專利名稱：改良安卡拉痘苗病毒變體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明提供了一種減毒病毒，它衍生自改良安卡拉痘苗病毒，它的特征是失去了在人類細胞系中重復復制的能力。本發(fā)明進一步描述了衍生于該病毒的重組病毒及該病毒或其重組體作為藥物或疫苗的用途。此外，本發(fā)明提供了一種甚至在免疫受損患者，對疫苗病毒已有免疫力的患者或正在接受抗病毒治療的患者中都能誘導免疫應答的方法。
背景技術：
改良安卡拉痘苗(MVA)病毒涉及痘苗病毒，它是痘病毒科正粘病毒屬的一員。MVA是通過將痘苗病毒的安卡拉毒株在雞胚成纖維細胞上連續(xù)傳516代(CVA)而得到的(綜述可參見Mayr，A.，等Infection 3，6-14 )。如此長期傳代得到一種MVA病毒，其基因組序列中缺失了大約31kb，因此它被描述為對宿主細胞具有高度選擇性，僅限于鳥類細胞(Meyer，H.等，J.Gen.Virol.72，1031-1038 )。所得MVA在多種動物模型中明顯缺乏毒力(Mayr，A.&Danner，K. Dev.Biol.Stand.41225-34)。此外，臨床試驗中還檢驗了該MVA毒株作為疫苗經(jīng)免疫接種而對抗人類天花的效果(Mayr等，Zbl.Bakt.Hyg.I，Abt.Org.B 167，375-390 ，Stickl等，Dtsch.med.Wschr.99，2386-2392 )。有超過120,000人(包括高危病人)參與這些研究，結果表明，與基于痘苗病毒的疫苗相比，MVA消除了毒力或感染性但保留了良好的致免疫性。
在接下來的數(shù)十年中，MVA經(jīng)過改良后，被用作重組基因表達的病毒載體或被用作重組疫苗(Sutter，G.等 ，Vaccine 121032-40)。
在此方面最令人驚訝的是，盡管Mayr等在二十世紀七十年代就已經(jīng)證實MVA在人和哺乳動物中是高度減毒的和無毒性的，但一些近期報道(Blanchard等，1998，J Gen Virol 79，1159-1167；Carroll & Moss，1997，Virology238，198-211；Altenberger，美國專利5,185,146；Ambrosini等，1999，J NeurosciRes 55(5)，569)稱，MVA在哺乳動物和人類細胞系中并未徹底減毒，因為在這些細胞中可能有殘余的復制。據(jù)假定這些報道是用MVA的不同毒株獲得的結果，因為所用的病毒在它們的特性、尤其它們在各種細胞系中的生長行為方面有本質(zhì)上的差異。
生長行為被認為是病毒減毒的指標。一般情況下，如果一種病毒株失去了它在宿主細胞中通過復制繁殖后代的能力或者這種能力減弱，則認為該病毒株是減毒株。上述關于MVA在人和哺乳動物細胞中并不是徹底失去復制競爭力的發(fā)現(xiàn)，導致對MVA作為用于人體的疫苗或作為重組疫苗的載體的絕對安全性提出疑問。
特別是，疫苗載體病毒的效力與安全性之間的平衡對于疫苗以及對于重組疫苗都是非常重要的。
發(fā)明目的因此，本發(fā)明的一個目標是提供新的病毒株，它們的安全性增加，可用于開發(fā)安全的產(chǎn)品，如疫苗或藥物。此外，本發(fā)明的另一目標是提供改進現(xiàn)有接種方案(vaccination regimen)的手段(means)。
發(fā)明詳述為了實現(xiàn)上述目標，本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中提供了新的痘苗病毒，它們能在非人的細胞和細胞系，尤其是雞胚成纖維細胞(CEF)和幼年倉鼠腎細胞系BHK(ECACC 85011433)中進行繁殖性復制(productivereplication)，但不能在人的細胞系中進行繁殖性復制。
已知的痘苗病毒株至少能在某些人類細胞系中進行繁殖性復制，尤其是在人的角質(zhì)細胞系HaCat_中(Boukamp等1988，J Cell Biol 106(3)761-71)。能在HaCat細胞系中復制預示著能在體內(nèi)，尤其是人體內(nèi)復制。事實上，實施例章節(jié)已表明，所有經(jīng)測試能在HaCat中有殘量的繁殖性復制的已知痘苗病毒株也能在體內(nèi)復制。因此，本發(fā)明優(yōu)選涉及不能在人類細胞系HaCat中進行繁殖性復制的痘苗病毒。本發(fā)明最優(yōu)選涉及不能在任何下述人類細胞系中進行繁殖性復制的痘苗病毒株人類宮頸腺癌細胞系HeLa(ATCC CCL-2)，人胚腎細胞系293(ECACC 85120602)，人的骨肉瘤細胞系143B(ECACC 91112502)以及細胞系HaCat。
病毒的生長行為或擴增/復制通常表示為感染細胞所產(chǎn)生的病毒量(輸出量)與最初用于感染細胞的病毒量(輸入量)的比例(“擴增比”)。輸出量與輸入量的比例為“1”表示，感染細胞產(chǎn)生的病毒量與最初用于感染細胞的病毒量相等的擴增狀態(tài)。這種狀態(tài)暗示感染細胞容許病毒進行感染和繁殖。
