專利名稱：識(shí)別n-乙醇酰gm3神經(jīng)節(jié)苷脂的重組抗體和片段以及其在腫瘤診斷和治療上的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域和特別是使用基因工程技術(shù)獲得較少免疫原性的免疫球蛋白以用于癌癥治療方面。本發(fā)明特別地涉及編碼識(shí)別抗原的單克隆抗體或其衍生片段的肽序列，所述抗原包含N-乙醇酰GM3神經(jīng)節(jié)苷脂，但不包括其它相關(guān)的神經(jīng)節(jié)苷脂如N-乙醇?；騈-乙酰，和硫酸化糖脂。
背景技術(shù)：
神經(jīng)節(jié)苷脂是包含唾液酸的糖鞘脂并且其存在于脊椎動(dòng)物的質(zhì)膜中(Stults CLM等人，Methods Enzymology 179:167-214,1989)。在文獻(xiàn)中已報(bào)道了這些分子中的一些是腫瘤相關(guān)抗原或腫瘤標(biāo)記(Hakamori SH :Curr Opin Immunol 3 :646-653,1991),然后描述了抗神經(jīng)節(jié)苷脂抗體在癌癥的診斷和治療中的用途(Hougton AN等人，NAS USA 82:1242-1246，1985 ;Zhang S 等人 Int J Cancer 73:42-49,1997)。哺乳動(dòng)物中更普遍的唾液酸是N-乙酸(NAc)和 N-乙醇酸(NGc) (Corfield AP 等人，Cell Biol Monogr 10 :5-50,1982)。通常NGc不在人和雞正常組織中表達(dá)但其廣泛地存在于其它脊椎動(dòng)物中(LeedenRW 等人，Biological Role of Sialic Acid. Rosemberg A 和 Shengtrund CL (Eds) PlenumPress, New York, 1-48,1976, KawaiT 等人，Cancer Research 51 :1242-1246, 2001)。然而來(lái)自文獻(xiàn)的報(bào)道顯示抗NGc抗體識(shí)別一些人腫瘤和腫瘤細(xì)胞系(Higashi H等人，Jpn J. Cancer Res. 79 :952-956,1988, Fukui Y 等人，BiochemBiophys Res Commun 160 1149-1154,1989) o已在人乳腺癌中發(fā)現(xiàn)GM3 (NGc)神經(jīng)節(jié)苷脂水平的增加(Marquina G等人，Cancer Research 56 :5165_5171，1996)，所述發(fā)現(xiàn)使得該分子作為癌癥治療的靶標(biāo)的用途非常具有吸收力。提交的專利EP0972782 Al描述了由根據(jù)Budapest條約保藏的保藏號(hào)為ECACC98101901的雜交瘤產(chǎn)生的鼠科動(dòng)物單克隆抗體。該單克隆抗體具有IgGl同種型并通過(guò)免疫Balb/c小鼠產(chǎn)生，所述小鼠用疏水地綴合低密度脂蛋白(VLDL)的NGcGM3神經(jīng)節(jié)苷脂和在弗氏佐劑存在的情況下進(jìn)行免疫，所述抗體優(yōu)選地結(jié)合NGcGM3神經(jīng)節(jié)苷脂和識(shí)別在人乳腺和黑素瘤腫瘤中表達(dá)的抗原。(Carr A等人,Hybridomal9 :3 :241-247, 2000)。該抗體對(duì)含有所述序列的細(xì)胞表現(xiàn)出很強(qiáng)的細(xì)胞溶解活性，這可以使其成為治療工具。此外已知由腫瘤誘導(dǎo)的新血管形成在腫瘤生長(zhǎng)的控制中構(gòu)成了其中一個(gè)主要參數(shù)。該參數(shù)已指導(dǎo)研究朝向?qū)ふ疑婕翱乖^(guò)程抑制的新的治療武器。存在涉及該過(guò)程的 14F7抗體功效的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。已在基質(zhì)凝膠測(cè)定中發(fā)現(xiàn)所述證據(jù)(Angiogenesis.第4卷，Pags. 113-121,2001 ；Ant1-Cancer Res.第 18 卷，Pags. 783-790，1998)?；|(zhì)凝膠是基底膜蛋白和圍繞內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)的混合物。其在新血管形成過(guò)程中的有效性在于在新血管發(fā)育期間內(nèi)皮-基質(zhì)相互作用的生理學(xué)重要性。同樣，該凝膠的組分例如層粘連蛋白被認(rèn)為是該過(guò)程的重要標(biāo)記。該模型類型也已用于涉及腫瘤誘導(dǎo)的血管發(fā)生的機(jī)制的研究中，允許評(píng)估能夠調(diào)節(jié)直接涉及腫瘤的事件因而影響其生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的藥物。
使用非人單克隆抗體例如鼠科動(dòng)物14F7對(duì)人的治療具有某些不利方面，特別是在反復(fù)的治療方案中。例如鼠科動(dòng)物單克隆抗體具有相對(duì)較短的血液半衰期。此外在用于人時(shí)，其喪失了重要的免疫學(xué)特性例如效應(yīng)物功能。并且更重要的是，鼠科動(dòng)物單克隆抗體包含相當(dāng)多的當(dāng)注射入人時(shí)產(chǎn)生免疫原性的氨基酸序列。大量研究已表明在施用外源抗體后在患者體內(nèi)產(chǎn)生的免疫應(yīng)答可以相當(dāng)強(qiáng)烈并且在最初的治療后基本上消除了抗體的治療功效。此外，甚至在用鼠科動(dòng)物單克隆抗體對(duì)患者進(jìn)行治療后，用非相關(guān)的鼠科動(dòng)物抗體進(jìn)行的后續(xù)治療可能會(huì)無(wú)效和甚至?xí)驗(yàn)榉Q作 HAMA 應(yīng)答(Khazaeli, M. B.,等人，Journal of Immunotherapy 15 :42-52,1994)的交叉反應(yīng)性而造成危險(xiǎn)。
