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新型人磷脂酰乙醇胺結合蛋白,其編碼序列及用途的制作方法

文檔序號:1178187閱讀:296來源:國知局
專利名稱:新型人磷脂酰乙醇胺結合蛋白,其編碼序列及用途的制作方法
技術領域
本發(fā)明屬于生物技術和醫(yī)學領域,具體地說,本發(fā)明涉及新的磷脂酰乙醇胺結合蛋白5,即PEBP 5(phosphatidylethanolamine binding protein 5,PEBP5)及其多核苷酸編碼序列。本發(fā)明還涉及此多核苷酸和多肽的用途和制備。本發(fā)明的PEBP 5多肽是一種新的與核苷酸結合,在信號轉導中發(fā)揮作用的分子。
背景技術
PEBP蛋白是一類能與磷脂酰乙醇胺(PE)結合的蛋白。該家族的所有成員都含有與PE結合的保守區(qū)域,PEBP家族種族來源廣泛,包括果蠅觸覺的氣味結合蛋白(OBP)、盤尾絲吸蟲感染后的免疫血清識別的抗原Ag16,酵母中抑制CDC25突變的因子CEN,哺乳動物的Raf-kinase inhibitor,RKIP,等等PEBP存在于組織細胞液,不存在于血清,淋巴液和乳液。在大腦特別是少突狀足細胞和男性生殖器官高表達,在膜的生物合成和維持膜隔離抗原中扮演著重要的角色。人和小鼠大腦中PEBP為十一氨基酸多肽海馬趾類膽堿神經(jīng)刺激肽(HCNP)前體蛋白,而HCNP促進乙酰膽堿的合成。牛腦PEBP與信號轉導通路中涉及到的多種核苷酸結合,在小G蛋白存在的情況,結合GTP和GDP。最近有人發(fā)現(xiàn)PEBP是一種新的絲氨酸蛋白酶抑制劑。hPEBP通過促進GDP/GTP的交換,活化異三聚體G蛋白依賴的信號轉導途徑。而且G蛋白偶聯(lián)受體如人類μ鴉片肽受體,人類生長抑素受體介導的信號轉導都涉及到人類PEBP(hPBEP)。PEBP能使胞內(nèi)的cAMP水平降低,推測與Gαi亞基的激活有關。Raf-1、絲裂原激活蛋白(MAP)、ERK都與hPBP中高度保守的區(qū)域結合,但是MEK和Raf-1競爭性地結合PEBP,因此RKIP分離MEK和Raf-1復合物,抑制MEK的活化。凋亡早期涉及到膜磷脂不對稱的消失,存在膜內(nèi)側面的磷脂酰乙醇胺和磷脂酰絲氨酸外翻,PEBP可能通過與胞內(nèi)側的磷脂酰乙醇胺結合,防止磷脂酰乙醇氨的外翻,抑制膜磷脂不對稱的丟失。進而抵抗TNF-a引起的凋亡。可見,PEBP家族成員功能廣泛,涉及到抵抗凋亡,膜形成,精子的成熟等各方面的生理功能。
鑒于磷脂酰乙醇胺結合蛋白的重要作用,本領域迫切需要開發(fā)新的磷脂酰乙醇胺結合蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的人磷脂酰乙醇胺結合蛋白PEBP5蛋白以及其片段、類似物和衍生物。
本發(fā)明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。
本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途。
在本發(fā)明的第一方面,提供新穎的分離出的PEBP5多肽,該多肽是人源的,它包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。較佳地,該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽;(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的,且具有信號轉導功能的由(a)衍生的多肽。
在本發(fā)明的第二方面,提供編碼分離的這些多肽的多核苷酸,該多核苷酸包含一核苷酸序列,該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70%相同性(a)編碼上述人PEBP5的多核苷酸;和(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。較佳地,該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。更佳地,該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中1-874位的序列;(b)具有SEQ ID NO1中66-746位的序列。
在本發(fā)明的第三方面,提供了含有上述多核苷酸的載體,以及被該載體轉化或轉導的宿主細胞或者被上述多核苷酸直接轉化或轉導的宿主細胞。
在本發(fā)明的第四方面,提供了制備具有人PEBP5蛋白活性的多肽的方法,該方法包含(a)在適合表達人PEBP5蛋白的條件下,培養(yǎng)上述被轉化或轉導的宿主細胞;(b)從培養(yǎng)物中分離出具有人PEBP5蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的第五方面,提供了與上述的人PEBP5多肽特異性結合的抗體。還提供了可用于檢測的核酸分子,它含有上述的多核苷酸中連續(xù)的10-874個核苷酸。
在本發(fā)明的第六方面,提供了模擬、促進、拮抗人PEBP5多肽活性的化合物,以及抑制人PEBP5多肽的表達的化合物。還提供了篩選和/或制備這些化合物的方法。較佳地,該化合物是人PEBP5多肽的編碼序列或其片段的反義序列。
在本發(fā)明的第七方面,提供了檢測樣品中是否存在PEBP5蛋白的方法,它包括將樣品與PEBP5蛋白的特異性抗體接觸,觀察是否形成抗體復合物,形成了抗體復合物就表示樣品中存在PEBP5蛋白。
在本發(fā)明的第八方面,提供了一種檢測與人PEBP5多肽異常表達相關的疾病或疾病易感性的方法,該方法包括檢測編碼所述多肽的核酸序列中是否存在突變。
在本發(fā)明的第九方面,提供了本發(fā)明多肽和編碼序列的用途。例如本發(fā)明多肽可被用于篩選促進人PEBP5多肽活性的激動劑,或者篩選抑制人PEBP5多肽活性的拮抗劑、或者被用于肽指紋圖譜鑒定。本發(fā)明的人PEBP5蛋白的編碼序列或其片段,可被作為引物用于PCR擴增反應,或者作為探針用于雜交反應,或者用于制造基因芯片或微陣列。
在本發(fā)明的第十方面,提供了一種藥物組合物,它含有安全有效量的本發(fā)明的人PEBP5多肽或其激動劑、拮抗劑以及藥學上可接受的載體。這些藥物組合物可治療腫瘤、炎癥、神經(jīng)系統(tǒng)和心血管病等病癥。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術的公開,對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖1是本發(fā)明的人PEBP5蛋白與其他PEBP蛋白的氨基酸序列同源性比較圖。上方序列是人PEBP5,下方序列是大鼠PEBP蛋白。相同的氨基酸在多個個序列之間用黑體標出,相似的氨基酸用灰體標出。圓圈所示氨基酸殘基為唾液酸結合所必需的殘基;箭頭標出不同結構域的界限;圖2是本發(fā)明的人PEBP5 RT-PCR表達分析,提示PEBP表達于某些腫瘤細胞以及人正常組織細胞圖3是本發(fā)明的人PEBP5 Northern印跡雜交所顯示的分布。結果提示PEBP5是一種具特定組織分布的分子。
具體實施例方式
