專利名稱：防止uvb引起的皮膚損傷的方法
相關(guān)申請本申請要求2001年4月13日遞交的序列號為60/283874的美國臨時申請的利益，其內(nèi)容全部引入作為參考。
背景技術(shù)：
光老化是由于長期暴露于UVB照射下所導(dǎo)致的，尤其在皺紋的形成過程中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明部分是基于發(fā)現(xiàn)阻止皮膚血管發(fā)生能防止UVB誘發(fā)皮膚的損傷，例如長期(慢性的)的UVB引起的光老化、例如皺紋在哺乳動物如人類的體內(nèi)的形成。
因而，本發(fā)明的特征在于一種防止或處理由于長期UVB所引起皮膚損傷如皺紋的方法。方法包括抑制受試者皮膚血管發(fā)生。優(yōu)選的實施方式是血管發(fā)生的抑制應(yīng)是在暴露于UVB的時候或之前。
在優(yōu)選的實施方式中，該方法同樣包括在長期的UVB引起的皮膚損傷的危險中，確定一個受試者，例如哺乳動物、如人類或非人類哺乳動物。一個處于長期的UVB引起的皮膚損傷如皺紋危險之中的受試者的確定，是通過受試者、衛(wèi)生保健供應(yīng)者或者化裝品供應(yīng)者。實施血管發(fā)生的抑制作用也可以通過受試者、衛(wèi)生保健供應(yīng)者或者化裝品供應(yīng)者。
在優(yōu)選的實施方式中受試者至少需要5歲。更適宜的甚至需要10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多歲。
一優(yōu)選的實施方式是防止和減少皺紋的形成。
在優(yōu)選的實施方式中，抑制血管發(fā)生是通過增加一種或多種抗血管生成因子的活性來完成的，諸如增加自然形成的在受試者體內(nèi)抗血管生成蛋白如TSP-2或TSP-1的活性，從而抑制皺紋的形成。增加TSP-2的活性是例如通過給予一種試劑來實現(xiàn)的。在優(yōu)選的實施方式中，使TSP-2活性增加的試劑是下列的一個或多個TSP-2多肽、或者生物學(xué)上的活性片段、或它的類似物，如TSP-2衍生多肽或逆向(retroinverso)多肽；編碼TSP-2多肽核酸，或者生物學(xué)上的活性片段、或它的類似物；一種TSP-2多肽的激動劑，如抗體、或具有或增加的TSP-2活性的小分子；或者一個增加TSP-2核酸表達的試劑，如能結(jié)合TSP-2啟動子區(qū)并提高表達的小分子。
在優(yōu)選的實施方式中，TSP-2的增加是通過試劑如誘導(dǎo)TSP-2表達的小分子，例如能促進TSP-2表達的試劑包括胎牛血清和TGF-α。優(yōu)選的實施方式中，誘導(dǎo)TSP-2表達的試劑是局部給藥的。在優(yōu)選的實施方式中，試劑在UVB下暴露如日曬前要充分實施于受試者，這樣抗血管發(fā)生作用才會出現(xiàn)在暴露在UVB下的受試者的皮膚上。
TSP-2活性同樣可以通過控制釋放到受試者的TSP-2核酸或TSP-2蛋白質(zhì)、片段、或類似物來實現(xiàn)。TSP-2核酸，蛋白質(zhì)、片段、或類似物可結(jié)合了一種控制釋放裝置實施于受試者，如一種生物相容聚合體、微顆?；蛘呔W(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。這種裝置能減小降解和控制TSP-2核酸、蛋白質(zhì)、片段、或類似物的釋放。這樣的一種TSP-2生物相容的控制系統(tǒng)能被實施于受試者，如在器官、關(guān)節(jié)腔或損傷部位或通過注射和植入，如肌注、皮下注射、靜脈注射。
TSP-2的水平也能夠通過內(nèi)源性的TSP-2活性的增加而增長。活性是通過提高基因表達的水平增加的，如增加TSP-2基因的轉(zhuǎn)錄；增強TSP-2信使核糖核酸的穩(wěn)定性，如改變信使核糖核酸的第二級或第三級的結(jié)構(gòu)；增大TSP-2信使核糖核酸的轉(zhuǎn)換，如改變TSP-2信使核糖核酸的序列；和/或增加TSP-2蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。增強TSP-2基因轉(zhuǎn)錄是通過如改變內(nèi)源性的TSP-2基因的調(diào)控序列。在一個實施方式中調(diào)節(jié)序列的改變是通過增加一種正調(diào)節(jié)元件(諸如作為轉(zhuǎn)錄催化劑的一種增強子或一個DNA結(jié)合部位)；一種負調(diào)節(jié)元件缺失(諸如作為轉(zhuǎn)錄抑制劑的一個DNA結(jié)合部位)和/或用另一基因置換內(nèi)源性調(diào)節(jié)序列，或其中的元件，從而使TSP-2基因更有效的轉(zhuǎn)錄。
在優(yōu)選的實施方式中，試劑是一種用來誘導(dǎo)TSP-2的化合物如小分子。
TSP-1的活性增強是通過如給予一種能增強其活性試劑來完成的。在優(yōu)選的實施方式中，增強TSP-1的活性的試劑可以是下列的一個或多個TSP-1多肽、或生物學(xué)上的活性片段或它的類似物，如TSP-1衍生多肽或它的逆向多肽；TSP-1多肽的編碼核酸、或者生物學(xué)活性片段、或它的類似物；TSP-1多肽的激動劑，如抗體、或或增加的TSP-1活性的小分子；或者一個增加TSP-1核酸表達的試劑，如一個能結(jié)合TSP-1啟動子區(qū)并增加的表達的小分子。
在優(yōu)選的實施方式中，TSP-1的活性增加是通過試劑如誘導(dǎo)TSP-1表達的小分子實現(xiàn)。例如能促進TSP-1表達的試劑包括胎牛血清和TGF-α。優(yōu)選的實施方式中，誘導(dǎo)TSP-1表達的試劑試局部實施的。在優(yōu)選的實施方式中，試劑在UVB下暴露如日曬前充分實施于受試者，這樣抗血管發(fā)生作用才會出現(xiàn)在暴露在UVB下的受試者的皮膚上。
TSP-1活性同樣可以通過控制釋放到受試者的TSP-1核酸或TSP-1蛋白質(zhì)、片段、或類似物來實現(xiàn)。TSP-1核酸，蛋白質(zhì)、片段、或類似物可結(jié)合了一種控制釋放裝置實施于受試者，如一種生物相容聚合體、微顆粒或者網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。這種裝置能減小降解和控制TSP-1核酸、蛋白質(zhì)、片段、或類似物的釋放。這樣的一種TSP-1生物相容的控制系統(tǒng)能被實施于受試者，如在器官、關(guān)節(jié)腔或損傷部位或通過注射和植入，如肌注、皮下注射、靜脈注射。
TSP-1的水平也能夠通過內(nèi)源性的TSP-1活性的增加而增長?；钚允峭ㄟ^提高基因表達的水平增加的，如增加TSP-1基因的轉(zhuǎn)錄；增強TSP-1信使核糖核酸的穩(wěn)定性，如改變信使核糖核酸的第二級或第三級的結(jié)構(gòu)；增大TSP-1信使核糖核酸的轉(zhuǎn)換，如改變TSP-1信使核糖核酸的序列；和/或增加TSP-1蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。增強TSP-1基因轉(zhuǎn)錄是通過如改變內(nèi)源性的TSP-1基因的調(diào)控序列。在一個實施方式中調(diào)節(jié)序列的改變是通過增加一種正調(diào)節(jié)元件(諸如作為轉(zhuǎn)錄催化劑的一種增強子或一個DNA結(jié)合部位)；一種負調(diào)節(jié)元件缺失(諸如作為轉(zhuǎn)錄抑制劑的一個DNA結(jié)合部位)和/或用另一基因置換內(nèi)源性調(diào)節(jié)序列，或其中的元件，從而使TSP-1基因更有效的轉(zhuǎn)錄。
在優(yōu)選的實施方式中，試劑是一種用來誘導(dǎo)TSP-1的混合物如小分子。
在優(yōu)選的實施方式中，用來增加一個或多個抗血管生成因子的試劑，是通過如誘導(dǎo)天然抗血管生成蛋白質(zhì)諸如TSP-2或TSP-1來實施的，如局部實施試劑、全身實施、口腔給藥、注射、更優(yōu)選的皮層和皮下實施。在優(yōu)選的實施方式中，試劑是用一種合適的輸送載體來實施的。優(yōu)選地，試劑包含在一個局部使用的組合物中，如凝膠、乳膏或液體。組合物還可以包含一種化妝品成分，如芳香劑或遮光劑，例如甲氧基肉桂酸辛酯、氨基苯甲酸、羥苯甲酮(oxybenzone)，padimate O，胡莫柳酯(homosalate)或二氧化鈦。該組合物還可以包括一些植物提取物，如蘆薈浸出液、葡萄浸出液。該組合物還可以包括維生素，如維生素A如松香油、維生素C如抗壞血酸維生素C或棕櫚酸酯、維生素E如醋酸生育酚(tocopherol acetate)。
在優(yōu)選的實施方式中，試劑在UVB下暴露如日曬前要充分實施于受試者，這樣抗血管發(fā)生作用會出現(xiàn)在暴露在UVB下的時候。
在另一優(yōu)選的實施方式中，用于增加一個或多個抗血管發(fā)生因子活性如通過增加一種自然形成的抗血管發(fā)生蛋白質(zhì)諸如TSP-2或TSP-1活性的試劑實施是重復(fù)的，如至少在許多天內(nèi)重復(fù)1、2、3、5、10、20次或更多次。在優(yōu)選的實施方式中，試劑實施是長期性的。在優(yōu)選的實施方式中，試劑的實施至少每周一次，優(yōu)選每周2、3、4、5次或至少在兩周內(nèi)每日一次，最好的是至少在1、2、3、4、5或6個月內(nèi)。例如，在3-12周內(nèi)定時實施如貫穿整個夏天。在優(yōu)選實施方式中，試劑被實施以抑制或預(yù)防，受試者暴露于UVB輻射下的臉部、頸部、胸部、耳部和手以及頭部的謝頂部位的其中一處或多處皺紋。
在優(yōu)選的實施方式中，受試者是已經(jīng)或即將長期暴露于UVB輻射下的。
在優(yōu)選的實施方式中，受試者所顯出的一或多個光老化的標志，如皺紋、皺紋線(lines)、下垂、雀斑、黑色皮膚、污點、色素沉著、老年斑、如肝斑、皮膚磨損、白內(nèi)障、表皮增生、皮膚彈性組織變性、細胞外基質(zhì)簡并、癌前或癌癥期間皮膚生長(光化角質(zhì)物、日光化角質(zhì)物)。
在優(yōu)選的實施方式中，血管發(fā)生被抑制是通過減少受試者體內(nèi)的VEGF的活性實現(xiàn)的，如在受試者體內(nèi)通過VEGF受體抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)如通過KDR；通過抑制VEGF蛋白質(zhì)的水平；降低VEGF基因表達的水平；和/或減少受試者VEGF蛋產(chǎn)生和/或活性，從而防止有UVB引起的皮膚損傷，如長期UVB引起的皮膚損傷如皺紋的形成。
在優(yōu)選的實施方式中，抑制VEGF是通過使用抑制VEGF活性的試劑來完成的。抑制VEGF活性的試劑可以是一或多個，試劑如小分子，其抑制VEGF受體，如通過抑制VEGF與其受體的結(jié)合或抑制VEGF受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(signaling)；可以結(jié)合一個細胞的VEGF核酸序列的VEGF核酸分子，如信使核糖核酸，抑制蛋白質(zhì)表達，如反義分子或VEGF核糖酶；可特異性結(jié)合VEGF的抗體，如破壞VEGF結(jié)合其正常的細胞靶的抗體；一種減少VEGF基因表達的試劑，如結(jié)合VEGF的啟動子的小分子。
在另一優(yōu)選的實施方式中，VEGF活性的抑制是通過降低一種內(nèi)源性VEGF基因的表達水平來實現(xiàn)，如減少VEGF基因的轉(zhuǎn)錄。在優(yōu)選的實施方式中，減少VEGF基因的轉(zhuǎn)錄是通過改變內(nèi)源VEGF基因的調(diào)節(jié)序列，如增加負調(diào)節(jié)序列(諸如DNA結(jié)合位點的轉(zhuǎn)錄抑制劑)。
在另一優(yōu)選的實施方式中，試劑是一種化合物，如抑制VEGF活性的小分子，比如通過抑制VEGF受體信號(signaling)或者和VEGF啟動子間接或直接地相互作用。
在優(yōu)選的實施方式中，抑制VEGF表達的試劑被給藥，如局部實施試劑、全身實施、口腔給藥、注射、更優(yōu)選的皮層和皮下實施。在優(yōu)選的實施方式中，試劑是用一種合適的輸送載體來實施的。優(yōu)選地，試劑包含在一個局部使用的組合物中，如凝膠、乳膏或液體。組合物還可以包含一種化妝品成分，如芳香劑或遮光劑，例如甲氧基肉桂酸辛酯、氨基苯甲酸、羥苯甲酮(oxybenzone)，padimate O，胡莫柳酯(homosalate)或二氧化鈦。該組合物還可以包括一些植物提取物，如蘆薈浸出液、葡萄浸出液。該組合物還可以包括維生素，如維生素A如松香油、維生素C如抗壞血酸維生素C或棕櫚酸酯、維生素E如醋酸生育酚(tocopherol acetate)。
在優(yōu)選的實施方式中，試劑在UVB下暴露如日曬前要充分實施于受試者，這樣抗血管發(fā)生作用會出現(xiàn)在暴露在UVB下的時候。
在另一優(yōu)選的實施方式中，用于增加一個或多個抗血管發(fā)生因子活性如通過增加一種自然形成的抗血管發(fā)生蛋白質(zhì)諸如TSP-2或TSP-1活性的試劑實施是重復(fù)的，如至少在許多天內(nèi)重復(fù)1、2、3、5、10、20次或更多次。在優(yōu)選的實施方式中，試劑實施是長期性的。在優(yōu)選的實施方式中，試劑的實施至少每周一次，優(yōu)選每周2、3、4、5次或至少在兩周內(nèi)每日一次，最好的是至少在1、2、3、4、5或6個月內(nèi)。例如，在3-12周內(nèi)定時實施如貫穿整個夏天。在優(yōu)選實施方式中，試劑被實施以抑制或防止，受試者暴露于UVB輻射下的臉部、頸部、胸部、耳部和手以及頭部的謝頂部位的其中一處或多處皺紋。
在優(yōu)選的實施方式中的方法包括實施一種或多種可增加TSP-2活性、可增加TSP-1活性或者可抑制VEGF的試劑。在優(yōu)選的實施列中，要實施一種或多種血管發(fā)生抑制劑如一種或多種誘導(dǎo)或增加抗血管生成抑制劑的試劑。
在另一方面，本發(fā)明的特征在于一種防止或處理由UVB引起的受試者皮膚損傷的方法，如長期UVB引發(fā)的皮膚損傷如皺紋。方法包括實施于受試者如局部，一種含有血管發(fā)生抑制劑，如試劑，如能增加或誘導(dǎo)血管發(fā)生抑制劑的小分子，或試劑，如能抑制血管生成分子的小分子的組合物，能充分減少或防止UVB引起的皮膚損傷，如長期UVB引發(fā)的皮膚損傷如皺紋。在優(yōu)選的實施方式中，試劑在UVB下暴露如日曬前要充分實施于受試者，這樣抗血管發(fā)生作用會出現(xiàn)在暴露在UVB下的時候。
在一種優(yōu)選的實施方式中，試劑是一種化合物，如一種能誘導(dǎo)TSP-2的小分子。
在一種優(yōu)選的實施方式中，試劑是一種化合物，如一種能抑制VEGF的小分子。
在優(yōu)選的實施方式中，試劑被局部實施，能夠?qū)嵤┯谀槻?、頸部、胸部、耳部和手以及頭部的謝頂部位以及身體其他部位。處理可以包括多于一種的血管發(fā)生抑制劑的實施方式，如至少2、3、4種方式。處理也可以包括每天的血管發(fā)生抑制劑的給藥。
在優(yōu)選的實施方式中，血管發(fā)生抑制劑如促進或誘導(dǎo)血管發(fā)生抑制劑的試劑是預(yù)備在一個無菌的組合物中。
