專利名稱：高凝固性纖維蛋白原膠的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高凝固性纖維蛋白原膠，具體的說是涉及一種能迅速形成纖維蛋白膠，具有高度止血和封閉創(chuàng)面的作用的纖維蛋白原、纖維蛋白原活性增強(qiáng)因子和少量凝血酶組成的藥物組合物。
凝血酶可以從動(dòng)物血液或人血液中提取制得，但是工藝復(fù)雜成本也高，而且凝血酶用量較大，有導(dǎo)致嚴(yán)重出血的危險(xiǎn)。目前市售纖維蛋白原膠中凝血酶的含量為300～600U/ml。因此降低纖維蛋白原膠中的凝血酶含量不僅是經(jīng)濟(jì)方面考慮的需要，也是臨床的需要。本發(fā)明通過對(duì)纖維蛋白原膠凝固活性調(diào)解因素的研究，發(fā)現(xiàn)了一些具有使纖維蛋白原凝固活性明顯增強(qiáng)的物質(zhì)，這些物質(zhì)在少量存在的情況下能增強(qiáng)纖維蛋白原凝固性，通過少量凝血酶作用即可迅速形成纖維蛋白膠，因此大大地減少了凝血酶的用量，降低了纖維蛋白原膠的生產(chǎn)成本。本發(fā)明中凝血酶的用量為10～100U/ml，是目前市售纖維蛋白原膠用量的1/6～1/30。而纖維蛋白原活性增強(qiáng)因子多為高分子聚合物，用量一般很少。
纖維蛋白原活性增強(qiáng)因子是具有聚陽離子特性的高分子化合物，在水溶液中解離形成聚陽離子。形成具有一定電荷密度的集團(tuán)。通過靜電作用和體積排斥作用，使纖維蛋白原分子的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，充分暴露出凝血酶的作用位點(diǎn)，因此使纖維蛋白原處于高度活性狀態(tài)，纖維蛋白原凝固性增強(qiáng)因子在這一組份中起到催化劑的作用。本發(fā)明是在這一新的研究發(fā)展的基礎(chǔ)上提出的。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的它由A、B、C、D四個(gè)組份構(gòu)成，其特征在于組份A是凍干纖維蛋白原，含量為20～120mg/ml；組份B是含有纖維蛋白原活性增強(qiáng)因子的生理緩沖鹽溶液；組份C是凍干凝血酶，含量為10～100U/ml；組份D是含有CaCI2的生理緩沖鹽溶液，pH6～8。
另外，本發(fā)明也可以由雙組份組成，將組份A溶于組份B制成組份1含有纖維蛋白原活性增強(qiáng)因子的纖維蛋白原生理緩沖鹽溶液，纖維蛋白原含量20～120mg/ml，在-20℃以下保存；將組份C溶于組份D制成組份2含有凝血酶的CaCI2生理緩沖鹽溶液，凝血酶含量為10～100U/ml，CaCl240mM，pH6～8，在-20℃以下保存。
其中，所述的纖維蛋白原膠為人血纖維蛋白原、牛血纖維蛋白原或豬血纖維蛋白原。
其中，所述的纖維蛋白原活性增強(qiáng)因子包括組蛋白、血小板第4因子、多聚賴氨酸、富組氨酸糖蛋白、魚精蛋白、聚二甲基二烯丙基氯化銨、堿性蛋白、β-血栓球蛋白、陽離子蛋白、聚陽離子化合物、亞甲藍(lán)或鏈霉素。
其中，所述的高凝固性纖維蛋白原膠四組份中組份A纖維蛋白原和組份C凝血酶為冷凍干燥品。雙組份高凝固性纖維蛋白原膠組份1和組份2為液體，在-20℃以下保存。
其中，組份A可以從動(dòng)物血液或人血液中提取制備將動(dòng)物或人的血漿，加入乙醇溶液，低溫?cái)嚢?，并離心收集沉淀，收集的沉淀物加入溶解液適量溶解，然后用雙縮脲法測(cè)定蛋白的濃度，最終將纖維蛋白原的濃度調(diào)至20～120mg/ml，分裝入瓶中，在-40℃～-20℃冷凍至完全凍結(jié)，用冷凍干燥機(jī)冷凍干燥12-24小時(shí)，冷凍干燥品在4℃保存。
其中，組份B為纖維蛋白原活性增強(qiáng)因子磷酸緩沖鹽溶液，優(yōu)選滲透壓為270～320mOsm，鈉含量為148～163mM/L，氯含量123～135mM/L，PH6～8。