本發(fā)明人利用cDNA文庫大規(guī)模測序和EST同源比較的方法,從正常人骨髓基質(zhì)細胞中分離到一種新型全長基因,全長874bp,含681bp編碼區(qū),編碼227個氨基酸,與其他分子比較發(fā)現(xiàn)與磷脂酰乙醇結合蛋白(PEBP)具有一定的同源性,在75位到195位為磷脂酰乙醇胺結合保守區(qū)域,迄今為之,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了4個人來源的PEBP,所以將之命名為PEBP5。RT-PCR分析顯示在睪丸、卵巢、甲狀腺、腎,前列腺癌以及造血細胞腫瘤Daudi表達。Northern顯示在甲狀腺、心肌和腦特異性表達,特別是腦,每個部位都為高表達??梢酝茰yPEBP5與神經(jīng)活動,大腦的發(fā)育有關可能調(diào)控多種生理和病理活動,發(fā)揮重要作用,并可能在抗感染、抗炎癥反應、抗腫瘤以及神經(jīng)生長修復、免疫功能調(diào)節(jié)等多個領域的免疫診斷和免疫治療方面具有重要的開發(fā)和應用價值。研究已表明,PEBP家族蛋白與多種生命活動相關。因此,為診斷和治療目的研究和開發(fā)新的人磷脂酰乙醇胺結合蛋白PEBP5有重要意義。
在本發(fā)明中,術語“PEBP5蛋白”、“PEBP5多肽”、“磷脂酰乙醇胺結合蛋白5”或“磷脂酰乙醇胺結合蛋白PEBP5”可互換使用,都指具有人磷脂酰乙醇胺結合蛋白PEBP5氨基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽。
如本文所用,“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì),原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的,但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開,則為分離純化的。
如本文所用,“分離的PEBP5蛋白或多肽”是指PEBP5多肽基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領域的技術人員能用標準的蛋白質(zhì)純化技術純化PEBP5蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽,優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物,或是化學合成的產(chǎn)物,或使用重組技術從原核或真核宿主(例如,細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主,本發(fā)明的多肽可以是糖基化的,或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明還包括人PEBP5蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用,術語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然人PEBP5蛋白相同的生物學功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽,而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的,或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽,或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物,例如聚乙二醇)融合所形成的多肽,或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列,或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據(jù)本文的教導,這些片段、衍生物和類似物屬于本領域熟練技術人員公知的范圍。
在本發(fā)明中,術語“人PEBP5多肽”指具有人PEBP5蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。該術語還包括具有與人PEBP5蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個,較佳地1-30個,更佳地1-20個,最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代,以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi),較佳地為10個以內(nèi),更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如,在本領域中,用性能相近或相似的氨基酸進行取代時,通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如,在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術語還包括人PEBP5蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與人PEBP5 DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人PEBP5多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽,如包含人PEBP5多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外,本發(fā)明還包括了人PEBP5多肽的可溶性片段。通常,該片段具有人PEBP5多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸,通常至少約30個連續(xù)氨基酸,較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸,更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸,最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供人PEBP5蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人PEBP5多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異,也可以是不影響序列的修飾形式上的差異,或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到,如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機誘變,還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物,以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應理解,本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化,如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸,磷酸絲氨酸,磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中,“人PEBP5蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID NO2的氨基酸序列相比,有至多10個,較佳地至多8個,更佳地至多5個,最佳地至多3個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表1