擴增比小于1，即擴增水平降低至輸入水平以下，表示缺乏繁殖性復制，并因此表示病毒已減毒。故，本發(fā)明人對鑒定并最終分離一種在多種人類細胞系，尤其人類細胞系143B，HeLa，293和HaCat中擴增比小于1的病毒株特別有興趣。
術語“不能進行繁殖性復制”是指本發(fā)明的病毒在人類細胞系，如細胞系293(ECACC 85120602)、143B(ECACC 91112502)、HeLa(ATCC CCL2)和HaCat(Boukamp等1988，J Cell Biol 106(3)761-71)中，在本發(fā)明實施例1針對某些具體的MVA病毒株所概述的條件下，擴增比小于1。優(yōu)選地，本發(fā)明病毒在上述每一種人類細胞系HeLa，HaCat和143B中的擴增比為0.8更小。
實施例1和表1都詳細顯示了，本發(fā)明的病毒在細胞系143B，HeLa或HaCat中都不能進行繁殖性復制。本發(fā)明實施例中所用的具體病毒株已保藏在歐洲細胞培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為V00083008。該病毒株在說明書全文中都被稱為“MVA-BN”。
已知的MVA病毒株在所測試的至少一種人類細胞系中顯示殘量復制(圖1，實施例1)。所有已知的痘苗病毒株在細胞系HaCat中顯示至少部分復制，而本發(fā)明的MVA病毒株，尤其是MVA-BN，在HaCat細胞中不進行繁殖性復制。更具體地，MVA-BN在人胚腎細胞系293(ECACC 85120602)中顯示0.05-0.2的擴增比。在人骨的骨肉瘤細胞系143B(ECACC 91112502)中，擴增比為0.0-0.6。在人的宮頸腺癌細胞系HeLa(ATCC CCL-2)和人的角質(zhì)細胞系HaCat(Boukamp等1988，J Cell Biol-106(3)761-71)中，擴增比分別為0.04-0.8和0.02-0.8。MVA-BN在非洲綠猴腎細胞(CV1ATCCCCL-70)中的擴增比為0.01-0.06。因此，MVA-BN作為本發(fā)明的原養(yǎng)型病毒株，在所檢測的任一種人類細胞系中都不進行繁殖性復制。
MVA-BN在雞胚成纖維細胞(CEF原代培養(yǎng)物)或幼年倉鼠腎細胞系BHK(ATCC CRL-1632)中的擴增比都明顯高于1。如以上概述，擴增比高于“1”表示繁殖性復制，因為感染細胞所產(chǎn)生的病毒量比用于感染細胞的病毒量增加了。因此，該病毒能在CEF原代培養(yǎng)物中以高于500的比例或在BHK細胞中以高于50的比例進行繁殖和擴增。
在本發(fā)明的一個具體實施方案中，本發(fā)明涉及保藏號為ECACCV0083008的病毒的衍生物。保藏號為ECACC V0083008的病毒的“衍生物”是指，與保藏株顯示基本相同的復制特性但在其基因組中有一或多個部分不同的病毒。與保藏的病毒具有相同“復制特性”的病毒是，在CEF細胞和細胞系BHK，HeLa，HaCat以及143B中以相似的擴增比進行復制、并且在轉基因小鼠模型AGR129中經(jīng)測定具有相似的體內(nèi)復制的那些病毒(見下文)。
在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的痘苗病毒株，尤其是MVA-BN及其衍生物，它們都以不能在體內(nèi)進行復制為特征。在本發(fā)明上下文中，“不能在體內(nèi)進行復制”是指，病毒不能在人類以及在小鼠模型中進行復制，解釋見下文?！安荒茉隗w內(nèi)進行復制”的特性優(yōu)選可在不能產(chǎn)生成熟B細胞和T細胞的小鼠中進行測定。這樣的小鼠如轉基因小鼠模型AGR129(得自Mark Sutter，Institute of Virology，University of Zurich，Zurich，Switzerland)。該小鼠品種在IFN受體I型(IFN-α/β)和II型(IFN-γ)的基因中以及在RAG中都有定位基因破壞。由于這些破壞，該小鼠不具有IFN系統(tǒng)，且不能產(chǎn)生成熟的B細胞和T細胞，因此其免疫系統(tǒng)嚴重受損，對復制型病毒高度易感。除了AGR129小鼠以外，其它任何不能產(chǎn)生成熟B細胞和T細胞等細胞、并因此免疫力嚴重受損、對復制型病毒高度易感的小鼠品種都可以使用。具體地，本發(fā)明的病毒在對AGR129小鼠腹膜內(nèi)注射107pfu個病毒進行感染后，至少45天內(nèi)不殺死小鼠，優(yōu)選至少60天內(nèi)，最優(yōu)選至少90天內(nèi)。優(yōu)選地，“不能在體內(nèi)進行復制”的病毒的另一特征是，在對AGR129小鼠腹膜內(nèi)注射107pfu個病毒進行感染后，至少45天不能從該小鼠的器官或組織中收獲到任何病毒，優(yōu)選至少60天，最優(yōu)選至少90天。關于用AGR129小鼠進行感染試驗的細節(jié)以及用于測定病毒能否從感染小鼠的器官和組織中回收的試驗的細節(jié)可參見實施例章節(jié)。