其中，組份C也可以從動(dòng)物血液或人血液中提取制備將動(dòng)物或人的血漿溶于蒸餾水中，用酸調(diào)節(jié)PH，離心，收集沉淀物為凝血酶復(fù)合物；在30℃條件下，將凝血酶原復(fù)合物溶于1～2倍的0.9％NaCI溶液中，攪拌均勻，加入1.5％的氯化鈣，攪拌，在4℃下放置，保證凝血酶原轉(zhuǎn)成凝血酶，離心棄去沉淀，上清液加入等量預(yù)冷至4℃的丙酮，攪拌均勻，在4℃冰箱中過夜。然后離心，收集沉淀，上清液回收丙酮。沉淀丙酮洗滌并研細(xì)，在冷箱中放置，然后過濾，沉淀分別用乙醇和乙醚洗滌，放置在于干燥器中干燥，得凝血酶粗品，把粗品溶于適量的0.9％ NaCI溶液中，在0℃放置，然后過濾，濾出的沉淀再用0.9％NaCI溶液溶解，在0℃放置，過濾，合并兩次濾液，調(diào)節(jié)pH值，然后離心，棄去沉淀，收集上層清液，在上清液中加入2倍量預(yù)冷至4℃的丙酮，靜置，離心。收集沉淀，沉淀再浸泡于冷丙酮中。靜置過夜，然后過濾，沉淀分別用無水乙醇、乙醚洗滌，干燥即得凝血酶，凝血酶的活性為500～1000U/mg，將凝血酶用1％的白蛋白溶液溶解，分裝，冷凍干燥，4℃保存。
其中，組份D為含有40mM/L CaCl2的磷酸緩沖鹽溶液，pH約為6～8。
使用時(shí)以組份B將組份A溶解，組份D將組份C溶解，然后同時(shí)噴涂到手術(shù)或出血?jiǎng)?chuàng)面即可形成一層纖維蛋白膜，起到封閉創(chuàng)面或止血止?jié)B的作用；雙組份高凝固性纖維蛋白原膠可溶化后直接使用。在使用過程中含有纖維蛋白原活性增強(qiáng)因子的溶解液有一定促進(jìn)凍干組份纖維蛋白原溶解的作用，便于臨床使用。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，明顯降低了凝血酶用量，減少了成本，增強(qiáng)了纖維蛋白原活性和粘合強(qiáng)度，具有高效的止血和促進(jìn)傷口愈合作用，另外聯(lián)合使用纖維蛋白原活性增強(qiáng)因子還具有抗菌、抑制創(chuàng)面感染的作用。纖維蛋白原活性增強(qiáng)因子能使纖維蛋白膠輕度收縮，擠出水份，形成具有一定強(qiáng)度的封閉膜，粘合創(chuàng)面更加牢固。
本發(fā)明與市場(chǎng)產(chǎn)品的比較
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明實(shí)施例1①纖維蛋白原的純化取500ml豬血漿，加入95ml55％(v/v)的乙醇，使乙醇的終濃度為8％，在-3℃條件下攪拌1個(gè)時(shí)，低溫(-4℃-4℃)離心收集沉淀，離心速度3000轉(zhuǎn)/分，離心20-30分鐘，收集的沉淀物加入溶解液(檸檬酸三鈉0.6％，葡萄糖2.5％，氯化鈉0.42％)適量溶解，然后用雙縮脲法測(cè)定蛋白的濃度，最終將纖維蛋白原的濃度調(diào)至20mg/ml，分裝入青霉素瓶中，每瓶5ml，在-40℃～-20℃冷凍至完全凍結(jié)，用冷凍干燥機(jī)冷凍干燥12-24小時(shí)，冷凍干燥品在4℃保存，為組份A。
②組份B為磷酸緩沖鹽溶液，滲透壓為270～320mOsm，鈉含量為148～163mM/L，氯含量123～135mM/L，PH6.8～7.8，多聚賴氨酸2mg/ml，過濾分裝到無菌青霉素瓶中，每瓶2.5ml。
③凝血酶的純化把豬血漿溶于蒸餾水中，用1％濃度的醋酸調(diào)節(jié)PH至5.3。在離心機(jī)上離心15分鐘，棄去上清液，收集沉淀物為凝血酶復(fù)合物；在30℃條件下，將凝血酶原復(fù)合物溶于1～2倍的0.9％NaCI溶液中，攪拌均勻，加入1.5％的氯化鈣，攪拌15分鐘，在4℃下放置2小時(shí)，保證凝血酶原轉(zhuǎn)成凝血酶，離心棄去沉淀，上清液移入搪瓷桶中。加入等量的預(yù)冷至4℃的丙酮，攪拌均勻，在4℃冰箱中過夜。然后離心，收集沉淀，上清液回收丙酮。