在優(yōu)選的實施方式中，血管發(fā)生抑制劑是指TSP-2。
在優(yōu)選的實施方式中，血管發(fā)生抑制劑是指TSP-1。
在優(yōu)選的實施方式中，組合物可以更進一步包括化妝品的成分，如芳香劑或遮光劑，例如甲氧基肉桂酸辛基酯、氨基苯甲酸、羥苯甲酮，padimateO，胡莫柳酯或二氧化鈦。該組合物還可以包括一些植物提取液，如蘆薈浸出液、葡萄浸出液。該組合物還可以包括一種維生素，如維生素A如松香油、維生素C如抗壞血酸維生素C或棕櫚酸酯、維生素E如醋酸生育酚。
在優(yōu)選的實施方式中，組合物是需要長期實施的。在實施方式中，試劑的實施至少每周一次，更適宜的每周2、3、4、5次或至少在兩周內(nèi)每日一次，最好的是至少在1、2、3、4、5或6個月內(nèi)。例如，在3-12周內(nèi)定時實施如貫穿整個夏天。在優(yōu)選的實施方式中，方法包括實施增加TSP-2活性的試劑、增加TSP-1活性的試劑和抑制VGEF試劑中的一種或更多種。在優(yōu)選的實施方式中，可以實施一種或多種血管發(fā)生抑制劑。
在另一方面，本發(fā)明的特征在于是一種防治由紫外線引起的受試者皮膚損傷的方法，如長期紫外線所引起的皮膚的損傷如皺紋。方法包括確定需要防護由于紫外線損傷皮膚的受試者，如長期紫外線引起的皮膚損傷如防護皺紋的形成；給受試者實施一種血管發(fā)生抑制劑，如試劑如提交或誘導(dǎo)血管生成抑制劑的小分子；給受試者實施一種血管發(fā)生抑制劑，如抑制血管生產(chǎn)分子的試劑如小分子；以及評價處理皺紋的作用。確定需要防護由于長期紫外線引起損傷皮膚如皺紋的受試者可以通過受試者本人、衛(wèi)生保健供應(yīng)商以及化妝品供應(yīng)商。血管發(fā)生抑制劑的實施和評價應(yīng)用于抑制皺紋所起到的作用同樣也是通過受試者本人、衛(wèi)生保健供應(yīng)商以及化妝品供應(yīng)商來完成的。
在優(yōu)選的實施方式中，血管發(fā)生抑制劑是指TSP-2。
在優(yōu)選的實施方式中，血管發(fā)生抑制劑是指TSP-1。
在優(yōu)選的實施方式中，血管發(fā)生分子是指VEGF。
在優(yōu)選的實施方式中，皺紋是由于暴露于紫外線輻射下所引起的。
在優(yōu)選的實施方式中，試劑是局部實施的。在實施方式中，試劑在紫外線下暴露如日曬前充分實施于受試者，這樣非血管發(fā)生作用會出現(xiàn)在暴露在紫外線下的受試者的皮膚上。
在優(yōu)選的實施方式中，試劑是長期應(yīng)用的。在優(yōu)選的實施方式中，試劑的實施至少每周一次，更適宜的每周2、3、4、5次或至少在兩周內(nèi)每日一次，最好的是至少在1、2、3、4、5或6個月內(nèi)。例如，在3-12周內(nèi)期實施如貫穿整個夏天。
在優(yōu)選的實施方式中，血管發(fā)生抑制劑如促進或誘導(dǎo)血管發(fā)生抑制劑試劑是預(yù)備在一個無菌的組合物中。
在優(yōu)選的實施方式中，方法包括實施增加TSP-2活性的試劑、增加TSP-1活性的試劑(TSP-1活性的增加可以通過類似于增加TSP-2活性的方法完成的)或者抑制VGEF的試劑中的一種或更多種。在優(yōu)選的實施方式中，可以給予一種或多種血管發(fā)生抑制劑。
另一方面，本發(fā)明的特征在于評價一種對于具有誘導(dǎo)抗血管發(fā)生蛋白質(zhì)表達能力的待試化合物的方法，如TSP-1或TSP-2在皮膚上誘導(dǎo)。方法包括提供細胞如表皮細胞，其包含核酸的轉(zhuǎn)基因，所述核酸編碼功能性連接到抗血管發(fā)生基因的控制區(qū)域如啟動子的報道子(reportor)，如TSP-1或TSP-2，其中所述報道子分子不是通常與啟動子有關(guān)的基因編碼的蛋白；將細胞與測試的化合物接觸；評價通過報道子產(chǎn)生的信號，通過測試其存在或強度與抗血管發(fā)生表達的調(diào)節(jié)有相互關(guān)聯(lián)?；衔锟梢允堑鞍住⒍嚯幕蛐》肿?，如分子量小于2000道爾頓甚至于1000道爾頓的小分子。
在優(yōu)選的實施方式中，報導(dǎo)子是指一種可提供熒光信號的分子。報導(dǎo)子可以是如熒光素酶、GFP、或BFP。在其他實施方式中，報導(dǎo)子是指一種酶。
在優(yōu)選的實施方式中，細胞是一種培養(yǎng)的細胞，如一種無限增值化的人體表皮角質(zhì)化細胞。
在優(yōu)選的實施方式中，細胞來自于轉(zhuǎn)基因動物。
在優(yōu)選的實施方式中，細胞來自于轉(zhuǎn)基因動物，測試的化合物實施于轉(zhuǎn)基因動物，如局部應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因動物的皮膚。
在優(yōu)選的實施方式中，方法還可以包括在人或動物體內(nèi)測試化合物，如通過將化合物實施于暴露于UVB下的動物來評價該化合物的作用。
在另一方面，本發(fā)明的特征還在于一種對于測試具有抑制血管發(fā)生蛋白，如VEGF表達的能力的化合物的評價方法，如抑制其在皮膚上。方法包括提供細胞如表皮細胞，其包含核酸的轉(zhuǎn)基因，所述核酸編碼功能性連接到抗血管發(fā)生基因的控制區(qū)域如啟動子的報道子(reportor)，如VEGF，其中所述報道子分子不是通常與啟動子有關(guān)的基因編碼的蛋白；將細胞與測試的化合物接觸；評價通過報道子產(chǎn)生的信號，通過測試其存在或強度與抗血管發(fā)生表達的調(diào)節(jié)有相互關(guān)聯(lián)?；衔锟梢允堑鞍?、多肽或小分子，如分子量小于2000道爾頓，優(yōu)選小于1000道爾頓甚至于500道爾頓的小分子。
在優(yōu)選的實施方式中，報導(dǎo)子是指一種可提供熒光信號的分子。報導(dǎo)子可以是如熒光素酶、GFP、或BFP。在其他實施方式中，報導(dǎo)子是指一種酶。
在優(yōu)選的實施方式中，細胞是一種培養(yǎng)的細胞，如一種無限增值化的人體表皮角質(zhì)化細胞。
在優(yōu)選的實施方式中，細胞來自于轉(zhuǎn)基因動物。
在優(yōu)選的實施方式中，細胞來自于轉(zhuǎn)基因動物，測試的化合物實施于轉(zhuǎn)基因動物，如局部應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因動物的皮膚。
在優(yōu)選的實施方式中，方法還可以包括在人或動物活體測試化合物，如通過將化合物實施于暴露于UVB下的動物來評價該化合物的作用。
在另一方面，本發(fā)明的特征在于一種防止或處理由UVB引起的皮膚損傷如皺紋的組合物。該組合物包括血管發(fā)生抑制劑(如TSP-1或TSP-2)、如增加或誘導(dǎo)TSP-1或TSP-2的試劑如小分子，或者試劑、抑制血管生成分子的小分子，如抑制VEGF的試劑和制劑學(xué)上可接受的載體。更適宜的是該組合物是無菌的。
在優(yōu)選的實施方式中，試劑是一種化合物，如誘導(dǎo)TSP-2的小分子。
在優(yōu)選的實施方式中，組合物的是局部實施的。
在優(yōu)選的實施方式中，血管發(fā)生抑制劑是指TSP-2。
在優(yōu)選的實施方式中，血管發(fā)生抑制劑是指TSP-1。
在優(yōu)選的實施方式中，包括增加TSP-2活性的試劑、增加TSP-1活性的試劑、抑制VEGF活性的試劑中的一或多個。在優(yōu)選實施方式中，包括一個或多個血管發(fā)生抑制劑。
在優(yōu)選的實施方式中，組合物也可以包括一種化妝品成分，如芳香劑或遮光劑，例如甲氧基肉桂酸辛基酯、氨基苯甲酸、羥苯甲酮，padimate O，胡莫柳酯或二氧化鈦。該組合物還可以包括一些植物提取液，如蘆薈提取液、葡萄提取液。該組合物還可以包括一種維生素，如維生素A如松香油、維生素C如抗壞血酸或維生素C如L-棕櫚酸酯、維生素E如醋酸生育酚。
在另一方面，本發(fā)明的特征還在于提供一種保護由于UVB引起的受試者皮膚損傷的方法，如長期UVB引起的皮膚損傷，皺紋的形成。方法包括提供給受試者一種組合物，組合物含有血管發(fā)生抑制劑如試劑如能夠增加或誘導(dǎo)血管發(fā)生抑制劑的小分子、如TSP-2或TSP-1或試劑、如抑制血管生成分子的小分子、抑制VEGF的試劑；以及可以防止或減少由紫外線引起的受試者皮膚損傷如長期UVB引起的皮膚損傷、如皺紋的該組合物的使用方法說明。
在優(yōu)選的實施方式中，使用方法包括暴露在日光下和/或暴露在日光之前應(yīng)用該組合物的指導(dǎo)說明。
在優(yōu)選的實施方式中，組合物是需要長期實施的。在實施方式中，試劑的實施至少每周一次，更適宜的每周2、3、4、5次或至少在兩周內(nèi)每日一次，最好的是至少在1、2、3、4、5或6個月內(nèi)。例如，在3-12周內(nèi)定時實施如貫穿整個夏天。
在優(yōu)選的實施方式中，血管發(fā)生抑制劑是指TSP-2。
在優(yōu)選的實施方式中，血管發(fā)生抑制劑是指TSP-1。
在優(yōu)選的實施方式中，試劑是一種化合物，如誘導(dǎo)TSP-2或TSP-1的小分子。
在優(yōu)選的實施方式中，組合物還應(yīng)包含一種化妝品的成分，如芳香劑或遮光劑，例如甲氧基肉桂酸辛基酯、氨基苯甲酸、羥苯甲酮，padimate O，胡莫柳酯或二氧化鈦。該組合物還可以包括一些植物浸出液，如蘆薈浸出液、葡萄浸出液。該組合物還可以包括一種維生素，如維生素A(如松香油)、維生素C(如抗壞血酸或維生素C棕櫚酸酯)、維生素E(如醋酸生育酚)。
在優(yōu)選的實施方式中，組合物包括增加TSP-2活性的試劑、增加TSP-1活性的試劑或抑制VEGF的試劑中的一種或多種。在實施方式中組合物包括一種或多種血管發(fā)生抑制劑。
在另一方面，本發(fā)明的特征在于可以防止UVB引起的受試者皮膚損傷如長期UVB引起的皮膚損傷、皺紋的試劑盒。該試劑盒包括含有血管發(fā)生抑制劑、試劑、可以增加或誘導(dǎo)血管發(fā)生抑制劑的小分子的組合物；以及可以防止由紫外線引起的受試者皮膚損傷如長期紫外線引起的皮膚損傷、皺紋的該組合物的使用方法的說明。
在優(yōu)選的實施方式中，試劑是一種化合物，如誘導(dǎo)TSP-2的小分子。
在優(yōu)選的實施方式中，使用方法的說明包括暴露在日光下和/或暴露在日光之前應(yīng)用該組合物的指導(dǎo)說明。
在優(yōu)選的實施方式中，使用方法的說明包括長期性應(yīng)用的指導(dǎo)說明。在優(yōu)選的實施方式中，使用方法還包括應(yīng)用組合物至少每周一次，更適宜的每周2、3、4、5次或至少在兩周內(nèi)每日一次，最好的是至少在1、2、3、4、5或6個月內(nèi)。例如，說明書中可以指出在3-12周內(nèi)定期使用如貫穿整個夏天。
在優(yōu)選的實施方式中，血管發(fā)生抑制劑是指TSP-2。
在優(yōu)選的實施方式中，血管發(fā)生抑制劑是指TSP-1。
在優(yōu)選的實施方式中，組合物還可以包括化妝品成分，如芳香劑，增濕劑，或遮光劑，例如甲氧基肉桂酸辛基酯、氨基苯甲酸、羥苯甲酮，padimateO，胡莫柳酯或二氧化鈦。該組合物還可以包括一些植物浸出液，如蘆薈浸出液、葡萄浸出液。該組合物還可以包括一種維生素，如維生素A(如松香油)、維生素C(如抗壞血酸或維生素C棕櫚酸酯)、維生素E(如醋酸生育酚)。
在優(yōu)選的實施方式中，使用方法的說明還包括組合物應(yīng)用于皮膚的指導(dǎo)說明，如外露皮膚、臉部、頸部、胸部、耳部和手以及頭部的謝頂部位。更適宜的是包括組合物在暴露于紫外線下如日曬和/或暴露于UVB之前的使用方法的指導(dǎo)說明。
在優(yōu)選的實施方式中，組合物包括增加TSP-2活性的試劑、增加TSP-1活性的試劑或抑制VEGF的試劑中的一種或多種。在實施方式中組合物包括一種或多種血管發(fā)生抑制劑。
在這里所指的皺紋是指皮膚表面被改變的外形。在皺紋的組織學(xué)水平上可能有或可能沒有特殊的構(gòu)造改變?？梢园凑誎ligman et al.(1985)BrJDerm 11337-42的描述中分類的，此文引入作為參考。Kligman把皺紋分為三類線形皺紋、溝形(glyphic)皺紋、波狀皺紋。線形皺紋是直的，通常出現(xiàn)在面部皮膚，是由于自然老化和暴露于紫外光下引起的。溝形皺紋這是在外觀上形成了三角形或長方形的皺紋，是基于暴露于日光下的臉部、手部、和頸部形成的，在紫外光下或皮膚日射病進一步惡化。波形(crinkles)皺紋比較細，波狀出現(xiàn)在松弛的皮膚上，基于皮膚的任何部位，作為代表性的是指手背和眼瞼的四周的皮膚。皺紋還包括有時涉及到的線紋(lines)、細的皺紋(finewrinkles)、皺紋、眼角紋(crow′s feet)或者下垂。
在這里使用的術(shù)語“小分子”包括肽、擬肽(peptidomimetics)或非肽化合物，諸如有機分子，分子量不少于2000道爾頓，更適宜的是不少于1000道爾頓。
這里所說的處理意思是整體或局部地緩和或消除紊亂的征狀或影響。這里的防止的意思是指完全預(yù)防或在外表延遲紊亂的征狀或影響。
在這里所說的暴露于長期的(慢性的)UVB輻射下是指暴露于自然光下或人造的UVB放射下(如紫外光燈(UVB sun lamp)、人工日曬或光線療法，如牛皮癬、遺傳性過敏癥皮炎或白癜風(fēng)的處理)。例如，慢性暴露是指暴露在UV指數(shù)為3-6之間或者更高的陽光下至少3次每次10分鐘，更適宜的至少5次、或10次在預(yù)先選擇的一段時間里。預(yù)先選擇的時間段可以是1個月、2、3、6、12或24個月，如在12個月的時間里暴露于累計5個小時的UVB的輻射下如陽光或人造UVB光。處于長期可能由紫外線引起的皮膚損傷如皺紋的危險中的受試者，可以是已經(jīng)或者將要暴露于UV指數(shù)為3-6或更高的陽光下至少10分鐘，在一年至少10次的時間段里的受試者，或者已經(jīng)或?qū)⒁┞队谝荒陼r間里累計5個小時的紫外線輻射中的受試者。更適宜的是，受試者要暴露在至少三年每年至少20次每次又至少30分鐘的紫外線輻射中。更進一步的是，受試者在上午11點到下午3點間暴露于日光下，或者受試者暴露于整個夏天的日光下，或者受試者暴露于UV指數(shù)高到極高的白天的日光下。處于長期可能由UVB引起的皮膚損傷如皺紋的危險中的受試者包括生活在高海拔的地區(qū)的人群，如至少在海拔1000英尺以上的人群；生活在近赤道地區(qū)的人群，如赤道兩旁1000英里以內(nèi)；一年中參加戶外運動至少10次的人群，如參與慢跑、網(wǎng)球、登山、滑雪或滑水；已經(jīng)或正在進行UVB光線療法的人群。
發(fā)明詳述暴露于UVB輻射主要的UVB輻射來自于自然的陽光。UVB光線的強度各改變?nèi)Q于白天時間的變化、一年四季的變化、太陽在天空的位置、海拔和距離赤道的遠近。雖然光線總是存在，在冬季的歲月里，但在夏季正午的時候是最強烈的。海拔和距離赤道的遠近也是考慮的重要因素。海拔越高UVB光線的強度越大。因此，登山運動員、滑雪者和那些居住在高海拔地區(qū)的人群都處于長期UVB帶來損傷的危險中。同樣，距離赤道越近的人群UV光線的強度就越強，長期UVB帶來的損傷的危險就越大。
雪地、水面和沙灘反射的陽光，增大了UVB輻射到達皮膚的總量。即使云遮日的時候，UVB仍然很強以至于長期暴露使皮膚光老化如皺紋。