本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用,“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO2的蛋白質(zhì),但與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列;成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列;成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸,也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體,其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的,等位變異體是一個多核苷酸的替換形式,它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入,但不會從實質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50%,較佳地至少70%,更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中,“嚴格條件”是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫,如0.2×SSC,0.1%SDS,60℃;或(2)雜交時加有變性劑,如50%(v/v)甲酰胺,0.1%小牛血清/0.1%Ficoll,42℃等;或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90%以上,更好是95%以上時才發(fā)生雜交。并且,可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物學功能和活性。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用,“核酸片段”的長度至少含15個核苷酸,較好是至少30個核苷酸,更好是至少50個核苷酸,最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴增技術(如PCR)以確定和/或分離編碼PEBP5蛋白的多聚核苷酸。
本發(fā)明中的多肽和多核苷酸優(yōu)選以分離的形式提供,更佳地被純化至均質(zhì)。
本發(fā)明的人PEBP5核苷酸全長序列或其片段通??梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法,可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關核苷酸序列,尤其是開放閱讀框序列來設計引物,并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板,擴增而得有關序列。當序列較長時,常常需要進行兩次或多次PCR擴增,然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列,就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體,再轉入細胞,然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外,還可用人工合成的方法來合成有關序列,尤其是片段長度較短時。通常,通過先合成多個小片段,然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
目前,已經(jīng)可以完全通過化學合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段,或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外,還可通過化學合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
應用PCR技術擴增DNA/RNA的方法(Saiki,et al. Science1985;2301350-1354)被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。特別是很難從文庫中得到全長的cDNA時,可優(yōu)選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴增法),用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的序列信息適當?shù)剡x擇,并可用常規(guī)方法合成??捎贸R?guī)方法如通過凝膠電泳分離和純化擴增的DNA/RNA片段。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體,以及用本發(fā)明的載體或PEBP5蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細胞,以及經(jīng)重組技術產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
通過常規(guī)的重組DNA技術(Science,1984;2241431),可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來表達或生產(chǎn)重組的PEBP5多肽。一般來說有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼人PEBP5多肽的多核苷酸(或變異體),或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞;
(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細胞;(3).從培養(yǎng)基或細胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
本發(fā)明中,人PEBP5多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術語“重組表達載體”指本領域熟知的細菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉錄病毒或其他載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于在細菌中表達的基于T7的表達載體(Rosenberg,et al.Gene,1987,56125);在哺乳動物細胞中表達的pMSXND表達載體(Lee and Nathans,J Bio Chem.2633521,1988)和在昆蟲細胞中表達的來源于桿狀病毒的載體??傊?,只要能在宿主體內(nèi)復制和穩(wěn)定,任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復制起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。
