4和5涉及在不同階段的飼養(yǎng)層細(xì)胞上培養(yǎng)ICM。
圖1(a)顯示了人類胚泡的顯微照片，該胚泡用玻璃固定吸液管固定，使ICM位于3點(diǎn)鐘的位置。
圖1(b)顯示了其中部分透明帶和滋養(yǎng)外胚層被激光消融的顯微照片。
圖1(c)顯示了當(dāng)該胚泡的透明帶和滋養(yǎng)外胚層被消融后，靠近該胚泡的抽吸吸液管的顯微照片，圖1(d)顯示了用抽吸吸液管開(kāi)始抽吸ICM的顯微照片。
圖1(e)顯示了抽吸過(guò)程中抽吸吸液管內(nèi)的大部分ICM的顯微照片。
圖1(f)顯示了從胚泡中移出后的ICM的顯微照片。
圖1(g)顯示了ICM分離后留存的滋養(yǎng)外胚層和透明帶的顯微照片。
圖2(a)顯示了另一個(gè)人類胚泡的顯微照片，該胚泡受到玻璃固定吸液管的固定，使ICM位于3點(diǎn)鐘的位置上。
圖2(b)顯示了透明帶和滋養(yǎng)外胚層被激光消融之后，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的微小前突的顯微照片。
圖2(c)顯示了用激光消融透明帶和鄰近的滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞之后，位于ICM附近的抽吸吸液管的顯微照片。
圖2(d)顯示了通過(guò)抽吸吸液管用輕微的吸力正在抽吸出ICM的顯微照片。
圖2(e)顯示了抽吸吸液管內(nèi)的ICM的大部分的顯微照片。
圖2(f)顯示了從胚泡中移出的ICM的顯微照片。
圖2(g)顯示了從胚泡中分離出ICM之后的滋養(yǎng)外胚層和透明帶的顯微照片。
圖3(a)顯示了已分離的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，植于幼鼠胚胎纖維原飼養(yǎng)層細(xì)胞(第3天)培養(yǎng)物上的顯微照片。
圖3(b)顯示了已分離的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，植于幼鼠胚胎纖維原飼養(yǎng)層細(xì)胞(第7天)培養(yǎng)物上的顯微照片。
圖4顯示了另一個(gè)胚胎的已分離的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，在幼鼠的胚胎纖維原飼養(yǎng)層細(xì)胞(第5天)培養(yǎng)物上顯微照片。
圖5顯示了從激光消融方法分離得到的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中獲得的胚胎干細(xì)胞系的顯微照片。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，本發(fā)明非常適合于實(shí)現(xiàn)目標(biāo)，獲得以上提到的目的和優(yōu)點(diǎn)。文中對(duì)本發(fā)明的最具有實(shí)踐性和最優(yōu)選的實(shí)施方式進(jìn)行了展示和描述。應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，可在本發(fā)明的范圍內(nèi)作適當(dāng)?shù)淖兏?。?yīng)該理解，本發(fā)明并不受限于所公開(kāi)的細(xì)節(jié)，而應(yīng)該擴(kuò)展到權(quán)利要求書所定義的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種采用非-接觸式二極管激光技術(shù)，分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)從而建立人類胚胎干細(xì)胞(hESC)系的方法，包括以下步驟(i)將35mm培養(yǎng)皿中的胚泡置入被礦物油覆蓋的50微升常規(guī)的胚胎活檢培養(yǎng)液中；(ii)安裝微操作系統(tǒng)，該微操作系統(tǒng)由帶有加熱臺(tái)的顯微鏡，夾持固定吸液管的工具夾，抽吸吸液管和空氣注射器組成；(iii)放置上述(i)中的培養(yǎng)皿，將胚泡裝載于上述(ii)中的加熱臺(tái)上，并調(diào)節(jié)胚泡，使其位于視野的中央；(iv)通過(guò)空氣注射器進(jìn)行抽氣，用固定吸液管固定胚泡，使其位于9點(diǎn)鐘的位置，使被分離的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)位于3點(diǎn)鐘的位置。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述的方法進(jìn)一步包括采用1.48微米二極管激光的3-5個(gè)脈沖對(duì)透明帶進(jìn)行激光消融，從而分解透明帶，在透明帶上的糖蛋白基質(zhì)上產(chǎn)生小孔。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步采用1.48微米的二極管激光進(jìn)行消融，通過(guò)細(xì)胞分解而去除內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)附近的滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述的方法進(jìn)一步包括抽吸內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)，該抽吸內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的步驟又包括(i)使抽吸吸液管穿過(guò)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)附近的透明帶和滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞上的孔而靠近胚泡；(ii)通過(guò)上述權(quán)利要求4(i)中的空氣注射器的微小吸力，將內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)抽吸到抽吸吸液管內(nèi)；(iii)將上述權(quán)利要求4(ii)中抽吸出的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)緩慢釋放到下述權(quán)利要求5的培養(yǎng)物液滴中。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述的方法進(jìn)一步包括培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞，該培養(yǎng)的步驟又包括(i)在胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液的微小液滴中洗滌分離出的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)數(shù)次；(ii)為培育胚胎干細(xì)胞，將內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)置于含有培養(yǎng)液存在下的飼養(yǎng)層的板上。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的胚胎活檢培養(yǎng)液中不含Ca++/Mg++。