Mateo等人(美國(guó)專利號(hào)US 5 712 120)描述了用于減少鼠科動(dòng)物抗體免疫原性的方法。經(jīng)Mateo等人(Mateo C等人,Hybridomal9 6 :463-471, 2000)描述的方法修飾的所述抗體保持了原始抗體的對(duì)抗原的識(shí)別和結(jié)合能力并產(chǎn)生較小的免疫原性，所述免疫原性的減小增加了其治療有效性。通過(guò)該方法獲得具有少量突變的經(jīng)修飾的抗體，當(dāng)與嵌合抗體比較時(shí)所述抗體表現(xiàn)免疫原性減小。從上面推知，需要以簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)的方式獲得免疫原性較小的治療性抗體版本并且因此產(chǎn)生足夠用于生產(chǎn)人使用的治療性制劑。還已知抗體片段的使用在疾病的免疫診斷中非常有用。除其它以外，IraPastan(提交的歐洲專利EP 0796334 Al)描述了使用特異性識(shí)別涉及Lewis Y抗原的糖類的抗體的可變區(qū)構(gòu)建Fv類型單鏈片段。基于所述片段，作者發(fā)展了用于檢測(cè)含有所述抗原的細(xì)胞的方法并且也提供了這些片段對(duì)含有所述抗原的細(xì)胞的抑制效應(yīng)的證據(jù)。由于該抗原在各種疾病的免疫治療中的潛能，14F7單克隆抗體結(jié)合位點(diǎn)的知識(shí)在實(shí)踐和理論上引人關(guān)注。Souriau, C 等人在 ExpertOpin. Biol. Ther. 1,845-855, 2001 和Chester, K. A.,等人在Dis. Markers. 16, 53-62, 2000中表明通過(guò)利用scFv類型的抗體片段的藥物學(xué)特性例如在腫瘤組織中更好的穿透性，使用其可產(chǎn)生非常好的治療用途。暴露在絲狀噬菌體上的來(lái)自雜交瘤的抗體片段迷你文庫(kù)的構(gòu)建使得能夠在該庫(kù)中選擇對(duì)所述抗原具有特異性識(shí)別能力的分子。目的是快速獲得以更小的分子尺寸結(jié)合原始抗體并且能夠由細(xì)菌宿主生產(chǎn)的抗體片段。該技術(shù)允許選出非功能性或不可能在細(xì)菌中生產(chǎn)的多個(gè)抗體片段的變體，所述變體是在用常規(guī)克隆技術(shù)(Roovers，R. C.等人，Br. J. Cancer. 78，1407-1416，1998)分離和操作雜交瘤基因的可變區(qū)的過(guò)程中獲得的。絲狀噬菌體中抗體片段呈遞技術(shù)學(xué)提供了接近抗體結(jié)合位點(diǎn)以及在所述抗體中引入修飾以提高其親和力(Chames, P.等人，J.1mmunol. 161, 5421-5429,1998,Lamminmaki, U 等人，J. Mol. Biol. 291, 589-602,1999, Parham1-Seren 等人，J. Tmmuno1.Methods. 259，43-53，2002)或調(diào)節(jié)其特異性(Iba, Y.等人，Prot. Engn.，11，361-370，1998, Miyazaki, C.等人，Prot. Engn. 12,407-415,1999, Darveau, R. P.等人，J. Clin.1mmunoassay. 15,25-29,1992)的獨(dú)特機(jī)會(huì)。在絲狀噬菌體中抗體片段的表達(dá)允許鏈的交換(Lantto, J.等人，Methods Mol. Biol. 178，303-316，2002)或反過(guò)來(lái)因而允許研究各鏈在抗原識(shí)別和其對(duì)抗體親和力的影響上所起的作用(Kabat, E. A. , Wu, T. T. , J.1mmunol. 147,1709-1719,1991, Barbas III, C. F. , Lerner, R. A. Methods A companion to MethodsinEnzymology 2，119-124，1991)，所述鏈?zhǔn)歉鞣N不同VLs和原始抗體VH的組合。鏈的交換使得可以修飾結(jié)合位點(diǎn)的特性并且也使得可以組合來(lái)自不同物種的免疫球蛋白序列以及使得可以選擇保持識(shí)別特異性的變體(Klimka，A.等人，Br. J. Cancer. 83，252-260，2000，Steinberger, P.等人，J. Biol. Chem. 275，36073-36078，2000，Rader, C.等人，Proc. Natl.Acad. Sc1. USA. 95，8910-8915，1998，Beiboer, S. ff. H.等人，J. Mol. Biol. 296，833-849，2000)。本發(fā)明涉及來(lái)源于鼠科動(dòng)物14F7單克隆抗體的經(jīng)修飾的抗體，所述經(jīng)修飾的抗體以相同的親和力識(shí)別原始抗原并且在給患者施用時(shí)產(chǎn)生較小的免疫原性。本發(fā)明的另一個(gè)發(fā)現(xiàn)是已獲得來(lái)源于所述抗體的片段，所述片段包含不同于原始抗體但保持其的與特異性、親和力以及識(shí)別特性相關(guān)的特性的輕鏈可變區(qū)，并且可通過(guò)細(xì)菌宿主以可溶性分子表達(dá)和呈現(xiàn)在絲狀噬菌體表面。來(lái)源于14F7抗體的片段可用作治療性武器。此外，14F7抗體的scFv類型片段在M13絲狀噬菌體表面的表達(dá)使得可以操縱結(jié)合位點(diǎn)和獲得具有用于治療目的更高親和力的變體。本發(fā)明的一個(gè)目的是表征抗體片段，所述抗體片段僅部分保存14F7的序列但仍保持其特異性、親和力和識(shí)別特性。 經(jīng)修飾的抗體和獲得的片段都特異性地識(shí)別表達(dá)NGcGM3抗原的腫瘤細(xì)胞，因而使得其可用于診斷或治療所述腫瘤，并且具有低于其所源自的鼠科動(dòng)物抗體的免疫原性。包含經(jīng)修飾的14F7抗體或其Fv單鏈片段的新的用于定位或治療表達(dá)所述抗原的腫瘤的治療性組合物是本發(fā)明的目的，其中所述抗體或片段可以結(jié)合放射性同位素。使用藥物組合物對(duì)表達(dá)NGcGM3神經(jīng)節(jié)苷脂的腫瘤進(jìn)行放射性免疫診斷或放射性免疫治療的方法也是本發(fā)明的目的，所述藥物組合物包含經(jīng)修飾的結(jié)合有放射性同位素的14F7抗體或其片段。發(fā)明詳述在本發(fā)明中描述了來(lái)源于由保藏號(hào)為ECACC 98101901的雜交瘤產(chǎn)生的鼠科動(dòng)物14F7單克隆抗體的嵌合抗體，其特征在于下列重鏈和輕鏈的高變區(qū)(CDRs)序列。CDRl SYffIHCDR2 YIDPATAYTESNQKFKDCDR3 ESPRLRRGIYYYAMDY輕鏈CDRl RASQSISNNLHCDR2 : YASQSISCDR3 =QQSNRffPLT優(yōu)選地所述嵌合抗體的特征在于下列重鏈和輕鏈的構(gòu)架區(qū)(FRs)的序列FRlQVQLQQSGNELAKPGASMKMSCRASGYSFTFR2 =WLKQRPDQGLEffIGFR3 KAILTADRSSNTAFMYLNSLTSEDSAVYYCARFR4 WGQGTTVTVSS輕鏈
FRl :DLVLTQSPATLSVTP⑶SVSFSCFR2 WYQQRTHESPRLLIKFR3 GIPSRFSGSGSGTDFTLSIISVETEDFGMYFCFR4 FGAGTKLELKRA此外嵌合抗體的特征在于包含人IgGl的重鏈恒定區(qū)和人Ck的輕鏈恒定區(qū)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及來(lái)源于由保藏號(hào)為ECACC98101901的雜交瘤產(chǎn)生的鼠科動(dòng)物14F7單克隆抗體的經(jīng)修飾的抗體，其特征在于重鏈和輕鏈的構(gòu)架區(qū)包含下列任何突變