本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含人PEBP5編碼DNA序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內(nèi)重組技術等(Sambroook,et al.Molecular Cloning,a LaboratoryManual,cold Spring Harbor Laboratory.New York,1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上,以指導mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子;λ噬菌體PL啟動子;真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。
此外,表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標記基因,以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型性狀,如真核細胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP),或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體,可以用于轉化適當?shù)乃拗骷毎?,以使其能夠表達蛋白質(zhì)。
宿主細胞可以是原核細胞,如細菌細胞;或是低等真核細胞,如酵母細胞;或是高等真核細胞,如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌,鏈霉菌屬;鼠傷寒沙門氏菌的細菌細胞;真菌細胞如酵母;植物細胞;果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞;CHO、COS、293細胞、或Bowes黑素瘤細胞的動物細胞等。
本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細胞中表達時,如果在載體中插入增強子序列時將會使轉錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子,通常大約有10到300個堿基對,作用于啟動子以增強基因的轉錄??膳e的例子包括在復制起始點晚期一側的100到270個堿基對的SV40增強子、在復制起始點晚期一側的多瘤增強子以及腺病毒增強子等。
本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當?shù)妮d體、啟動子、增強子和宿主細胞。
用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規(guī)技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時,能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲,用CaCl2法處理,所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要,轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物,可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉淀法,常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
獲得的轉化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng),表達本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細胞,培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養(yǎng)。當宿主細胞生長到適當?shù)募毎芏群?,用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子,將細胞再培養(yǎng)一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可在細胞內(nèi)、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要,可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。
重組的人PEBP5蛋白或多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)直接做為藥物治療PEBP5蛋白功能低下或喪失所致的疾病,和用于篩選促進或對抗PEBP5蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。用表達的重組人PEBP5蛋白篩選多肽庫可用于尋找有治療價值的能抑制或刺激人PEBP5蛋白功能的多肽分子。
另一方面,本發(fā)明還包括對人PEBP5 DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體,尤其是單克隆抗體。這里,“特異性”是指抗體能結合于人PEBP5基因產(chǎn)物或片段。較佳地,指那些能與人PEBP5基因產(chǎn)物或片段結合但不識別和結合于其它非相關抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結合并抑制人PEBP5蛋白的分子,也包括那些并不影響人PEBP5蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的人PEBP5基因產(chǎn)物結合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體,而且還包括具有免疫活性的抗體片段,如Fab’或(Fab)2片段;抗體重鏈;抗體輕鏈;遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人,美國專利No.4,946,778);或嵌合抗體,如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領域內(nèi)技術人員已知的各種技術進行制備。例如,純化的人PEBP5基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段,可被施用于動物以誘導多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的,表達人PEBP5蛋白或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來制備(見Kohler等人,Nature256;495,1975;Kohler等人,Eur.J.Immunol.6511,1976;Kohler等人,Eur.J.Immunol.6292,1976;Hammerling等人,In Monoclonal Antibodies and T CellHybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人PEBP5蛋白功能的抗體以及不影響人PEBP5蛋白功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人PEBP5基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū),通過常規(guī)免疫技術獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人PEBP5基因產(chǎn)物的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生;與翻譯后修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽),可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得。