7.根據(jù)權(quán)利要求5(ii)所述的方法，其中所采用的培養(yǎng)液為胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液。
8.根據(jù)權(quán)利要求5(ii)所述的方法，其中所采用的板為覆蓋0.5％明膠的板。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的胚胎干細(xì)胞介質(zhì)培養(yǎng)液是由下列介質(zhì)培養(yǎng)液組成的混合物(i)Dulbecco’s改性的Eagle’s培養(yǎng)液(DMEM)，其不含丙酮酸鈉但具有高濃度的葡萄糖(70-90％)；(ii)胎牛血清(10-30％)(iii)β-巰基乙醇(0.1mM)(iv)非-必需的氨基酸(1％)(v)L-谷氨酰胺2mM(vi)基本纖維原細(xì)胞生長(zhǎng)因子(4ng/ml)。
10.根據(jù)權(quán)利要求5(ii)所述的方法，其中所述的飼養(yǎng)層是鼠源或人源。
11.分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的方法，包括下列步驟(i)固定處于胚泡階段，具有透明帶，滋養(yǎng)外胚層和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的胚胎；(ii)用激光消融法在胚泡階段的胚胎內(nèi)產(chǎn)生小孔；并(iii)通過(guò)小孔，從處于胚泡階段的胚胎中移出內(nèi)細(xì)胞團(tuán)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的孔穿過(guò)透明帶。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的孔穿過(guò)透明帶和滋養(yǎng)外胚層。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的激光消融法是采用非接觸式二極管激光實(shí)現(xiàn)的。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的非接觸式激光為連續(xù)的1.48μm的二極管激光。
16.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的移出是采用被引導(dǎo)的抽吸吸液管，穿過(guò)小孔進(jìn)行抽吸而實(shí)現(xiàn)的。
17.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的方法在不含動(dòng)物來(lái)源的抗體和血清的條件下進(jìn)行。
18.建立人類胚胎干細(xì)胞系的方法，包括以下步驟(i)通過(guò)用激光剝離消融法在胚泡階段的胚胎上產(chǎn)生小孔，從處于胚泡階段的胚胎中分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，并通過(guò)孔，從處于胚泡階段的胚胎中移出內(nèi)細(xì)胞團(tuán)；(ii)在胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液和失活的小鼠胚胎纖維原細(xì)胞飼養(yǎng)層的存在下培養(yǎng)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，以產(chǎn)生內(nèi)細(xì)胞團(tuán)衍生的團(tuán)塊。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液基本上由下列的物質(zhì)組成(i)Dulbecco’s改性的Eagle’s培養(yǎng)液，含量為胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液的約70％到約90％，Dulbecco’s改性的Eagle’s培養(yǎng)液中不存在丙酮酸鈉但具有高含量的葡萄糖；(ii)胎牛血清，含量為胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液體積的10％到30％；(iii)β-巰基乙醇，含量為根據(jù)胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液總摩爾數(shù)所確定的0.1微摩爾；(iv)非-必需的氨基酸，含量為胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液體積的約1％；(v)L-谷氨酰胺，含量為根據(jù)胚胎干細(xì)胞介質(zhì)培養(yǎng)液總摩爾數(shù)所確定的2微摩爾；以及(vi)基本纖維原細(xì)胞生長(zhǎng)因子，含量為每毫升胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液中為4ng。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，進(jìn)一步包括下列步驟移出內(nèi)細(xì)胞團(tuán)衍生的團(tuán)塊，采用機(jī)械方法分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)衍生的團(tuán)塊，并將機(jī)械法分離的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)衍生的團(tuán)塊再次置于新鮮的飼養(yǎng)層細(xì)胞上。
21.采用如實(shí)施例所描述并結(jié)合顯微照片所闡述的利于非接觸式二極管激光技術(shù)，為建立人類胚胎干細(xì)胞(hESC)系而分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)的方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的方法，步驟包括將含有透明帶、滋養(yǎng)外胚層和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的胚泡階段的胚胎固定，用激光消融在胚泡階段的胚胎上打孔，然后通過(guò)該孔從胚泡階段的胚胎中取出內(nèi)細(xì)胞團(tuán)。激光消融技術(shù)是通過(guò)非－接觸式二極管實(shí)現(xiàn)的。從胚泡階段的胚胎中分離出的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)用來(lái)構(gòu)建人胚胎干細(xì)胞系。
文檔編號(hào)A61B18/20GK1545549SQ02816421
公開(kāi)日2004年11月10日 申請(qǐng)日期2002年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月23日
發(fā)明者菲魯扎·拉杰什·帕里克, 薩蒂什·馬哈德奧羅·托泰, 莎伊拉賈·阿努帕姆·薩克塞納, 馬哈德奧羅 托泰, 菲魯扎 拉杰什 帕里克, 賈 阿努帕姆 薩克塞納 申請(qǐng)人:利萊恩斯生命科學(xué)有限公司