沉淀丙酮洗滌并研細(xì)，在冷箱中放置3天，然后過濾，沉淀分別用乙醇和乙醚洗滌一次，放置在于干燥器中干燥，得凝血酶粗品，把粗品溶于適量的0.9％NaCI溶液中，在0℃放置6小時(shí)以上，然后用濾紙過濾，濾出的沉淀再用0.9％NaCI溶液溶解，在0℃放置6小時(shí)以上，過濾，合并兩次濾液，用1％醋酸溶液調(diào)節(jié)pH值5.5然后離心，棄沉淀，收集上層清液，在清液中加入2倍量預(yù)冷至4℃的丙酮，靜置3小時(shí)，離心30分鐘。收集沉淀，沉淀再浸泡于冷丙酮中。靜置過夜，然后過濾，沉淀分別用無水乙醇、乙醚各洗滌一次，干燥即得凝血酶，凝血酶的活性為500-1000U/mg，將凝血酶用1％的白蛋白溶液溶解，分裝青霉素小瓶中，每瓶凝血酶含量為75-125U，冷凍干燥，4℃保存。為組份C。
④組份D為含有40mM/L CaCl2的磷酸緩沖鹽溶液，pH為6.8-7.8。無菌過濾分裝到青霉素瓶中，每瓶2.5ml。
實(shí)施例2。
①按實(shí)施例1中的方法制備纖維蛋白原，無菌過濾分裝到青霉素瓶中，每瓶2.5ml，纖維蛋白原含量40mg/ml，組蛋白3mg/ml，-20℃冰箱保存。組份1。
②按實(shí)施例1中的方法制備凝血酶，無菌過濾分裝到青霉素瓶中，每瓶2.5ml，凝血酶50U/ml，CaCl240mM，-20℃冰箱保存，組份2。
實(shí)施例3①按實(shí)施例1中的方法制備纖維蛋白原，無菌過濾分裝到青霉素瓶中，每瓶2.5ml，纖維蛋白原含量40mg/ml，聚二甲基二烯丙基氯化銨(分量200,000)1mg/ml，-20℃冰箱保存。組份1。
②按實(shí)施例1中的方法制備凝血酶，無菌過濾分裝到青霉素瓶中，每瓶2.5ml，凝血酶為50U/ml，CaCl240mM，-20℃冰箱保存。組份2。
實(shí)施例4①按實(shí)施例1中的方法制備纖維蛋白原，無菌過濾分裝到青霉素瓶中，每瓶2.5ml，纖維蛋白原含量40mg/ml，血小板第4因子2mg/ml，-20℃冰箱保存。組份1。
②按實(shí)施例1中的方法制備凝血酶，無菌過濾分裝到青霉素瓶中，每瓶2.5ml，凝血酶為50U/ml，CaCl240mM，-20℃冰箱保存。組份2。
實(shí)施例5①按實(shí)施例1中的方法制備纖維蛋白原，無菌過濾分裝到青霉素瓶中，每瓶2.5ml，纖維蛋白原含量40mg/ml，富組氨酸糖蛋白2mg/ml，-20℃冰箱保存。組份1。
②按實(shí)施例1中的方法制備凝血酶，無菌過濾分裝到青霉素瓶中，每瓶2.5ml，凝血酶為50U/ml，CaCl240mM，-20℃冰箱保存。組份2。
實(shí)施例6①按實(shí)施例1中的方法制備纖維蛋白原，無菌過濾分裝到青霉素瓶中，每瓶2.5ml，纖維蛋白原含量40mg/ml，魚精蛋白2.5mg/ml，-20℃冰箱保存。組份1。
②按實(shí)施例1中的方法制備凝血酶，無菌過濾分裝到青霉素瓶中，每瓶2.5ml，凝血酶為50U/ml，CaCl240mM，-20℃冰箱保存。組份2。
實(shí)施例7①按實(shí)施例1中的方法制備纖維蛋白原，無菌過濾分裝到青霉素瓶中，每瓶2.5ml，纖維蛋白原含量40mg/ml，β-血栓球蛋白質(zhì)1.5mg/ml，-20℃冰箱保存。組份1。
②按實(shí)施例1中的方法制備凝血酶，無菌過濾分裝到青霉素瓶中，每瓶2.5ml，凝血酶為50U/ml，CaCl240mM，-20℃冰箱保存。組份2。
實(shí)施例8①按實(shí)施例1中的方法制備纖維蛋白原，無菌過濾分裝到青霉素瓶中，每瓶2.5ml，纖維蛋白原含量40mg/ml，亞甲藍(lán)2mg/ml，-20℃冰箱保存。組份1。
②按實(shí)施例1中的方法制備凝血酶，無菌過濾分裝到青霉素瓶中，每瓶2.5ml，凝血酶為50U/ml，CaCl240mM，-20℃冰箱保存。組份2。
實(shí)施例9①按實(shí)施例1中的方法制備纖維蛋白原，無菌過濾分裝到青霉素瓶中，每瓶2.5ml，纖維蛋白原含量40mg/ml，鏈霉素2.5mg/ml，-20℃冰箱保存。組份1。