在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的痘苗病毒株，尤其MVA-BN及其衍生物，它們的特征在于在致死攻擊小鼠模型中測得，致免疫性高于已知病毒株MVA 575。該實驗的詳述見下文實施例2。簡言之，在這樣的模型中，未接種的小鼠被具有復制競爭力的痘苗病毒株如Westem Reserve株L929 TK+或IHD-J感染后死亡。在描述致死攻擊模型的上下文中，被具有復制競爭力的痘苗病毒感染，該過程稱為“攻擊”。受攻擊4天后，小鼠通常被殺死，卵巢中的病毒滴度用VERO細胞經(jīng)標準空斑試驗進行測定(詳見實施例章節(jié))。對未接種的小鼠，以及接種了本發(fā)明的痘苗病毒的小鼠，測定它們的病毒滴度。更具體地，本發(fā)明病毒的特征是，在上述檢驗中，接種102TCID50/ml的本發(fā)明病毒比不接種病毒，小鼠卵巢病毒滴度減少至少70％，優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少90％。
在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的痘苗病毒，尤其MVA-BN及其衍生物，可用于通過初次/加強給藥疫苗的方式進行免疫接種。已有很多報道提示用MVA作為運送載體進行初次/加強免疫，誘導出的免疫應答很弱，效果不及用DNA進行初次免疫、再用MVA加強免疫所得的效果(Schneider等，1998，Nat.Med.4；397-402)。在所有這些研究中，所用的MVA病毒株都不同于本發(fā)明的痘苗病毒。為了解釋用MVA進行初次和加強免疫時免疫應答弱的原因，有假設認為，初次免疫期間產(chǎn)生的抗MVA抗體在再次免疫時對給與的MVA有中和作用，從而阻止了對免疫應答的有效加強。相反，用DNA進行初次免疫、再用MVA進行加強免疫(DNA-初次/MVA-加強)的方案，據(jù)報道在產(chǎn)生強效應答方面占優(yōu)勢，因為該方案將DNA有效引發(fā)免疫應答的能力與MVA在事先不具有針對MVA的免疫力的情況下加強上述應答的特性結合起來。顯然，如果事先存在對MVA的免疫力和/或痘苗病毒阻礙對免疫應答的加強作用，那么使用MVA作為疫苗或治療藥物，其效力有限，尤其是在已接受了預防天花(smallpox)的免疫接種的個體內(nèi)更是如此。但是，根據(jù)另一實施方案，本發(fā)明的痘苗病毒，尤其MVA-BN及其衍生物，以及攜有異源序列的相應重組病毒，可用于在未曾感染的動物體內(nèi)，以及在事先對痘病毒具有免疫力的動物體內(nèi)，進行有效地初次免疫并然后增強免疫應答。故，本發(fā)明的痘苗病毒在痘苗病毒初次免疫/痘苗病毒加強免疫的方案中，與在DNA-初次免疫/痘苗病毒加強免疫的方案中相比，誘導出至少基本相同的水平的免疫力。
將痘苗病毒視為在痘苗病毒初次免疫/痘苗病毒加強免疫的方案中，與在DNA-初次免疫/痘苗病毒加強免疫的方案相比，誘導出至少基本相同的水平的免疫力，作出這一判定的條件可以是通過以下一種(優(yōu)選全部兩種)試驗(“試驗1”和“試驗2”)中測定，CTL應答在痘苗病毒初次免疫/痘苗病毒加強免疫的方案中與在DNA-初次免疫/痘苗病毒加強免疫方案中相比，為至少基本相同。更優(yōu)選，在至少一種上述試驗中，痘苗病毒初次免疫/痘苗病毒加強免疫后的CTL應答比DNA-初次免疫/痘苗病毒加強免疫后的高。最優(yōu)選，在以下兩種試驗中，痘苗病毒初次免疫/痘苗病毒加強免疫后的CTL應答比DNA-初次免疫/痘苗病毒加強免疫后的高。
試驗1為了實施痘苗病毒初次免疫/痘苗病毒加強免疫的方案，對6-8周齡BALB/c(H-2d)小鼠靜脈給予107TCID50的本發(fā)明痘苗病毒進行初次免疫，3周后，用相同的病毒、以相同的量和相同的給予方式進行加強免疫，所述病毒能表達鼠的多表位(polytope)，如Thomson等，1988，J.Immunol.160，1717所述。為達到此目的，必須構建一種表達所述多表位的重組痘苗病毒。構建這樣的重組病毒的方法為本領域已知，下文有詳述。在DNA初次免疫/痘苗病毒加強免疫的方案中，初次免疫是對小鼠肌肉內(nèi)注射50μg能表達與痘苗病毒相同的抗原的DNA；用痘苗病毒加強免疫是以與痘苗病毒初次免疫/痘苗病毒加強免疫方案完全相同的方式進行。表達所述多表位的DNA質(zhì)粒也在上述Thomson等的文獻中有介紹。在上述兩種方案中，于加強免疫的2周后，測定針對表位SYIPSAEKI，RPQASGVYM和/或YPHFMPTNL的CTL應答。對CTL應答的測定優(yōu)選用Schneider等，1998，Nat.Med.4，397-402所述的ELISPOT分析進行，該方法在下文關于一種具體的本發(fā)明病毒的實施例章節(jié)也有描述。本發(fā)明病毒在該實驗中的特征是，根據(jù)對IFN-γ生成細胞的數(shù)量/106脾細胞的評估(也參見實驗章節(jié))，上述由痘苗病毒初次免疫/痘苗病毒加強免疫方案誘導的針對所述表位的CTL免疫應答，與由DNA初次免疫/痘苗病毒加強免疫方案誘導的基本相同，優(yōu)選至少相同。