MM.位點(diǎn)5 V替代Q位點(diǎn)9 A替代N位點(diǎn)11 :V替代L位點(diǎn)12 :V替代A位點(diǎn)18 : V替代M位點(diǎn)19: R替代K位點(diǎn)20 V替代M位點(diǎn)38: R替代K位點(diǎn)40: A替代R位點(diǎn)42 G替代D位點(diǎn)48 V替代I輕鏈位點(diǎn)39 K替代R位點(diǎn)40 P替代T位點(diǎn)41 :G替代H位點(diǎn)42 Q替代E位點(diǎn)58 V替代I優(yōu)選地，所述經(jīng)修飾的抗體特征在于含有人IgGl的重鏈恒定區(qū)和人Ck的輕鏈恒定區(qū)。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及來(lái)源于14F7抗體的Fv單鏈類型片段，所述片段包含獲自雜交瘤(保藏號(hào)ECACC 98101901)的重鏈可變區(qū)的序列并保存14F7的識(shí)別特異性。優(yōu)選地所述Fv片段包括來(lái)源于非免疫小鼠或人的輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)不同于由所述的雜交瘤產(chǎn)生的輕鏈可變區(qū)，所述Fv片段允許其通過(guò)細(xì)菌宿主以呈現(xiàn)在絲狀噬菌體上的抗體片段或可溶性分子產(chǎn)生。本發(fā)明也涉及表達(dá)所述嵌合和人源化的抗體的細(xì)胞系和產(chǎn)生來(lái)源于14F7的片段的細(xì)菌克隆。此外，本發(fā)明涉及用于治療和/或定位以及確定惡性乳腺和黑素瘤腫瘤及其轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的藥物組合物，其特征在于包含本發(fā)明的一種重組單克隆抗體或其片段以及適合于其應(yīng)用的賦形劑。所述抗體或片段可結(jié)合用于定位和/或治療惡性腫瘤的放射性同位素。最后本發(fā)明涉及使用所描述的重組抗體生產(chǎn)用于治療和/或定位和鑒定惡性腫瘤的藥物組合物。
下面涉及實(shí)施和使用本發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明書。1. PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))合成和擴(kuò)增14F7鼠科動(dòng)物抗體的可變區(qū)的cDNA。通過(guò)在弗氏佐劑存在的情況下用疏水地綴合低密度脂蛋白的GM3 (NeuGc)神經(jīng)節(jié)苷脂免疫Balb/c小鼠獲得鼠科動(dòng)物14F7抗體(EP0972782 ALCarr A等人，Hybridoma 19:3 =241-247, 2000) o根據(jù)廠商說(shuō)明書使用TRIZOL提取方法(GIBCO BRL, NY)從IO6個(gè)產(chǎn)生14F7單克隆抗體(鼠科動(dòng)物IgGl Mab)的雜交瘤細(xì)胞中獲取RNA，所述14F7單克隆抗體識(shí)別NGcGM3神經(jīng)節(jié)苷脂。根據(jù)廠商說(shuō)明書通過(guò)使用成套試劑Access RT-PCR(Promega, USA)進(jìn)行互補(bǔ)·DNA(cDNA)的合成以及VH和VL可變區(qū)的擴(kuò)增。簡(jiǎn)短地說(shuō)，在25皮摩爾dT寡核苷酸和對(duì)應(yīng)于各可變區(qū)VH和VL的末端的寡核苷酸存在的情況下從5 y g RNA進(jìn)行反應(yīng)，所述dT寡核苷酸設(shè)計(jì)用來(lái)與RNA的多聚A尾巴雜交。在60°C下溫育10分鐘，然后加入混合物，所述混合物包含反應(yīng)緩沖液中的0. 2mM各脫氧核糖核苷酸(dNTPs)、ImM MgSO4,5 u AMV-逆轉(zhuǎn)錄酶和5 u DNA聚合酶，總體積50 ill。將所述樣品在48°C溫育45分鐘，94 °C進(jìn)行2分鐘，然后進(jìn)行40個(gè)PCR循環(huán)94°C (30秒)，60。。(I分鐘)，68°C (2分鐘)，和最終在68°C下溫育7分鐘。2.嵌合基因的構(gòu)建和擴(kuò)增的cDNA的測(cè)序。 用限制性內(nèi)切酶Eco RV-Nhe I (針對(duì)VH)和Eco RV-Sal I (針對(duì)VK)降解VH和VK的PCR產(chǎn)物，并克隆入各自的表達(dá)載體(Coloma MJ等人,J Immunol Methods 152:89-104,1992)。將VH區(qū)克隆入已包含人IgGl恒定區(qū)和抗L-組氨醇的選擇標(biāo)記基因的PAH4604載體。將VK區(qū)克隆入攜帶抗micophenolic acid的基因和人k恒定區(qū)的PAG4622載體。所得的基因構(gòu)建體分別稱為14F7VH-PAH4604和14F7VK-PAG4622。根據(jù)廠商描述的方案使用試劑盒T7 DNA Polymerase (Amershan-Pharmacia)通過(guò)雙脫氧核苷酸方法(Sanger F等人，PNASUSA 74 :5463-5470,1979)對(duì)兩個(gè)構(gòu)建體進(jìn)行測(cè)序。3.嵌合抗體的表達(dá)用酶Pvu I 線性化的 10 ii g 14F7VH-PAH4604 和 10 u gl4F7VK_PAG4622 經(jīng)電穿孔導(dǎo)入NSO細(xì)胞中。用乙醇沉淀DNAs，混合并溶解在50 ii L PBS (磷酸緩沖鹽溶液)中。當(dāng)大約IO7個(gè)細(xì)胞長(zhǎng)至半?yún)R合時(shí)通過(guò)離心收集細(xì)胞。然后在電穿孔杯中將所述細(xì)胞與DNA —起重新懸浮于0. 5mL的PBS。在冰浴10分鐘后，使所述細(xì)胞接受200V和960F的脈沖，并保持在冰上10分鐘。將所述細(xì)胞培養(yǎng)在96孔板中的Modified Dulbecco (DMEM-F12)選擇培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基含有10%胎牛血清(FCS)和IOmM L-組氨醇。加入選擇培養(yǎng)基后10天可觀察到轉(zhuǎn)染的克隆。通過(guò)克隆上清液的ELISA確定嵌合免疫球蛋白的產(chǎn)生。為此目的，用IOOmM碳酸鹽碳酸氫鹽緩沖液(pH9. 8)中的山羊抗人IgG血清包被聚苯乙烯板(High binding,Costar)，4°C過(guò)夜。然后用PBS-Tween(磷酸緩沖鹽溶液，0. 5% Tween-20, pH7. 5)洗板，力口入在PBS-Tween-FCS中稀釋的培養(yǎng)上清液樣品并在37°C溫育I小時(shí)。再用PBS-Tween洗板，然后用綴合過(guò)氧化物酶(Jackson)的山羊抗人k鏈血清在37°C溫育I小時(shí)。然后以相同的方式洗板并用PH 4. 2包含底物0-fenilendiamine的檸檬酸鹽-磷酸緩沖液溫育。15分鐘后在492nm測(cè)量吸光率。通過(guò)使用NGcGM3和NacGM3神經(jīng)節(jié)苷脂進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)ELISA來(lái)確定嵌合抗體識(shí)別抗原的能力。簡(jiǎn)短地說(shuō)，用50 ii L甲醇中的4 ii g/mL NGcGM3或NAcGM3的溶液包被聚苯乙烯板(PolysorpjNunc)并在 37°C下溫育 I 小時(shí)。然后用 200 y L I % 的 Tris-HCl (pH7. 8-8. 0)緩沖液中的牛血清白蛋白溶液(BSA)在37°C下封閉板I小時(shí)。用PBS洗板3次后，在lmg/mL生物素化鼠科動(dòng)物14F7抗體存在的情況下以2 u g/mL-0. 01 u g/mL之間的濃度范圍加入在