抗人PEBP5蛋白的抗體可用于免疫組織化學技術中,檢測活檢標本中的人PEBP5蛋白。此外,與人PEBP5蛋白結合的單克隆抗體也可用放射性同位素標記,注入體內(nèi)可跟蹤其位置和分布。這種放射性標記的抗體可作為一種非創(chuàng)傷性診斷方法用于腫瘤細胞的定位和判斷是否有轉移。
本發(fā)明中的抗體可用于治療或預防與人PEBP5蛋白相關的疾病。給予適當劑量的抗體可以刺激或阻斷人PEBP5蛋白的產(chǎn)生或活性。
抗體也可用于設計成針對體內(nèi)某一特殊部位的免疫毒素。如人PEBP5蛋白高親和性的單克隆抗體可與細菌或植物毒素(如白喉毒素,蓖麻蛋白,紅豆堿等)共價結合。一種通常的方法是用巰基交聯(lián)劑如SPDP,攻擊抗體的氨基,通過二硫鍵的交換,將毒素結合于抗體上,這種雜交抗體可用于殺滅人PEBP5蛋白陽性的細胞(例如淋巴結細胞等)。
多克隆抗體的生產(chǎn)可用人PEBP5蛋白或多肽免疫動物,如家兔,小鼠,大鼠等。多種佐劑可用于增強免疫反應,包括但不限于弗氏佐劑等。
利用本發(fā)明蛋白,通過各種常規(guī)篩選方法,可篩選出與PEBP5蛋白發(fā)生相互作用的物質(zhì),如配體、抑制劑、激動劑或拮抗劑等。
本發(fā)明蛋白及其抗體、抑制劑、激動劑、拮抗劑或受體等,當在治療上進行施用(給藥)時,可提供不同的效果。通常,可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質(zhì)中,其中pH通常約為5-8,較佳地pH約為6-8,盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進行給藥,其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
本發(fā)明的多肽或其激動劑和拮抗劑可直接用于疾病治療,例如,用于腫瘤、炎癥,神經(jīng)系統(tǒng)和心血管病方面的治療。在使用本發(fā)明時,還可同時使用其他治療劑。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物,它含有安全有效量的本發(fā)明PEBP5多肽或其激動劑、拮抗劑以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式,例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物,可通過常規(guī)方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?;钚猿煞值慕o藥量是治療有效量,例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外,本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時,是將安全有效量的PEBP5蛋白或其拮抗劑、激動劑施用于哺乳動物,其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重,而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重,較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當然,具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素,這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
人PEBP5蛋白的多聚核苷酸也可用于多種治療目的?;蛑委熂夹g可用于治療由于PEBP5蛋白的無表達或異常/無活性的PEBP5蛋白的表達所致的細胞增殖、發(fā)育或代謝異常。重組的基因治療載體(如病毒載體)可設計成表達變異的PEBP5蛋白,以抑制內(nèi)源性的PEBP5蛋白活性。來源于病毒的表達載體如逆轉錄病毒、腺病毒、腺病毒相關病毒、單純皰疹病毒、細小病毒等可用于將PEBP5基因轉移至細胞內(nèi)。構建攜帶PEBP5基因的重組病毒載體的方法可見于已有文獻(Sambrook,et al.)。另外重組人PEBP5基因可包裝到脂質(zhì)體中,然后再轉移至細胞內(nèi)。
抑制人PEBP5mRNA的寡聚核苷酸(包括反義RNA和DNA)以及核酶也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。核酶是一種能特異性分解特定RNA的酶樣RNA分子,其作用機制是核酶分子與互補的靶RNA特異性雜交后進行核酸內(nèi)切作用。反義的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技術獲得,如固相磷酸酰胺化學合成法合成寡核苷酸的技術已廣泛應用。反義RNA分子可通過編碼該RNA的DNA序列在體外或體內(nèi)轉錄獲得。這種DNA序列已整合到載體的RNA聚合酶啟動子的下游。為了增加核酸分子的穩(wěn)定性,可用多種方法對其進行修飾,如增加兩側的序列長度,核糖核苷之間的連接應用磷酸硫酯鍵或肽鍵而非磷酸二酯鍵。
多聚核苷酸導入組織或細胞內(nèi)的方法包括將多聚核苷酸直接注入到體內(nèi)組織中;或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質(zhì)粒等)先將多聚核苷酸導入細胞中,再將細胞移植到體內(nèi)等。
能與人PEBP5蛋白結合的多肽分子可通過篩選由各種可能組合的氨基酸結合于固相物組成的隨機多肽庫而獲得。篩選時,必須對人PEBP5蛋白分子進行標記。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測人PEBP5蛋白水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領域所熟知的,且包括FISH測定和放射免疫測定。試驗中所檢測的人PEBP5蛋白水平,可以用作解釋人PEBP5蛋白在各種疾病中的重要性和用于診斷PEBP5蛋白起作用的疾病。
一種檢測檢測樣品中是否存在PEBP5蛋白的方法是利用PEBP5蛋白的特異性抗體進行檢測,它包括將樣品與PEBP5蛋白特異性抗體接觸;觀察是否形成抗體復合物,形成了抗體復合物就表示樣品中存在PEBP5蛋白。
PEBP5蛋白的多聚核苷酸可用于PEBP5蛋白相關疾病的診斷和治療。在診斷方面,PEBP5蛋白的多聚核苷酸可用于檢測PEBP5蛋白的表達與否或在疾病狀態(tài)下PEBP5蛋白的異常表達。如PEBP5 DNA序列可用于對活檢標本的雜交以判斷PEBP5蛋白的表達異常。雜交技術包括Southern印跡法,Northern印跡法、原位雜交等。這些技術方法都是公開的成熟技術,相關的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上,用于分析組織中基因的差異表達分析和基因診斷。用PEBP5蛋白特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(RT-PCR)體外擴增也可檢測PEBP5蛋白的轉錄產(chǎn)物。