試驗2該試驗基本對應于試驗1。但相對于試驗1中靜脈給予107TCID50的痘苗病毒，在本試驗中是皮下給予108TCID50的本發(fā)明痘苗病毒來進行初次免疫和加強免疫。本發(fā)明的病毒在該實驗中的特征是，根據(jù)對IFN-γ生成細胞的數(shù)量/106脾細胞的評估(也參見實驗章節(jié))，上述由痘苗病毒初次免疫/痘苗病毒加強免疫方案誘導的針對所述表位的CTL免疫應答，與由DNA初次免疫/痘苗病毒加強免疫方案誘導的基本相同，優(yōu)選至少相同。
根據(jù)上述試驗之一測出的CTL應答的強度對應于保護作用的水平。
因此，本發(fā)明的病毒特別適于進行疫苗接種。
簡短說，本發(fā)明的痘苗病毒的特征在于具有至少一種下列特性
(i)能在雞胚成纖維細胞(CEF)以及在細胞系BHK中進行繁殖性復制，但不能在人類細胞系HaCat中進行繁殖性復制，(ii)不能在體內(nèi)復制，(iii)在致死攻擊模型中比已知病毒株MVA 575(ECACC V00120707)誘導出更高的致免疫性，和/或(iv)在痘苗病毒初次免疫/痘苗病毒加強免疫的方案中，與在DNA-初次免疫/痘苗病毒加強免疫的方案中相比，誘導出至少基本相同的水平的免疫力。
優(yōu)選本發(fā)明的痘苗病毒具有至少兩種上述特性，更優(yōu)選至少三種上述特性。最優(yōu)選具有上述所有特性的痘苗病毒。
在另一實施方案中，本發(fā)明涉及用于免疫接種的試劑盒，它在第一個小瓶/容器中包含用于第一次接種(初次免疫)的本發(fā)明病毒，在第二個小瓶/容器中包含用于第二次接種(加強免疫)的本發(fā)明病毒。所述病毒可以為非重組病毒，即不包含異源核苷酸序列的痘苗病毒。這種痘苗病毒的一個實例是MVA-BN及其衍生物。或者，所述病毒可以是重組痘苗病毒，它包含額外的異源核苷酸序列。如說明書其它章節(jié)所述，這樣的異源序列可以編碼能誘導免疫系統(tǒng)發(fā)生應答的表位。因此，有可能應用這種重組痘苗病毒進行免疫接種，從而對抗包含所述表位的蛋白或制劑。所述病毒可以按照下文的詳述來配制。每次接種所用病毒的量已在上文中限定。
本領域技術人員已知如何獲得具有至少一種下列特性的痘苗病毒-能在雞胚成纖維細胞(CEF)以及在幼年倉鼠腎細胞系BHK中進行繁殖性復制，但不能在人角質(zhì)細胞系HaCat中進行繁殖性復制，-不能在體內(nèi)復制，-在致死攻擊模型中比已知病毒株MVA 575誘導出更高的致免疫性，和/或-在痘苗病毒初次免疫/痘苗病毒加強免疫的方案中，與在DNA-初次免疫/痘苗病毒加強免疫的方案中相比，誘導出至少基本相同的水平的免疫力。
獲得這類病毒的方法可包括以下步驟
(i)將已知的痘苗病毒株，優(yōu)選MVA 574或MVA 575(ECACCV00120707)，引入能容許該病毒進行繁殖性復制的非人類細胞中，所述非人類細胞優(yōu)選選自CEF細胞或BHK細胞系，(ii)從這些細胞分離/富集病毒顆粒，和(iii)分析所得的病毒是否具有至少一種所需的上述生物學特性，其中上述步驟可任選地進行重復，直至獲得具有所需復制特性的病毒。本發(fā)明還涉及通過本發(fā)明的這種方法獲得的病毒。確定所需生物學特性的方法在本說明書的其它部分予以解釋。
本發(fā)明人應用這種方法，通過多輪克隆純化，從MVA分離物的傳代物575(MVA 575)鑒定并分離了本發(fā)明的病毒株。這種新的病毒株對應于上述保藏號為ECACC V0083008的病毒株。
本發(fā)明痘苗病毒的生長行為，尤其是MVA-BN的生長行為，表明本發(fā)明的病毒株相對于迄今為止鑒定的任何其它MVA分離物，在人類細胞系中的減毒性和體內(nèi)復制能力的喪失方面，具有很大的優(yōu)勢。本發(fā)明的病毒株因此是開發(fā)更安全的產(chǎn)品(如疫苗或藥物)的理想候選者，參見下文。
在一個實施方案中，本發(fā)明的病毒，特別是MVA-BN及其衍生物，被作為疫苗，用于對抗人類痘病毒疾病，如天花。在另一實施方案中，本發(fā)明的病毒可以是重組病毒，即可以將異源基因表達為，例如，異源于該病毒的抗原或表位，并因此可作為疫苗，用于誘導針對異源抗原或表位的免疫應答。
術語“免疫應答”是指外來物質(zhì)或微生物進入生物體時免疫系統(tǒng)的反應。根據(jù)定義，免疫應答可分為特異性反應和非特異性反應，這兩者密切交錯。非特異性免疫應答是針對廣泛多種外來物質(zhì)和感染因子的應急防御。特異性免疫應答是在生物體受到一種物質(zhì)的第一次攻擊之后，經(jīng)過較長的一段時間后產(chǎn)生的防御反應。特異性免疫應答是高效的，而且負責使從一種具體感染中恢復的個體獲得對抗這種具體感染的保護作用。當相同或非常相似的感染因子再次感染時，由于已經(jīng)具有了針對該因子的“事先存在的免疫力”，因此僅引起溫和得多的癥狀，或者根本不出現(xiàn)癥狀。這樣的免疫力和免疫記憶將分別持續(xù)較長時間，在某些情況中，將持續(xù)終生。因此，對免疫記憶的誘導可以用于預防接種。