I% Tris-HCl-BSA中稀釋的樣品，37°C溫育2小時(shí)。在用PBS洗板之后，在37°C下用鏈霉抗生物素-過(guò)氧化物酶綴合物(Jackson)對(duì)反應(yīng)顯色I(xiàn)小時(shí)。在492nm測(cè)量吸光率。4.通過(guò)T表位的人源化來(lái)構(gòu)建人源化的Ab 147FhTT表位的預(yù)測(cè)用AMPHI 程序(Margalit H 等人，J Immunol 138 =2213-2229,1987)分析 14F7 可變結(jié)構(gòu)域的序列，所述程序允許鑒定具有與T細(xì)胞免疫原性相關(guān)的兩親性螺旋結(jié)構(gòu)的7或11個(gè)氨基酸的片段。在這種情況下這些算法預(yù)測(cè)涉及鼠科動(dòng)物14F7單克隆抗體的重鏈和 輕鏈可變區(qū)中的T表位呈遞的片段。-與人免疫球蛋白的同源性分析將14F7的可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與報(bào)道的人免疫球蛋白的可變區(qū)序列比較以鑒定與正被分析的鼠科動(dòng)物分子具有最高同源性的人免疫球蛋白。可使用互聯(lián)網(wǎng)上可獲得的 SWISSPR0T 數(shù)據(jù)庫(kù)通過(guò) BLAST 程序(Altschul S F 等人，Nucleic Acids Res 25:3389-3402,1997)實(shí)現(xiàn)該目的。-免疫原性減小的分析所述方法的實(shí)質(zhì)在于通過(guò)可能的T表位的斷裂或人源化獲得免疫原性減小，同時(shí)在FRs上特別是那些具有兩親性螺旋結(jié)構(gòu)的片段上具有最少突變(排除那些參與抗原識(shí)別位點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu)的位點(diǎn))。根據(jù)所述方法將鼠科動(dòng)物免疫球蛋白的VH和VL可變區(qū)的序列與最高同源性的人的免疫球蛋白的進(jìn)行比較并且只在FRs區(qū)內(nèi)的兩親性區(qū)域中鑒定鼠科動(dòng)物和人序列之間不同的殘基(Kabat E, Sequencesof proteins of immunological interest, FifthEdition,NationalInstitute of Health, 1991)。這些“鼠科動(dòng)物”殘基可以與發(fā)現(xiàn)于人序列的相同位置上的殘基互換。出現(xiàn)在FRs位置上負(fù)責(zé)規(guī)范結(jié)構(gòu)的殘基、出現(xiàn)在Vernier區(qū)域的殘基或參與VH-VL界面相互作用的殘基不能被突變，因?yàn)槠淇梢杂绊懣贵w可變結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)因而影響與抗原的結(jié)合。通過(guò)可變區(qū)域分子建?？色@得額外的涉及替換對(duì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的影響的信息。由于在突變?cè)姆治鲋锌紤]例如在兩親性螺旋中存在脯氨酸殘基或這樣的事實(shí)某些鼠科動(dòng)物殘基不出現(xiàn)在最高同源性的人序列中的相同位置上但經(jīng)常出現(xiàn)在其它的人免疫球蛋白中，因此可能獲得包含最多突變的版本，即，所有不同于人序列的鼠科動(dòng)物殘基發(fā)生突變，但也可獲得具有不同突變組合的其它版本。在鑒定鼠14F7序列中可能的T表位和鑒定這些片段內(nèi)的不同于人的殘基后，可通過(guò)常規(guī)的定向誘變技術(shù)進(jìn)行替換。-人源化14F7hT抗體在NSO細(xì)胞內(nèi)的克隆和表達(dá)。在通過(guò)前述方法獲得對(duì)應(yīng)于14F7hT抗體的VH和VL區(qū)的基因構(gòu)建體后，將其克隆入各自的與上述在嵌合抗體構(gòu)建情況下相似的表達(dá)載體中，獲得如下基因構(gòu)建體14F7hTVK-PAG4622和14F7hTVH_PAH4604。在與描述的用于嵌合抗體的完全相同的條件下將這些基因轉(zhuǎn)染NSO細(xì)胞。同樣通過(guò)ELISA檢測(cè)產(chǎn)生所述人源化抗體的克隆。使用NGcGM3和NAcGM3神經(jīng)節(jié)苷脂通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性ELISA確定所述人源化抗體對(duì)抗原的特異性識(shí)別的能力。所述方法與描述用于嵌合抗體的方法一致。5.基于絲狀噬菌體的來(lái)自14F7雜交瘤的抗體片段文庫(kù)的構(gòu)建。從14F7雜交瘤細(xì)胞中分離信使RNA，合成互補(bǔ)DNA，分別使用兩套設(shè)計(jì)用來(lái)與廣譜的鼠科動(dòng)物可變區(qū)雜交的寡核苷酸來(lái)分別擴(kuò)增對(duì)應(yīng)于重鏈和輕鏈的可變區(qū)的序列。純化各擴(kuò)增的重鏈可變區(qū)，用合適的酶降解并連接入預(yù)先用相同酶降解的噬菌體PHG-1m載體(設(shè)計(jì)用來(lái)將單鏈抗體呈現(xiàn)在絲狀噬菌體表面)。純化結(jié)合反應(yīng)的產(chǎn)物并通過(guò)電穿孔將其導(dǎo)入TGl大腸桿菌(E. coli)株系的細(xì)菌中。經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞構(gòu)成了有限多樣性(其所有都來(lái)源于14F7雜交瘤)的重鏈可變區(qū)半文庫(kù)。純化對(duì)應(yīng)于該半文庫(kù)的DNA并且分別連接至輕鏈可變區(qū)(預(yù)先純化和用合適的酶降解)集合體中。最后通過(guò)電穿孔將其基因構(gòu)建體導(dǎo)入TGl株系細(xì)菌中，形成不同種類的獨(dú)立文庫(kù)。其中一個(gè)是用也獲自14F7雜交瘤的輕鏈可變區(qū)構(gòu)建 的有限多樣性的迷你文庫(kù)。也獲得了鏈交換文庫(kù)，其中來(lái)自雜交瘤的重鏈可變區(qū)與多種獲自鼠科動(dòng)物和人淋巴細(xì)胞的輕鏈可變區(qū)集合體組合。