檢測PEBP5基因的突變也可用于診斷PEBP5蛋白相關的疾病。PEBP5蛋白突變的形式包括與正常野生型PEBP5 DNA序列相比的點突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等。可用已有的技術如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外,突變有可能影響蛋白的表達,因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
本發(fā)明的序列對染色體鑒定也是有價值的。簡而言之,根據(jù)本發(fā)明PEBP5蛋白的cDNA制備PCR引物(優(yōu)選15-35bp),可以將序列定位于染色體上。然后,將這些引物用于PCR篩選含各條人染色體的體細胞雜合細胞。只有那些含有相應于引物的人基因的雜合細胞會產(chǎn)生擴增的片段。
一旦序列被定位到準確的染色體位置,此序列在染色體上的物理位置就可以與基因圖數(shù)據(jù)相關聯(lián)。這些數(shù)據(jù)可見于例如,V.Mckusick,MendelianInheritance in Man(可通過與Johns Hopkins University Welch Medical Library聯(lián)機獲得)。然后可通過連鎖分析,確定基因與業(yè)已定位到染色體區(qū)域上的疾病之間的關系。
在本發(fā)明的一個實例中,提供了一種分離的多核苷酸,它編碼具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽。本發(fā)明的多核苷酸是從人骨髓基質(zhì)細胞cDNA文庫中分離出的。其序列如SEQ ID NO1所示,它包含的多核苷酸序列全長為874個堿基,其開放讀框位于66-746位,編碼全長為227個氨基酸的人PEBP5蛋白(SEQ ID NO2)。該PEBP5蛋白屬于PEBP家族分子,該蛋白在結構上具有PEBP家族的結構特征,含有一個結合磷脂酰乙醇的保守區(qū)域,RT顯示在睪丸、卵巢、甲狀腺、腎,前列腺癌以及造血細胞腫瘤Daudi表達。Northern顯示在甲狀腺、骨骼肌、心肌和腦特異性表達,特別是腦,每個部位都為高表達。行的研究提示、可以推測PEBP與神經(jīng)活動,大腦的發(fā)育有關可能調(diào)控多種生理和病理活動,發(fā)揮重要作用,并可能在抗感染、抗炎癥反應、抗腫瘤以及神經(jīng)生長修復、免疫功能調(diào)節(jié)等多個領域的免疫診斷和免疫治療方面具有重要的開發(fā)和應用價值。研究已表明,PEBP5家族蛋白與多種生命活動相關。因此,為診斷和治療目的研究和開發(fā)新的人磷脂酰乙醇胺結合蛋白PEBP5有重要意義。
因此,PEBP5蛋白或其相關的拮抗劑、激動劑等可為治療腫瘤、炎癥、神經(jīng)系統(tǒng)和心血管病等疾病提供新的免疫診斷和靶向治療途徑,因而具有巨大的應用前景。
下面結合具體實施例,進一步闡述本發(fā)明。應理解,這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法,通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人,分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1人PEBP5 cDNA的克隆用Trizol試劑(Life Technologies)提取人骨髓基質(zhì)細胞總RNA。然后,從總RNA中分離poly(A)mRNA。將poly(A)mRNA經(jīng)逆轉錄形成cDNA后,用SuperScriptII克隆試劑盒(Life Technologies)將cDNA片段定向插入到載體的多克隆位點上,轉化DH5α細菌形成cDNA質(zhì)粒文庫。用雙脫氧法測定隨機挑選克隆的5’末端的序列。將測定的cDNA序列與已有的公共DNA序列數(shù)據(jù)庫進行比較,結果發(fā)現(xiàn)有一個cDNA克隆的DNA序列為新的全長cDNA。通過合成一系列引物對新克隆所含的DNA序列進行雙向測定。計算機分析表明,克隆所含的全長cDNA是一個新的cDNA序列(如SEQ ID NO1所示),編碼一個新的蛋白質(zhì)(如SEQ ID NO2所示)。此蛋白質(zhì)被命名為人磷脂酰乙醇胺結合蛋白PEBP5,其編碼基因命名為人磷脂酰乙醇胺結合蛋白PEBP5基因。
序列SEQ ID NO1全長為874bp,包括64bp的5’端非編碼區(qū)和125bp的3’端非編碼區(qū),編碼含227個氨基酸的多肽。理論上計算未糖基化的成熟分子的分子量約為25kD。與大鼠的PEBP一致性達50%,相似性達60%,屬于磷脂酰乙醇胺結合蛋白家族分子(圖1)。
實施例2用RT-PCR方法進行人PEBP5的細胞表達分析用Trizol試劑提取處于對數(shù)生長期的HeLa等各種細胞系的總RNA,取5μg細胞總RNA與1μg Oligo-dT12-18混合,進行反轉錄。反轉錄體系為20μl,反應結束后加80μl ddH2O進行稀釋。PCR擴增PEBP5所用的引物如下有義引物5’GGGTTGGACAATGAGGCTG(SEQ ID NO3),反義引物5’TGTGCTTGGGCTCGCTGGC(SEQ ID NO4),同時以β-actin作為陽性對照。PCR反應體積為50μl,其中含反轉錄模板10μl、0.5mM引物、0.2mM dNTP和1U rTaq DNA聚合酶(TakaraInc.),擴增參數(shù)為95℃ 15秒、57℃ 30秒、72℃ 30秒,28個循環(huán)后PCR產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳初步確認。DNA序列分析結果表明該PCR產(chǎn)物的編碼DNA序列與SEQ ID NO1所示的64-717完全相同。
RT-PCR分析結果(圖2)顯示PEBP5 mRNA在睪丸、卵巢、甲狀腺、腎,前列腺癌以及造血細胞腫瘤Daudi有不同程度的表達。
實施例3人PEBP5的Northern印跡分析按如下常規(guī)方法進行Northern印跡待檢濾膜置于10ml經(jīng)68℃預熱的雜交液,在雜交爐(Bellco)中于68℃預雜交30分鐘;將標記好的cDNA探針于95~100℃變性2~5分鐘,置冰上迅速冷卻后加入雜交液(cDNA探針終濃度為2~10ng/ml或1~2×106cpm/ml),充分混勻,于68℃雜交2小時。雜交結束后,濾膜用2×SSC、0.05%SDS室溫淋洗數(shù)次,繼振蕩沖洗30~40分鐘,其間更換洗液數(shù)次。隨后用0.1×SSC、0.1%SDS于50℃振蕩沖洗20~40分鐘。最后濾膜用塑料保鮮膜包裹,于-70℃曝光X線膠片24~48小時。
Northern顯示(圖3)在甲狀腺、骨骼肌、心肌和腦特異性表達,特別是腦,每個部位都為高表達。這表明PEBP5蛋白是一種特定表達的蛋白。
實施例4人PEBP5重組表達在該實施例中,用序列如下的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物,以抽提骨髓基質(zhì)細胞總mRNA為模板通過RT-PCR,或者以實施例1中的全長質(zhì)粒DNA為模板進行擴增,獲得人PEBP5 DNA作為插入片段。
PCR反應中使用的5’端寡核苷酸引物序列為5’-GCGAATTCGTTGGACAATGAGGCTGGT-3’(SEQ ID NO5)該引物含有EcoR I限制性內(nèi)切酶的酶切位點,在該酶切位點之后是人PEBP5的全部編碼序列;3’端引物序列為5’-ATGAATTCTCCATACCCACATCGTCGG-3’(SEQ ID NO6)該引物含有EcoR I限制性內(nèi)切酶的酶切位點、翻譯終止子和人PEBP5的全部編碼序列。
