專利名稱：抗過敏特異性IgY及其制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗體及其制備方法，特別是涉及一種抗各種過敏性疾病的復(fù)合IgY及其制備方法。
背景技術(shù)：
過敏癥是一種最為常見的多發(fā)病，對人類健康構(gòu)成極大危害。全世界不知有多少人終生飽嘗這種疾病的折磨，甚至造成殘廢或猝死。在印度，“過敏癥”發(fā)病率占人口總數(shù)高達(dá)11-12％；在美國僅花粉過敏癥的人群發(fā)病率就高達(dá)15％，每年要耗資6億美元治療這種疾?。欢谥袊?，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，各種過敏性疾病的患者有上億人之多。有報(bào)道顯示，全世界每年僅用于治療支氣管哮喘的醫(yī)療費(fèi)用就超過30億美元，由于這類疾病而導(dǎo)致的誤工、誤學(xué)及早亡所造成的損失更是無法計(jì)算。
過敏性疾病，是一種由外界抗原物質(zhì)作用于體內(nèi)發(fā)生的不正常的免疫反應(yīng)。臨床表現(xiàn)如支氣管哮喘和支氣管炎、過敏性鼻炎、過敏性喉水腫(喉炎)、過敏性皮膚炎等，癥狀頑固，治療起來相當(dāng)困難。通常采用激素類和擬腎上腺素等化學(xué)藥物治療。令人遺憾的是，目前廣泛應(yīng)用的治療方案及其藥物都僅僅是局部抗炎或短暫紓緩癥狀的、不完善的治標(biāo)手段，而不是“病因治療”。更重要的是，所帶來的副作用都相當(dāng)大。如應(yīng)用皮質(zhì)激素會引致中樞神經(jīng)系統(tǒng)和肌肉骨骼以及內(nèi)分泌方面的不良反應(yīng)，并可誘發(fā)口咽部和食道真菌感染，以及皰疹病毒感染；尤其對小兒危害更大，使小兒生長受抑、影響小兒骨骼和性腺等方面的發(fā)育。采用擬腎上腺素能藥和β2-受體激動劑，還會引起高血壓、心律失常等心血管疾病及出現(xiàn)骨骼肌震顫(如手抖)，甚至造成患者腎上腺皮質(zhì)功能不全或衰竭；嚴(yán)重時(shí)會引起心臟停搏而死亡。國際醫(yī)學(xué)界根據(jù)長期觀察和統(tǒng)計(jì)分析揭示，過度使用β2-受體激動劑等是前幾年哮喘死亡率不斷增加的禍根。
鑒于局部抗炎和平喘等治療方法存在的嚴(yán)重缺陷，針對過敏性疾病是由于某種“過敏原”導(dǎo)致人體發(fā)生“特異反應(yīng)”(變態(tài)反應(yīng))而引起的機(jī)理，于某種“過敏原”導(dǎo)致人體發(fā)生“特異反應(yīng)”(變態(tài)反應(yīng))而引起的機(jī)理，醫(yī)學(xué)界研究開發(fā)了一種特異性免疫方法(“脫敏療法”)，通過反復(fù)注射特異性過敏原刺激機(jī)體產(chǎn)生“封閉抗體”，和再次進(jìn)入機(jī)體的“過敏原”結(jié)合為復(fù)合物而被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除。
這種方法被稱為“過敏癥”的“最新療法”，但是在實(shí)施中卻存在著許多困難和危險(xiǎn)性。不但起效慢、療程長(長達(dá)2-5年)而難于堅(jiān)持；而且，注射后容易出現(xiàn)乏力、關(guān)節(jié)痛、蕁麻疹等不良反應(yīng)，還會誘發(fā)支氣管痙攣和過敏性休克等嚴(yán)重不良反應(yīng)，甚至造成死亡。因此，嚴(yán)重影響了這種本來是先進(jìn)的“最新療法”的推廣應(yīng)用。
目前的現(xiàn)狀是，雖然近幾十年來全世界有關(guān)過敏性疾病的治療藥物和設(shè)備不斷問世，但是，過敏性疾病的發(fā)病率，不僅未能下降，甚至還出現(xiàn)哮喘的患病率和死亡率反而逐年增加的反常現(xiàn)象。殘酷的現(xiàn)實(shí)表明，至今全世界尚未找到一種根治過敏性疾病特別是哮喘的安全可靠的方法。因此，研究開發(fā)一種從病發(fā)根源上入手、副作用又小的有效治療方法和藥物，對于使千百萬患者徹底擺脫過敏性疾病的煎熬、保障人民身心健康、提高廣大國民健康素質(zhì)，無疑具有十分重要的意義。
技術(shù)內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種對哮喘等過敏性疾病特效、安全、使用方便的抗體制劑及其制備方法。
本發(fā)明目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的1、篩選出引致過敏性疾病的過敏原A、花粉癥過敏原蒿屬花粉、豚草花粉、狗尾草、梯牧草、黑麥、樹木花粉如法國梧桐、楓、楊、榆、柏、構(gòu)、桑、柳、松、懸鈴木、樺、銀杏等。
同時(shí)也可依據(jù)對多數(shù)過敏癥患者的“特異性皮膚試驗(yàn)”結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析，來篩選決定本地區(qū)主要的致敏花粉種類。再根據(jù)這些致敏花粉的“抗原交叉性”，進(jìn)行分類組合，確定有代表性的幾種花粉過敏原。
也可根據(jù)各地最常見的有代表性的致敏花粉所鑒定出的過敏原蛋白質(zhì)或抗原成份，如豚草、艾草為Hrt VI(學(xué)名)、鴨茅為Arab aI(學(xué)名)、垂枝樺木為Dac gI(學(xué)名)、扁柏為BetVI(學(xué)名)、杉木為CryIC(學(xué)名)等等有代表性的、最常見的過敏原蛋白質(zhì)或抗原成份作為這部分致敏花粉的代表性過敏原。
還可以根據(jù)篩選出的致敏花粉種類，選用已商品化的若干種致敏花粉浸出液或萃取劑作為有代表性的花粉過敏原。
B、塵螨過敏原與過敏性疾病關(guān)系最密切的螨有4種，即屋塵螨、粉塵螨、宇塵螨和多毛螨。這4種螨之間具有共同抗原成份。其中屋塵螨是導(dǎo)致塵螨過敏性疾病的最重要的過敏原。屋塵螨有I、II、III、IV、V等五種抗原決定簇。
可根據(jù)本地大多數(shù)過敏癥患者“特異性皮膚試驗(yàn)”的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，從目前最常用的、已商品化的各種塵螨過敏原的“抗原交叉性”，進(jìn)行分類組合。市面上的“粉塵螨注射液”也可直接選用。
C、霉菌過敏原將空氣中最常見、孢子播散數(shù)量最大和致敏性最強(qiáng)的真菌進(jìn)行分離和篩選，保留純菌種，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，可制成各種真菌過敏原浸出液。然后，根據(jù)這些有代表性的致敏真菌的“抗原交叉性”進(jìn)行分類組合。
D、蟑螂過敏原采用已商品化的蟑螂抗原成份或蟑螂浸出液(如“黑胸大蠊”萃取液)，也可用當(dāng)?shù)伢胱灾平鲆?，或?qū)Ⅲ爰羧コ岚蚝?，放入高速勻漿機(jī)攪成漿汁，作為制備抗原的基礎(chǔ)原材料。
E、寵物過敏原可采用寵物的皮脂腺分泌物、唾液或尿蛋白的萃取液制作過敏原。
也可選用這些寵物有代表性過敏原蛋白質(zhì)直接作抗原的原材料。如貓的主要過敏原蛋白質(zhì)為Fel dI，狗唾液的過敏原蛋白質(zhì)為Ca dI。