在特定的白天UV的指數(shù)(環(huán)境保護局制定)顯示的是太陽光中紫外線的強度。強度分為四個級別適度(UV指數(shù)不小于3)、高(指數(shù)在3-6)、很高(指數(shù)在6-10)、極高(指數(shù)大于10)。適度的UV指數(shù)是指超過1小時會灼傷皮膚；極高的水平是指小于15分鐘就已經(jīng)灼傷皮膚。指數(shù)通常是出現(xiàn)在天氣預(yù)報里。臨床上，UVB的照射量是用MED來測定的。一個MED是在敏感皮膚上出現(xiàn)曬斑(sunburn)所需的UVB的總量。因為UVB的照射效果是累積的，長期的或慢性的UVB會誘導(dǎo)產(chǎn)生的皺紋作為長期的UVB照射的結(jié)果的水平要低于在急性照射下所產(chǎn)生的紅斑或水腫或嚴重?zé)齻?如低于一個MED)。例如，如果受試者長期暴露于陽光下即使受試者暴露在低的或適中的UV指數(shù)的數(shù)天那么他就有長期UVB誘導(dǎo)產(chǎn)生皺紋的危險。
血管發(fā)生和慢性的UVB的照射光老化皮膚的特征在于表皮的增生、皮膚彈性和基質(zhì)蛋白質(zhì)的簡并(5，38)，以及靜脈周淋巴組織細胞浸潤的存在(23)。這里描述的結(jié)果顯示皮膚的慢性的UVB照射明顯與皮膚的血管發(fā)生、在增生的表皮上增加VEGF表達以及通過TSP-1預(yù)防由UVB引起的皮膚損傷和皺紋形成的皮膚血管發(fā)生的靶抑制有關(guān)系。
一個制定的慢性光老化的實驗?zāi)Ｐ蚐kh-1無毛老鼠經(jīng)過10周的UVB輻射，我們發(fā)現(xiàn)明顯地皺紋的形成以及組織學(xué)上特有的表皮和真皮的增生與增加紊亂的彈性檢測以及皮膚的膠原纖維有關(guān)。計算機幫助下的對于內(nèi)皮結(jié)合處分子CD31(39)的組織部分褪色的定量的圖像分析在有效地增加脈管密度和體積的情況下顯示出在長期的UVB輻射下皮膚血管發(fā)生的顯著感應(yīng)現(xiàn)象。脈管的改變與出現(xiàn)在皮膚創(chuàng)傷愈合時間的抗原的改變相比較，先前存在的血管芽和脈管的增生有助于富含血管的顆粒狀組織的形成(24)。與此相對，慢性皮炎如牛皮癬主要表現(xiàn)為脈管的改變即皮膚微脈管的延長和增生，并沒有新的脈管芽(vessel sprouts)的形成。這些發(fā)現(xiàn)說明皮膚在長期的UVB的輻射下導(dǎo)致了一種慢性的組織修補反應(yīng)，進一步暗示血管發(fā)生(angiogenesis)在由UVB引起的皮膚損傷處理中起到重要的作用。
脈管內(nèi)皮的增長因子(VEGF)證實是主要的，源自皮膚血管發(fā)生因子(40)的角化細胞，在由于牛皮癬損傷皮膚(12)的增生的表皮上與另外和皮膚血管發(fā)生(14，41)有關(guān)皮膚性疾病的增加表達，也可以在康復(fù)新表皮(13，42)中。在實驗記錄中，VEGF信使核糖核酸表達的一個顯著的增量調(diào)節(jié)是基于慢性UVB照射皮膚所造成的皮膚增生，優(yōu)選的是基底上角化細胞。這些發(fā)現(xiàn)是和之前所介紹的在人體內(nèi)外(43)(44)嚴重的UVB照射誘導(dǎo)VEGF表達是一致的。
血管發(fā)生與長期UVB引起的皺紋血管發(fā)生抑制劑TSP-1在皮膚特異性過量表達的轉(zhuǎn)基因小鼠暴露于長期UVB的照射下。使用確定的角蛋白14(K14)啟動子盒(cassette)對于靶向TSP-1轉(zhuǎn)基因表達到表皮的角化細胞，我們之前確定的K14/TSP-1轉(zhuǎn)基因小鼠是通過增加表皮的TSP-1的表達水平、形態(tài)上，厚度正常的表皮和真皮以及在皮膚創(chuàng)傷的康復(fù)(24)期間皮膚血管發(fā)生有力的抑制。K14啟動子的使用保證了在表皮增生條件下高度的轉(zhuǎn)基因的表達，因為K14基因表達在增生擴散的角化細胞中大大增強。這里實施例描述的結(jié)果顯示表皮的TSP-1的過量的表達有力的抑制皮膚和膠原蛋白和彈性纖維組織的破壞，同時也完全抑制了皮膚皺紋的形成。這與皮膚血管發(fā)生被有效的抑制減少內(nèi)皮增值速率以及增加內(nèi)皮細胞的編程性細胞死亡有關(guān)?？傊@些結(jié)果表明，與修復(fù)有關(guān)的、UVB引起的血管發(fā)生的抑制作用也防止了包括皺紋的形成在內(nèi)的皮膚光損傷。
已有發(fā)現(xiàn)TSP-1通過I型重復(fù)(repeats)內(nèi)不同序列與內(nèi)皮細胞上的用CD36受體的特異性交互作用，介導(dǎo)血管發(fā)生的抑制，結(jié)果導(dǎo)致增加了內(nèi)皮細胞的死亡速率(46)。近來的證據(jù)暗示TSP-1類似于所敘述的分子TSP-2，同樣能抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)的活化，為它的抗血管發(fā)生作用提供了重要啟示(48，49)。這些結(jié)果證實存在一個TSP-1的額外機理，通過對于MMP-9活化的抑制，可以減小由于UVB輻射而誘導(dǎo)的皮膚血管發(fā)生。MMP-9是消化細胞外基質(zhì)的成分的鋅蛋白酶的分子家族的成員，已發(fā)現(xiàn)在UV照射下人的皮膚上MMP-9的表達和活性水平的增強(35，50，51)。
相反的，相對于野生型小鼠，TSP-2敲除小鼠在長期UVB的暴露下的反應(yīng)中起皺現(xiàn)象增強。然而我們發(fā)現(xiàn)在長期的UVB照射后TSP-2敲除小鼠和野生型小鼠在MMP-9的活性上沒有顯著性的差別。結(jié)果表明皮膚血管發(fā)生的特異性抑制(與MMP作用相反)可能代表了對于防止長期UVB引起的皮膚損傷如皺紋的一個有前景的新的方法。
TSP的類似物類似物區(qū)別于自然形成的TSP-1或TSP-2是在氨基酸序列、在不包括序列的情形或者前兩者均有。非序列的修飾包括體內(nèi)外TSP-1或TSP-2的化學(xué)衍生作用。非序列的修飾包括乙酰化作用、甲基化、磷酸化、羧化作用或糖基化作用的改變。
TSP-1或TSP-2的序列如人體的TSP-1或TSP-2在現(xiàn)代技術(shù)中是已知的。優(yōu)選的類似物包括TSP-1或TSP-2(或其中的生物學(xué)的活性片段)的序列通過一個或多個保守的氨基酸置換或者一個或多個非保守的氨基酸置換，缺失，或插入來區(qū)別于野生序列部分這些所述改變未取消TSP-1或TSP-2的生物活性。代表性的保守性的置換包括一個氨基酸的置換為具有類似特征的另一個，如置換在如下組中進行纈氨酸、甘氨酸；甘氨酸、丙氨酸；纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；絲氨酸、蘇氨酸；賴氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。其他的保守置換可以按下表中進行。
表1保守性氨基酸置換

本發(fā)明的其他類似物是指其具有可以增強肽穩(wěn)定性的修飾；類似物可以包括例如在肽序列中一個或多個非肽鍵(替代肽鍵)。也可以包括含有除了自然存在的L-氨基酸以外的殘基的類似物，如D-氨基酸或非天然存在的氨基酸或合成的氨基酸，如β或γ氨基酸；和其他環(huán)狀類似物。
片段和類似物的產(chǎn)生片段的產(chǎn)生一種蛋白質(zhì)片段可以用幾種方法制造，如通過蛋白水解的消化或通過化學(xué)水解的合成的重組。內(nèi)在的或末端的多肽的片段可以通過從核酸一端(對于末端片段)或兩端(對于內(nèi)部片段)去除一個或多個編碼多肽的核苷酸來產(chǎn)生。誘變DNA的表達產(chǎn)生多肽片段。有″末端嚙咬性(end-nibbling)″核酸內(nèi)切酶的消化可產(chǎn)生編碼系列(an array of)片段的DNA。由DNA編碼的蛋白質(zhì)片段也可以通過隨機切變(random shearing)，限制酶消化或上述方法的組合而產(chǎn)生。
片段也可以通過用現(xiàn)代已知技術(shù)化學(xué)合成如常規(guī)的Merrifield固相f-Moc或t-Boc化學(xué)。例如，本發(fā)明的肽可分為任意想要的長度的片段，片段無重疊，或者分成所需長度的重疊的片段。
類似物的產(chǎn)生通過隨機方法生產(chǎn)改變DNA和肽序列蛋白質(zhì)氨基酸序列的變體可以通過編碼蛋白質(zhì)或者一個特定域或的DNA的隨機誘變制成。有用的方法包括PCR誘變和飽和誘變。隨機氨基酸序列變體文庫也能通過一系列的簡并的寡聚核苷酸序列的合成來產(chǎn)生。(在變體文庫中篩選蛋白質(zhì)的方法在申請的其他部分。)PCR的誘變在PCR的誘變中，減小tap聚合酶的精確度用于隨機突變引入到DNA的克隆片段中(Leung et al.，1989，Technique 111-15)。這是一個非常有力和相對迅速的引入隨機突變的方法。待誘變的DNA區(qū)域采用聚合酶鏈式反應(yīng)擴增，其條件是降低tapDNA聚合酶DNA合成的精確度，如通過利用dGTP/dATP比率為5和在PCR反應(yīng)中加入Mn2+。
飽和誘變飽和誘變可以迅速引入許多的單堿基置換到克隆的DNA片段(Mayerset al.，1985，Science 229242)。這項技術(shù)包含了突變的產(chǎn)生，如在體外通過化學(xué)處理或照射單鏈的DNA，互補DNA鏈的合成。突變頻率是可以通過調(diào)節(jié)處理強度來調(diào)整的，本質(zhì)上所有可能的堿基置換都可以得到。因為此方法不包括對于突變片段的選擇中性置換，那些改變功能的置換都可以得到。這種點突變的分布對于保守序列元件沒有偏差。
簡并寡聚核苷酸同系物文庫也能從一系列的寡聚核苷酸序列中產(chǎn)生。簡并序列的化學(xué)合成是在自動的DNA合成儀中完成的，合成基因連接到一個適當?shù)谋磉_載體。簡并寡聚核苷酸的合成是已知技術(shù)(如Narang，SA(1983)Tetrahedron 393；Itakura et al.(1981)Recombinant DNA，Proc 3rd Cleveland Sympos.Macromolecules，ed.AG Walton，AmsterdamElsevier pp273-289；Itakura etal.(1984)Annu.Rev.Biochem.53323；Itakura et al.(1984)Science 1981056；Ike et al.(1983)Nucleic AcidRes.11477.)此技術(shù)中已經(jīng)用于其他蛋白質(zhì)的直向進化中(如Scott et al.(1990)Science 249386-390；Roberts et al.(1992)PNAS 8924292433；Devlin et al.(1990)Science 249404-406；Cwirlaet al.(1990)PNAS 876378-6382；as well as U.S.Patents Nos.5,223,409，5,198,346，and 5,096,815)。
類似物的產(chǎn)生通過定向誘變生產(chǎn)改變的DNA和肽序列非隨機或定向誘變技術(shù)通常用于在特定區(qū)的特定序列或突變。此技術(shù)通常用于制造變體，其包括蛋白質(zhì)已知氨基酸序列的殘基的缺失、插入或置換。突變位點可以個別或系列修飾，如通過(1)首先用保守氨基酸取代然后進行根據(jù)取得的結(jié)果用更激烈的方式，(2)刪除靶殘基，或(3)插入與所定位點相同類別或相鄰的不同類別的殘基，或上述1-3項的結(jié)合。
丙氨酸掃描誘變丙氨酸掃描(scanning)誘變對于確定所需蛋白的要突變的優(yōu)選位置或域的特定殘基或區(qū)是一個有用的方法，Cunningham和Wells(Science 2441081-1085，1989)。在丙氨酸的掃描中，殘基或靶殘基的一組被識別(如帶電殘基，如Arg，Asp，His，Lys，和Glu)并被中性或負電氨基酸取代(最優(yōu)選丙氨酸或聚丙氨酸)。氨基酸的置換影響氨基酸與細胞內(nèi)外的周圍水環(huán)境的相互作用。對于置換證明功能靈敏性的域可以通過引入進一步的或其他的變體在置換的位置而精選。因而，當對于引入一個氨基酸序列變化的位點是預(yù)定的，突變本身的本質(zhì)是不需要預(yù)定的。例如，為使在特定位置的突變的性能最優(yōu)化，丙氨酸的掃描或隨機誘變可以在靶向編碼子或區(qū)域被實施，篩選表達的所要蛋白亞單位變體以優(yōu)化所要活性的組合。
寡聚核苷酸調(diào)節(jié)的誘變寡聚核苷酸調(diào)節(jié)的誘變對于制備置換、缺失、插入DNA變體是有用的方法，如Adelman et al.，(DNA 2183，1983)。簡要地，想得到的DNA是通過雜交到編碼突變的低聚糖核苷酸到DNA模板而改變，模板是包括想得到的蛋白質(zhì)的不變的或天然的DNA序列的質(zhì)體或噬菌體的單鏈形式。雜交之后，DNA的聚合酶通常用于合成模板完整的第二互補鏈從而整合寡聚核苷酸引物，并將編碼所要蛋白DNA中的所選改變。通常，寡聚核苷酸至少是25核苷酸長。最佳的寡聚核苷酸是由對于模板在核苷譯碼任意一邊都完全互補的12-15個核苷酸。這就保證了寡聚核苷酸將正確與單鏈DNA模板分子雜交。寡聚核苷酸在現(xiàn)有技術(shù)中是易合成的，諸如Crea et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.(1978)USA，755765)中的記載。
盒誘變預(yù)備變體的另外的方法，盒(cassette)誘變，是基于Wells et al.(Gene(1985)34315)中關(guān)于記載。對于變異而言原材料是一個包括待突變蛋白質(zhì)DNA亞單位DNA的質(zhì)粒(或其他載體)。待變異的蛋白質(zhì)亞單位DNA的編碼子可以被識別的。在識別的變異位點每一邊肯定有一個獨特的限制核酸內(nèi)切酶的位點。如果沒有這些限制酶切位點的存在，在想得到的蛋白質(zhì)亞單位DNA的適當部位用上述的寡聚核苷酸調(diào)節(jié)的誘變方式導(dǎo)入，可以引導(dǎo)它們的產(chǎn)生。在限制性酶切位點導(dǎo)入質(zhì)粒中后，在這些位點酶切時其線性化。限制位點之間編碼DNA序列但包含所要突變的雙鏈寡聚核苷酸通過標準程序合成。兩條鏈分別合成然后通過標準方法雜交在一起。雙鏈的寡聚核苷酸是作為盒被歸類的。盒被設(shè)計為有3’和5’端這與線性化質(zhì)粒的端相容，這樣就能直接連接到質(zhì)粒?，F(xiàn)有質(zhì)粒含有變異的想得到的蛋白質(zhì)亞單位DNA序列。
細合的誘變組合誘變也通常被用于產(chǎn)生突變體。例如排列同系物或其他有關(guān)系的蛋白質(zhì)的組的氨基酸序列，適宜的是促進最高同源性的可能性。出現(xiàn)在排列序列的特定的部位的所有氨基酸能挑選出組合序列的簡并組。變體的多樣化文庫是通過在核酸水平上的組合誘變來產(chǎn)生的，并通過多樣化(variegated)的基因文庫來編碼的。例如，一種合成的寡聚核苷酸的混合物能被酶促地連接到基因序列以至于潛在序列的簡并組是作為個別的肽被表達出來的，或者二者擇一的，作為一組含有簡并序列組的較大融合蛋白質(zhì)。