將獲得的PCR產(chǎn)物純化后經(jīng)EcoR I酶切再與質(zhì)粒pGEM-3ZF按常規(guī)方法重組并轉化至感受態(tài)大腸桿菌BL21,挑取陽性克隆鑒定后純化并測序(ABI公司的377型測序儀,BigDye Terminator試劑盒,PE公司)。將正確序列的人PEBP5cDNA EcoR I酶切片段克隆至表達載體pGEX-2T(Pharmacia),形成形成載體pGEX-2T-人PEBP5,然后轉化大腸桿菌BL21。陽性克隆用EcoR I酶切鑒定,正向克隆用BamH I酶切鑒定,產(chǎn)物行0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析。經(jīng)測序證實,已插入了所設計的PEBP5編碼序列。
挑表達PEBP5的陽性BL21克隆接種于100ml 2×YTA培養(yǎng)基中,37℃ 300rpm振蕩培養(yǎng)12-15hr,1∶10稀釋于預熱的2×YTA培養(yǎng)基繼續(xù)振蕩培養(yǎng)1.5hr,加100mM IPTG至0.1mM后30℃誘導2-6hr,5,000g 4℃離心10min去上清,置冰上用50ml 1×PBS(0.14M NaCl,2.7mM KCl,10.1mM Na2HPO4,1.8mM KH2PO4,pH7.3)重懸,超聲(B.Braun Labsonic U)破碎后再加入20% Triton X-100至1%輕搖30min,然后12,000g 4℃離心10min,上清用0.8μm濾膜過濾后,過1ml 50%谷胱甘肽Sepharose 4B層析柱,1×PBS充分洗滌后,加入500ul谷胱甘肽洗脫緩沖液(10mM谷胱甘肽,50mM Tris-HCl,pH8.0)室溫靜置30分鐘后收集洗脫液,重復洗脫2-3次,得到人PEBP5-GST融合蛋白。融合蛋白的分子量與預測值相符。
實施例5抗人PEBP5抗體的產(chǎn)生將實施例4中獲得的重組蛋白人PEBP5用來免疫動物以產(chǎn)生抗體,具體方法如下。重組分子用層析法進行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進行分離,將電泳條帶從凝膠中切下,并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白,對小鼠進行腹膜內(nèi)注射。14天后,用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原,對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進行腹膜內(nèi)注射以加強免疫。每隔14天進行一次加強免疫,至少進行三次。獲得的抗血清的特異反應活性用它在體外沉淀人PEBP5基因翻譯產(chǎn)物的能力加以評估。結果發(fā)現(xiàn),抗體可特異性地與本發(fā)明蛋白發(fā)生結合。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考,就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解,在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后,本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改,這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表<110>浙江大學免疫學研究所<120>新型人磷脂酰乙醇胺結合蛋白,其編碼序列及用途<130>025014<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>874<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(66)..(746)<223><400>1actggattcg ctgcggagcc ctggaagctg cctttccttc tccctgtgct taaccagagg 60tgccc atg ggt tgg aca atg agg ctg gtc aca gca gca ctg tta ctg ggt110Met Gly Trp Thr Met Arg Leu Val Thr Ala Ala Leu Leu Leu Gly1 5 10 15ctc atg atg gtg gtc act gga gac gag gat gag aac agc ccg tgt gcc 158Leu Met Met Val Val Thr Gly Asp Glu Asp Glu Asn Ser Pro Cys Ala20 25 30cat gag gcc ctc ttg gac gag gac acc ctc ttt tgc cag ggc ctt gaa 206His Glu Ala Leu Leu Asp Glu Asp Thr Leu Phe Cys Gln Gly Leu Glu35 40 45gtt ttc tac cca gag ttg ggg aac att ggc tgc aag gtt gtt cct gat 254Val Phe Tyr Pro Glu Leu Gly Asn Ile Gly Cys Lys Val Val Pro Asp50 55 60tgt aac aac tac aga cag aag atc acc tcc tgg atg gag ccg ata gtc 302Cys Asn Asn Tyr Arg Gln Lys Ile Thr Ser Trp Met Glu Pro Ile Val65 70 75aag ttc ccg ggg gcc gtg gac ggc gca acc tat atc ctg gtg atg gtg 350Lys Phe Pro Gly Ala Val Asp Gly Ala Thr Tyr Ile Leu Val Met Val80 85 90 95gat cca gat gcc cct agc aga gca gaa ccc aga cag aga ttc tgg aga 398Asp Pro Asp Ala Pro Ser Arg Ala Glu Pro Arg Gln Arg Phe Trp Arg100 105 110cat tgg ctg gta aca gat atc aag ggc gcc gac ctg aag aaa ggg aag 446His Trp Leu Val Thr Asp Ile Lys Gly Ala Asp Leu Lys Lys Gly Lys115 120 125att cag ggc cag gag tta tca gcc tac cag gct ccc tcc cca ccg gca 494Ile Gln Gly Gln Glu Leu Ser Ala Tyr Gln Ala Pro Ser Pro Pro Ala130 135 140cac agt ggc ttc cat cgc tac cag ttc ttt gtc tat ctt cag gaa gga 542His Ser Gly Phe His Arg Tyr Gln Phe Phe Val Tyr Leu Gln Glu Gly145 150 155aaa gtc atc tct ctc ctt ccc aag gaa aac aaa act cga ggc tct tgg 590Lys