2、在篩選和分類組合各種過敏原的基礎(chǔ)上，分別制備單一或復(fù)合的過敏原抗原。
將各組別單一或混合的過敏原提取液或制劑，按1-10∶1-10比例加入福氏佐劑，再放入高速勻漿機(jī)中，高速攪拌形成油包水乳液，即制成單一或復(fù)合過敏原抗原；
也可以直接將花粉、塵螨、霉菌、蟑螂碎片、寵物皮毛屑等加入福氏佐劑混合后放入高速勻漿機(jī)中，以10000～30000rpm轉(zhuǎn)速進(jìn)行高速粉碎勻化，形成油包水液；制得含全菌和菌體成份或含全部致敏蛋白質(zhì)成份的復(fù)合抗原；3、制備免疫球蛋白IgE抗原可以從人體特別是過敏癥患者的血清中提取IgE，也可購買現(xiàn)成的IgE免疫球蛋白作為抗原原料。
將IgE免疫球蛋白按1-10∶1-10比例配以福氏佐劑，放入高速勻漿機(jī)中，高速粉碎勻化，即制成IgE抗原；4、制備免疫蛋應(yīng)用本公司已申請的專利技術(shù)(專利申請?zhí)?0101270.3和02121244.9)，用各種單一或復(fù)合過敏原抗原以及IgE抗原，分別對產(chǎn)蛋雞進(jìn)行免疫；每隔二周再強(qiáng)化注射一次，計(jì)免疫三次；第一次免疫20天后，檢取雞所產(chǎn)免疫蛋，并對應(yīng)不同的抗原，對所檢取的免疫蛋進(jìn)行編碼標(biāo)記；以上免疫方法和注射頻率可根據(jù)實(shí)際情況適當(dāng)調(diào)整和變化；也可應(yīng)用上述同樣的免疫技術(shù)，用各種單一或復(fù)合過敏原抗原以及IgE抗原，分別對產(chǎn)蛋鴨進(jìn)行免疫；5、抗各種過敏原特異性IgY特異性IgY粗提物的制備流動水逐個(gè)洗凈免疫蛋，再用酒精擦洗消毒；用打蛋機(jī)擊破蛋，蛋黃篩取出蛋黃，攪打蛋黃均勻，按蛋黃液量加入4-6倍蒸餾水稀釋，攪拌均勻，用1.0N的Hcl調(diào)整PH至5.5-6.0，2-6℃靜置12-24小時(shí)，虹吸得取上清液，稱A液；將以上沉淀液以8000rpm離心20分種，得取上清液，稱B液；將A液和B液混和均勻，超濾，得到超濾濃縮液，加入2.0％海藻酸鈉液，至終濃度為1.0‰，攪拌直至渾濁沉淀，加入2.0％氯化鈣液，至終濃度1.0‰，攪拌均勻，2-6℃靜置過夜，8000rpm離心30分種，取上清液，進(jìn)而通過細(xì)菌過濾器除菌，得到無菌濾液，冷凍干燥，即為IgY粗提物，最后把所制備的抗各種不同抗原的IgY粗提物進(jìn)行編碼標(biāo)記。
6、抗各種過敏原特異性IgY粗提物和抗IgE特異性IgY粗提物的純化將以上工藝所制取的抗各種過敏原特異性IgY和抗IgE特異性IgY粗提物分別先后過離子交換柱和凝膠層析柱，即得純IgY；
7、制備抗某一種特定過敏原的特異性復(fù)合IgY不同抗原制得的純IgY，同樣按照以上述各自不同的編碼標(biāo)記嚴(yán)格標(biāo)記以便區(qū)分，將一種抗過敏特異性IgY或多種抗過敏特異性IgY混合物與抗IgE特異性IgY按1-10∶1-10的比例混合均勻，然后加入一定比例蒸餾水或生理鹽水配制成溶劑；也可將抗IgE特異性IgY干粉和抗某一種過敏原的特異性IgY或多種抗過敏特異性IgY混合物干粉按1-10∶1-10比例混合直接制成粉劑；上述多種抗過敏特異性IgY混合物是選用多種抗相應(yīng)的不同過敏原的特異性IgY，先將它們按1-10∶1-10(2種)或1-10∶1-10∶1-10(3種)或1-10∶1-10∶1-10∶1-10(4種)或依此類推的比例均勻混合制成；本發(fā)明制備的一系列抗過敏原特異性復(fù)合IgY溶劑或粉劑直接加入各種霧化器(Nebulizers)中，經(jīng)霧化器霧化形成霧狀微粒，供患者吸入氣管、肺部或者鼻咽部就可產(chǎn)生有效的治療和預(yù)防作用。這種霧化器可以是噴射式氣動霧化器(有電動泵式、壓縮氣泵式、腳踏氣泵或壓縮氧氣等形式)或者超聲波霧化器，也可以是其他任何形式的霧化裝置。
本發(fā)明制備的一系列抗過敏原特異性復(fù)合IgY干粉也可直接裝入多種干粉吸入器(Dry Powder inhalers)內(nèi)供患者使用。干粉吸入器有單劑量和多劑量兩種，單劑量型干粉吸入器又分成旋轉(zhuǎn)式吸入器(Spinhaler)和轉(zhuǎn)動式吸入器(Rotahaler)兩種，多劑量型干粉吸入器又分碟式吸入器(DisKhaler)和渦流式吸入器(Turbuhaler)兩種?；颊咧灰僮鬟@種干粉吸入器就可很方便地將抗過敏原復(fù)合IgY組合制劑吸入氣管、肺部或者吸入鼻咽部。
同樣，也可將所制取的一系列抗過敏原復(fù)合IgY溶劑或者粉劑加水(蒸餾水或生理鹽水等)稀釋后加入各種噴霧罐中制成各種噴霧劑。為使噴霧藥物微粒足夠細(xì)小，灌裝時(shí)必須加入助推劑，常用的助推劑為氟里昂(Chlorofluorocarbon，CFC)或者氮?dú)?N2)等。把本發(fā)明制備的抗過敏原復(fù)合IgY以一定壓力保存于噴霧罐中，制成一種輕便的壓力式定量吸入產(chǎn)品。當(dāng)手壓驅(qū)動定量活瓣時(shí)，就可噴出充分霧化的IgY溶液?；颊咧灰∵@種噴霧罐的出口，配合掀壓噴頭吸氣，或者借助“儲霧罐”吸氣，就可以將這種抗過敏原復(fù)合IgY吸入氣管或肺部。
對于過敏性鼻炎和咽喉炎患者，噴霧劑在灌裝時(shí)可加“助推劑”，也可不加“助推劑”，只需將所制得的抗過敏原復(fù)合IgY加水稀釋在常壓條件下灌入罐內(nèi)，裝上普通定量噴頭就可制成噴霧劑。使用時(shí)，只要將這種常壓定量噴霧罐出口對準(zhǔn)鼻子往鼻子內(nèi)噴入霧狀液體即可。
本發(fā)明在大部分特異性IgY中都復(fù)合了抗IgE特異IgY樣，既使對某個(gè)過敏原直接抑制作用不強(qiáng)，成份中的抗IgE特異性IgY亦可與肥大細(xì)胞表面的IgE結(jié)合，因而使過敏原無法與IgE用，照樣避免了肥大細(xì)胞的激活和炎癥介質(zhì)的釋放，防止支氣管哮喘的發(fā)作；故而可確保萬無一失。這也是本發(fā)明的精髓所在。為了降低成本，在一些專供輕度患者使用或預(yù)防使用的品種中可不加入“抗IgE特異性IgY”。在實(shí)際應(yīng)用中，可以預(yù)先在前述的對各種常見過敏原進(jìn)行篩選和分類膽合的基礎(chǔ)上，科學(xué)制訂生產(chǎn)品種和數(shù)量，每個(gè)序列都制備一組抗不同過敏原的特異性IgY。各組合的抗過敏IgY產(chǎn)品分別賦予不同的商品名(可用中文和英文字母以及代碼表示)，并按不同序列和組別給予編碼，可以很方便地識別和檢索，如“抗粉塵螨IgY”(anti-Der i-igY)、“抗莠草花粉IgY″(allti-AgE-IgY)，“抗真菌tgYI號”(anti-AT-IgY)、“抗真菌IgY II號”(anti-AF-IgY)等等。再將這些不同組合的抗過敏IgY如前所述制成各種不同的劑型和標(biāo)準(zhǔn)化包裝，形成系列化和標(biāo)準(zhǔn)化，便于根據(jù)需要隨意選用。