術語“免疫系統(tǒng)”是指參與生物體對抗外來物質(zhì)和微生物的防御反應的一組器官。免疫系統(tǒng)包括細胞部分和體液部分，其中細胞部分包括多種細胞，如淋巴細胞和其它衍生自白細胞的細胞；體液部分包括小分子肽和補體因子。
“接種”是指用感染因子(如減毒或滅活的感染因子)攻擊生物體，從而誘導出特性免疫力。本發(fā)明中，該術語還包括用本發(fā)明重組痘苗病毒，尤其是重組的MVA-BN及其衍生物攻擊生物體，所述重組病毒表達異源于該病毒的抗原或表位。這類表位的實例可參見說明書其它章節(jié)，例如有來自諸如登革熱病毒、丙型肝炎病毒、HIV等其它病毒的蛋白的表位，或來自與腫瘤和癌癥進展相關的蛋白的表位。將重組痘苗病毒給藥至機體內(nèi)以后，所述表位被表達并被呈遞給免疫系統(tǒng)，從而可能誘導出針對這些表位的特異性免疫應答。生物體因此針對含有由重組痘苗病毒編碼的表位的因子/蛋白而被免疫。
“免疫力”是指，由于成功消除了感染因子或其特征性部分所致的在先感染，而使生物體獲得對抗該感染因子所致疾病的部分或完全保護作用。免疫力的基礎在于免疫系統(tǒng)的特化細胞的存在、誘導和活化。
正如上文一個本發(fā)明實施方案中提到，本發(fā)明的重組病毒，尤其重組MVA-BN及其衍生物，包括至少一種異源核酸序列。本文中術語“異源”是指，在天然狀態(tài)下，通常并非與所述病毒密切相關的核酸序列的任意組合，而這樣的病毒也稱為“重組病毒”。
根據(jù)本發(fā)明另一實施方案，異源序列優(yōu)選抗原性表位，所述表位選自任何非痘苗病毒來源。最優(yōu)選，重組病毒表達一或多種來自下列來源的抗原性表位Plasmodium falciparum，分支桿菌，流感病毒，選自黃病毒科、副粘病毒屬、肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒的病毒，或者引起出血性發(fā)熱的病毒如漢坦病毒(Hantaviruses)或絲狀病毒(Filoviruses)，即埃博拉病毒(Ebola)或馬堡(Marburg)病毒。
根據(jù)另一實施方案，以及除了上述對抗原性表位的選擇以外，異源序列可選自另一種痘病毒或痘苗病毒來源。這些病毒序列可用于修飾宿主適應譜或病毒的致免疫性。
在另一實施方案中，本發(fā)明的病毒可編碼能表達治療性化合物的異源基因/核酸。病毒中異源核酸所編碼的“治療性化合物”可以是，例如，治療性核酸，如反義核酸，或具有所需生物活性的肽或蛋白。
根據(jù)另一優(yōu)選的實施方案，異源核酸序列的表達優(yōu)選在痘病毒啟動子的轉錄控制之下，更優(yōu)選受控于痘苗病毒啟動子，但不排除其它情況。
根據(jù)另一實施方案，異源核酸序列優(yōu)選插入病毒基因組的非必需區(qū)域。在本發(fā)明另一優(yōu)選實施方案中，將異源核酸序列插入MVA基因組的天然缺失位點(見PCT/EP96/02926)。將異源序列插入痘病毒基因組的方法為本領域已知。
根據(jù)另一優(yōu)選實施方案，本發(fā)明還包括病毒基因組，其重組體或其功能性部分。所述病毒序列可用于通過，例如PCR、雜交技術、或成熟的ELISA試驗，來鑒定或分離病毒或其重組體。此外，所述病毒序列可以由表達載體來表達，以便產(chǎn)生編碼蛋白或肽，它們?nèi)缓罂梢詫δ切┤狈Π谒霰磉_載體中的病毒序列的病毒缺失突變體進行彌補。
病毒基因組的“功能性部分”是指完整基因組序列中編碼物理實體(如蛋白，蛋白區(qū)，蛋白表位)的部分。病毒基因組的功能性部分還指完整基因組序列中，編碼調(diào)節(jié)元件或它們的單獨具有活性的部分(如啟動子、增強子、順式或反式作用元件)的部分。
本發(fā)明的重組病毒可用于將異源核酸序列引入靶細胞，所述序列對于靶細胞而言可以是同源的，也可以是異源的。通過將異源核酸序列引入靶細胞，可在體外產(chǎn)生異源的肽或多肽和/或由這些序列編碼的完整病毒。該方法包括用重組MVA感染宿主細胞，在適當?shù)臈l件下培養(yǎng)已被感染的宿主細胞，分離和/或富集由所述宿主細胞產(chǎn)生的肽、蛋白和/或病毒。
此外，將同源或異源序列引入細胞的方法還可以應用于體外治療，優(yōu)選應用于體內(nèi)治療。進行體外治療時，將已事先(回體)感染了病毒的分離的細胞給藥至動物活體，以便誘導免疫應答。進行體內(nèi)治療時，將病毒或其重組體直接給藥至動物活體以誘導免疫應答。在該情況中，接種部位周圍的細胞在體內(nèi)被本發(fā)明的病毒或其重組體直接感染。
由于本發(fā)明病毒在人類細胞和猴細胞中的生長受到嚴格限制，因此是高度減毒的，用于治療包括人在內(nèi)的廣泛多種哺乳動物較為理想。因此，本發(fā)明還提供了用于，例如，在動物活體，包括人體內(nèi)誘導免疫應答的藥用組合物和疫苗。本發(fā)明的病毒在任何其它基因治療方案中也是安全的。