用于篩選肽片段或同系物文庫的主要高產(chǎn)方法在現(xiàn)有技術(shù)中對于篩選產(chǎn)生的突變基因產(chǎn)物有不同的技術(shù)。篩選大基因文庫的技術(shù)通常包括克隆基因文庫到可復(fù)制的表達向量，用向量的合成文庫轉(zhuǎn)化適當?shù)募毎谙氲玫降幕钚缘目蓹z測到條件下表達基因，組合成三聚合分子，結(jié)合一個自然配基，如一個受體或基質(zhì)，促進相關(guān)的向量編碼的檢測到產(chǎn)物的基因的分離。以下描述的每項技術(shù)對于大量已引起的序列的篩選高產(chǎn)量分析是可修改的，如通過隨機誘變技術(shù)。
兩個雜種體系兩種雜種(hybrid)(交互作用肼(trap))分析通常能確定和VEGF有交互作用的蛋白質(zhì)?？梢园觿?、superagonists、拮抗劑。(受試者蛋白質(zhì)和與其有交互作用的蛋白質(zhì)是指習(xí)慣使用的餌蛋白(bait protein)和魚蛋白(fishproteins)。)這些分析依賴于檢測功能性轉(zhuǎn)錄激活劑的重構(gòu)，其由采用餌蛋白的蛋白-蛋白相互作用介導(dǎo)。尤其是，這些分析是利用表達雜種蛋白的嵌合基因完成的。第一雜種包含融合到餌蛋白的DNA結(jié)合域，如TSP-1或TSP-2分子或它的片段。第二雜種蛋白包括融合到”魚”蛋白的轉(zhuǎn)錄活化域，如表達文庫。如果魚和餌蛋白能相互作用，它們將靠近DNA結(jié)合和轉(zhuǎn)錄活化域。這種接近足以使可操作連接到轉(zhuǎn)錄調(diào)控位點的報道基因轉(zhuǎn)錄，所述位點可為DNA結(jié)合域識別，標記基因的表達可以檢測到并用于對餌蛋白與另一蛋白的交互作用計分。
展示文庫在篩選分析的一個方法中，后補肽在細胞或病毒粒的表面顯現(xiàn)出來，具體細胞或病毒顆粒通過展示的產(chǎn)物結(jié)合合適的受體蛋白在″淘選檢測(panning assay)″中測定。例如，對于細菌細胞表面膜蛋白，基因文庫能克隆到所述基因，通過淘選檢測所得融合蛋白(LacIner et al.，WO 88/06630；Fuchset al.(1991)BiolTechnology 91370-1371；and Goward et al.(1992)TIBS 18136-140)。在一個近似的方法中，一個可檢測的標記的配基能被用于潛在的功能性的肽的同系物計分。熒光標記的配基，如受體，可用于檢測保持配體結(jié)合活性的同系物。熒光標記的配基的使用，可以使細胞在熒光顯微鏡下在視覺上被檢測和分離出來，或者在細胞形態(tài)學(xué)上可以通過熒光細胞分類器分離出來。
基因文庫可表達為在病毒粒表面上的融合蛋白質(zhì)。例如，在纖維狀的噬菌體體系中，異質(zhì)的肽序列能在有感染力的噬菌體的表面上表達，因此具有兩大優(yōu)勢。首先，由于這些噬菌體適于每毫升濃度超過1013噬菌體的上親合基質(zhì)，大量的噬菌體都能通過一次篩選。第二，由于這些有感染力的噬菌體在它們表面顯現(xiàn)出基因產(chǎn)物，如果特殊的噬菌體在低產(chǎn)量下能從親合基質(zhì)中回收，噬菌體能夠通過另一輪感染而擴增。幾乎同樣的E.大腸桿菌纖維狀噬菌體M13.fd組，和fl.常用于噬菌體的展示文庫。噬菌體gIII或gVIII膜蛋白中任意一個在未破壞病毒粒的最終包裝情況下能用于融合蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。異質(zhì)的抗原決定基在pIII的NH2-末端被表達，攜帶這類抗原決定基的噬菌體能從缺乏抗原決定基的過量噬菌體中回收(LacIner et al.PCT publication WO 90/02909；Garrard et al.，PCT publication WO 92/09690；Marks et al.(1992)J.Biol.Chem.26716007-16010；Griffiths et al.(1993)EMBOJ 12725-734；Clackson et al.(1991)Nature 352624-628；and Barbaset al.(1992)PNAS 894457-4461)。
一個普通的方法是用大腸桿菌的麥芽糖受體(外膜蛋白質(zhì)LamB)作為肽融合partner(Charbit et al.(1986)EMBO 5，3029-3037)。寡聚核苷酸被插入編碼LamB基因質(zhì)粒來生產(chǎn)融合到蛋白質(zhì)細胞外的環(huán)(loop)肽。這些肽可用于結(jié)和配基，如對于抗體，當細胞實施于動物時能引出免疫響應(yīng)。其他細胞表面的蛋白質(zhì)，如OmpA(Schorr et al.(1991)Vaccines 91，pp.387-392)，PhoE(Agterberg，et al.(1990)Gene 88，37-45)，and PAL(Fuchs et al.(1991)BiolTech9，1369-1372)，以及大的細菌表面結(jié)構(gòu)對于肽的顯示是作為一個媒介物。肽融合于菌毛蛋白，聚合的蛋白質(zhì)形成通管為了遺傳信息的細菌間交換(Thiry etal.(1989)Appl.Environ.Microbiol.55，984-993)。因為它在與其他細胞相互作用中的作用，纖毛提供了一個對于在細胞外環(huán)境中肽的表達的有利的支持。另外用于顯示肽的大的表層結(jié)構(gòu)是細菌的運動結(jié)構(gòu)如鞭毛。肽的融合到亞單位蛋白質(zhì)的鞭毛蛋白提供了一個肽拷貝在宿主細胞的密集排列(Kuwajima et al.(1988)BiolTech.6，1080-1083)。其他細菌種類的表面蛋白質(zhì)也提供了作為肽融合配偶體。如葡萄球菌蛋白質(zhì)A和外膜的奈瑟氏菌屬的蛋白酶IgA(Hansson et al.(1992)J.Bacteriol.174，4239-4245 and Klauseret al.(1990)EMBO J.9，1991-1999)。
以上所描述的纖維狀噬菌體體系和LamB體系中，肽和它的編碼DNA之間的物理連接是通過在其表面的這種肽的粒子(噬菌體或細胞)內(nèi)DNA包含(containment)實現(xiàn)的。捕獲了肽，也就捕獲了該粒子和其中的DNA。另一種可供選擇的方案是使用DNA結(jié)合蛋白LacI在肽和DNA之間形成一個連接(Cull et al.(1992)PNAS USA 891865-1869)。這種系統(tǒng)需要使用一種質(zhì)粒，這種質(zhì)粒在它的寡核苷酸克隆位點的3′-末端含有LacI基因。在阿拉伯糖的受控誘導(dǎo)下，產(chǎn)生一種LacI-肽融合蛋白。這種融合保留了LacI結(jié)合短DNA序列已知為LacO操縱基因(LacO)的天然能力。通過在表達質(zhì)粒上建立兩份LacO，LacI-肽融合物可以牢固的結(jié)合到編碼它的質(zhì)粒上去。因為每個細胞里面的質(zhì)粒只含有單個寡核苷酸序列并且每個細胞只表達單個肽序列，肽與指導(dǎo)它的合成的DNA序列特異性并且穩(wěn)定結(jié)合。文庫細胞逐漸溶解，肽-DNA復(fù)合物暴露在固定受體的基質(zhì)下以回收含有活性肽的復(fù)合物。然后把相關(guān)的質(zhì)粒DNA再導(dǎo)入到細胞中進行擴增，進行DNA序列測定以確定肽配體的同一性。作為這種方法實用性的一個例證，有人建了一個含有十二肽的大隨機文庫，并且挑選一個單克隆抗體來抗類鴉片肽強啡肽B。結(jié)果顯示回收了一組肽，與共有序列相關(guān)的所有肽都對應(yīng)強啡肽B的一個6-殘基片段(Cull等，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89-1869)。
這個方案有時候被認為是在質(zhì)粒上肽方案。它與噬菌體展示方法在兩個重要的方式上不同。首先，肽附加到融合蛋白的C-末端，這導(dǎo)致文庫成員顯示為具有游離羧基末端的肽。絲狀噬菌體外殼蛋白，pIII和pVIII通過它們的C-末端都固定在噬菌體上，客體肽被放到向外延伸的N-末端區(qū)域。在一些設(shè)計中，被噬菌體顯示的肽可以剛好出現(xiàn)在融合蛋白的氨基末端。(Cwirla，et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87，6378-6382)。第二個區(qū)別是，一系列的生物偏差會影響那些實際出現(xiàn)在文庫里面的肽群體。LacI融合分子被限制在宿主細胞的胞漿里面。在翻譯過程中噬菌體外殼融合物暫時暴露在胞漿里面，但是它們會迅速的通過內(nèi)層膜分泌到胞質(zhì)室，通過它們的C-末端親脂區(qū)域，保持固定在膜上，在含有肽的N-末端，伸到胞質(zhì)并等待著結(jié)合到噬菌體粒子上去。由于LacI里面的肽和噬菌體文庫顯示不同的蛋白分解活性，這導(dǎo)致它們可能有顯著的差異。噬菌體外殼蛋白需要轉(zhuǎn)運穿過內(nèi)層膜，信號肽酶處理作為它并入到噬菌體的前奏。一些特定的肽在這些過程中發(fā)揮著不利的影響并且這些肽在文庫里面沒有代表性。(Gallop et al.(1994)J.Med.Chem.37(9)12331251)。這些特殊的誤差在LacI顯示系統(tǒng)里面不是一個要素。
在重組體隨機文庫里面可獲得的小分子肽的數(shù)量是巨大的。具有107-109個獨立克隆的文庫可以通過常規(guī)的方法建立。已經(jīng)建立了具有1011個重組體這樣大的文庫，但是，這種文庫的大小對克隆文庫有實際的限制。這種文庫大小的限制出現(xiàn)在轉(zhuǎn)換那些含有隨機片段的DNA到宿主細菌細胞里面這一步。為了克服這個限制，最近發(fā)展了一種體外系統(tǒng)，這個系統(tǒng)以多核糖體復(fù)合物里面的初始肽(nascent peptide)的作用為基礎(chǔ)。這個顯示文庫方法具有產(chǎn)生比目前可獲得的噬菌體/噬菌?；蛘哔|(zhì)粒文庫大3-6個數(shù)量級文庫數(shù)量的潛力。而且，文庫的構(gòu)建，肽的表達和篩選都是以一種完全不依賴細胞的方式完成的。
這種方法的一個應(yīng)用(Gallop et al.(1994)J.Med.Chem.37(9)12331251)，構(gòu)建了可以編碼1012個十肽的分子DNA文庫并且在體外E.coliS30結(jié)合轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)文庫的表達。選擇合適的條件的結(jié)合在mRNA上建立核蛋白體，使很大比例的RNA在多核糖體上積聚，從而產(chǎn)生含有那些仍然連接在它們的編碼RNA上的初始肽的復(fù)合物。多核糖體足夠的堅實以致于它在固定受體有親和純化，這種親和方式與更多傳統(tǒng)的重組肽顯示文庫以同樣的方式進行篩選。從所結(jié)合的復(fù)合體得到的RNA被回收，轉(zhuǎn)換為cDNA，并且通過PCR進行擴增以產(chǎn)生下一輪合成和篩選的模板。多核糖體顯示方法可以結(jié)合噬菌體顯示系統(tǒng)。幾輪篩選之后，從多核糖體濃縮池里提取的cDNA被克隆到噬菌粒載體上。這種載體不僅可作為肽表達載體，顯示融合到外殼蛋白上的肽，還可以作為鑒定肽時的DNA序列測定載體。通過表達噬菌體上的來自多核糖體的肽，我們可以繼續(xù)以這種方式進行親和挑選，還可以通過噬菌體ELISA實驗測定每個克隆上肽的結(jié)合活性，還可以通過一個完整的噬菌體ELISA實驗測定肽的結(jié)合特異性。(Barret，etal.(1992)Anal.Biochem 204，357-364)。為了鑒定活性肽的序列，可以測定由噬菌粒宿主產(chǎn)生的DNA序列。
次級篩選為了進一步確定生物活性，這些生物活性例如可以允許本領(lǐng)域一般技術(shù)人員區(qū)分顯效藥和拮抗藥，然后，使用次級篩選進行上面描述的高通量測定。所使用的次級篩選的類型將會取決于那些需要實驗的目標活性。例如，可以建立這樣一個測定方法，在這個測定方法里，抑制目的蛋白例如TSP1或者TSP2與其配體之間相互作用的能力，可以從上述的初段篩選之一分離出來的一組肽片段中，區(qū)分顯效藥或者拮抗藥。例如，一個測試化合物抑制皮膚中血管發(fā)生的能力可以通過許多現(xiàn)有技術(shù)進行測定，例如，通過對皮膚應(yīng)用測試化合物或者對皮膚進行處理，例如實驗動物(例如，小鼠)；評價在沒有該化合物的情況下皮膚中血管的數(shù)量或者大小，并與存在該化合物的情況進行比較。能引起皮膚中血管的數(shù)量或者大小下降的化合物被認為是可以抑制皮膚中血管發(fā)生的化合物。
因此，現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)知道產(chǎn)生片段以及類似物的方法和測試它們活性的方法。一旦確定重要的核心序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員都可以獲得類似物和片段并且可以測試它們的目標活性，這是一個常規(guī)的途徑。
肽類似物本發(fā)明同時也減少了TSP-1或者TSP-2多肽的蛋白結(jié)合域以產(chǎn)生類似物，例如，肽或者非肽劑。例如，“人乳頭狀瘤病毒蛋白肽抑制劑結(jié)合視網(wǎng)膜母細胞瘤基因蛋白”歐洲專利申請EP 0 412 762和EP 0 031 080可以使用下面物質(zhì)產(chǎn)生關(guān)鍵殘基的非水解肽類似物苯并二氮雜(benzodiazepine)(例如，見Freidinger et al.in PeptidesChemistry andBiology，G.R.Marshall ed.，ESCOM PublisherLeiden，Netherlands，1988)，氮雜卓(例如，見Huffman et al.in PeptidesChemistry and Biology，G.R.Marshalled.，ESCOM PublisherLeiden，Netherlands，1988)，γ取代gama內(nèi)酰胺環(huán)(Garvey et al.in PeptidesChemistry and Biology，G.R.Marshall ed.，ESCOMPublisherLeiden，Netherlands，1988)，南五味子酮(ketomethylene)假肽(Ewenson et al.(1986)JMed Chem 29295；and Ewenson et al.in PeptidesStructure and Function(Proceedings of the 9th American Peptide Symposium)Pierce Chemical Co.Rockland，IL，1985)，β-旋轉(zhuǎn)(turn)二肽核心(Nagai et al.(1985)Tetrahedron Lett 26647；and Sato et al.(1986)JChem Soc Perkin Trans11231)，和β-氨基醇(Gordon et al.(1985)Biochem Biophys Res Commun126419；and Dann et al.(1986)Biochem Biophys Res Commun 13471).