系列化和標(biāo)準(zhǔn)化后，醫(yī)生和患者只需根據(jù)“皮試”結(jié)果，就可以簡單地直接選擇一樣或幾樣“抗過敏IgY”現(xiàn)成產(chǎn)品作治療或預(yù)防之用。如某個(gè)患者，通過“皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)”確定是對“粉塵螨”和“豚草花粉”過敏，則只需在標(biāo)準(zhǔn)化的“抗過敏IgY”的產(chǎn)品系列中選用“抗塵螨IgY”(如抗螨I號anti-Der I-IgY)和“抗莠草IgY”(抗花I號或anti-AgE-IgY)二種噴霧劑或者選用一種“抗(螨+花)IgY”[anti-(D+A)-IgY]復(fù)合型的噴霧劑就解決問題了。
本發(fā)明在深入研究哮喘等過敏疾病的免疫學(xué)發(fā)生機(jī)制的基礎(chǔ)上，準(zhǔn)確地抓住外因致敏原和內(nèi)因特異性IgE兩大最關(guān)鍵的影響因素，并且創(chuàng)造性地應(yīng)用被動免疫技術(shù)，制備一系列抗過敏原特異性IgY和一種抗IgE特異性IgY。一方面清除和抑制了進(jìn)入氣道的致敏原，另一方面又直接抑制并減少了特異性IgE水平有效地阻止了過敏癥狀的發(fā)生。同時(shí)，本發(fā)明所制備的抗過敏原特異性復(fù)合IgY和抗IgE特異性IgY是一種獨(dú)特的純天然生物制劑，將這種天然成份直接噴施于呼吸道，而不是注射或口服進(jìn)入人體循環(huán)系統(tǒng)，作用直接，安全無害，見效又快。由于這是一種相當(dāng)于食品的天然物質(zhì)，甘甜可口，即使長期經(jīng)常噴霧吸入體內(nèi)，也不產(chǎn)生任何毒副作用和不良反應(yīng)。哮喘等過敏癥患者以及有過敏體質(zhì)的人只要隨身帶一支用本發(fā)明的成份制作的輕巧噴霧劑，經(jīng)常噴一噴，就既可有效抑制癥狀發(fā)作，又可完全預(yù)防新的過敏現(xiàn)象的出現(xiàn)，達(dá)到既治療又預(yù)防的雙重目的。
實(shí)驗(yàn)例1分別用粉塵螨和屋塵螨加入福氏佐劑混勻制作粉塵螨抗原和屋塵螨抗原。以ELISA法(酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn))檢測所制得的抗粉塵螨特異性IgY對這兩種抗原的結(jié)合效價(jià)。結(jié)果如下

從檢測結(jié)果可以看出，用本發(fā)明的方法所制備的抗粉塵螨特異性IgY對粉塵螨過敏原有較高的抗體結(jié)合效價(jià)。同時(shí)，本發(fā)明的抗原制作方法和強(qiáng)化免疫方式，所制得的抗粉塵螨IgY具有一定的廣譜性，除了對所免疫的粉塵螨有較高的效價(jià)外，對同屬的有“抗原交叉”的其他塵螨(如“屋塵螨”)同樣有較高的效價(jià)。
試驗(yàn)結(jié)果提示我們只要用一種有代表性的塵螨(如“粉塵螨”)制作抗原免疫母雞，所制備的抗粉塵螨特異性IgY對常見的幾種塵螨都有抗原交叉反應(yīng)。這樣，就可以精簡抗塵螨特異性IgY的品種，降低成本。
實(shí)驗(yàn)例2分別用粉塵螨和屋塵螨加入福氏佐劑混勻制作粉塵螨抗原和屋塵螨抗原。以ELISA法檢測所制得的鴨抗粉塵螨IgY對這兩種抗原的結(jié)合效價(jià)。
結(jié)果如下

檢測結(jié)果說明采用本發(fā)明的方法免疫產(chǎn)蛋鴨，所制備的鴨抗粉塵螨特異性IgY完全可以達(dá)到與免疫雞一樣的效果。所得的鴨抗粉塵螨特異性IgY照樣有很高的效價(jià)并具有一定的廣譜性。
實(shí)驗(yàn)例3以ELISA法分別檢測所制備的抗蒿草花粉特異性IgY對這四種花粉抗原的結(jié)合效價(jià)。結(jié)果如下表

從表中可以看出，采用本發(fā)明的方法免疫母雞所制得的抗蒿草花粉特異性IgY對免疫的過敏原蒿草花粉的蛋白抗原結(jié)合效價(jià)較高，同時(shí)具有一定的廣譜性；對于有“抗原交叉”的同屬莠草類花粉都同樣有很高的效價(jià)。這樣就提示我們，用本發(fā)明的方法制備的抗蒿草花粉特異性IgY可用于凡是對莠草類花粉過敏的患者作預(yù)防和治療之用。
由于同科同屬的植物花粉之間有抗原交叉，因此，本草類植物花粉也只需以有代表性的幾種樹花粉(如法國梧桐花粉、柳樹花粉、松樹花粉等)制備幾種抗相對應(yīng)花粉的特異性IgY，每種抗某屬花粉特異性IgY對同一屬樹花粉引致的過敏癥都可通用。禾木植物花粉也只需以有代表性的狗尾草、梯牧草、黑麥等作抗原分別制備抗狗尾草等花粉的特異性IgY，對各自同一屬的有“抗原交叉”的禾木植物花粉過敏癥都可適用。
實(shí)驗(yàn)例4以ELISA法分別檢測所制得的抗煙曲霉菌特異性IgY對煙曲霉菌、土曲霉菌、棒曲霉菌、黑曲霉菌、黃曲霉菌5種抗原的抗體結(jié)合效價(jià)。結(jié)果如下表所示

從表中看出，采用本發(fā)明的抗原制作方法所制得的煙曲霉菌特異性IgY抗體結(jié)合效價(jià)相當(dāng)高，對同屬的其他霉菌的結(jié)合效價(jià)也較高；從而，進(jìn)一步驗(yàn)證了這五種霉菌之間有抗原交叉性。本發(fā)明制備的抗霉菌特異性IgY廣譜性也很強(qiáng)，這表明只要制備抗某種霉菌的特異性IgY，對凡有“抗原交叉性”的其他霉菌引發(fā)的過敏癥也都會有很好的作用。
實(shí)驗(yàn)例5以ELISA法，用所制取的檢測抗原檢測抗貓過敏特異性IgY對該貓過敏原的抗體結(jié)合效價(jià)，檢測結(jié)果效價(jià)為1:128。證明按本發(fā)明的方法制得的抗貓過敏特異性IgY對貓過敏原抑制效果相當(dāng)理想。
實(shí)驗(yàn)例6以ELISA法，采用本例(1)項(xiàng)中所列方法制作的蟑螂蛋白抗原作檢測抗原，檢測所制備的抗蟑螂過敏特異性IgY對蟑螂過敏原的抗體結(jié)合效價(jià)，檢測結(jié)果效價(jià)為1:256。驗(yàn)證了按本發(fā)明的方法制備的抗寵物過敏特異性IgY效果十分理想。
實(shí)驗(yàn)例7以ELISA法，采用本例(1)項(xiàng)中所制得的IgE抗原作檢測抗原，檢測所制備的抗IgE特異性IgY對IgE的抗體結(jié)合效價(jià)，檢測結(jié)果效價(jià)為1:512。實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的方法制備的抗IgE特異性IgY具有很高的活性，完全達(dá)到預(yù)期的效果。
實(shí)驗(yàn)例8哮喘患者使用抗哮喘組合霧化劑的臨床觀察(1)在患中度哮喘的住院成年患者中，挑選經(jīng)過“皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)”診斷為對塵螨過敏或莠草類花粉過敏，或二者皆過敏的患者共計(jì)20名。
(2)采用本發(fā)明制備的“抗哮喘組合霧化劑”，藥液瓶打開后，把藥液倒入PARI型壓縮霧化氣泵中，經(jīng)霧化供患者吸入。每天吸二次，每次持續(xù)吸入5-10分鐘。
(3)每天觀察試驗(yàn)患者的癥狀變化情況。
(4)經(jīng)吸用“抗哮喘組合霧化劑”2周后，15名患者哮喘音基本消失，喘息癥狀減輕。有5名患者夜間仍有陣發(fā)性喘息，給予補(bǔ)充吸入“抗哮喘組合霧化劑”，吸入10分鐘后，喘息即停止。
(5)連續(xù)吸入2個(gè)月后，其中17名患者的喘息癥狀消失，另3名患者喘息癥狀也明顯改善，由每日有發(fā)作，變?yōu)槊恐?-2次偶發(fā)性發(fā)作。