Val Ile Ser Leu Leu Pro Lys Glu Asn Lys Thr Arg Gly Ser Trp160 165 170 175aaa atg gac aga ttt ctg aac cgt ttc cac ctg ggc gaa cct gaa gca 638Lys Met Asp Arg Phe Leu Asn Arg Phe His Leu Gly Glu Pro Glu Ala180 185 190agc acc cag ttc atg acc cag aac tac cag gac tca cca acc ctc cag 686Ser Thr Gln Phe Met Thr Gln Asn Tyr Gln Asp Ser Pro Thr Leu Gln195 200 205gct ccc aga gaa agg gcc agc gag ccc aag cac aaa aac cag gcg gag 734Ala Pro Arg Glu Arg Ala Ser Glu Pro Lys His Lys Asn Gln Ala Glu210 215 220ata gct gcc tgc tagatagccg gctttgccat ccgggcatgt ggccacactg 786Ile Ala Ala Cys225cccaccaccg acgatgtggg tatggaaccc cctctggata cagaacccct tcttttccaa846ataaaaaaaa aatcatccag gaaaaaaa 874<210>2<211>227<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>2Met Gly Trp Thr Met Arg Leu Val Thr Ala Ala Leu Leu Leu Gly Leu1 5 10 15Met Met Val Val Thr Gly Asp Glu Asp Glu Asn Ser Pro Cys Ala His20 25 30Glu Ala Leu Leu Asp Glu Asp Thr Leu Phe Cys Gln Gly Leu Glu Val35 40 45Phe Tyr Pro Glu Leu Gly Asn Ile Gly Cys Lys Val Val Pro Asp Cys50 55 60Asn Asn Tyr Arg Gln Lys Ile Thr Ser Trp Met Glu Pro Ile VaI Lys65 70 75 80Phe Pro Gly Ala Val Asp Gly Ala Thr Tyr Ile Leu Val Met Val Asp85 90 95Pro Asp Ala Pro Ser Arg Ala Glu Pro Arg Gln Arg Phe Trp Arg His100 105 110Trp Leu Val Thr Asp Ile Lys Gly Ala Asp Leu Lys Lys Gly Lys Ile115 120 125Gln Gly Gln Glu Leu Ser Ala Tyr Gln Ala Pro Ser Pro Pro Ala His130 135 140Ser Gly Phe His Arg Tyr Gln Phe Phe Val Tyr Leu Gln Glu Gly Lys145 150 155 160Val Ile Ser Leu Leu Pro Lys Glu Asn Lys Thr Arg Gly Ser Trp Lys165 170 175Met Asp Arg Phe Leu Asn Arg Phe His Leu Gly Glu Pro Glu Ala Ser180 185 190Thr Gln Phe Met Thr Gln Asn Tyr Gln Asp Ser Pro Thr Leu Gln Ala195 200 205Pro Arg Glu Arg Ala Ser Glu Pro Lys His Lys Asn Gln Ala Glu Ile210 215 220Ala Ala Cys225<210>3<211>19<212>DNA<213>引物<400>3gggttggaca atgaggctg 19<210>4<211>19<212>DNA<213>引物<400>4tgtgcttggg ctcgctggc 19<210>5<211>27<212>DNA<213>引物<400>5gcgaattcgt tggacaatga ggctggt27<210>6<211>27<212>DNA<213>引物<400>6atgaattctc catacccaca tcgtcgg2權利要求
1.一種分離的人磷脂酰乙醇胺結合蛋白PEBP5多肽,其特征在于,它包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2.如權利要求1所述的多肽,其特征在于,該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽;(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的,且具有信號轉導功能的由(a)衍生的多肽。
3.一種分離的多核苷酸,其特征在于,它包含一核苷酸序列,該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70%相同性(a)編碼如權利要求1和2所述多肽的多核苷酸;(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
4.如權利要求3所述的多核苷酸,其特征在于,該多核苷酸編碼具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽。
5.如權利要求3所述的多核苷酸,其特征在于,該多核苷酸的序列選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中1-874位的序列;(b)具有SEQ ID NO1中66-746位的序列。
6.一種載體,其特征在于,它含有權利要求3所述的多核苷酸。
7.一種遺傳工程化的宿主細胞,其特征在于,它含有權利要求6所述的載體。
8.一種具有人PEBP5多肽活性的多肽的制備方法,其特征在于,該方法包含(a)在適合表達人PEBP5多肽的條件下,培養(yǎng)權利要求7所述的宿主細胞;(b)從培養(yǎng)物中分離出具有人PEBP5多肽活性的多肽。
9.一種能與權利要求1所述的人PEBP5多肽特異性結合的抗體。
10.一種藥物組合物,其特征在于,它含有安全有效量的權利要求1所述的多肽以及藥學上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及了一種新型磷脂酰乙醇胺結合蛋白5,即PEBP 5(phosphatidylethanolamine binding protein 5,PEBP5)。本發(fā)明提供編碼此蛋白分子的多核苷酸和經(jīng)重組技術產(chǎn)生這種蛋白分子的方法。本發(fā)明還公開了這種新型磷脂酰乙醇胺結合蛋白5及其多核苷酸編碼序列的用途。本發(fā)明還公開了抗此蛋白分子用于疾病的診斷及治療的策略,特別是可用于癌癥的診斷和治療。
文檔編號A61K38/17GK1477117SQ0213655
公開日2004年2月25日 申請日期2002年8月19日 優(yōu)先權日2002年8月19日
發(fā)明者王曉健, 李楠, 曹雪濤 申請人:浙江大學免疫學研究所
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