融合蛋白用來調(diào)節(jié)TSP-1或者TSP-2蛋白水平的多肽可以融合到另一個蛋白或者它的一部分上去。例如，一個TSP-1或者TSP-2蛋白或者它們的一部分可以操作連接到另一個多肽部分上以提高它的溶解性?？梢匀诤蟃SP-1或者TSP-2或者它們的一部分的蛋白包括血漿蛋白或者它的片段，它們可以提高VEGF的循環(huán)半衰期。例如，融合蛋白可以是TSP-1或者TSP-2免疫球蛋白(Ig)融合蛋白，在這個蛋白里TSP-1或者TSP-2序列與來自免疫球蛋白總科的一個序列進行融合。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾個可溶的融合蛋白的構(gòu)造物，在這個構(gòu)造里，細胞外結(jié)構(gòu)域的細胞表面糖蛋白與免疫球蛋白的不變F(c)域進行融合。例如，Capon et al.(1989)Nature 337(9)525-531，提供了關(guān)于通過融合CD4與免疫球蛋白(IgGI)生成更長久性CD4類似物的指導(dǎo)。又見，Capon et al.，U.S.Patent Numbers5,116,964 and 5,428,130(CD4-IgG融合構(gòu)建體)；Linsley et al.，U.S，Patent Number 5,434,131(CTLA4-IgG1 and B7-IgGI融合構(gòu)建體)；Linsley et al.(1991)J.Exp.Med.174561-569(CTLA4-IgGI融合構(gòu)建體)；and Linsley et al.(1991)J.Exp.Med 173721-730(CD28-IgGI and B7-IgGI融合構(gòu)建體)。已經(jīng)證實這種融合蛋白對于調(diào)節(jié)受體-配體相互作用和減少體內(nèi)炎癥方面作用很大。例如，融合蛋白已經(jīng)在體內(nèi)使用了，在這樣的融合蛋白里面，細胞表面腫瘤壞死因子受體(TNFR)蛋白的細胞外結(jié)構(gòu)域已經(jīng)融合到免疫球蛋白的不變(Fc)域。例如，Moreland etal.(1997)N.Engl.J.Med.337(3)141-147；and，van der Poll et al.(1997)Blood 89(10)3727-3734)。
反義核酸序列那些對編碼陽性血管發(fā)生因子例如VEGF的核苷酸有反義作用的核酸分子，可以被用來作為此處所描述的方法來抑制血管形成的試劑?！胺戳x”核酸包括一個核苷酸序列，這個序列與編碼陽性血管發(fā)生因子例如VEGF的“有義”核酸互補，例如與一個雙鏈cDNA分子的編碼鏈互補或者與一個mRNA序列互補。因此，反義核酸可以與有義核酸形成氫鍵。反義核酸能夠與一條完全的VEGF編碼鏈互補或者與它的一部分互補。例如，可以使用對那些編碼VEGF的核苷酸序列其中的編碼鏈中“編碼域”起反義作用的反義核酸分子。
目前已經(jīng)知道編碼VEGF的編碼鏈序列。在給定編碼VEGF的編碼鏈序列的情況下，可以根據(jù)Watson-Crick堿基配對原則設(shè)計反義核酸。反義核酸分子可以與VEGF mRNA中的全部編碼域互補配對，但是最好是選擇只對VEGF mRNA編碼域或者非編碼域的一部分起反義作用的寡核苷酸。例如，反義寡核苷酸可以互補那些圍繞VEGF mRNA翻譯起始部位的區(qū)域。一個反義寡核苷酸例如在長度上可以大約有5，10，15，20，25，30，35，40，45，50個核苷酸。在現(xiàn)有技術(shù)下，可用進行化學(xué)合成和酶結(jié)合反應(yīng)以構(gòu)建一個反義核酸。例如，可以化學(xué)合成一個反義核酸(例如，一個反義寡核苷酸)，使用自然的存在的核苷酸或者那些目標在于增強分子的生物穩(wěn)定性以及增強反義和有義核酸分子之間形成的雙鏈的物理穩(wěn)定性的各種修飾的核苷酸，例如，使用硫代磷酸鹽(phosphorothioate)衍生物和吖啶取代核苷酸?？梢杂脕硇纬煞戳x核酸的修飾核苷酸的例子包括5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，次黃嘌呤，黃嘌呤，4-乙酰胞嘧啶，5-(羧基羥基甲基)尿嘧啶，5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷，5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶，二氫尿嘧啶，β-D-galactosyl queosine，次黃苷，N6-異戊烯腺嘌呤，1-甲基鳥嘌呤，1-甲基次黃苷，2，2-二甲基鳥嘌呤，2-甲基腺嘌呤，2-甲基鳥嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N6-腺嘌呤，7-甲基鳥嘌呤，5-甲基氨基甲基尿嘧啶，5-甲氧氨基甲基-2-巰基脲嘧啶，β-D-甘露糖基queosine，5′-甲氧基羧甲基尿嘧啶，5-甲氧尿嘧啶，2-甲硫基-N6-異戊烯腺嘌呤，尿嘧啶-5-氧乙酸(v)，wybutoxosine，假尿嘧啶，queosine，2-巰基胞嘧啶，5-甲基-2-硫脲嘧啶，2-硫脲嘧啶，4-硫脲嘧啶，5-甲基尿嘧啶，尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯，尿嘧啶-5-氧乙酸(v)，5-甲基-2-硫脲嘧啶，3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶，(acp3)w，2，6-二氨基嘌呤。還有其它的方法，我們可以使用一種表達載體來生物合成反義核酸，在這種表達載體里面核酸已經(jīng)以反義方向被亞克隆(即，從插入核酸轉(zhuǎn)錄而得到的RNA將會是靶核酸的反義定向)。
RNAi能夠沉默基因的雙鏈核酸分子同樣也可以被作為抑制IR信號途徑部分表達的一種試劑，這個被沉默的基因可以編碼這里所描述的IR信導(dǎo)途徑的成分，例如這里所描述的一個成分。RNA干擾(interference)(RNAi)是部分植物在轉(zhuǎn)錄后發(fā)生基因沉默(gene silencing)的一種機制，在這個過程中對應(yīng)目的基因(或者編碼區(qū))的雙鏈RNA(dsRNA)被導(dǎo)入到細胞或者生物體里面，結(jié)果導(dǎo)致相應(yīng)mRNA的降解。在恢復(fù)基因表達之前，RNAi作用對多細胞分裂起著持續(xù)的作用。因此，RNAi在RNA水平形成靶敲除或“敲下(knockdouns)”是一種特別強的方法。RNAi已經(jīng)在人類細胞上得到成功的證明，包括人胚胎腎和海拉細胞(例如Elbashir et al.Nature 2001 May 24；411(6836)494-8)。在一個具體實施方案里，在哺乳細胞可以通過增強RNA發(fā)夾(hairpins)的內(nèi)源表達來誘導(dǎo)基因沉默。(見Paddison et al.，2002，PNASUSA 991443-1448)。在另一個具體實施方案里，轉(zhuǎn)染小(21-23nt)dsRNA來專門抑制基因表達(綜述Caplen(2002)Trends in Biotechnology 2049-51)。
簡單的說，RNAi被認為是按照如下過程起作用的。對應(yīng)將要被沉默基因的一部分的dsRNA被導(dǎo)入到細胞。消化dsRNA到21-23個核苷酸siRNAs，或者短干擾(interfering)雙鏈RNA分子。然后，siRNA雙鏈結(jié)合一個核酶復(fù)合物從而形成所謂RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物或者RISC。RISC通過同源mRNA和siRNA鏈之間的堿基配對靶向到同源轉(zhuǎn)錄體上，并在距離siRNA 3′端12個堿基的位置切割mRNA。(綜述見Sharp et al(2001)Genes Dev 15485490；and Hammond et al.(2001)Nature Rev Gen 2110-119)基因沉默RNAi技術(shù)使用標準分子生物學(xué)方法。通過標準方法可以形成那些對應(yīng)于要失活的靶基因序列的dsRNA。例如，通過用T7核糖核酸聚合酶同時轉(zhuǎn)錄模板DNA(對應(yīng)靶序列)雙鏈。在商業(yè)上可以獲得在RNAi中所使用的產(chǎn)生dsRNA的試劑盒，例如，來自New England Biolabs公司。轉(zhuǎn)染dsRNA或者轉(zhuǎn)染那些工程化形成dsRNA的質(zhì)粒的方法在現(xiàn)有技術(shù)上都是比較常規(guī)的方法。
據(jù)報道，通過在哺乳細胞上轉(zhuǎn)染mRNA-cDNA雜種構(gòu)建物，證明基因沉默效應(yīng)與那些RNAi效應(yīng)類似，(Lin et al.，Biochem Biophys Res Commun2001 Mar 2；281(3)639-44)，他們提供了基因沉默的其它策略。
給予方式調(diào)節(jié)血管發(fā)生的制劑比如血管發(fā)生抑制劑，例如，TSP-1或者TSP-2，或者調(diào)節(jié)TSP-1或者TSP-2的制劑都可以通過標準的方法給予受試者。例如，可以從各種不同的給予途徑里面選擇任何一種進行，包括靜脈內(nèi)，真皮內(nèi)，皮下，口服(例如，吸入)，透皮(局部)和粘膜給藥。在一個具體實施方案里，可以局部給藥TSP-1或者TSP-2或者它的調(diào)節(jié)劑。
調(diào)節(jié)TSP-1或者TSP-2蛋白水平試劑，例如，TSP-1或者TSP-2核酸分子，TSP-1或者TSP-2多肽，片段或者類似物，TSP-1或者TSP-2調(diào)節(jié)劑，和抗-TSP-1或者抗-TSP-2抗體(這里也指活性化合物)，這些都可以并到藥物組合物中使之易于對象例如人的給藥。這些典型的組合物成分包括核酸分子，多肽，調(diào)節(jié)劑，或者抗體，和藥用合適的載體。這里使用詞語“藥用合適的載體”意圖在于包括任何所有的溶劑，分散試劑，包衣，抗細菌劑和抗真菌劑，等滲和吸收延遲劑等與給藥相容的其它類似的制劑。目前已經(jīng)知道藥物活性物質(zhì)的這些試劑和制劑的使用方法。除了那些與活性化合物不相容的一些普通的試劑或者制劑的范圍，在組成成分的發(fā)明中可以使用這些試劑。補充的活性成分也可以并到合成中。
通過與目的給藥途徑相適應(yīng)可以配制藥物組合物。非腸道給藥可以使用溶液或者混懸液，真皮內(nèi)或者皮下應(yīng)用包括以下成分無菌稀釋劑例如注射用水，生理鹽水，固定油類，聚乙二醇，甘油，丙二醇或者其它的合成溶劑；抗菌劑例如苯甲醇或者尼泊金甲酯；抗氧化劑例如抗壞血酸或者亞硫酸氫鈉；螯合劑例如乙二胺四乙酸；緩沖液例如醋酸鹽，檸檬酸鹽，或者磷酸鹽緩沖液，以及調(diào)節(jié)滲透壓的試劑例如氯化鈉或者葡萄糖?？梢杂盟峄蛘邏A來調(diào)節(jié)pH，例如鹽酸或者氫氧化鈉。非腸道制劑可以附上安瓿，一次性注射器或者由玻璃或塑料制成的多劑量小藥水瓶。
適合注射的藥物組合物包括無菌水溶液(溶于水)或者分散體，和臨用制劑的無菌注射溶液或者分散體的無菌粉末。對靜脈給藥，合適的載體包括生理鹽水，消毒水，Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，NJ)或者磷酸鹽緩沖液(PBS)?？傊?，所有成分都必須無菌并且應(yīng)該具備一定的流動性使之可以很容易的在注射器里面存在。在制備和貯存的條件下必須穩(wěn)定而且必須一直保持著防止像細菌和真菌這些微生物的污染。載體可以是一種溶劑或者分散試劑包括例如，水，乙醇，多元醇(例如甘油，丙二醇，液體聚乙二醇等等)，和與它相配的混合物。例如使用包衣例如卵磷脂，至于分散體通過保持所需的粒徑和通過使用表面活性劑，保持適當?shù)牧鲃有?。通過使用各種抗細菌劑和抗真菌劑可以防止微生物的生長，例如，尼泊金，氯代丁醇，苯酚，抗壞血酸，硫柳汞等等。許多情況下，在成分上將會優(yōu)先選擇物質(zhì)包括等滲劑例如糖，多元醇例如甘露醇，山梨醇，氯化鈉。通過在處方上加入那些可以延遲吸收的物質(zhì)例如單硬脂酸鋁和凝膠，引起注射成分的延長吸收。
通過把所需量的活性化合物(例如TSP-1或者TSP-2多肽)加到一個合適的溶劑中，按照需要可以單用或者合用剛才列舉的成分，然后過濾滅菌，這樣就可以制備無菌注射溶液了。通常，分散體的制備是通過把活性化合物加到無菌容器上，這個無菌容器含有一個基本的分散試劑和剛才列舉的那些所需的成分。至于制備無菌注射溶液的無菌粉末，首選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，由這些方法可以得到活性成分的粉末并且還可以得到從它的以前的無菌過濾中的其它的想要的成分。
口服制劑通常包括一種惰性稀釋劑或者可食用載體。它們可以附著在凝膠囊里或者被壓成片劑。為了口服處理給藥，活性化合物可以加到敷料中然后以片劑，藥片或者膠囊的形式使用?？诜苿┮部梢允褂昧鲃虞d體來制備，流動載體作為含漱劑使用，在流動載體里面的化合物以口服的形式應(yīng)用，swished，吐出或者吞咽下去。藥物粘合劑或者敷料可以作為制劑的一部分。片劑，丸劑，膠凝，藥片等等可以含有以下成分或者類似性質(zhì)化合物中的任何一種粘合劑例如微晶纖維素，黃蓍樹膠或者明膠；敷料例如淀粉或者乳糖，崩解劑例如海藻酸，Primogel，或者玉米淀粉；滑潤劑例如硬脂酸鎂或者Sterotes；助流劑例如膠體二氧化硅；甜味劑例如蔗糖或者糖精；或者調(diào)味劑例如薄荷，水楊酸甲酯，或者橙調(diào)味劑。
也可以通過粘膜或者透皮的方式進行全身給藥。對于粘膜或者透皮給藥，在處方中使用適合穿透屏障的滲透激動劑。已知的這些滲透激動劑通常包括例如對于粘膜給藥，洗滌劑，膽鹽和夫西地酸衍生物?？梢酝ㄟ^鼻腔噴霧或者栓劑實現(xiàn)粘膜給藥。對于透皮給藥，活性化合物加入到軟膏，油膏，凝膠或者乳膏以及目前現(xiàn)有技術(shù)普遍的處方里。這些透皮處方可以應(yīng)用到皮膚上來促進或者抑制毛發(fā)生長。
在一個具體的實施方案里，活性化合物以載體的形式制備，這種載體可以保護化合物防止在體內(nèi)快速消除，例如控釋處方，包括植入劑和微囊給藥系統(tǒng)?？梢允褂蒙锟山到獾暮蜕锵嗳菪缘母叻肿硬牧侠缫蚁┐姿嵋蚁ィ鬯狒?，聚乙醇酸，膠原，聚正酯和聚乳酸。制備這些制劑的方法與那些已經(jīng)成熟的方法類似。也可以從商業(yè)公司得到一些材料例如Alza公司和NovaPharmaceuticals公司。脂質(zhì)體混懸液(包括利用連接單克隆抗體針對病毒抗原的原理靶向感染細胞的脂質(zhì)體)。脂質(zhì)體混懸液也可以作為藥劑可接受的載體。這些制劑都可以根據(jù)目前已經(jīng)成熟的技術(shù)來制備，例如在U.S.PatentNo.4,522,811中描述的方法。
這里所描述的核酸分子可以插入到載體中并且作為基因處理的載體?？梢酝ㄟ^例如靜脈注射，局部給藥(見U.S.Patent 5,328,470)或者立體定位注射(見Chen et al.，PNAS 913054-3057，1994)這些方法對受試者給基因處理載體。基因處理載體的制備包括基因處理載體在合適的稀釋劑里面，或者包括緩釋基質(zhì)在這個緩釋基質(zhì)里面包埋基因處理載體。另外的方法，只要完整的基因給藥載體例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以從重組細胞原封不動的得到，制劑制備就可以包括一個或者多個能夠產(chǎn)生基因轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的細胞。