藥用組合物通常包括一或多種可藥用和/或經(jīng)核準的載體，添加劑，抗生素，防腐劑，輔助劑，稀釋劑和/或穩(wěn)定劑。這類輔助物質(zhì)可以是水，鹽水，甘油，乙醇，增濕劑或乳化劑，pH緩沖物質(zhì)，等等。適當?shù)妮d體通常是分子量較大、代謝較慢的分子，如蛋白、多糖、多聚乳酸，多聚乙醇酸，多聚氨基酸，氨基酸共聚物，脂質(zhì)聚集物，等等。
為了制備疫苗，本發(fā)明的病毒或其重組體被轉變?yōu)樯砜山邮艿男问?。這可以依據(jù)用于天花預防性接種的痘病毒疫苗的制備經(jīng)驗來進行(參見Stickl，H.等 Dtsch.med.Wschr.99，2386-2392)。例如，將純化的病毒以5×108TCID50/ml的濃度配制在約10mM Tris，140mM NaCI pH7.4中，-80℃保存。為了制備疫苗注射劑(vaccine shot)，將102-108的病毒顆粒，在有2％蛋白胨和1％人白蛋白存在的情況下，凍干在安瓿(優(yōu)選玻璃安瓿)內(nèi)的100ml磷酸鹽緩沖液(PBS)中。或者，可通過將病毒在配制劑中逐步凍干的方式來制備疫苗注射劑。這種配制劑可包含適于體內(nèi)給藥的額外添加劑，如甘露醇，葡聚糖，糖，甘氨酸，乳糖，或聚乙烯吡硌烷酮，或其它添加劑，如抗氧化劑或惰性氣體，穩(wěn)定劑或重組蛋白(如人血清白蛋白)。然后將玻璃安瓿密封，在介于4℃和室溫之間的溫度中保存數(shù)月。但是，只要不必使用，優(yōu)選將安瓿保存在-20℃以下。
為了進行免疫接種或治療，可將凍干品溶于0.1-0.5ml水溶液中，優(yōu)選生理鹽水或Tris緩沖液，經(jīng)過系統(tǒng)途徑或局部途徑給藥，即通過本領域技術人員已知的胃腸道外途徑、肌肉途徑或任何其它給藥途徑來給藥。給藥方式、給藥劑量以及給藥次數(shù)可由本領域技術人員通過已知的方式最優(yōu)化。
此外，根據(jù)另一實施方案，本發(fā)明的病毒特別有效于在免疫受損的動物，如感染了SIV的猴(CD4＜400/μl血液)，或免疫受損的人體內(nèi)誘導免疫應答。術語“免疫受損”描述的是個體免疫系統(tǒng)的一種狀態(tài)，它僅有不完全的免疫應答或用于抵抗感染因子的防御效力減弱。更令人感興趣的另一實施方案中，本發(fā)明的病毒可在免疫受損的動物或人體內(nèi)增強免疫應答，甚至當這些動物或人具有事先存在的針對痘病毒的免疫力時也是如此。特別有趣的是，本發(fā)明的病毒還可以在接受抗病毒(如抗逆轉錄病毒)治療的動物或人體內(nèi)增強免疫應答?！翱共《局委煛卑榱讼蛞种撇《靖腥径M行的治療，例如(i)核苷類似物的應用，(ii)病毒酶活性或病毒裝配過程的抑制劑的應用，或(iii)影響宿主免疫應答的細胞因子的應用。
根據(jù)另一實施方案，所述病毒尤其可應用于獸醫(yī)領域，例如，用于免疫動物使之抵抗痘感染(pox infection)，但也不限于此。對小型動物而言，免疫接種優(yōu)選通過胃腸道外方式或鼻內(nèi)方式進行，而對大型動物或人而言，優(yōu)選以皮下、肌肉內(nèi)或口服方式進行接種。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，含有有效劑量僅為102TCID50(組織培養(yǎng)感染劑量)的本發(fā)明病毒的疫苗注射劑就足以在小鼠體內(nèi)誘導出對抗野生型痘苗病毒攻擊的完整免疫力。這特別令人驚訝，因為預計減毒程度如此之高的本發(fā)明病毒將不利于，并因此減弱其致免疫性。這樣的預計是基于以下認識為了誘導出免疫應答，必需有足夠量的抗原性表位被呈遞給免疫系統(tǒng)。已高度減毒并因此不能復制的病毒僅能呈現(xiàn)出極少量的抗原性表位，與它自身摻入的一樣多。一般不認為病毒顆粒上攜帶的如此量的抗原足以誘導出有效的免疫應答。但本發(fā)明的病毒即使在僅為102TCID50的極低有效劑量之下，也能在小鼠/痘苗病毒攻擊模型中刺激出有力的保護性免疫應答。本發(fā)明的病毒因此而顯示出意外的、甚至相對于現(xiàn)有MVA病毒株而言增強的致免疫性。這種強致免疫性使本發(fā)明的病毒以及由它衍生出的任何疫苗都特別有效于在免疫受損的動物或人體內(nèi)應用。
根據(jù)另一實施方案，本發(fā)明的病毒可作為佐劑來使用。在本說明書上下文中，“佐劑”是指疫苗中能增強特異性免疫應答的物質(zhì)?！皩⒉《居米髯魟笔侵冈谝延械囊呙缰屑{入病毒，以便使接受該疫苗的患者的免疫系統(tǒng)受到額外的刺激。大多數(shù)疫苗中抗原性表位的免疫效應常常能通過添加所謂佐劑而被增強。佐劑通過引起針對疫苗的抗原性表位的更強的特異性免疫反應而對免疫系統(tǒng)產(chǎn)生共刺激。這種刺激可通過非特異性免疫系統(tǒng)的因子，如干擾素和白細胞介素來調(diào)節(jié)。