實(shí)驗(yàn)例10過敏性鼻炎患者使用手撳常壓噴霧劑型的“抗過敏特異性IgY”的臨床觀察結(jié)果(1)通過“皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)”診斷，選擇對塵螨或蟑螂過敏的慢性鼻炎患者50名作臨床試驗(yàn)。
(2)將50名患者隨時(shí)分為二組，治療組使用抗過敏“常壓定量噴霧罐”，對照組使用裝有安慰劑的“常壓定量噴霧罐”。
治療前，2組患者都患有較嚴(yán)重的過敏性鼻炎持續(xù)鼻塞鼻癢和陣發(fā)性噴嚏，流大量漿液性鼻涕，嗅覺減退。治療組有3人嗅覺減退，對照組2人嗅覺減退。
(3)兩組患者分別使用手撳噴霧罐往鼻部噴入霧狀溶劑，每天噴3次。觀察并嚴(yán)格記錄兩組患者癥狀。
(4)治療2周后，治療組25人中有19人鼻塞和鼻癢癥狀基本消除，鼻涕量明顯減少；有4人癥狀有改善，有2人沒有明顯感覺。
對照組中25人，癥狀基本維持不變。
(5)連續(xù)治療12周后，治療組25人中，有22人鼻塞和鼻癢癥狀完全消除，流鼻涕情況也基本恢復(fù)正常；原嗅覺減退的3人已恢復(fù)正常嗅覺有2人癥狀明顯減輕，有1人無改善。對照組中25人，癥狀反復(fù)，沒有改善。
實(shí)施例1制備抗粉塵螨特異性IgY將市面上購得的現(xiàn)成的粉塵螨注射液按1∶1比例與福氏佐劑混勻，置于高速勻漿機(jī)，以20000rpm進(jìn)行高速勻化，制得乳狀勻質(zhì)抗原；用所制得的粉塵螨抗原對良種蛋雞進(jìn)行免疫，采用皮下注射和翅靜脈注射相結(jié)合的免疫法，每只雞每次注射1-2ml抗原，相當(dāng)于約5000-10000只塵螨；每隔二周再強(qiáng)化注射一次，計(jì)免疫3次；第一次免疫20天后，檢取雞所產(chǎn)免疫蛋；用酒精擦洗消毒免疫蛋，用打蛋機(jī)擊破蛋，蛋黃篩取出蛋黃，攪打蛋黃均勻，按蛋黃液量加入4-6倍蒸餾水稀釋，攪拌均勻，用0.1N的Hcl調(diào)整ph5.5-6.0，2-6℃，靜置過夜，虹吸得取上清液，稱A液；以上沉淀液以8000rpm離心20分鐘，得取上清液，稱B液；將A液和B液混和均勻，超濾，得取超濾濃縮液，加入2.0％海藻酸鈉液，至終濃度為1.0‰，攪伴，加入2.0％氯化鈣液，至終濃度1.0‰，攪伴均勻，2-6℃靜置過夜，8000rmp離心30分鐘，取上清液，細(xì)菌過濾器過濾，得到無菌濾液，冷凍干燥，即為抗粉塵螨物異性IgY粗提物；將以上IgY粗提取物溶解于PH7.0、0.01MPB，經(jīng)DEAE-SephadexA50柱層析和SephadexG200凝膠柱層析，得到純抗粉塵螨物異性IgY。
實(shí)施例2免疫產(chǎn)蛋鴨，制備抗塵螨特異性鴨IgY將粉塵螨注射液按3∶2比例與福氏佐劑混勻，加入高速勻漿機(jī)，以20000rpm進(jìn)行高速勻化，制得乳狀勻質(zhì)抗原；用所制得的粉塵螨抗原對良種蛋鴨進(jìn)行免疫，采用皮下注射和翅靜脈注射相結(jié)合的免疫法，每只鴨每次注射1-2ml抗原，相當(dāng)于約5000-10000只塵螨；每隔二周再注射一次，計(jì)免疫3次；第一次免疫20天后，檢取鴨所產(chǎn)免疫蛋；用酒精擦洗消毒免疫蛋，用打蛋機(jī)擊破蛋，蛋黃篩取出蛋黃，攪打蛋黃均勻，按蛋黃液量加入4-6倍蒸餾水稀釋，攪拌均勻，用0.1N的Hcl調(diào)整pH5.5-6.0，2-6℃靜置過夜，虹吸得取上清液，稱A液；以上沉淀液以8000rpm離心20分鐘，得取上清液，稱B液；將A液和B液混和均勻，超濾，得取超濾濃縮液，加入2.0％海藻酸鈉液，至終濃度為1.0‰，攪伴，加入2.0％氯化鈣液，至終濃度1.0‰，攪伴均勻，2-6℃靜置過夜，8000rmp離心30分鐘，取上清液，細(xì)菌過濾器過濾，得到無菌濾液，冷凍干燥，即為抗粉塵螨特異性鴨IgY；將以上IgY粗提取物溶解于PH7.0、0.01MPB，經(jīng)KEAE-SephadexA50柱層析和SephadexG200凝膠柱層析，得到純抗粉塵螨特特異性鴨IgY。
實(shí)施例3:制備抗蒿草花粉、豚草花粉、藜草花粉和藻草花粉特異性IgY分別用蒿草花粉、豚草花粉、藜草花粉和藻草花粉制備抗原，首先將所采集的四種花粉分別用高速勻漿機(jī)以10000rpm轉(zhuǎn)速高速粉碎，然后按5∶4比例分別加入福氏佐劑，再在高速勻漿機(jī)中以20000rpm高速勻化，分別制得四種乳狀花粉蛋白抗原；用所制得的蒿草花粉等抗原分別對良種蛋雞進(jìn)行免疫，同樣采用皮下注射和翅靜脈注射相結(jié)合的免疫法，每只雞每次注射1.5ml抗原，相當(dāng)于約50-100μg花粉蛋白質(zhì)；每隔二周再強(qiáng)化注射一次，一個(gè)月內(nèi)計(jì)免疫3次；第一次免疫20天后，分別檢取雞所產(chǎn)免疫蛋；用酒精擦洗消毒免疫蛋，用打蛋機(jī)擊破蛋，蛋黃篩取出蛋黃，攪打蛋黃均勻，按蛋黃液量加入4-6倍蒸餾水，靜置過夜，虹吸得取上清液，稱A液；以上沉淀液以8000rpm離心20分鐘，得取上清液，稱B液；將A液和B液混和均勻，超濾，得到超濾濃縮液，加入2.0％海藻酸鈉液，至終濃度為1.0‰，攪拌，加入2.0％氯化鈣液，至終濃度1.0‰，攪拌均勻，2-6℃靜置過夜，8000rmp離心30分鐘，取上清液，細(xì)菌過濾器過濾，得到無菌濾液，冷凍干燥，分別制得抗蒿草花粉、抗豚草花粉、抗藜草花粉和抗藻草花粉特異性IgY粗提物干粉成品；將以上IgY粗提取物溶解于PH7.0、0.01MPB，經(jīng) KEAE-SephadexA50柱層析和SephadexG200凝膠柱層析，把粗提物純化，即得抗蒿草花粉、抗豚草花粉、抗藜草花粉和抗藻草花粉特異性純IgY。
實(shí)施例4制備抗霉菌過敏原特異性IgY用煙曲霉菌、土曲霉菌、棒曲霉菌、黑曲霉菌、黃曲霉菌混合制作抗原將以上4種霉菌分別按常規(guī)培養(yǎng)后，制取菌液；各菌液以1∶1∶1∶1比例混合，制成混合菌液；將此混合菌液按6∶7比例加入福氏佐劑，然后置高速勻漿機(jī)以20000rpm高速勻化，制得4種霉菌混合抗原；用此混合抗原對良種蛋雞進(jìn)行免疫，同樣采用皮下注射和翅靜脈注射相結(jié)合的免疫法，每只雞每次注射1.0ml抗原，相當(dāng)于約200 g蛋白質(zhì)抗原；每隔二周再強(qiáng)化注射一次，計(jì)免疫3次；第一次免疫后20天后，檢取雞所產(chǎn)免疫蛋；用酒精擦洗消毒免疫蛋，用打蛋機(jī)擊破蛋，蛋黃篩取出蛋黃，攪打蛋黃均勻，按蛋黃液量加入4-6倍蒸餾水靜置過夜，虹吸得取上清液，稱A液；以上沉淀液以8000rpm離心20分鐘，得取上清液，稱B液；將A液和B液混和均勻，超濾，得到超濾濃縮液，加入2.0％海藻酸鈉液，至終濃度為1.0‰，攪拌，加入2.0％氯化鈣液，至終濃度1.0‰，攪拌均勻，2-6℃靜置過夜，8000rmp離心30分鐘，取上清液，細(xì)菌過濾器過濾，得到無菌濾液，冷凍干燥，即制得抗煙曲霉菌、抗土曲霉菌、抗棒曲霉菌、抗黑曲霉菌、抗黃曲霉菌特異性IgY粗提物干粉成品；將以上IgY粗提取物溶解于PH7.0、0.01MPB，經(jīng)DEAE-SephadexA50柱層析和SephadexG200凝膠柱層析，即得抗霉菌過敏原特異性純IgY。