藥物組合物可以裝在一個容器，包，或者帶有給藥方式說明的分樣器里面。
調(diào)節(jié)血管發(fā)生劑例如TSP-1，TSP-2，多肽，片段或者類似物可以進行局部性的給藥，例如局部給藥。這種制劑可以一次性給藥或者連續(xù)給藥，例如制劑分足夠多次給藥使得TSP-1或者TSP-2蛋白水平在選擇的時間段內(nèi)一直保持藥效，選擇的時間段例如5，10，20，30，50，90，180，365天或者更長。調(diào)節(jié)例如增加或者抑制TSP-1或者TSP-2蛋白水平，例如TSP-1或者TSP-2多肽水平或者它的片段以及類似物的制劑可以重復(fù)給藥。
基因處理本發(fā)明的基因構(gòu)建物也可以作為基因處理內(nèi)容的一部分來載運核酸。這些核酸可以編碼正的或者負(negative)的血管發(fā)生因子例如血管發(fā)生抑制劑，例如TSP-1或者TSP-2多肽或者它的片段以及類似物。本發(fā)明的特點在于體內(nèi)轉(zhuǎn)染的表達載體和TSP-1或者TSP-2多肽在特定細胞類型例如表皮細胞里面的表達，從而在例如表皮抑制血管發(fā)生。TSP-1或者TSP-2多肽的表達構(gòu)造體可能需要給到任何具有生物有效性的載體上，例如能夠在體內(nèi)有效載運TSP-1或者TSP-2基因到體內(nèi)細胞的任何處方或者成分。方法包括把受試者基因插入到病毒載體里，病毒載體包括重組逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒，腺伴隨病毒(adeno-associated virus)，單純皰疹病毒-1，或者重組細菌以及真核質(zhì)粒。病毒載體直接轉(zhuǎn)染細胞；質(zhì)粒DNA可以在例如陽離子脂質(zhì)體(lipofectin)或者其衍生物(例如偶合抗體)，聚賴氨酸偶合物，短桿菌肽S6，人造病毒包膜，或者其它的像這樣的細胞內(nèi)載體的幫助下轉(zhuǎn)運，而且還可以把基因構(gòu)造體或者CaPO4沉淀物在體內(nèi)直接注射來實現(xiàn)。
體內(nèi)把核酸導(dǎo)入到細胞的優(yōu)選方法是使用含有核酸例如cDNA的病毒載體，這種cDNA可以編碼TSP-1或者TSP-2多肽以及VEGF反義核酸。使用病毒載體轉(zhuǎn)染細胞有一個優(yōu)點就是很大比例的靶細胞可以接收到核酸。而且，在病毒載體例如含有cDNA的病毒載體里面，編碼的分子可以在那些已經(jīng)占據(jù)了病毒載體核酸的細胞內(nèi)有效的表達。
逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和腺伴隨病毒載體可以作為外源基因轉(zhuǎn)運到體內(nèi)的重組基因給藥系統(tǒng)，尤其對轉(zhuǎn)運到人身上。這些載體可以有效的把基因轉(zhuǎn)運到細胞并且已經(jīng)轉(zhuǎn)運的核酸可以穩(wěn)定的整合到宿主的染色體DNA上。那些僅僅能夠產(chǎn)生復(fù)制缺陷逆轉(zhuǎn)錄病毒的特殊細胞系(稱作“包裝細胞(packagingcell)”)的發(fā)展增強了逆轉(zhuǎn)錄病毒在基因處理方面的實用性。而且缺陷逆轉(zhuǎn)錄病毒以在基因處理為目的的基因轉(zhuǎn)移方面的使用為其特點。(綜述見Miller，A.D.(1990)Blood 76271)。缺陷逆轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制體可以被包到病毒顆粒里面，病毒顆粒通過使用標準技術(shù)聯(lián)合使用輔助病毒來傳染靶細胞。用這些病毒在體內(nèi)或者體外產(chǎn)生重組逆轉(zhuǎn)錄病毒和感染細胞的記錄可以在分子生物學(xué)現(xiàn)行記錄中找到。Ausubel，F(xiàn).M.et al.(eds.)Greene PublishingAssociates，(1989)，Sections 9.10-9.14和其它的標準實驗手冊。合適的逆轉(zhuǎn)錄病毒的例子包括pLJ，pZIP，pWE和pEM，這些已經(jīng)有成熟的現(xiàn)有技術(shù)。用來制備同向性(ecotropic)和兩向性(amphotropic)逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)的合適包裝病毒系包括ψcrip，ψCre，ψ2和ψAm。逆轉(zhuǎn)錄病毒已經(jīng)被用來在體內(nèi)或者體外把各種基因?qū)朐S多不同細胞類型包括上皮細胞。(見例子Eglitis，etal.(1985)Science 2301395-1398；Danos and Mulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 856460-6464；Wilson et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 853014-3018；Armentano et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 876141-6145；Huber et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 888039-8043；Ferry et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 888377-8381；Chowdhury et al.(1991)Science 2541802-1805；van Beusechem et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 897640-7644；Kay et al.(1992)Human Gene Therapy 3641-647；Dai et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910892-10895；Hwu et al.(1993)J.Immunol.1504104-4115；U.S.Patent No.4,868,116；U.S.Patent No.4,980,286；PCT Application WO 89/07136；PCT Application WO 89/02468；PCT Application WO 89/05345；and PCT Application WO 92/07573).
本發(fā)明中有用途的另一種病毒基因轉(zhuǎn)運系統(tǒng)利用了源自腺病毒載體。操縱腺病毒基因組使它編碼并表達目的基因產(chǎn)物，但是當在正常的細胞溶解酵素病毒生存周期條件下它的復(fù)制能力失活。見，例如Berkner et al.(1988)BioTechniques 6616；Rosenfeld et al.(1991)Science 252431-434；andRosenfeld et al.(1992)Cell 68143-155。來自腺病毒毒株Ad 5 d1324型或者其它腺病毒毒株(例如Ad2，Ad3，Ad7等)的合適腺病毒載體已經(jīng)有成熟的技術(shù)。重組腺病毒在特定的情況下有優(yōu)勢，因為它們沒有能力感染非分化細胞所有可以被用來感染各種范圍的細胞類型，包括上皮細胞(Rosenfeld etal.(1992)，出處同上)。而且，病毒粒子相對比較穩(wěn)定，比較易于純化和濃縮，就像上述提到的可以加以修飾來影響侵染性光譜。除此之外，導(dǎo)入的腺病毒DNA(和其中含有的外源DNA)不會整合到宿主細胞的基因組里面而是保持游離狀態(tài)，因此可以避免那些由于在原位導(dǎo)入的DNA整合到宿主基因組(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA)發(fā)生插入誘變的潛在問題的發(fā)生。而且，腺病毒基因組對外源DNA的攜帶容量相對其它的基因轉(zhuǎn)運載體來說很大(可達8千堿基對)(Berkner et al.出處同上；Haj-Ahmand and Graham(1986)J.Virol.57267)。
然而另外一種有用的轉(zhuǎn)運目的基因的病毒載體系統(tǒng)是腺伴隨病毒(AAV)。腺伴隨病毒是一種天然存在的有缺陷病毒，它需要其它的病毒例如腺病毒或者皰疹病毒來作為進行有效復(fù)制和有長生命周期的輔助病毒。(綜述見Muzyczka et al.(1992) Curr.Topics in Micro.and Immunol.15897-129)。腺伴隨病毒也是能夠把它的DNA整合到非分裂細胞和顯示穩(wěn)定整合的高頻率的幾種病毒之一。(見例子Flotte et al.(1992)Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.7349-356；Samulski et al.(1989)J.Virol.633822-3828；andMcLaughlin et al.(1989)J.Virol.621963-1973)。僅僅含有少到300個堿基的AAV的載體可以被包裝然后整合。外源DNA的空間局限在大約4.5千堿基對。就像在Tratschin et al.(1985)Mol.Cell.Biol.53251-3260描述的，AAV載體可以用來把DNA導(dǎo)入到細胞。使用AAV載體已經(jīng)把各種各樣的核酸導(dǎo)入到不同的細胞類型(見例子Hermonat et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 816466-6470；Tratschin et al.(1985)Mol.Cell.Biol.42072-2081；Wondisford et al.(1988)Mol.Endocrinol.232-39；Tratschin et al.(1984)J.Virol.51611-619；and Flotte et al.(1993)J.Biol.Chem.2683781-3790)除了病毒轉(zhuǎn)運方法，例如上面說闡述的那些，也可以使用非病毒方法在動物組織內(nèi)引起TSP-1或者TSP-2多肽，片段以及類似物的表達?；蜣D(zhuǎn)運的大多數(shù)非病毒方法都是根據(jù)哺乳動物細胞攝取大分子和在胞內(nèi)運輸大分子的正常機制。在首選的具體方案中，本發(fā)明的非病毒基因轉(zhuǎn)運系統(tǒng)是根據(jù)靶細胞攝取目的TSP-1或者TSP-2基因的胞內(nèi)途徑。這種類型的基因轉(zhuǎn)運例子包括來自脂質(zhì)體系統(tǒng)，聚賴氨酸偶合物(cenjugate)和人造病毒包膜。其它的具體形式包括質(zhì)粒注射系統(tǒng)就像Meuli等提到的，Meuli etal.(2001)JInvest Dermatol.116(1)131-135；Cohen et al.(2000)Gene Ther 7(22)1896905；or Tam et al.(2000)Gene Ther 7(21)1867-74在一個有代表性的實施方案中，編碼TSP-1或者TSP-2多肽，活性片段或者類似物的基因可以被包入到表面有陽性電荷的脂質(zhì)體上(例如lipofectins)并且(任選地)這些脂質(zhì)體有針對靶組織的細胞表面抗原抗體標記(Mizuno et al.(1992)No Shinkei Gek(i 20547551；PCT publicationWO91/06309；Japanese patent application 1047381；and European patentpublication EP-A-43075)在臨床上，通過許多方法中的任何一種，這些方法之間在現(xiàn)有技術(shù)上都很接近，對于處理性的TSP-1或者TSP-2基因的基因轉(zhuǎn)運系統(tǒng)可以引入到受試者身上。例如，可以通過例如通過靜脈注射把基因轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的藥物制劑系統(tǒng)性的導(dǎo)入。倘若是基因轉(zhuǎn)運媒介，細胞類型，或者由于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列控制受體表達的組織類型表達，或者這幾種都有，靶細胞內(nèi)蛋白的特殊轉(zhuǎn)導(dǎo)的發(fā)生主要來自轉(zhuǎn)染的特異性。在其它的實施方案中，重組基因的初期轉(zhuǎn)運主要限制在在一個地方(being quite localized)導(dǎo)入到動物。例如，可以使用導(dǎo)管導(dǎo)入基因轉(zhuǎn)運載體(見U.S.Patent 5,328,470)或者通過立體定位注射(stereotactic injection)(例如Chen et al.(1994)PNAS 913054-3057)基因處理構(gòu)建的藥物制劑基本上包括基因轉(zhuǎn)運系統(tǒng)在合適的稀釋劑里面，或者制劑包括一種緩釋基質(zhì)，在這個緩釋基質(zhì)里面包埋基因轉(zhuǎn)運載體。另外的方法，只要完整的基因轉(zhuǎn)運系統(tǒng)例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以原封不動的從重組細胞得到，制劑制備就可以包括一個或者多個能夠產(chǎn)生基因轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的細胞。
細胞處理也可以在受試者上，通過導(dǎo)入到細胞增加TSP-1或者TSP-2例如表皮細胞，例如角化細胞，可導(dǎo)入調(diào)節(jié)產(chǎn)生TSP-1或者TSP-2的核苷酸序列例如編碼TSP-1或者TSP-2多肽或者功能片段或者其類似物的核苷酸序列；啟動子序列例如來自TSP-1或者TSP-2基因或者其它基因的啟動子序列；增強子序列例如5′不翻譯區(qū)(UTR)，例如來自TSP-1或者TSP-2基因或者其它基因的5′UTR，例如來自TSP-1或者TSP-2基因或者其它基因的3′UTR；聚腺苷?；饔梦稽c；絕緣序列(insulator sequence)；或者另外的調(diào)節(jié)TSP-1或者TSP-2表達的序列。然后把細胞導(dǎo)入到受試者中。
將要用作基因工程的原代和傳代細胞可以從各種組織中得到，這些細胞包括那些在培養(yǎng)過程中能夠保持繁殖的細胞類型。例如，原代(primary)和傳代(secondary)細胞包括成纖維細胞，角化細胞，上皮細胞(例如乳房上皮細胞，腸上皮細胞)，內(nèi)皮細胞，神經(jīng)膠質(zhì)細胞，神經(jīng)細胞，血液的形成元素(例如淋巴細胞，骨髓細胞)，肌細胞(成肌細胞)和這些體細胞類型的前體細胞。原代細胞最好是從那些給予基因工程的原代或者傳代細胞的個體獲得。然而，原代細胞可以從相同種或者不同種(例如，小鼠，大鼠，兔，貓，狗，豬，牛，鳥，綿羊，山羊，馬)的供體(不是接受者)獲得。