6.產(chǎn)生抗N-乙醇酰GM3的抗體片段的克隆的分離和表征。隨機(jī)挑取各文庫(kù)的克隆，通過(guò)使用輔助噬菌體M13 K07從其中產(chǎn)生噬菌體。通過(guò)固相免疫酶檢驗(yàn)(ELISA)直接分析攜帶所述抗體片段的噬菌體對(duì)N-乙醇酰GM3的識(shí)別。因此產(chǎn)生功能性片段的克隆被定位。產(chǎn)生攜有抗體片段(來(lái)自形成各文庫(kù)的轉(zhuǎn)化細(xì)菌的總混合物)的噬菌體以獲得富含功能性抗體片段的制備物并考察文庫(kù)的多樣性。將獲得的噬菌體混合物與結(jié)合在固體表面的抗原N-乙醇酰GM3接觸，攜帶具有結(jié)合能力的抗體片段的噬菌體被保留而其余被充分的洗滌除去。通過(guò)改變PH洗脫所述結(jié)合噬菌體和繁殖所述結(jié)合噬菌體以獲得新的噬菌體混合物，所述混合物用作針對(duì)抗原進(jìn)行新一輪選擇的起始材料。在各輪選擇后，分析呈現(xiàn)在來(lái)自集落的噬菌體上的抗體片段的識(shí)別功能。因此鑒定了稀釋在起始文庫(kù)中的產(chǎn)生功能性片段的另外的克隆。由所述克隆產(chǎn)生的抗體片段的表征包括通過(guò)ELISA分析抗成組的相關(guān)神經(jīng)節(jié)苷脂的特異性、通過(guò)免疫組織化學(xué)進(jìn)行的腫瘤識(shí)別研究、估計(jì)其在噬菌體外作為可溶性功能性抗體片段產(chǎn)生的能力以及其可變區(qū)的完全測(cè)序。
實(shí)施例在下列的實(shí)施例中，除非特別指出，使用的所有限制性酶或修飾以及試劑和材料獲自商業(yè)來(lái)源。實(shí)施例1.獲取14F7嵌合單克隆抗體通過(guò)使用具有限制性位點(diǎn)Eco RV-Nhe I (針對(duì)VH)和Eco RV-SalI (針對(duì)VK)的特異性寡核苷酸，用Vent聚合酶進(jìn)行PCR以合成和擴(kuò)增鼠科動(dòng)物的VH和VK可變區(qū)cDNA。寡核苷酸引物如下對(duì)于VH 寡核苷酸I (在信號(hào)肽處雜交):5’ ggg gatatc cacc atg gaa agg cac tgg ate ttt ctc ttcctg 3’寡核苷酸2 (在JHl處雜交):
5， ggg gctagc tga gga gac ggt gac cgt ggt 3，對(duì)于VK 寡核苷酸I (在信號(hào)肽處雜交):5，ggg gatatc cacc atg gt (at) t (tc) c (ta) ca cct cag (at) t (ac) ctt gga ctt3，寡核苷酸2 (在VLJ5處雜交):5’ age gtcgac tta cgt ttc age tcc age ttg gtc cc 3’用限制性內(nèi)切酶Eco RV-Nhe I (針對(duì)VH)和Eco RV-Sal I (針對(duì)VK)降解VH和VK的PCR產(chǎn)物，并克隆入其各自的分別對(duì)應(yīng)于VH和VK的表達(dá)載體PAH4604和PAG4622中。這些載體用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)免疫球蛋白，由Sherie Morrison (UCLA, California,USA)提供。載體PAH4604包含人IgGl恒定區(qū)PAG4622包含人k恒定區(qū)(Coloma J等人，J Immunol Methods 152 :89_104，1992)。在14F7的VH和VK區(qū)被克隆入前面的載體中后，產(chǎn)生了構(gòu)建體 14F7VH-PAH4604 和 14F7VK-PAG4622。根據(jù)廠商描述的實(shí)驗(yàn)方案使用17 DNA Polymerase測(cè)序試劑盒(Amershan-Pharmacia)通過(guò)雙脫氧核苷酸方法(Sanger F 等人，DNAsequencing withchain-terminating inhibitors. PNAS USA1979 ；74 :5463-5470)對(duì) 12 個(gè)獨(dú)立的克隆進(jìn)行測(cè)序。根據(jù) Kabat 分類(Kabat E, Sequences of proteins of inmunological interest,Fifth Edition, National Institute of Health, 1991), VH 和 VK 序列分別與 IIB 和 V 亞型高度相關(guān)(

圖1A和B)。用Pvu I 酶線性化的 10 ii g 14F7VH-PAH4604 和 10 u gl4F7VK_PAG4622 對(duì)NSO 細(xì)胞進(jìn)行電穿孔。用乙醇沉淀DNAs，混合和溶解在50 ii L PBS中。通過(guò)離心收集培養(yǎng)至半?yún)R合的大約IO7個(gè)細(xì)胞并在電穿孔杯中與DNA —起重新懸浮于0. 5mL PBS中。在冰浴10分鐘后，使所述細(xì)胞接受200V和960F的脈沖，然后冰浴10分鐘。將所述細(xì)胞培養(yǎng)在96孔板的含有10% FCS和IOmM L-組氨醇的Dulbecco Modified(DMEM-F12)選擇培養(yǎng)基中。在加入選擇培養(yǎng)基10天后觀察到轉(zhuǎn)染的克隆。使用克隆的上清液通過(guò)ELISA確定嵌合免疫球蛋白的產(chǎn)生。為此目的,用IOOmM碳酸鹽碳酸氫鹽緩沖液(pH9. 8)中的山羊抗人IgG血清(Sigma)包被聚苯乙烯板(High binding, Co star)并在4°C過(guò)夜。然后用PBS-Tween (磷酸緩沖鹽 溶液，0. 5% Tween-20, pH 7. 5)洗板，加入在PBS-Tween-FCS中稀釋的培養(yǎng)上清液樣品并在37°C溫育I小時(shí)。然后再用PBS-Tween洗板，然后用綴合過(guò)氧化物酶的山羊抗人k鏈血清(Jackson)在37°C溫育I小時(shí)。之后以相同的方法洗板并用含有底物o_fenilendiamine的檸檬酸鹽磷酸緩沖溶液(pH 4.2)進(jìn)行溫育。15分鐘后在492nm測(cè)量吸光率。實(shí)施例2. 14F7Q抗體對(duì)NGcGM3和NAcGM3的反應(yīng)性。通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)ELISA確定14F7嵌合抗體(Ab)的反應(yīng)性。圖2顯示與鼠科動(dòng)物14F7比較的嵌合14F7對(duì)包被GM3 N-乙醇酰神經(jīng)節(jié)苷脂的聚苯乙烯板(Polysorp, Nunc)的識(shí)別特異性。兩種Abs都顯示以相似的濃度達(dá)到鼠科動(dòng)物生物素化的14F7 Ab對(duì)抗原識(shí)別的50%的抑制。然而當(dāng)用N-乙?；腉M3變體包被板時(shí)，對(duì)任何一個(gè)所述抗體都沒有觀察到免疫反應(yīng)性。