實(shí)施例5制備抗寵物過敏的特異性IgY取貓唾液和尿液按1∶1比例混合，取混合物按7∶8比例加入福氏佐劑，放置入高速勻漿機(jī)以20000rpm高速混勻，制得乳狀貓抗原；用所制得的乳狀貓抗原對良種蛋雞進(jìn)行免疫，同樣采用皮下注射和翅靜脈注射相結(jié)合的免疫法，每只雞每次注射1-2ml抗原，相當(dāng)于約50-100μg蛋白質(zhì)抗原；每隔二周再強(qiáng)化注射一次，計(jì)免疫3次；第一次免疫20天后，檢取雞所產(chǎn)免疫蛋；用酒精擦洗消毒免疫蛋，用打蛋機(jī)擊破蛋，蛋黃篩取出蛋黃，攪打蛋黃均勻，按蛋黃液量加入4-6倍蒸餾水，靜置過夜，虹吸得取上清液，稱A液；以上沉淀液以8000rpm離心20分鐘，得取上清液，稱B液；將A液和B液混和均勻，超濾，得到超濾濃縮液，加入2.0％海藻酸鈉液，至終濃度為1.0‰，攪拌，加入2.0％氯化鈣液，至終濃度1.0‰，攪拌均勻，2-6℃靜置過夜，8000rmp離心30分鐘，取上清液，細(xì)菌過濾器過濾，得到無菌濾液，冷凍干燥，即制得抗寵物過敏的特異性IgY粗提物成品；將以上IgY粗提取物溶解于PH7.0、0.01MPB，經(jīng)DEAE-SephadexA50柱層析和SephadexG200凝膠柱層析，即得抗寵物過敏的特異性純IgY。
實(shí)施例6制備抗蟑螂過敏特異性IgY收集30-50只的蟑螂，剪去其翅膀，將其軀干集中置入高速勻漿機(jī)以10000rpm進(jìn)行粉碎；然后按蟑螂碎屑的重量，以6∶8的重量比加入福氏佐劑，再在高速勻漿機(jī)中以20000rpm高速粉碎勻化，制得乳狀蟑螂蛋白抗原；用所制得的蟑螂抗原對良種蛋雞進(jìn)行免疫，采用皮下注射和翅靜脈注射相結(jié)合的強(qiáng)化免疫法，每只雞每次注射1-2ml抗原，相當(dāng)于50-100微克蛋白質(zhì)；每隔二周再強(qiáng)化注射一次，一個(gè)月內(nèi)計(jì)免疫3次；第一次免疫20天后，檢取雞所產(chǎn)免疫蛋；用酒精擦洗消毒免疫蛋，用打蛋機(jī)擊破蛋，蛋黃篩取出蛋黃，攪打蛋黃均勻，按蛋黃液量加入4-6倍蒸餾水稀釋，攪拌均勻，用0.1N的Hcl調(diào)整ph5.5-6.0，2-6℃，靜置過夜，虹吸得取上清液，稱A液；以上沉淀液以8000rpm離心20分鐘，得取上清液，稱B液；將A液和B液混和均勻，超濾，得取超濾濃縮液，加入2.0％海藻酸鈉液，至終濃度為1.0‰，攪拌，加入2.0％氯化鈣液，至終濃度1.0‰，攪拌均勻，2-6℃靜置過夜，8000rmp離心30分鐘，取上清液，細(xì)菌過濾器過濾，得到無菌濾液，冷凍干燥，即為抗蟑螂過敏特異性IgY粗提物；將以上IgY粗提物溶解于PH7.0、0.01MPB，經(jīng)DEAE-SephadexA50柱層析和SephadexG200凝膠柱層析，得純抗蟑螂過敏特異性純IgY。
實(shí)施例7抗IgE特異性IgY的制備將免疫球蛋白IgE按3∶5比例與福氏佐劑混合，然后加入高速勻漿機(jī)以10000rpm高速勻化，制得IgE抗原；用所制得的IgE抗原對良種蛋雞進(jìn)行免疫，采用皮下注射和翅靜脈注射相結(jié)合的強(qiáng)化免疫法，每只雞每次注射量達(dá)到1-2ml抗原，相當(dāng)于50-100微克蛋白質(zhì)；每隔二周再強(qiáng)化注射一次，一個(gè)月內(nèi)計(jì)免疫3次；第一次免疫20天后，檢取雞所產(chǎn)免疫蛋；用酒精擦洗消毒免疫蛋，用打蛋機(jī)擊破蛋，蛋黃篩取出蛋黃，攪打蛋黃均勻，按蛋黃液量加入4-6倍蒸餾水稀釋，攪拌均勻，用0.1N的Hcl調(diào)整ph5.5-6.0，2-6℃，靜置過夜，虹吸得取上清液，稱A液；以上沉淀液以8000rpm離心20分鐘，得取上清液，稱B液；將A液和B液混和均勻，超濾，得取超濾濃縮液，加入2.0％海藻酸鈉液，至終濃度為1.0‰，攪拌，加入2.0％氯化鈣液，至終濃度1.0‰，攪拌均勻，2-6℃靜置過夜，8000rmp離心30分鐘，取上清液，細(xì)菌過濾器過濾，得到無菌濾液，冷凍干燥，即為抗IgE特異性IgY粗提取物；將以上IgY粗提取物溶解于pH7.0、0.01MPB，經(jīng)DEAE-SephadexA50柱層析和SephadexG200凝膠柱層析，得抗IgE特異性純IgY。
實(shí)施例8抗哮喘組合霧化劑的制備抗粉塵螨特異性IgY干粉100g和抗蒿草花粉特異性IgY100g以及抗IgE特異性IgY干粉100g加入小型攪拌機(jī)中充分混和，得到抗哮喘特異性復(fù)合IgY300g；按以下配方調(diào)配30升抗哮喘復(fù)合IgY組合溶液抗哮喘特異性復(fù)合IgY300g阿斯巴甜 36g香橙香精 90g水蜜桃香精 30g生理鹽水 加至30升先調(diào)制生理鹽水25升，然后加入阿斯巴甜和香精，攪拌均勻后，再邊攪拌邊緩緩加入復(fù)合IgY；接著，加生理鹽水至30升，充分?jǐn)嚢杈鶆?；測量溶液的pH值，用1.0NNaOH溶液調(diào)pH至6.5-7.5；經(jīng)細(xì)菌過濾除菌，然后采用無菌瓶灌裝抗哮喘復(fù)合噴霧劑。每支裝20ml。
實(shí)施例9制備抗過敏手撳定量壓力噴霧罐抗粉塵螨特異性IgY干粉100g和抗蟑螂過敏原特異性IgY干粉100g以及抗IgE特異性IgY干粉100g加入小型攪拌機(jī)中充分混和，制成抗過敏特異性復(fù)合IgY干粉300g；按以下配方調(diào)配200升抗過敏復(fù)合IgY組合溶液；抗過敏特異性復(fù)合IgY 300g阿斯巴甜240g香橙香精600g水蜜桃香精 200g薄荷香精1400g蒸餾水 加至200升先取蒸餾水180升，然后分別加入阿斯巴甜、香精，攪拌均勻，再邊攪拌邊緩緩加入復(fù)合IgY；接著加蒸餾水至200升，充分?jǐn)嚢杈鶆?，測量溶液pH值，根據(jù)所測的pH值用1.oNNaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.5-7.5；溶液調(diào)配好后，必須在壓力罐生產(chǎn)線上灌裝手動定量壓力噴霧罐20000支，每支噴霧罐灌足10ml后，必須再充入壓力氮?dú)饣蛘叻锇鹤鳛橹苿?拋射劑)，裝上定量閥門，密封，即得。
實(shí)施例10制備抗過敏定量常壓噴霧罐抗霉菌過敏原特異性純IgY干粉100重量份，抗寵物過敏特異性純IgY干粉100重量份，，抗IgE特異性IgY干粉100重量份，加入小型攪拌機(jī)中充分混和，制成抗過敏特異性復(fù)合IgY干粉300重量份，；按以下配方調(diào)配200重量份抗過敏復(fù)合IgY組合溶液；抗過敏特異性復(fù)合IgY 300重量份，阿斯巴甜 240重量份，香橙香精 600重量份，水蜜桃香精 200重量份，薄荷香精 1400重量份，蒸餾水 加至200體積份先取蒸餾水180體積份，然后分別加入阿斯巴甜、香精，攪拌均勻，再邊攪拌邊緩緩加入復(fù)合IgY；接著加蒸餾水至200體積份，充分?jǐn)嚢杈鶆?，測量溶液pH值，根據(jù)所測的pH值用1.0N NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.5-7.5間；經(jīng)細(xì)菌過濾除菌，灌裝手撳定量常壓噴霧罐20000支，每支10ml，每支灌裝滿10ml。