術(shù)語“原代細胞”包括從脊椎動物組織(它們被傳代之前即附著在組織培養(yǎng)基質(zhì)例如小盤或者燒杯)分離出來的細胞混懸液中出現(xiàn)的細胞，來自組織的在外植塊不僅包括那些首次傳代的以前的細胞類型還包括來自這些傳代細胞的細胞混懸液里面出現(xiàn)的細胞。術(shù)語“傳代細胞”或者″細胞株″指的是在培養(yǎng)過程后來所有步驟的細胞。也就是說，第一次的傳代的原代細胞從培養(yǎng)基質(zhì)中清除并且再次傳代(細胞傳代)，此處指的是傳代細胞，所有的細胞都進行后來的細胞傳代。傳代細胞是指含有傳代細胞的細胞株，它們已經(jīng)被傳代一次或者多次。一個細胞株包括這樣的傳代細胞，1)它已經(jīng)被傳代一次或者多次；2)它在培養(yǎng)中顯示有限數(shù)量的平均群體倍增數(shù)；3)顯示接觸抑制性質(zhì)和支抗依賴性生長(支抗依賴不適用那些經(jīng)懸浮培養(yǎng)繁殖的細胞)和4)是非永生的(anchorage)。定義(純系細胞株)為源自于一種生成細胞的細胞株。定義“異源性細胞株”為源自于一種或者多種生成細胞的細胞株。
脊椎動物尤其哺乳動物的原代和傳代細胞，它的起點可以用那些包括編碼信號肽或者異源核酸序列例如編碼TSP-1或者TSP-2外源核酸序列并且在長期時間內(nèi)體外體內(nèi)可以穩(wěn)定重復(fù)的產(chǎn)生編碼產(chǎn)物產(chǎn)生來轉(zhuǎn)染。一個異源氨基酸也可以作為調(diào)節(jié)序列例如啟動子，它可以誘導(dǎo)表達例如引起內(nèi)源TSP-1或者TSP-2序列的誘導(dǎo)性表達或者上調(diào)?？梢岳猛庠粗亟M把外源核酸序列導(dǎo)入到原代和傳代細胞，例如，U.S.PatentNo.5,641,670，其內(nèi)容在這里提供參考。
轉(zhuǎn)染的原代和傳代細胞可以包括DNA，這種DNA不僅編碼一種可選標記，這種標記在其上面有可選表型，而且促進它們的識別和分離。產(chǎn)生那些可以穩(wěn)定表達外源合成DNA，純系(clonal)細胞株和異源細胞的異源性細胞株的原代或傳代細胞的方法，產(chǎn)生純系的異源細胞株的方法和通過使用大量的轉(zhuǎn)染原代或傳代細胞來處理或者防止異常或者不良的情況的方法，這些方法都是本發(fā)明的部分內(nèi)容。
純系或者異源性細胞株中原代或者傳代細胞的轉(zhuǎn)染可以通過標準方法獲得脊椎動物組織，這些方法例如鉆取活組織檢查或者獲得原代細胞類型的組織的其它手術(shù)方法。例如，鉆取活組織檢查用來獲得的皮膚作為成纖維細胞或者角化細胞的來源。使用已知的方法例如酶消化或者外植，從組織獲得元代細胞的混合物。如果使用酶消化，可以使用的酶有例如膠原酶，透明質(zhì)酸酶，分散酶，鏈霉蛋白酶，胰蛋白酶，彈性蛋白酶，糜蛋白酶。
最后得到的原代細胞混合物可以直接轉(zhuǎn)染或者在轉(zhuǎn)染之前先培養(yǎng)，然后從培養(yǎng)皿中分離，最后再次混懸。原代或者傳代細胞與外源核酸序列接合例如穩(wěn)定的整合到它們的基因組，然后為了完成轉(zhuǎn)染進行處理。外源核酸序列可以任選包括編碼可選標記的DNA。外源核酸序列和可選標記編碼DNA可以在單獨的構(gòu)建物上或者同一個。使用合適量的DNA以確?？梢援a(chǎn)生含有至少一種穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細胞和適當?shù)谋磉_外源DNA?？傊?，大約使用0.1μg到500μgDNA。
在這里使用的，術(shù)語“轉(zhuǎn)染”包括把外源核酸導(dǎo)入到細胞的各種技術(shù)包括磷酸鈣或者氯化鈣沉淀，微注射，DEAE-糊精介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，lipofection或者電穿孔。
在適當?shù)碾妷汉碗娙?相當時間常數(shù))下進行電穿孔，結(jié)果使得DNA構(gòu)造物進入到原代或者傳代細胞?？梢栽谝粋€寬范圍電壓內(nèi)(例如50-2000伏特)和相應(yīng)電容下進行電穿孔。通常使用的全部DNA量大約是0.1μg到500μg。
磷酸鈣沉淀法，改性磷酸鈣沉淀法，多聚季胺(polybrene)沉淀法，脂質(zhì)體融合和受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)運這些方法都可以用來轉(zhuǎn)染細胞。也可以使用微注射來轉(zhuǎn)染原代或者傳代細胞一個穩(wěn)定的已轉(zhuǎn)染細胞然后被分離，培養(yǎng)，和亞培養(yǎng)，使它在培養(yǎng)條件下有充足的時間來繁殖穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染傳代細胞即轉(zhuǎn)染傳代細胞的純系細胞株。另外一個方法，不止一個轉(zhuǎn)染細胞被培養(yǎng)和亞培養(yǎng)，結(jié)果都產(chǎn)生異源性細胞株。
轉(zhuǎn)染的原代或者傳代細胞有足夠的成倍數(shù)量來產(chǎn)生足夠大的純系細胞株或者異源性細胞株以給個體提供有效量的處理蛋白?？傊?，例如，0.1平方厘米的皮膚進行活組織檢查認為含有一百萬個細胞；一個細胞被用來產(chǎn)生一個純系細胞株并且經(jīng)歷大約27次倍增來產(chǎn)生一億個轉(zhuǎn)染傳代細胞。如果從將近一百萬個細胞的初轉(zhuǎn)染總體來產(chǎn)生異源性細胞株，只需要10倍就可以產(chǎn)生一億個轉(zhuǎn)染細胞。
在轉(zhuǎn)染的純系異源性細胞株中所需的細胞數(shù)量是可變的，這個數(shù)量取決于各種因素包括轉(zhuǎn)染細胞的使用，轉(zhuǎn)染細胞中外源DNA的功能水平，轉(zhuǎn)染細胞的植入部位(例如，可以使用細胞的數(shù)量局限在植入的解剖部位)，和年齡，表面積，受試者的臨床情況，但是并不局限于這些。正確的安排這些因素來給予人生長激素處理水平，對于一個不健康的重10千克的孤立性生長激素缺乏癥的受試者，大約會需要5億分之一的轉(zhuǎn)染成纖維細胞(這些細胞的體積大約像受試者的拇指尖那么大)。
植入轉(zhuǎn)染傳代細胞的純系細胞株或者異源性細胞株轉(zhuǎn)染細胞例如本文描述所產(chǎn)生的細胞，可以導(dǎo)入到將要轉(zhuǎn)運產(chǎn)品的個體。純系細胞株或者異源性細胞株然后導(dǎo)入到個體?？梢允褂酶鞣N給藥途徑和各種部位(例如腎囊下(renal subcapsular)，皮下，中樞神經(jīng)系統(tǒng))(包括鞘內(nèi))，血管內(nèi)，肝內(nèi)，內(nèi)臟內(nèi)，腹膜內(nèi)(包括網(wǎng)膜內(nèi))，肌肉內(nèi)，植入)。在個體內(nèi)植入一個轉(zhuǎn)染細胞，轉(zhuǎn)染細胞產(chǎn)生由異源DNA編碼的產(chǎn)物或者轉(zhuǎn)染細胞受異源DNA本身的影響。例如，遭受掉頭發(fā)的個體是植入產(chǎn)生TSP-1或者TSP-2細胞的候選。
可以在個體做一小片皮膚活組織檢查；這是一個可以在門診受試者上實現(xiàn)的簡單的操作。例如從臂下取出一片皮膚然后需要大約一分鐘，處理樣品，最后導(dǎo)致受試者細胞(例如成纖維細胞)的分離，然后利用基因工程原理來產(chǎn)生TSP-1或者TSP-2或者其它蛋白或者那些可以誘導(dǎo)產(chǎn)生TSP-1或者TSP-2的分子。根據(jù)受試者的年齡，體重和臨床狀態(tài)，所需數(shù)量的細胞進行大量培養(yǎng)。全部過程應(yīng)該需要4-6周，在最后的時候，適當量的基因工程細胞導(dǎo)入到個體，一次給門診受試者(例如通過在受試者的皮膚下注射到它們的背部，例如在頭皮或者臉部)。受試者目前就會具有產(chǎn)生可以防止或者減少皺紋的TSP-1或者TSP-2的能力。
對一些人，這種方法會是一次性的處理，對其它人，需要多次細胞處理處理。
就像這個例子暗示的，使用的細胞通常會是受試者特異性的基因工程細胞。然而，也可以從相同種的其它個體或者從不同種來獲得細胞。使用這些細胞可能需要服用抑制免疫力的藥，另外可以選擇抗原組織相容性，或者使用一種屏障設(shè)備來防止植入細胞的排斥作用。
轉(zhuǎn)染原代或者傳代細胞可以單獨給藥或者聯(lián)合一種屏障以及給接受者抑制細胞免疫應(yīng)答劑。例如，可以給對象免疫抑制劑來抑制或者防礙對象的正常反應(yīng)。首選，免疫抑制劑是可以抑制對象的T細胞或者B細胞的活性的一種抑制免疫力的藥物。這些抑制免疫力的藥物可以從商業(yè)上獲得(例如A Sandoz Corp.East Hanover，NJ生產(chǎn)的環(huán)孢菌素)。
一種免疫抑制劑例如藥物可以使對象產(chǎn)生足夠期望處理效果(例如，抑制細胞排斥反應(yīng))的劑量?，F(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)知道抑制免疫力藥物的劑量范圍。見，例如Freed et al.(1992)N.Engl.J.Med.3271549；Spencer et al.(1992)N.Engl.J.Med.3271541′Widner et al.(1992)n.Engl.J.Mecl.3271556)。劑量具體值可能根據(jù)一些因素例如個體的疾病狀態(tài)，年齡，性別和體重的變化而變化。
另外一種可以被用來抑制受試者T細胞活性的物質(zhì)可以是一種抗體或者它的衍生物片段?，F(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)知道抗體具有在體內(nèi)耗盡或者退隱(sequestering)T細胞的能力。可以使用多克隆抗血清例如抗淋巴細胞血清。另外的方法，可以使用一個或者更多的單克隆抗體。優(yōu)選的耗盡T細胞的抗體包括可以與細胞表面CD2，CD3，CD4，CD8，CD40，CD40配體結(jié)合的單克隆抗體?，F(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)知道這些抗體并且商業(yè)上可獲得，例如美國模式培養(yǎng)物保藏所。結(jié)合人類T細胞的CD3的首先抗體是OKT3(ATCC CRL8001)。
可以在適當?shù)臅r間給予那些在接收對象身上可以耗盡，退隱或者抑制T細胞的抗體一個劑量來抑制移植后細胞的排斥反應(yīng)?？贵w的給藥方式首選那些可以靜脈給藥的藥物適當?shù)南♂寗?例如生理鹽水)載體。
干擾或者抑制接受對象細胞免疫應(yīng)答的另外一個方法就是使用免疫障礙物。此處使用的“免疫障礙物”指的是一種設(shè)備，它可以在受試者的所給細胞和涉及免疫應(yīng)答的細胞之間充當一個屏障。例如，細胞可以以一種植入設(shè)備的方式給。可植入設(shè)備含有的細胞在一種半透性屏障里面，就是這樣一種屏障，它可以允許養(yǎng)分和其產(chǎn)物進出屏障，但是阻止大免疫系統(tǒng)成分例如抗體或者補體的進入。典型的植入設(shè)備包括基質(zhì)例如水凝膠，生物相容性網(wǎng)織品(mesh)，以及放置細胞的核部位。隨意地，一種半透性包衣可以包裹凝膠。如果所給細胞被放置在凝膠芯里面，所給細胞應(yīng)該與免疫系統(tǒng)的細胞進行分離而且應(yīng)該與宿主的細胞和細胞毒抗體隔離。首選的方法是，使用一種滲透選擇性包衣例如PLL或者PLO。包衣通常有空隙率，這樣可以阻止接收對象免疫系統(tǒng)成分的進入并阻止這些成分破壞植入設(shè)備里面的細胞。
現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)知道包囊細胞的許多方法。例如，使用一種水溶性樹膠來獲得半透性水不溶凝膠來包囊細胞細胞，其它包囊方法見U.S.patentNo4,352,883。其它可以使用的植入設(shè)備見U.S.Patent No.5,084,350，U.S.Patent No.5,427.935，WO 95/19743 published July 27，1995，U.S.Patent No.5,545,423，U.S.Patent Number 4,409,331，U.S.Patent Number 4,663,286，andEuropean Patent No.301,777。
使用轉(zhuǎn)染細胞或者傳代細胞的一個優(yōu)勢在于，通過控制導(dǎo)入個體的細胞數(shù)量，可以控制轉(zhuǎn)運到體內(nèi)的蛋白量。而且，有些情況，使移去那些不再需要產(chǎn)生產(chǎn)物的轉(zhuǎn)染細胞成為可能。本發(fā)明使用轉(zhuǎn)染原代或者傳代細胞來處理的另外的優(yōu)勢在于，通過例如給予鋅，類固醇，或者可以影響蛋白，產(chǎn)物或者核酸產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄的物質(zhì)，或者影響核酸產(chǎn)物穩(wěn)定性的物質(zhì)，可以調(diào)節(jié)處理產(chǎn)物的產(chǎn)生，實施例實例1長期UVB照射后增強皮膚血管發(fā)生UVB照射(累積劑量5.65J/cm2)10周后，從雙份小鼠經(jīng)過UVB照射和沒有UVB照射的皮膚背部取出復(fù)制物，以評價皮膚表面起伏(relief)，作為皮膚損傷程度參數(shù)。在經(jīng)UVB照射的小鼠上可觀察到明顯的皺紋形成，而在沒有UVB照射的對照小鼠上沒有發(fā)現(xiàn)可見的皺紋。肉眼觀察皮膚下面證明，在UVB照射小鼠皮下血管發(fā)生增加并伴有增大血管和血管分枝增加。
組織學(xué)分析表明UVB處理的小鼠其表皮，真皮和脂肪腺(36)增厚，并且在真皮上層伴有炎癥細胞的積累。而且，與沒有照射的對照皮膚上觀察到的纖維的整齊性相比，我們在UVB照射皮膚上發(fā)現(xiàn)了碎裂的和不完整的膠原蛋白纖維以及彈性纖維。與沒有處理的對照組相比，CD31免疫染色揭示了，在UVB照射小鼠的真皮內(nèi)增大的血管的數(shù)量增加。這些變化在真皮乳頭，緊接表皮下面的區(qū)域，最為顯著。對增生標記物Ki67和內(nèi)皮接合分子CD31的鑒別性的螢光免疫染色檢驗顯示，在UVB照射皮膚，增大的血管內(nèi)的增生內(nèi)皮細胞的數(shù)量增加了很多，但是，在對照皮膚，很少觀察到增生內(nèi)皮細胞。在UVB照射皮膚的上層真皮內(nèi)觀察到內(nèi)皮細胞的最高增生速率。在沒有照射的表皮內(nèi)，在基底層有選擇性的發(fā)現(xiàn)增生表皮角化細胞。相反，絕大多數(shù)的增生角化細胞是在UVB照射后增生表皮層的基部上層發(fā)現(xiàn)的。
定量計算機-輔助形態(tài)測定分析皮膚血管密度和大小的技術(shù)可以利用CD31染色組織切片。與沒有照射的對照組相比，長期照射UVB導(dǎo)致血管密度有顯著性(p＜0.001)增長。UVB照射皮膚里面的血管顯著的(p＜0.001)有67％的增大，這導(dǎo)致血管覆蓋的皮膚面積有130％以上的增加(p＜0.001)。
實例2長期UVB照射后表皮VEGF的表達增強。
考察了長期UVB照射對皮膚的VEGF mRNA表達的影響。使用原位雜交技術(shù)，發(fā)現(xiàn)長期UVB照射后在底部上層的表皮角化細胞里VEGF mRNA的表達得到有效的上調(diào)，但是，在沒有UVB照射的小鼠皮膚里很少，幾乎沒有發(fā)現(xiàn)VEGF mRNA的表達。
實例3TSP-1的過表達防止UVB引起的皮膚損傷，皺紋形成和血管發(fā)生。
為了表征皮膚血管發(fā)生對于長期UVB照射影響的生物學(xué)重要性，使具有皮膚特異性的內(nèi)源血管發(fā)生抑制劑TSP-1過表達的轉(zhuǎn)基因小鼠經(jīng)歷同樣的UVB照射方案。這些小鼠以前曾經(jīng)有詳細的特征并且顯示可以有效的抑制誘導(dǎo)的血管發(fā)生(24)。UVB照射(UVB累積劑量是6.52J/cm2)10周后，所有野生型的小鼠在它們的背部皮膚顯示明顯的皺紋形成。相反，在TSP-1過表達的轉(zhuǎn)基因小鼠上很少發(fā)現(xiàn)幾乎沒有皺紋形成。肉眼觀察，與野生型的同窩出生仔畜相比，K14/TSP-1轉(zhuǎn)基因小鼠同樣顯示減少的皮膚血管發(fā)生。