鼠科動(dòng)物C5 Mab用作非相關(guān)Ab。實(shí)施例3.獲得不同的人源化抗體版本。將14F7 VH和VK序列與人序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較以獲得對(duì)VH和VK區(qū)(圖1A和B)具有最高同源性的人14F7抗體序列。此外，確定兩個(gè)序列中的兩親性區(qū)域或潛在的T表位。然后按照T表位人源化的方法確定將鼠科動(dòng)物VH和VK序列轉(zhuǎn)換成人序列所需的突變。我們下面涉及可以進(jìn)行的最大可能的突變。在VH區(qū)的情況下，在位點(diǎn)5、9、11、12、18、19、20、38、40、42和48上引入突變，其中氨基酸Q，N，L，A，M，K，M，K，R，D和I分別被V，A，V，V，V，R，V，R，A，G和V取代。通過(guò)重疊PCR 產(chǎn)物(Kamman M 等人，Nucleic Acids Research 17 :5404-5410,1989)進(jìn)行這些突變，方法為在第一輪PCRs中使用寡核苷酸I和2及3和4，然后所得PCR產(chǎn)物在另一輪PCR中重疊并只使用寡核苷酸2和4進(jìn)行PCR。所使用的寡核苷酸序列顯示如下用于重鏈的5、9、11和12突變的寡 核苷酸寡核昔酸1:5' gtc cag ctt gtg cag tct ggg get gaa gtg gtaaaa cct ggg
O /寡核苷酸2 :5’ ggg gctagc tga gga gac ggt gac cgt ggt 3’寡核音酸 3:5' ccc agg ttt tac cac ttc age ccc aga ctg cacaag ctg gac
O /寡核音酸 4:5’ ggg gat ate cacc atg gaa agg cac tgg ate tttctc ttc ctg
O y在對(duì)前面的突變進(jìn)行測(cè)序和鑒定后，在攜帶其的DNA的18、19和20位點(diǎn)上引入突變以分別用氨基酸V、R、V取代M、K、M0下面顯示用于所述突變的寡核苷酸I和2及3和4。如前面所述進(jìn)行PCR產(chǎn)物的重疊。用于重鏈的18、19和20突變的寡核苷酸寡核苷酸1:5' ggg gcc tea gtg agg gtg tcc tgc agg 3'寡核苷酸2 :5’ ggg gctagc tga gga gac ggt gac cgt ggt 3’寡核苷酸3# cct gca gga cac cct cac tga ggc ccc 3!寡核音酸4:5，ggg gatatc cacc atg gaa agg cac tgg ate tttctc ttc ctg 3，同樣在對(duì)前面突變進(jìn)行測(cè)序和鑒定后，在攜帶其的DNAs的38、40和42位點(diǎn)上引入突變R、A、G以分別替代氨基酸K、R、D。下面顯示用于這些突變的寡核苷酸I和2及3和4。如前面所述進(jìn)行PCR產(chǎn)物的重疊。用于重鏈的38、40和42突變的寡核苷酸寡核苷酸1:5' cac tgg tta aga cag gca cctggc cag ggt ctg3!寡核苷酸2 :5’ ggg gctagc tga gga gac ggt gac cgt ggt 3’寡核苷酸3:5' cag acc ctg gcc agg tgc ctg tct taa cca gtg3!寡核音酸 4:5’ ggg gat ate cacc atg gaa agg cac tgg ate tttctc ttc ctg
O y最后在通過(guò)測(cè)序鑒定前面的突變后，在攜帶其的DNAs的位點(diǎn)48上引入突變以氨基酸V替代I。下面顯示用于該突變的寡核苷酸I和2及3和4。如前面所述進(jìn)行PCR產(chǎn)
物的重疊。用于重鏈的48突變的寡核苷酸
寡核苷酸1:5’ ctggaa tgg gtt gga tac att 3,寡核苷酸2:5’ ggggctagc tga gga gac ggt gac cgt ggt 3,寡核苷酸3 :5，aatgta tcc aac cca ttc cag 3，寡核音酸 4:5’ ggggat ate cacc atg gaa agg cac tgg ate tttctc ttc ctg
O y通過(guò)測(cè)序鑒定所有這些突變。獲得的基因構(gòu)建體命名為14F7hTVH。在重鏈的情況下，在VH14F7和最相似的人抗體之間有不同的氨基酸沒有進(jìn)行取代，因?yàn)檫@些取代涉及Vernier區(qū)的氨基酸或這些取代是抗原識(shí)別中關(guān)鍵的位置。
對(duì)于輕鏈，在位置39、40、41、42和58上進(jìn)行突變，分別用K、P、G、Q和V取代R、T、H、E、I。以與重鏈中相同的方式引入突變。下面描述所使用的寡核苷酸序列。用于輕鏈的39、40、41和42突變的寡核苷酸寡核苷酸1:5' tat caa caa aaa cca ggt cag tct cca agg 3!寡核苷酸2 :5，age gtcgac tta cgt ttc age tcc age ttg gtccc 3，寡核苷酸3 :5' cct tgg aga ctg acc tgg ttt ttg ttg ata 3'寡核苷酸4 :5，ggg gatatc cacc atg gt (at) t (tc) c (ta) cacct cag (at) t (ac) cttgga ctt 3’通過(guò)測(cè)序鑒定前面的突變后，在攜帶其的DNAs的位點(diǎn)58上引入突變以氨基酸V取代I。下面顯示用于該突變的寡核苷酸I和2及3和4。如前面所述進(jìn)行PCR產(chǎn)物的重疊。用于輕鏈的58突變的寡核苷酸寡核苷酸1:5，att tct ggg gtc ccc tcc agg 3，寡核音酸2 :5，age gtcgac tta cgt ttc age tcc age ttg gtccc 3，寡核苷酸3 :5，cct gga ggg gac ccc aga aat 3’寡核苷酸4:5，ggg gatatc cacc atg gt (at) t (tc) c (ta) ca cctcag (at) t (ac) cttgga ctt 3’在進(jìn)行突變后通過(guò)測(cè)序確定之。所得的基因構(gòu)建體稱為14F7hTVK。將人源化的VK和VH區(qū)克隆入載體PAG4622和PAH4604，分別產(chǎn)生構(gòu)建體14F7hTVH-PAH4604和14F7hTVK_PAG4622。分別用10 y g預(yù)先用Pvu I降解而線性化的載體14F7hTVH-PAH4604和14F7hTVK_PAG4622對(duì)NSO細(xì)胞進(jìn)行電穿孔，所述各載體攜帶人源化的可變區(qū)。表達(dá)14F7hT人源化抗體的克隆的電穿孔方法和檢測(cè)方法與所描述的用于嵌合抗體的方法相同。實(shí)施例4 :在體內(nèi)血管形成模型中14F7 Ab對(duì)腫瘤生長(zhǎng)減少的影響。將與作為血管發(fā)生誘導(dǎo)物的基質(zhì)凝膠混合的黑素瘤B16腫瘤細(xì)胞系用作體內(nèi)血管發(fā)生的模型。