權(quán)利要求
1.一種抗過敏特異性IgY，其特征在于該抗過敏特異性IgY的制備方法包括下列步驟篩選出引致過敏性疾病的過敏原，在篩選和分類組合各種過敏原的基礎(chǔ)上，分別制備單一或復(fù)合的過敏原抗原；制備免疫球蛋白IgE抗原；制備免疫蛋，制備抗各種過敏原特異性IgY粗提物，制備抗IgE特異性IgY粗提物；抗各種過敏原特異性IgY粗提物和抗IgE特異性IgY粗提物的純化；制備抗某一種或多種特定過敏原的特異性復(fù)合IgY。
2.如權(quán)利要求1所述的抗過敏特異性IgY，其特征在于該抗過敏特異性IgY的制備方法包括下列步驟篩選出引致過敏性疾病的過敏原；在篩選和分類組合各種過敏原的基礎(chǔ)上，分別制備單一或復(fù)合的過敏原抗原，將各組別單一或混合的過敏原提取液或制劑，按1-10∶1-10比例加入福氏佐劑，再置入高速勻漿機(jī)中，高速攪拌形成油包水乳液，即制成單一或復(fù)合過敏原抗原；制備免疫球蛋白IgE抗原可以從人體特別是過敏癥患者的血清中提取IgE，或購買現(xiàn)成的IgE免疫球蛋白作為抗原原料，將IgE免疫球蛋白按1-10∶1-10比例配以福氏佐劑，置入高速勻漿機(jī)中，高速勻化，即制成IgE抗原；制備免疫蛋用各種單一或復(fù)合過敏原抗原或IgE抗原，分別對產(chǎn)蛋雞進(jìn)行免疫，每隔二周再強(qiáng)化注射一次，一個(gè)月計(jì)免疫三次，第一次免疫20天后，檢取雞所產(chǎn)免疫蛋，并對相應(yīng)不同的抗原，對所檢取的免疫蛋進(jìn)行編碼標(biāo)記；抗各種過敏原特異性IgY粗提物的制備流動水逐個(gè)洗凈免疫蛋，再用酒精擦洗消毒；用打蛋機(jī)擊破蛋，蛋黃篩取出蛋黃，攪打蛋黃均勻，按蛋黃液量加入4-6倍蒸餾水稀釋，攪拌均勻，用1.0N的Hcl調(diào)pH至5.5-6.0，2-6℃靜置12-24小時(shí)，虹吸得取上清液，稱A液；將以上沉淀液以8000rpm離心20分種，得取上清液，稱B液；將A液和B液混和均勻，超濾，得到超濾濃縮液，加入2.0％海藻酸鈉液，至終濃度為1.0‰，攪拌直至渾濁沉淀，加入2.0％氯化鈣液，至終濃度1.0‰，攪拌均勻，2-6℃靜置過夜，8000rpm離心30分種，取上清液，進(jìn)而通過細(xì)菌過濾器除菌，得到無菌濾液，冷凍干燥，即為IgY粗提物，最后把所制備的抗各種不同抗原的IgY粗提物進(jìn)行編碼標(biāo)記；抗各種過敏原特異性IgY粗提物和抗IgE特異性IgY粗提物的純化將以上工藝所制取的抗各種過敏原特異性IgY和抗IgE特異性IgY粗提物分別先后過離子交換柱和凝膠層析柱，即得純IgY；制備抗某一種或多種特定過敏原的特異性復(fù)合IgY不同抗原制得的純IgY，同樣按照上述各自不同的編碼標(biāo)記嚴(yán)格標(biāo)記以便區(qū)分，將一種抗過敏特異性IgY或多種抗過敏特異性IgY混合物與抗IgE特異性IgY按1-10∶1-10的比例混合均勻，然后加配制成溶劑，即得。
3.如權(quán)利要求1或2所述的抗過敏特異性IgY，其特征在于該抗過敏特異性IgY的制備方法中引致過敏性疾病的過敏原可以是任何蛋白質(zhì)過敏原。
4.如權(quán)利要求3所述的抗過敏特異性IgY，其特征在于蛋白質(zhì)過敏原是指花粉過敏原，塵螨過敏原，霉菌過敏原，蟑螂過敏原，寵物過敏原。
5.如權(quán)利要求1、2或3所述的抗過敏特異性IgY，其特征在于該抗過敏特異性IgY的制備方法中也可以直接將花粉、塵螨、霉菌、蟑螂碎片、寵物皮毛屑等加入福氏佐劑混合后，置入高速勻漿機(jī)中，以10000～30000rpm進(jìn)行高速粉碎勻化，形成油包水液，制得含全菌和菌體成份或含全部致敏蛋白質(zhì)成份的復(fù)合抗原。
6.如權(quán)利要求1、2或3所述的抗過敏特異性IgY，其特征在于該抗過敏特異性IgY的制備方法中也可應(yīng)用同樣的免疫技術(shù)，用各種單一或復(fù)合過敏原抗原以及IgE抗原，分別對產(chǎn)蛋鴨進(jìn)行免疫。
7.如權(quán)利要求1、2或3所述的抗過敏特異性IgY，其特征在于該抗過敏特異性IgY的制備方法中也可將抗IgE特異性IgY干粉和抗某一種過敏原的特異性IgY或多種抗過敏特異性IgY混合物干粉按1-10∶1-10比例混合直接制成粉劑。
8.如權(quán)利要求6所述的抗過敏特異性IgY，其特征在于該抗過敏特異性IgY的制備方法中上述多種抗過敏特異性IgY混合物是選用多種抗相應(yīng)的不同過敏原的特異性IgY，先將它們按1-10∶1-10或1-10∶1-10∶1-10或1-10∶1-10∶1-10∶1-10依此類推的比例均勻混合制成。
9.如權(quán)利要求1或2所述的抗過敏特異性IgY，其特征在于該抗過敏特異性IgY可以制成臨床可接受的劑型。
10.一種抗粉塵螨特異性IgY，其特征在于該抗粉塵螨特異性IgY的制備方法包括下列步驟將市面上購得的現(xiàn)成的粉塵螨注射液按1∶1比例與福氏佐劑混勻，置于高速勻漿機(jī)，以20000rpm進(jìn)行高速勻化，制得乳狀勻質(zhì)抗原；用所制得的粉塵螨抗原對良種蛋雞進(jìn)行免疫，采用皮下注射和翅靜脈注射相結(jié)合的免疫法，每只雞每次注射1-2ml抗原，相當(dāng)于約5000-10000只塵螨；每隔二周再強(qiáng)化注射一次，一個(gè)月內(nèi)計(jì)免疫3次；第一次免疫20天后，檢取雞所產(chǎn)免疫蛋；用酒精擦洗消毒免疫蛋，用打蛋機(jī)擊破蛋，蛋黃篩取出蛋黃，攪打蛋黃均勻，按蛋黃液量加入4-6倍蒸餾水稀釋，攪拌均勻，用0.1N的Hcl調(diào)整pH5.5-6.0，2-6℃，靜置過夜，虹吸得取上清液，稱A液；以上沉淀液以8000rpm離心20分鐘，得取上清液，稱B液；將A液和B液混和均勻，超濾，得取超濾濃縮液，加入2.0％海藻酸鈉液，至終濃度為1.0‰，攪拌，加入2.0％氯化鈣液，至終濃度1.0‰，攪拌均勻，2-6℃靜置過夜，8000rmp離心30分鐘，取上清液，細(xì)菌過濾器過濾，得到無菌濾液，冷凍干燥，即為抗粉塵螨特異性IgY粗提物；將以上IgY粗提取物溶解于pH7.0、0.01MPB，經(jīng)DEAE-SephadexA50柱層析和SephadexG200凝膠柱層析，得到純抗粉塵螨特異性IgY。
11.一種抗粉塵螨特異性鴨IgY，其特征在于該抗粉塵螨特異性鴨IgY的制備方法包括下列步驟將粉塵螨注射液按3∶2比例與福氏佐劑混勻，置于高速勻漿機(jī)，以20000rpm進(jìn)行高速勻化，制得乳狀勻質(zhì)抗原；用所制得的粉塵螨抗原對良種蛋鴨進(jìn)行免疫，采用皮下注射和翅靜脈注射相結(jié)合的免疫法，每只鴨每次注射1-2ml抗原，相當(dāng)于約5000-10000只塵螨；每隔二周再注射一次，計(jì)免疫3次；第一次免疫注射20天后，檢取鴨所產(chǎn)免疫蛋；用酒精擦洗消毒免疫蛋，用打蛋機(jī)擊破蛋，蛋黃篩取出蛋黃，攪打蛋黃均勻，按蛋黃液量加入4-6倍蒸餾水稀釋，攪拌均勻，用0.1N的Hcl調(diào)整pH5.5-6.0，2-6℃靜置過夜，虹吸得取上清液，稱A液；以上沉淀液以8000rpm離心20分鐘，得取上清液，稱B液；將A液和B液混和均勻，超濾，得取超濾濃縮液，加入2.0％海藻酸鈉液，至終濃度為1.0‰，攪拌，加入2.0％氯化鈣液，至終濃度1.0‰，攪拌均勻，2-6℃靜置過夜，8000rmp離心30分鐘，取上清液，細(xì)菌過濾器過濾，得到無菌濾液，冷凍干燥，即為抗粉塵螨特異性鴨IgY；將以上IgY粗提取物溶解于pH7.0、0.01MPB，經(jīng)DEAE-SephadexA50柱層析和SephadexG200凝膠柱層析，得到純抗粉塵螨特特異性鴨IgY。