②按實(shí)施例1中的方法制備凝血酶，無菌過濾分裝到青霉素瓶中，每瓶2.5ml，凝血酶為50U/ml，CaCl240mM，-20℃冰箱保存。組份2。
本發(fā)明的實(shí)施效果檢驗(yàn)①實(shí)施例1的效果測(cè)試a.將組份A用組份B溶解，組份C用組份D溶解，溶解時(shí)間5分鐘。
b.凝固時(shí)間測(cè)定，取組份A溶解液0.1ml加入小試管中，再加入組份C溶液0.1ml，用秒表計(jì)時(shí)，凝固時(shí)間9-12秒。
c.強(qiáng)度測(cè)定在直徑3.57cm，高0.2cm(表面積為10cm2)。無菌器皿內(nèi)，加入組份A和組份C的溶液各2ml，37℃條件下，放置10分鐘，將膜從皿中完整取出，形狀為膜狀，有彈性。繞屈180°5次以上無發(fā)生斷裂現(xiàn)象。
②實(shí)施例2至9的效果測(cè)試a.將組份1和組份2在37℃條件下溶解。
b.凝固時(shí)間測(cè)定，取組份1溶解溶液0.1ml加入小試管中，再加入組份2溶液0.1ml，用秒表計(jì)時(shí)，凝固時(shí)間9-12秒。
c.強(qiáng)度測(cè)定在直徑3.57cm，高0.2cm(表面積為10cm2)。無菌器皿內(nèi)，加入組份1和組份2的溶液各2ml，37℃條件下，放置10分鐘，將膜從皿中完整取出，形狀為膜狀，有彈性。繞屈180°5次以上無發(fā)生斷裂現(xiàn)象。
權(quán)利要求
1.高凝固性纖維蛋白原膠，它由A、B、C、D四個(gè)組份構(gòu)成，其特征在于組份A是凍干纖維蛋白原，含量為20～120mg/ml；組份B是含有纖維蛋白原活性增強(qiáng)因子的生理緩沖鹽溶液；組份C是凍干凝血酶，含量為10～100U/ml；組份D是含有CaCI2的生理緩沖鹽溶液，pH6～8。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高凝固性纖維蛋白原膠，其中，所述的四個(gè)組份中將組份A溶于組份B制成組份1含有纖維蛋白原活性增強(qiáng)因子的纖維蛋白原生理緩沖鹽溶液，纖維蛋白原含量20～120mg/ml，在-20℃以下保存；將組份C溶于組份D制成組份2含有凝血酶的CaCI2生理緩沖鹽溶液，凝血酶含量為10～100U/ml，CaCl240mM，pH6～8，在-20℃以下保存。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高凝固性纖維蛋白原膠，其中，所述的纖維蛋白原膠為人血纖維蛋白原、牛血纖維蛋白原或豬血纖維蛋白原。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高凝固性纖維蛋白原膠，其中，所述的纖維蛋白原活性增強(qiáng)因子包括組蛋白、血小板第4因子、多聚賴氨酸、富組氨酸糖蛋白、魚精蛋白、聚二甲基二烯丙基氯化銨、堿性蛋白、β-血栓球蛋白、陽離子蛋白、聚陽離子化合物、亞甲藍(lán)或鏈霉素。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高凝固性纖維蛋白原膠，其中，所述的高凝固性纖維蛋白原膠四組份中組份A纖維蛋白原和組份C凝血酶為冷凍干燥品。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高凝固性纖維蛋白原膠，其中，所述的組份1和組份2為液體，在-20℃以下保存。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高凝固性纖維蛋白原膠,它由組份A凍干纖維蛋白原、組份B含有纖維蛋白原活性增強(qiáng)因子的生理緩沖鹽溶液、組份C凍干凝血酶和組份D含有CaCl
文檔編號(hào)A61L15/16GK1386547SQ0212375
公開日2002年12月25日 申請(qǐng)日期2002年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月24日
發(fā)明者王春仁, 張清 申請(qǐng)人:張清