在C57/BL6雄性小鼠的中腹線處皮下移植帶有基質(zhì)凝膠的腫瘤系(B16)，測(cè)量腫瘤血管形成過(guò)程的誘導(dǎo)。為實(shí)現(xiàn)該目的，將黑素瘤B16細(xì)胞與0. 5mL基質(zhì)凝膠和64個(gè)單位/mL肝素混合，單獨(dú)地使用作為對(duì)照組或與其它抗體組合，通過(guò)皮下注射至動(dòng)物腹部區(qū)域進(jìn)行施用。接種15天后，殺死動(dòng)物并將凝膠珠狀物連同真皮和表皮殘余取出，并宏觀觀察腫瘤的大小。圖3顯示用14F7處理的小鼠腫瘤的腫瘤團(tuán)大小顯著減小。為區(qū)分新血管，對(duì)用蘇木精/曙紅染色和用抗PECAM Mab (內(nèi)皮標(biāo)記)免疫染色的凝膠進(jìn)行組織病理學(xué)分析。圖4A和B顯示與未處理動(dòng)物的腫瘤切片相比，在用14F7處理的動(dòng)物組織切片中觀察到血管數(shù)目減少。實(shí)施例5 從14F7雜交瘤構(gòu)建絲狀噬菌體的抗體片段文庫(kù)。用 TriPure Isolation Reagent(Boehringer Mannheim, Germany)從 5.OxlO614F7雜交瘤細(xì)胞中分離信使RNA并用Pro-STAR FirstStrand RT-PCR reagent試劑盒(Stratagene, USA)合成互補(bǔ)DNA。按照下列條件進(jìn)行26個(gè)循環(huán)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以擴(kuò)增來(lái)自雜交瘤的重鏈和輕鏈可變區(qū)94°C進(jìn)行50秒、55°C進(jìn)行I分鐘、72°C進(jìn)行I分鐘。為進(jìn)行擴(kuò)增，使用了所有可能的成套簡(jiǎn)并寡核苷酸組合(設(shè)計(jì)用來(lái)與廣泛的小鼠可變區(qū)雜交)，所述寡核苷酸顯示于下列表中
用于擴(kuò)增VH和VL的寡核苷酸。在寡核苷酸序列中，簡(jiǎn)并位置出現(xiàn)在括號(hào)內(nèi)。限制性位點(diǎn)的序列用下劃線標(biāo)示。5，VH Apa LI5，…ttc tat tct cac agt gca cag(gc)ag gt (gt)cag ct(gt)ac(ag)cag tc (at)gga 3，5，...ttc tat tct cac agt gca cag gc (ag)gt (ct)ca (ag)ctg cag cag ct (ct)ggg gc 3’5， ...ttc tat tct cac agt gca cag ga(ag)gtg aag ct(gt)(gc)t(gc)gag tctgg (ag)gga 3，3’ VH Sfi I5，... ga acc agt act cca rrc ctg aRR rrc crc aga gac agt gac cag agt ccc 3，5，... ga acc agt act cca rrc ctg aRR rrc cm gga gac ggt gac tga ggt tcc 3，5，...ga acc agt act cca rrc ctR aRR rrc CRa gga gac(gt)gt ga(gc)(ca)gtgga(gc)cc. . . 3'5，Vl Sal I. . . gta ctc caR tcR acR aca ttg tg (ca) tg (at) t (ac) c agt ctc c. . .. . . gta ctc caR tcR acR ata tcc aga tga c (ac) c a (ga) a ct (ac) c. . .5，. . . gta ctc cag_tcg_ac (eg) aaa ttg t (tg) c tea ccc agt ctc c. . . 3，3，Vl Not I5’ .. .aag gaa aaa aRC rrc crc ttt (tc)a (tg) (tc)tc cag ctt ggt. . . 3f5， aag gaa aaa aRC rrc crc ttt (tg)a (tg)ctc caa ctt gt (gt). . . 3f純化擴(kuò)增的重鏈可變區(qū)并隨后用限制性酶Sfi I和ApaL I進(jìn)行降解。純化降解產(chǎn)物并與 phagomidium 載體 pHG_lm(Heber Biotec S. A.，Cuba)(圖 5)的 DNA 連接。通過(guò)電穿孔用所得的基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化大腸桿菌株系TG1。轉(zhuǎn)化的細(xì)菌群體組成2. 3X104個(gè)成員的中等大小的重鏈可變區(qū)半文庫(kù)，所述重鏈可變區(qū)來(lái)源于14F7雜交瘤。純化半文庫(kù)的質(zhì)粒DNA,隨后用Not I和Sal I酶降解。將該DNA分別與4個(gè)預(yù)先用相同酶降解的輕鏈可變區(qū)集合體連接。用這些新的基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化TGl株系細(xì)菌從而獲得4個(gè)獨(dú)立的文庫(kù)。其中一個(gè)是包含來(lái)源于14F7雜交瘤的重鏈和輕鏈可變區(qū)的大小為1. 6xl06個(gè)體的有限多樣性迷你文庫(kù)。其它三個(gè)是整合多種早先獲自小鼠(K同種型)和人(K和X同種型)的輕鏈可變區(qū)集合體的鏈交換文庫(kù)并且其大小分別為1. OxlO7U. 4xl06和1. 2xl06個(gè)成員。實(shí)施例6 :產(chǎn)生抗N-乙醇酰GM3的抗體片段的克隆的分離。根據(jù)前面(Marks,J. D.等人，J. Mol. Biol. 222，581-597. 1991)描述的方法在微量滴定板的小孔中產(chǎn)生攜帶抗體片段的噬菌體，所述噬菌體來(lái)自各文庫(kù)隨機(jī)挑取的92個(gè)克隆。通過(guò)在以I U g/ml N-乙醇酰GM3和N-乙酰GM3包被的聚氯乙烯板(Costar，USA)上進(jìn)行ELISA來(lái)估計(jì)其特異性。用綴合過(guò)氧化物酶(Amersham, Sweden)的抗M13單克隆抗體檢測(cè)結(jié)合的噬菌體。除了表征隨機(jī)挑選的單個(gè)克隆，還進(jìn)行從噬菌體混合物中選擇具有結(jié)合N-乙醇酰GM3的能力的噬菌體，所述噬菌體混合物由形成各文庫(kù)的細(xì)胞群產(chǎn)生。為了該目的，使用輔助噬菌體M13 K07產(chǎn)生噬菌體，根據(jù)提到的方法通過(guò)用聚乙二醇沉淀來(lái)純化其并將其與結(jié)合在塑料表面(Inmuno tubes, Nunc, Denmark)的N-乙醇酰GM3接觸。充分洗·滌管子并在lOOmmol/1三乙胺存在的情況下洗脫所述噬菌體。中和洗脫物并用于感染大腸桿菌株系TGl的細(xì)菌。從感染的細(xì)菌群中產(chǎn)生攜帶抗體的噬菌體并再次純化噬菌體，將純化的噬菌體用作起始材料在與所述條件相同的條件下進(jìn)行新一輪篩選。