12.抗蒿草花粉、抗豚草花粉、抗藜草花粉和抗藻草花粉四種特異性IgY，其特征在于該四種特異性IgY的制備方法包括下列步驟分別用蒿草花粉、豚草花粉、藜草花粉和藻草花粉制備抗原，首先將所采集的四種花粉分別用高速勻漿機(jī)以10000rpm轉(zhuǎn)速高速粉碎，然后按5∶4比例分別加入福氏佐劑，再在高速勻漿機(jī)中以20000rpm高速勻化，分別制得四種乳狀花粉蛋白抗原；用所制得的蒿草花粉等抗原分別對良種蛋雞進(jìn)行免疫，同樣采用皮下注射和翅靜脈注射相結(jié)合的免疫法，每只雞每次注射1.5ml抗原，相當(dāng)于約50-100μg花粉蛋白質(zhì)；每隔二周再強(qiáng)化注射一次，一個(gè)月內(nèi)計(jì)免疫3次；第一次免疫20天后，分別檢取雞所產(chǎn)免疫蛋；用酒精擦洗消毒免疫蛋，用打蛋機(jī)擊破蛋，蛋黃篩取出蛋黃，攪打蛋黃均勻，按蛋黃液量加入4-6倍蒸餾水，靜置過夜，虹吸得取上清液，稱A液；以上沉淀液以8000rpm離心20分鐘，得取上清液，稱B液；將A液和B液混和均勻，超濾，得到超濾濃縮液，加入2.0％海藻酸鈉液，至終濃度為1.0‰，攪拌，加入2.0％氯化鈣液，至終濃度1.0‰，攪拌均勻，2-6℃靜置過夜，8000rmp離心30分鐘，取上清液，細(xì)菌過濾器過濾，得到無菌濾液，冷凍干燥，分別制得抗蒿草花粉、抗豚草花粉、抗藜草花粉和抗藻草花粉特異性IgY粗提物干粉；將以上IgY粗提取物分別溶解于pH7.0、0.01MPB，分別先后經(jīng)DEAE-SephadexA50柱層析和SephadexG200凝膠柱層析，把粗提物純化，即得抗蒿草花粉、抗豚草花粉、抗藜草花粉和抗藻草花粉四種特異性純IgY。
13.一種抗霉菌過敏原特異性IgY，其特征在于該特異性IgY的制備方法包括下列步驟用煙曲霉菌、土曲霉菌、棒曲霉菌、黑曲霉菌、黃曲霉菌混合制作抗原將以上4種霉菌分別按常規(guī)培養(yǎng)后，制取菌液；各菌液以1∶1∶1∶1比例混合，制成混合菌液；將此混合菌液按6∶7比例加入福氏佐劑，然后置高速勻漿機(jī)以20000rpm高速勻化，制得4種霉菌混合抗原；用此混合抗原對良種蛋雞進(jìn)行免疫，同樣采用皮下注射和翅靜脈注射相結(jié)合的免疫法，每只雞每次注射1.0ml抗原，相當(dāng)于約200μg蛋白質(zhì)抗原；每隔二周再強(qiáng)化注射一次，一個(gè)月內(nèi)計(jì)免疫3次；第一次免疫20天后，檢取雞所產(chǎn)免疫蛋；用酒精擦洗消毒免疫蛋，用打蛋機(jī)擊破蛋，蛋黃篩取出蛋黃，攪打蛋黃均勻，按蛋黃液量加入4-6倍蒸餾水靜置過夜，虹吸得取上清液，稱A液；以上沉淀液以8000rpm離心20分鐘，得取上清液，稱B液；將A液和B液混和均勻，超濾，得到超濾濃縮液，加入2.0％海藻酸鈉液，至終濃度為1.0‰，攪拌，加入2.0％氯化鈣液，至終濃度1.0‰，攪拌均勻，2-6℃靜置過夜，8000rmp離心30分鐘，取上清液，細(xì)菌過濾器過濾，得到無菌濾液，冷凍干燥，即制得抗煙曲霉菌、抗土曲霉菌、抗棒曲霉菌、抗黑曲霉菌、抗黃曲霉菌特異性IgY粗提物干粉；將以上IgY粗提取物溶解于PH7.0、0.01MPB，經(jīng)DEAE-SephadexA50柱層析和SephadexG200凝膠柱層析，即得抗霉菌過敏原特異性純IgY。
14.一種抗寵物過敏的特異性IgY，其特征在于該特異性IgY的制備方法包括下列步驟取貓唾液和尿液按1∶1比例混合，取混合物按7∶8比例加入福氏佐劑，置入高速勻漿機(jī)以20000rpm轉(zhuǎn)速高速混勻，制得乳狀貓抗原；用所制得的乳狀貓抗原對良種蛋雞進(jìn)行免疫，同樣采用皮下注射和翅靜脈注射相結(jié)合的免疫法，每只雞每次注射1-2ml抗原，相當(dāng)于約50-100μg蛋白質(zhì)抗原；每隔二周再強(qiáng)化注射一次，一個(gè)月內(nèi)計(jì)免疫3次；第一次免疫20天后，檢取雞所產(chǎn)免疫蛋；用酒精擦洗消毒免疫蛋，用打蛋機(jī)擊破蛋，蛋黃篩取出蛋黃，攪打蛋黃均勻，按蛋黃液量加入4-6倍蒸餾水，靜置過夜，虹吸得取上清液，稱A液；以上沉淀液以8000rpm離心20分鐘，得取上清液，稱B液；將A液和B液混和均勻，超濾，得到超濾濃縮液，加入2.0％海藻酸鈉液，至終濃度為1.0‰，攪拌，加入2.0％氯化鈣液，至終濃度1.0‰，攪拌均勻，2-6℃靜置過夜，8000rmp離心30分鐘，取上清液，細(xì)菌過濾器過濾，得到無菌濾液，冷凍干燥，即制得抗寵物過敏的特異性IgY粗提物成品；將以上IgY粗提取物溶解于PH7.0、0.01MPB，經(jīng)DEAE-SephadexA50柱層析和SephadexG200凝膠柱層析，即得抗寵物過敏的特異性純IgY。
15.一種抗蟑螂過敏特異性IgY，其特征在于該特異性IgY的制備方法包括下列步驟收集30-50只的蟑螂，剪去其翅膀，將其軀干集中置入高速勻漿機(jī)以10000rpm進(jìn)行粉碎；然后按蟑螂碎屑的重量，以6∶8的重量比加入福氏佐劑，再在高速勻漿機(jī)中以20000rpm高速粉碎勻化，制得乳狀蟑螂蛋白抗原；用所制得的蟑螂抗原對良種蛋雞進(jìn)行免疫，采用皮下注射和翅靜脈注射相結(jié)合的強(qiáng)化免疫法，每只雞每次注射1-2ml抗原，相當(dāng)于50-100微克蛋白質(zhì)；每隔二周再強(qiáng)化注射一次，一個(gè)月內(nèi)計(jì)免疫3次；第一次免疫20天后，檢取雞所產(chǎn)免疫蛋；用酒精擦洗消毒免疫蛋，用打蛋機(jī)擊破蛋，蛋黃篩取出蛋黃，攪打蛋黃均勻，按蛋黃液量加入4-6倍蒸餾水稀釋，攪拌均勻，用0.1N的Hcl調(diào)整pH5.5-6.0，2-6℃，靜置過夜，虹吸得取上清液，稱A液；以上沉淀液以8000rpm離心20分鐘，得取上清液，稱B液；將A液和B液混和均勻，超濾，得取超濾濃縮液，加入2.0％海藻酸鈉液，至終濃度為1.0‰，攪拌，加入2.0％氯化鈣液，至終濃度1.0‰，攪拌均勻，2-6℃靜置過夜，8000rmp離心30分鐘，取上清液，細(xì)菌過濾器過濾，得到無菌濾液，冷凍干燥，即為抗蟑螂過敏特異性IgY粗提物；將以上IgY粗提物溶解于PH7.0、0.01MPB，經(jīng)DEAE-SephadexA50柱層析和SephadexG200凝膠柱層析，得抗蟑螂過敏特異性純IgY。