組織學(xué)分析表明，UVB誘導(dǎo)真皮和皮下組織增厚不是表皮增厚，與野生型小鼠相比，K14/TSP-1轉(zhuǎn)基因小鼠增厚的較少。與野生型小鼠相比，在K14/TSP-1轉(zhuǎn)基因小鼠的真皮內(nèi)發(fā)現(xiàn)伴隨有較少的炎癥細胞浸潤和膠原纖維的更加有規(guī)則的排列和結(jié)構(gòu)。而且，K14/TSP-1轉(zhuǎn)基因小鼠的皮膚血管減少了很多。CD31染色皮膚部分的形態(tài)測定分析顯示，TSP-1轉(zhuǎn)基因小鼠的血管大小降低達55％以上(p＜0.001)而且被血管覆蓋的皮膚面積有顯著的下降(p＜0.001)。在TSP-1轉(zhuǎn)基因小鼠上沒有發(fā)現(xiàn)血管密度的顯著下降。與UVB照射的野生型同窩出生仔畜相比，CD31和Ki-67的雙重免疫熒光染色證實了，在UVB照射的TSP-1轉(zhuǎn)基因小鼠的真皮層內(nèi)，增生內(nèi)皮細胞的數(shù)量有顯著的下降。而且，TUNEL檢測聯(lián)合CD31染色揭示了，與野生型同窩出生仔畜相比，TSP-1轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚內(nèi)凋亡的內(nèi)皮細胞的數(shù)量增加。
實例4TSP-1的過表達防止UVB誘導(dǎo)的MMP-9活化。
在調(diào)節(jié)UVB誘導(dǎo)的細胞外基質(zhì)成分的降解中一直涉及到基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)(35)，而且，最近研究表明，通過控制VEGF的生物利用度，MMP-9在血管發(fā)生過程中起著決定性的作用(37)。在野生型和TSP-1轉(zhuǎn)基因小鼠的背部皮膚給予單劑量UVB照射(126mJ/cm2)，然后通過凝膠酶譜測定皮膚裂解物中MMP-9的活性。對野生型小鼠進行單劑量UVB照射，24小時后結(jié)果發(fā)現(xiàn)皮下血管發(fā)生有顯著的增加。但是，在TSP-1轉(zhuǎn)基因小鼠血管發(fā)生不顯著。凝膠酶譜證明了，野生型和TSP-1轉(zhuǎn)基因小鼠正常皮膚里MMP-9的活性具有相同水平。UVB照射24小時后，然而，MMP-9的活性在野生型小鼠皮膚中顯著增強，但是在TSP-1轉(zhuǎn)基因小鼠下降。
實例5TSP-2基因敲除小鼠顯示增強皺紋的形成。
與野生型小鼠相比，TSP-2缺陷小鼠經(jīng)長期UVB照射(UVB累積劑量7.23J/cm2)顯示顯著的皺紋形成。與野生型同窩出生仔畜相比，慢性UVB照射后TSP-2缺陷小鼠出現(xiàn)增大的皮膚血管和增強的血管分支。
蘇木素-伊紅染色表明與野生型對照皮膚相比，長期UVB照射后TSP-2缺陷小鼠的皮膚中出現(xiàn)表皮和真皮增厚。三色染色證實與野生型小鼠相比，慢性UVB照射后TSP-2缺陷小鼠的乳頭真皮里面出現(xiàn)膠原蛋白纖維的不規(guī)則排列。CAE染色揭示與野生型小鼠相比，TSP-2缺陷小鼠出現(xiàn)炎癥細胞浸潤增強。
CD31免疫染色顯示與野生型同窩出生仔畜相比，慢性UVB照射后在TSP-2缺陷小鼠的真皮上層和全部皮膚(真皮和皮下組織)出現(xiàn)更多的而且增大的血管。CD31染色部分經(jīng)計算機-輔助圖像分析顯示與野生型同窩出生仔畜相比，慢性UVB照射后在TSP-2缺陷小鼠的全部皮膚里面血管大小和血管密度有顯著的增加。與整個皮膚血管發(fā)生相似，慢性UVB照射后在TSP-2缺陷小鼠的真皮上層，表皮-真皮的邊界100μm距離內(nèi)，發(fā)現(xiàn)血管發(fā)生顯著的增加。
CD31和BrdU的雙重免疫熒光染色顯示與野生型小鼠相比，在TSP-2缺陷小鼠皮膚的真皮上層和真皮下層，增生內(nèi)皮細胞(箭頭)的數(shù)量有顯著的增加。
VEGF原位雜交證明與那些含很少或者幾乎不含VEGF mRNA表達的野生型表皮相比，慢性UVB照射后，TSP-2缺陷小鼠在增生表皮的角化細胞基部上層出現(xiàn)增強的VEGF mRNA表達。
凝膠-酶譜顯示與沒有照射的野生型小鼠相比，UVB照射的野生型小鼠皮膚中出現(xiàn)強的誘導(dǎo)MMP-9活性。慢性UVB照射后，在TSP-2缺陷小鼠和野生型小鼠之間，MMP-9活性沒有主要的不同。
實例6方法和材料UVB照射方案在第一個實驗里，使用4個相同的有間隙的一排熒光燈(ElderPharmaceuticals，Bryan，OH)(25)，8周大的雌性無毛Skh-1小鼠(每組n＝7)暴露在UVB下進行照射。燈的高度調(diào)整到可以在小鼠背部皮膚表面?zhèn)魉?.35mW/cm2。小鼠用每周兩次(trice)的UVB照射10周，起始劑量是0.5最低紅斑(erythema)量(20mJ/cm2)，以后逐漸以0.5MED為增量增加直到最大劑量4.5MED(26)。UVB的總共累積劑量是5.62J/cm2。沒有觀察到急性陽光灼傷反應(yīng)。對照小鼠進行假照射。在另外一個實驗，8周大的雌性K14/TSP-1轉(zhuǎn)基因小鼠(24)或者FVB野生型對照組(每組n＝7)按照上述的方法進行UVB照射總共12周(UVB累積劑量6.52J/cm2)。12周后，處死小鼠，然后使用(SILFLO；Flexico Developments Ltd，U.K.)(27)所描述的硅橡膠取出雙份皮膚。背部皮膚樣品可以在液氮中快速冰凍或者像(28)描述那樣固定在10％福爾馬林中。所有動物研究都經(jīng)過Massachusetts General HospitalSubcommittee on Research Animal Care的批準。
CD31的免疫組織化學(xué)和皮膚血管的計算機-輔助形態(tài)測定分析使用單克隆鼠抗-鼠CD31抗體(Pharmingen，San Diego，CA)，像(24)所描述的那樣在7μm冷凍切片上進行免疫組織化學(xué)染色。從5個UVB照射的小鼠和5個年齡匹配且沒有UVB照射的對照小鼠中取出有代表性的切片，然后使用Nikon E-600顯微鏡(Nikon；Melville，NY)進行分析。就像(24)描述的那樣，使用光點數(shù)碼相機(Diagnostic Instruments，Sterling Heights，MI)捕獲圖像，使用IP-LAB軟件(Scanalytics Inc，F(xiàn)airfax，VA)進行形態(tài)測定分析。在60倍放大的情況下觀察切片的三個不同區(qū)域，在真皮和在距離表皮-真皮連接處100urn面積范圍內(nèi)檢測每平方毫米血管的數(shù)量，血管平均大小和血管占有的相對面積。使用雙側(cè)單(two-sided anpaired)Student′s t-檢驗來分析微血管密度和血管大小的不同。除此之外，像(29)描述的那樣，從相同小鼠的皮膚中獲得石蠟切片并且進行常規(guī)的蘇木素-伊紅，Verhoeffs彈性和Weigert′s間苯二酚品紅染色。
增生和編程性細胞死亡測定為了分析內(nèi)皮細胞增生，在7pm冷凍切片上進行內(nèi)皮細胞標記物CD31和增生標記物Ki-67(30，31)的雙重免疫熒光染色，使用單克隆鼠抗-鼠CD31抗體和兔抗-Ki-67多克隆抗體(Novocastra Laboratories，Burlingame，CA)。連接FITC的抗—鼠IgG和連接Texas-Red的抗—兔IgG(JacksonImmunoResearch Laboratories，West Grove，PA)被用作次生抗體(32)。每個實驗小組可以從5只小鼠獲得有代表性的切片，然后使用Nikon E-600顯微鏡分析切片。從完全相同的區(qū)域獲得CD31和Ki-67染色的數(shù)字圖像并且結(jié)合起來顯示增生內(nèi)皮細胞。像(24)描述的那樣，使用Fluorescence-FragELDNA斷裂檢測試劑盒(Oncogene，Cambridge，MA)和連接結(jié)合Texas-Red的抗-鼠IgG的抗-鼠CD31抗體，通過雙重免疫熒光檢測凋亡內(nèi)皮細胞。
原位雜交像(19)描述的那樣，在石蠟切片上進行原位雜交。簡要地，用二甲苯處理載波片以移去石蠟，然后，連續(xù)的洗脫用粗級乙醇；0.2M HCI；含311g/ml蛋白酶K的Tris/EDTA；0.2％甘氨酸；4％pH 7.4的磷酸鹽緩沖液的聚甲醛；含1/200(vol/vol)醋酐的0.1M三乙醇胺和2XSSC。載波片然后在52℃與標記35S的核探針在如下的混合物中進行過夜雜交，混合物包括0.3M氯化鈉，0.01M Tris pH 7.6，5mM EDTA，50％甲酰胺，10％糖酐酯，0.1mg/ml酵母tRNA，和0.01M二硫蘇糖醇。雜交后清洗液包括65℃的2XSSC/50％甲酰胺/1OmM二硫蘇糖醇和2XSSC。載波片然后用含有0.3M醋酸銨的粗級乙醇脫水，干燥，用Kodak NTB2乳劑包被，4℃暗處儲存2周。用柯達19顯影劑制備乳劑，用蘇木素復(fù)染劑載波片。文獻(12)報道，從一個393-bp鼠的VEGF cDNA片段制備VEGF的反義和正義單鏈35S標記的RNA探針，并把探針克隆到pGEM-3Z(Promega)。
凝膠酶譜野生型FVB的背部剃毛皮膚小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠(每組n＝4)暴露在單劑量的UVB照射(126mJ/cm2)。24小時后，處死小鼠，割去背部皮膚樣品，然后在提取緩沖液(0.05M Tris/pH 7.5，0.2M NaCl，5mM CaCl2，0.1％TritonX-100)中進行勻化。離心后，收集上清做凝膠-酶譜。稍加改進文獻(33，34)的方法，然后做酶譜。簡要地說，皮膚裂解物再次混懸在非還原的4X SDS樣品緩沖液(0.5M Tris-HCl/pH 6.8，0.02％溴酚藍，40％(v/v)甘油，3％SDS)中，然后裝到含有0.1％豬肉皮膚凝膠(SIGMA)的SDS聚丙酰胺凝膠里。20μg每種蛋白質(zhì)裂解物加到SDS-PAGE中。凝膠和2.5％Triton X-100共同孵育以除去SDS，然后與孵育緩沖液(O.05M Tris-HCl/pH 8.0，5mM CaCl2，511M ZnCl)放置過夜。然后用0.5％庫馬西亮藍R-250/30％甲醇/10％醋酸溶液對凝膠染色，隨后用30％甲醇/10％醋酸溶液進行脫色。檢測到MMP-9活性是分子量為92kDa的條帶(35)。
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其它實施方式雖然發(fā)明是被與其相關(guān)的內(nèi)容上逐條描述，但在前的表述以及例子只是為了舉例說明并不是為了限定發(fā)明的范圍，其限定是通過附加的權(quán)利要求完成的。其他方面、優(yōu)點和修改都是在權(quán)利要求范圍之內(nèi)的。
引用的所有專利和參考文獻都全部引入作為參考。其他的實施方式是在之后的權(quán)利要求中。
權(quán)利要求
1.一種防止由于長期UVB而引起受試者皺紋的方法，其包含確定需要防止皺紋的受試者；抑制受試者皮膚中血管發(fā)生，從而防止在受試者身上由長期UVB引起的皺紋。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中血管發(fā)生是通過提高受試者體內(nèi)TSP-2或TSP-1的活性來抑制的。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中血管發(fā)生的抑制是通過給予受試者一種能誘導(dǎo)抗血管發(fā)生因子的化合物來完成的。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中的抗血管發(fā)生因子是指TSP-1和TSP-2。
5.一種防止或處理長期UVB在受試者身上引起的皺紋的方法，所述的方法包括給予受試者含有血管發(fā)生抑制劑或能夠誘導(dǎo)大量的血管發(fā)生抑制劑的試劑以減少或防止所述皺紋。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的皺紋是指由于暴露于自然日光下形成的。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的血管發(fā)生抑制劑是局部給予的。
8.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的血管發(fā)生抑制劑是以無菌的組合物形式的。
9.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的血管發(fā)生抑制劑是指TSP-2或TSP-1。
10.一種處理和防止長期的UVB引起皺紋的組合物，其含有一種血管發(fā)生抑制劑或能夠誘導(dǎo)血管發(fā)生抑制劑的試劑，以及藥學(xué)上可以接受的載體。
11.如權(quán)利要求10所述的組合物，其中所述的血管發(fā)生抑制劑是指TSP-2或TSP-1。
12.如權(quán)利要求10所述的組合物，還可以含有化妝品成分。
13.如權(quán)利要求12所述的組合物，其中所述的化妝品成分是指芳香劑。
14.如權(quán)利要求12所述的組合物，其中所述的化妝品成分是指遮光劑。
15.一種對由于長期UVB引起皺紋受試者提供保護的方法，其中所述的方法包括提供受試者含有血管發(fā)生抑制劑或能夠誘導(dǎo)血管發(fā)生抑制劑的試劑的一種組合物，以及提供受試者使用所述防止皺紋的組合物的指導(dǎo)。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中的血管發(fā)生抑制劑是指TSP-2或TSP-1。
17.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述的指導(dǎo)含有暴露于陽光之前使用組合物于皮膚的指導(dǎo)說明。
18.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述的組合物還可以含有化妝品成分。
19.一種防止長期UVB引起受試者皺紋的試劑盒，所述的試劑盒包括含有血管發(fā)生抑制劑或能夠誘導(dǎo)血管發(fā)生抑制劑的試劑的一種組合物，以及提供使用防止皺紋的組合物的指導(dǎo)。
20.如權(quán)利要求19所述的試劑盒，其中所述的血管發(fā)生抑制劑是指TSP-1或TSP-2。
21.如權(quán)利要求19所述的試劑盒，其中所述的組合物還可以含有化妝品成分。
22.如權(quán)利要求19所述的試劑盒，其中所述的指導(dǎo)含有在暴露于陽光之前使用所述的組合物于皮膚的指導(dǎo)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種防止或減少受試者由于長期UVB輻射所引起皺紋的方法。該方法包括抑制受試者皮膚中的血管發(fā)生。
文檔編號A61P17/16GK1512868SQ02811284
公開日2004年7月14日 申請日期2002年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月13日
發(fā)明者邁克爾·J·德特馬, 邁克爾 J 德特馬, 一郎, 矢野喜一郎 申請人:通用醫(yī)療公司