經(jīng)過(guò)4輪篩選后，隨機(jī)挑選92個(gè)產(chǎn)生自各文庫(kù)的噬菌體感染的細(xì)菌克隆和以與所述用于對(duì)從文庫(kù)中隨機(jī)挑選的克隆進(jìn)行估計(jì)的方法相似的方法進(jìn)行N-乙醇酰GM3識(shí)別。根據(jù)對(duì)產(chǎn)生克隆的文庫(kù)的克隆(根據(jù)攜帶識(shí)別N-乙醇酰GM3的抗體片段的噬菌體分離的)的直接分析，發(fā)現(xiàn)所述克隆在三個(gè)鏈交換文庫(kù)中頻率不同。在專門由來(lái)源于14F7雜交瘤的可變區(qū)形成的迷你文庫(kù)中沒有陽(yáng)性克隆。多輪選擇后，從鏈交換文庫(kù)中分離出另外的克隆，并且在原始序列的迷你文庫(kù)中沒有發(fā)現(xiàn)一個(gè)所述克隆。下表顯示產(chǎn)生識(shí)別N-乙醇酰GM3的抗體片段的克隆的數(shù)量和其出現(xiàn)在經(jīng)分析來(lái)自各文庫(kù)的克隆總數(shù)中的頻率。只有一個(gè)克隆產(chǎn)生呈現(xiàn)與N-乙酰GM3交叉反應(yīng)性的噬菌體。
文犀？目性克隆頻率V陽(yáng)性克隆頻率
______(直接篩選)(4輪篩選)
雜交瘤14F7文庫(kù)0/920/92'
鼠科動(dòng)物K輕鏈的交換31/92 (33. 7 ) 52/92 (56.52 )
人 K 糕鏈的交換2/92 17 8/92 (17, 39%)
人入輕鏈的交換4/92 (4. 35%)12/92 (13. 04%)一個(gè)克隆具有與N-乙酰GM3的交叉反應(yīng)。實(shí)施例7.來(lái)源于14F7的識(shí)別N-乙醇酰GM3的抗體片段的表征。通過(guò)使用與pHG-lm載體的區(qū)域雜交的寡核苷酸用自動(dòng)測(cè)序儀ALFExpressII (Pharmacia, Sweden)對(duì)11個(gè)抗體片段的可變區(qū)進(jìn)行完全測(cè)序,所述pHG_lm載體的區(qū)域位于編碼插入抗體片段的序列的5’和3’端的側(cè)翼。可以確定所有重鏈可變區(qū)的序列對(duì)應(yīng)于一個(gè)報(bào)道的14F7的重鏈可變區(qū)，僅在構(gòu)架區(qū)I和構(gòu)架區(qū)4區(qū)域出現(xiàn)變化，所述變化可假定是由PCR中簡(jiǎn)并寡核苷酸的使用引入的。包含3個(gè)CDRs的序列沒有變化。相反地，所有
11個(gè)克隆的輕鏈可變區(qū)序列與14F7的不同并且被分入5個(gè)不同序列組，2個(gè)鼠科動(dòng)物來(lái)源組和I個(gè)人來(lái)源(K同種型)組和2個(gè)其它的為\同種型的人來(lái)源組。各序列組挑選一個(gè)代表性克隆進(jìn)行隨后的表征。下表表示所選擇的克隆的輕鏈可變區(qū)之間在其來(lái)源的一致性、其來(lái)源和同種型以及亞組分類(根據(jù)Kabat分類)方面的差異。
權(quán)利要求
1.一種來(lái)源于鼠科動(dòng)物14F7單克隆抗體的并保存14F7的識(shí)別特異性的Fv單鏈類型片段，其中所述鼠科動(dòng)物14F7單克隆抗體由保藏號(hào)為ECACC 98101901的雜交瘤產(chǎn)生，所述片段含有如下所示的重鏈的高可變區(qū)(CDRs)和FRs區(qū)的序列 重鏈CDRl =SYffIHCDR2 YIDPATAYTESNQKFKDCDR3 ESPRLRRGIYYYAMDYFRl QVQLQQSGNELAKPGASMKMSCRASGYSFTFR2 =WLKQRPDQGLEffIGFR3 KAILTADRSSNTAFMYLNSLTSEDSAVYYCARFR4 WGQGTTVTVSSo
2.權(quán)利要求1的片段，其進(jìn)一步含有具有如下序列的VL結(jié)構(gòu)域Frl DIVMFQSPASLAVSLGQRATISCCDRl RASQSVSSSSYSYMHFr2 WYQQKPGQPPKLLIKCDR2 YASNLESFr3 GVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCCDR3 QHSRDVPLTFFr4 GAGTKLEIK。
3.權(quán)利要求1的片段，其進(jìn)一步含有具有如下序列的VL結(jié)構(gòu)域Frl DIQMTQTPSSLSASLGDRVTISCCDRl RASQDISNYLNFr2 WYQQKPDGTVKLLIVCDR2 YTSRLHSFr3 GVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCCDR3 QQGNTLPPTFFr4GAGTKLELK。
4.權(quán)利要求1的片段，其進(jìn)一步含有具有如下序列的VL結(jié)構(gòu)域FrlDIQMTQTPSSLSASVGDRVTITCCDRlRASQSISSFLNFr2WYQQKPGKAPKLLIYCDR2AASNLQSFr3GVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQPEDFAAYYCCDR3QQGYTTPLTFFr4GQGTKLELKo
5.權(quán)利要求1的片段，其進(jìn)一步含有具有如下序列的VL結(jié)構(gòu)域FrlQSVVTQPPSASGGPGQSLTISCCDRlTGTSSDVGGYNHVSFr2WYQQHPGKAPKLMIYCDR2DVSKRPSFr3GVPHRFSGSKSGNTASLTVSGLQAEDEAVYYCCDR3SSYAGSNNLVFFr4GGGTKVTVLo
6.權(quán)利要求1的片段，其進(jìn)一步含有具有如下序列的VL結(jié)構(gòu)域FrlSSELTQDPAVSVALGQTVRITCCDRlQGDSLRSYYASFr2WYQQKPGQAPVLVIY
全文摘要
本發(fā)明主要涉及通過(guò)基因工程生產(chǎn)免疫原性較少的免疫球蛋白，更具體地涉及識(shí)別抗原的單克隆抗體，所述抗原包括N-乙醇酰GM3神經(jīng)節(jié)苷脂而不包括其它的N-乙醇?；騈-乙酰類型的神經(jīng)節(jié)苷脂或硫酸化糖脂。更特別地本發(fā)明涉及編碼重組單克隆抗體的肽序列或其衍生片段以及含有所述重組抗體或其片段的藥物組合物和其在乳腺癌和黑素瘤的診斷和治療上的用途，所述重組單克隆抗體抗N-乙醇酰GM3神經(jīng)節(jié)苷脂。
文檔編號(hào)C07K16/30GK103012586SQ20121051726
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2004年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月23日
發(fā)明者L·T·羅奎納瓦羅, C·M·馬提奧德阿克斯塔德爾里奧, M·羅德里戈茲岡薩雷茲, G·羅扎斯多蘭特斯, A·塔拉維拉佩雷茲, E·莫利諾弗里亞斯 申請(qǐng)人:分子免疫中心