16.一種抗IgE特異性IgY，其特征在于該特異性IgY的制備方法包括下列步驟將免疫球蛋白IgE按3∶5比例與福氏佐劑混合，然后加入高速勻漿機(jī)以10000rpm高速勻化，制得IgE抗原；用所制得的IgE抗原對良種蛋雞進(jìn)行免疫，采用皮下注射和翅靜脈注射相結(jié)合的免疫法，每只雞每次注射1-2ml抗原，相當(dāng)于50-100微克蛋白質(zhì)；每隔二周再強(qiáng)化注射一次，一個(gè)月內(nèi)計(jì)免疫3次；第一次免疫20天后，檢取雞所產(chǎn)免疫蛋；用酒精擦洗消毒免疫蛋，用打蛋機(jī)擊破蛋，蛋黃篩取出蛋黃，攪打蛋黃均勻，按蛋黃液量加入4-6倍蒸餾水稀釋，攪拌均勻，用0.1N的Hcl調(diào)整pH5.5-6.0，2-6℃，靜置過夜，虹吸得取上清液，稱A液；以上沉淀液以8000rpm離心20分鐘，得取上清液，稱B液；將A液和B液混和均勻，超濾，得取超濾濃縮液，加入2.0％海藻酸鈉液，至終濃度為1.0‰，攪拌，加入2.0％氯化鈣液，至終濃度1.0‰，攪拌均勻，2-6℃靜置過夜，8000rmp離心30分鐘，取上清液，細(xì)菌過濾器過濾，得到無菌濾液，冷凍干燥，即為抗IgE特異性IgY粗提取物；將以上IgY粗提取物溶解于PH7.0、0.01MPB，經(jīng)DEAE-SephadexA50柱層析和SephadexG200凝膠柱層析，得抗IgE特異性純IgY。
17.一種抗哮喘特異性復(fù)合IgY，其特征在于該抗哮喘特異性復(fù)合IgY由抗粉塵螨特異性IgY干粉1重量份抗蒿草花粉特異性IgY 1重量份抗IgE特異性IgY干粉 1重量份，充分混和制成。
18.一種抗哮喘IgY制劑，其特征在于該制劑中每升含有抗哮喘特異性復(fù)合IgY8-12克。
19.一種抗哮喘噴霧劑的制備方法，其特征在于該方法為抗粉塵螨特異性IgY干粉100重量份，抗蒿草花粉特異性IgY100重量份，抗IgE特異性IgY干粉100重量份加入小型攪拌機(jī)中充分混和，得到抗哮喘特異性復(fù)合IgY300重量份；按以下配方調(diào)配30升抗哮喘復(fù)合IgY組合溶液抗哮喘特異性復(fù)合IgY300重量份阿斯巴甜 36重量份香橙香精 90重量份水蜜桃香精 30重量份生理鹽水 加至30000重量份先調(diào)制生理鹽水25000重量份，然后加入阿斯巴甜和香精，攪拌均勻后，再邊攪拌邊緩緩加入復(fù)合IgY；接著，加生理鹽水至30體積份，充分?jǐn)嚢杈鶆颍粶y量溶液的pH值，用1.0NNaOH溶液調(diào)pH至6.5-7.5；經(jīng)細(xì)菌過濾除菌，最后采用無菌瓶灌裝抗哮喘復(fù)合噴霧劑。
20.一種抗過敏特異性復(fù)合IgY，其特征在于該抗過敏特異性復(fù)合IgY由抗豚草特異性IgY干粉 1重量份、抗蟑螂過敏原特異性IgY干粉1重量份、抗IgE特異性IgY干粉 1重量份，充分混和制成。
21.如權(quán)利要求20所述的抗過敏復(fù)合IgY制劑，其特征在于該制劑中每200升含有抗過敏特異性復(fù)合IgY300克左右。
22.一種抗過敏噴霧劑的制備方法，其特征在于該方法為抗豚草特異性IgY干粉100重量份，抗蟑螂過敏原特異性IgY干粉100重量份，抗IgE特異性IgY干粉100重量份加入小型攪拌機(jī)中充分混和，制成抗過敏特異性復(fù)合IgY干粉300重量份；按以下配方調(diào)配200000重量份抗過敏復(fù)合IgY組合溶液；抗過敏特異性復(fù)合IgY 300重量份阿斯巴甜 240重量份香橙香精 600重量份水蜜桃香精200重量份薄荷香精 1400重量份蒸餾水加至200000重量份先取蒸餾水180000重量份，然后分別加入阿斯巴甜、香精，攪拌均勻，再邊攪拌邊緩緩加入復(fù)合IgY；接著加蒸餾水至200000重量份，充分?jǐn)嚢杈鶆?，測量溶液pH值，根據(jù)所測的pH值用1.0N NaOH溶液調(diào)pH至6.5-7.5；溶液調(diào)配好后，經(jīng)細(xì)菌過濾除菌，最后在壓力罐生產(chǎn)線上無菌灌裝手動定量壓力噴霧罐。每支噴霧罐灌足10ml后，再充入壓力氮?dú)饣蛘叻锇旱茸鳛橹苿?拋射劑)，裝上定量閥門，密封，即得。
23.一種抗過敏特異性復(fù)合IgY，其特征在于該抗過敏特異性復(fù)合IgY由抗霉菌過敏原特異性IgY干粉 1重量份、抗寵物過敏特異性純IgY干粉 1重量份、抗IgE特異性IgY干粉 1重量份，充分混和制成。
24.如權(quán)利要求23所述的抗過敏復(fù)合IgY制劑，其特征在于該制劑中每200升含有抗過敏特異性復(fù)合IgY300克左右。
25.一種抗過敏噴霧劑的制備方法，其特征在于該方法為抗霉菌過敏原特異性純IgY干粉100重量份，抗寵物過敏特異性純IgY干粉100重量份，，抗IgE特異性IgY干粉100重量份，加入小型攪拌機(jī)中充分混和，制成抗過敏特異性復(fù)合IgY干粉300重量份，；按以下配方調(diào)配200000重量份抗過敏復(fù)合IgY組合溶液；抗過敏特異性復(fù)合IgY 300重量份，阿斯巴甜 240重量份，香橙香精 600重量份，水蜜桃香精 200重量份，薄荷香精 1400重量份，蒸餾水 加至200000重量份先取蒸餾水180000重量份，然后分別加入阿斯巴甜、香精，攪拌均勻，再邊攪拌邊緩緩加入復(fù)合IgY；接著加蒸餾水至200000重量份，充分?jǐn)嚢杈鶆?，測量溶液pH值，根據(jù)所測的pH值用1.0N NaOH溶液調(diào)pH至6.5-7.5；經(jīng)細(xì)菌過濾除菌，最后無菌灌裝手撳定量常壓噴霧罐。
26.如權(quán)利要求2所述的抗過敏特異性IgY，其特征在于該抗過敏特異性IgY的制備方法中單一或復(fù)合的過敏原抗原與福氏佐劑的比例可以是3∶2。
27.如權(quán)利要求2所述的抗過敏特異性IgY，其特征在于該抗過敏特異性IgY的制備方法中單一或復(fù)合的過敏原抗原與福氏佐劑的比例可以是3∶5。
28.如權(quán)利要求2所述的抗過敏特異性IgY，其特征在于該抗過敏特異性IgY的制備方法中單一或復(fù)合的過敏原抗原與福氏佐劑的比例可以是5∶4。
29.如權(quán)利要求2所述的抗過敏特異性IgY，其特征在于該抗過敏特異性IgY的制備方法中單一或復(fù)合的過敏原抗原與福氏佐劑的比例可以是6∶7。
30.如權(quán)利要求2所述的抗過敏特異性IgY，其特征在于該抗過敏特異性IgY的制備方法中單一或復(fù)合的過敏原抗原與福氏佐劑的比例可以是7∶8。
31.如權(quán)利要求2所述的抗過敏特異性IgY，其特征在于該抗過敏特異性IgY的制備方法中單一或復(fù)合的過敏原抗原與福氏佐劑的比例可以是6∶8。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗過敏特異性IgY及其制備方法，本發(fā)明制備方法包括下列步驟篩選出引致過敏性疾病的過敏原，在篩選和分類組合各種過敏原的基礎(chǔ)上，分別制備單一或復(fù)合的過敏原抗原，制備免疫球蛋白IgE抗原，制備免疫蛋，制備抗各種過敏原特異性IgY粗提物，抗各種過敏原特異性IgY粗提物和抗IgE特異性IgY粗提物的純化，制備抗某一種特定過敏原的特異性復(fù)合IgY。本發(fā)明特異性IgY制劑用于哮喘等過敏性疾病的預(yù)防和治療具有特效、安全、使用方便的特點(diǎn)。
文檔編號A61P11/06GK1513558SQ0214602
公開日2004年7月21日 申請日期2002年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月25日
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