因此，在本發(fā)明另一實施方案中，所述病毒在哺乳動物包括人體中用于激活、支持或抑制免疫系統(tǒng)，并優(yōu)選激活對抗任何抗原決定簇的免疫應答。所述病毒還可用于在感染的危險增加的情況中，如在壓力(stress)之下支持免疫系統(tǒng)。
用作佐劑的病毒可以為非-重組病毒，即在其基因組中不含異源DNA的那些病毒。這類病毒的一個實例是MVA-BN。另一種情況是，用作佐劑的病毒是在其基因組中包含天然狀態(tài)下不存在于該病毒基因組的異源DNA序列的病毒。為了作為佐劑來使用，重組病毒DNA優(yōu)選包含并表達那些能編碼免疫刺激性肽或蛋白(如白細胞介素)的基因。
根據(jù)另一實施方案，優(yōu)選所述病毒用作佐劑或添加至另一疫苗中時已被滅活。病毒的滅活可通過，例如，加熱或用化學物質(zhì)處理來進行，如本領域已知的那樣。優(yōu)選病毒被β-propriolacton滅活。根據(jù)本發(fā)明的這一實施方案，將滅活的病毒添加至對抗多種傳染病或增生性疾病的疫苗中，從而增加患者針對該疾病的免疫應答。
發(fā)明簡述本發(fā)明單獨或聯(lián)合包含下列具有至少一種下列特性的痘苗病毒-能在雞胚成纖維細胞(CEF)以及在幼年倉鼠腎細胞系BHK中進行繁殖性復制，但不能在人角質(zhì)細胞系HaCat中進行繁殖性復制，-不能在體內(nèi)復制，-在致死攻擊模型中比已知病毒株MVA 575誘導出更高的致免疫性，和/或-在痘苗病毒初次免疫/痘苗病毒加強免疫的方案中，與在DNA-初次免疫/痘苗病毒加強免疫的方案中相比，誘導出至少基本相同的水平的免疫力。
不能在以下任何一種人類細胞系中進行繁殖性復制的上述病毒人類胚腎細胞系293，人類骨肉瘤細胞系143B和人類宮頸腺癌細胞系HeLa。
在歐洲細胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC)，Salisbury(UK)以保藏號V00083008進行保藏的上述病毒及其衍生物。
含有至少一種異源核酸序列的上述病毒。
上述病毒，其中所述異源核酸序列選自編碼至少一種抗原、抗原性表位、和/或治療性化合物的序列。
衍生自上述病毒的基因組或其功能性部分。
藥用組合物，含有上述病毒和/或上述基因組和/或其功能性部分以及一種可藥用載體、稀釋劑和/或添加劑。
疫苗，含有上述病毒和/或上述基因組和/或其功能性部分。
上述病毒，上述基因組和/或其功能性部分，上述組合物或上述疫苗作為在活體動物(包括人體)中影響(優(yōu)選誘導)免疫應答的藥物。
上述病毒，上述藥用組合物，上述疫苗或上述限定的病毒，其中所述病毒，組合物或疫苗在第一次接種(初次接種)和在第二次接種(加強接種)中以治療有效量給予。
上述病毒，和/或上述基因組，在制備藥物或疫苗中的用途。
將同源和/或異源核酸序列導入靶細胞的方法，包括用上述含異源序列的病毒感染靶細胞，或用上述基因組轉染靶細胞。
制備肽、蛋白和/或病毒的方法，包括-用上述病毒感染宿主細胞，-在適當條件下培養(yǎng)已感染的宿主細胞，和-分離和/或富集由所述宿主細胞產(chǎn)生的肽和/或蛋白和/或病毒。
在動物(包括人)活體內(nèi)影響(優(yōu)選誘導)免疫應答的方法，包括對需要治療的動物或人給藥上述病毒，上述基因組和/或其功能性部分，上述組合物或上述疫苗。
上述方法，包括給藥至少102TCID50(組織培養(yǎng)感染劑量)的病毒。
上述方法，其中所述病毒，組合物或疫苗在第一次接種(初次接種)和第二次接種(加強接種)中以治療有效量給藥。
上述方法，其中所述動物為免疫受損的動物。
上述方法，其中所述動物事先已具有對痘病毒的免疫力。
上述方法，其中所述動物正接受抗病毒治療。
上述的動物正接受抗病毒治療的方法，其特征在于所述抗病毒治療是抗逆轉錄病毒治療。
上述病毒，上述基因組和/或其功能性病毒作為佐劑的用途。
增強對抗疫苗中所含抗原和/或抗原性表位的特異性免疫應答的方法，包括對將要用所述疫苗進行治療的活體動物，包括人，給藥上述病毒或上述基因組作為佐劑。
上述病毒或上述基因組，它們作為佐劑使用。
一種細胞，優(yōu)選人的細胞，它含有上述病毒，或含有上述基因組或其功能性部分。
獲得上述痘苗病毒的方法，包括以下步驟-將一種市售痘苗病毒株，優(yōu)選MVA 575引入能允許該病毒在其中進行繁殖性復制的那些非人類細胞中，其中所述非人類細胞優(yōu)選選自CEF細胞和BHK細胞系，-從這些細胞分離/富集病毒粒子，和-分析所得病毒是否具有上述生物學特性的至少一種，其中可任選重復上述步驟，直至獲得具有所需復制特性的病毒。
用于初次/加強免疫接種的試劑盒，它在第一個小瓶/容器中包含用于第一次接種(初次接種)的上述病毒，上述疫苗，或上述作為藥物的病毒，在第二個小瓶/容器中包含用于第二次接種(加強接種)的上述病毒，上述疫苗，或上述作為藥物的病毒。
上述病毒，上述組合物和/或上述疫苗用于制備疫苗的用途，其中所述病毒，組合物或疫苗在初次接種中給藥，相同的病毒或疫苗在加強接種中給藥。


圖1不同的MVA株在不同細胞系中的生長動力學。圖1A)的結果是根據(jù)所測試的MVA株來分組，而圖1B)的結果是根據(jù)所測試的細胞系來分組。B)在細胞系中培養(yǎng)4天(D4)后收獲的病毒的量通過空斑試驗測定，并將其表示為4天后收獲的病毒相對于第1天(D1)原始接種量的比例。
圖2用MVA-BN或MVA 575進行接種所提供的對抗痘苗病毒致死攻擊的保護作用。所述保護作用是通過標準空斑試驗測定的攻擊后第4天卵巢中滴度的減少。
圖3應用不同的初次免疫-加強免疫方案，對CTL的誘導效應以及所提供的對抗流感病毒攻擊的保護作用。
3A用編碼鼠的多表位的DNA或MVA-BN疫苗以不同聯(lián)合進行接種后，針對4種不同H-2d限制性表位的CTL應答的誘導。BALB/c小鼠(每組5只)用DNA(肌肉內(nèi))或MVA-BN(皮下)接種，并在三周后接受加強免疫。在加強免疫的2周后，用ELISPOT試驗測定針對由這些疫苗(TYQRTRALV，流感病毒；SYIPSAEKI，P.Berghei；YPHFMPTNL，巨細胞病毒；RPQASGVYM，LCV)編碼的4種不同表位的CTL應答。
3B用編碼鼠的多表位的DNA或MVA-BN疫苗以不同聯(lián)合進行接種后，針對4種不同表位的CTL應答的誘導。BALB/c小鼠(每組5只)用DNA(肌肉內(nèi))或MVA-BN(靜脈內(nèi))接種，并在三周后接受加強免疫。在加強免疫的2周后，用ELISPOT試驗測定針對由這些疫苗(TYQRTRALV，流感病毒；SYIPSAEKI，P.Berghei；YPHFMPTNL，巨細胞病毒；RPQASGVYM，LCV)編碼的4種不同表位的CTL應答。
3C用相同的最佳劑量(1×108TCID50)的重組MVA-BN通過皮下途徑進行初次和加強免疫后，肽特異性T細胞和MVA特異性T細胞的頻率。每組8只小鼠用如圖所示兩種針劑的不同組合進行接種。末次接種的2周后，用IFN-γ ELISPOT試驗測定肽特異性脾細胞的數(shù)量。柱形代表具體點的均數(shù)±均值標準差。
圖4接種MVA-BN nef或MVABN的猴子體內(nèi)的SIV載量。
圖5免疫接種的猴子在用SIV進行感染后的存活。
圖6針對MVA-BN的猴血清抗體滴度。每一動物的抗體滴度用不同形狀表示，實心矩形表示平均滴度。
圖7免疫受損(CD4＜400ml血液)的猴子在用編碼tat的MVA-BN接種后的SIV水平。猴子已事先接受三次MVA-BN或MVA-BN nef接種(第0，8，16周)，并且已經(jīng)用SIV的致病性分離物感染(第22周)。在第100，102和106周(箭頭所示)，這些猴子接種了MVA-BN tat。
圖8接受抗逆轉錄病毒治療并用MVA-BN進行了治療性免疫接種的猴子體內(nèi)的SIV水平。三組猴子(n＝6)用SIV感染，并每天用PMPA進行治療(黑線所示)。在第10和16周，給這些動物接種重組MVA混合物或鹽水(箭頭所示)。
圖9感染并用重組MVA接種后針對SIV的體液應答。三組(n＝6)猴子用SIV致病性分離物感染(第0周)，然后進行抗逆轉錄病毒治療(PMPA，黑線所示)。在第10和16周，給這些猴子接種重組MVA混合物或鹽水?？筍IV抗體用感染的T細胞的裂解物作為抗原在標準ELISA試驗中進行測定。
圖10正在接受抗逆轉錄病毒治療的、感染了SIV的猴子中針對MVA的體液應答。三組(n＝6)猴子用SIV致病性分離物感染(第0周)，然后進行抗逆轉錄病毒治療(PMPA，黑線所示)。在第10和16周，給這些猴子接種重組MVA混合物或鹽水?？筂VA抗體用標準的MVA捕獲性ELISA試驗測定。
圖11小鼠用不同的天花疫苗接種后對MVA抗體的誘導。接種MVA-BN(第0和4周)后MVA抗體的水平，與接種常規(guī)痘苗病毒株后的水平進行比較，所述常規(guī)病毒株為經(jīng)由尾部劃破(tail scarification)方式接種的Elstree和Wyeth(第0周)、MVA 572(第0和4周)、按照前-Elstree疫苗形式接種的MVA-BN和MVA 572。MVA 572已保藏在歐洲細胞培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為ECACC V94012707。病毒滴度用捕獲性ELISA測定，利用曲線圖的線性部分進行線性回歸，并定義為產(chǎn)生最佳密度0.3的稀釋度。*MVA-BNMVA-BN顯著(p＞0.05)區(qū)別于MVA 572MVA 572。
實施例以下實施例將進一步舉例說明本發(fā)明。本領域技術人員應理解，所提供的實施例無意限制本發(fā)明技術的應用。
實施例1在選定的細胞系中新的MVA病毒株的生長動力學和體內(nèi)復制(i)細胞系中的生長動力學為了鑒定本發(fā)明新分離的病毒株(以下稱為MVA-BN)，將這一新病毒株的生長動力學與其它已知MVA病毒株的進行比較。
比較以下病毒在后文所列的原代細胞以及細胞系中的生長動力學MVA-BN(病毒原種，#23，18.02.99粗制品，滴度2.0×107TCID50/ml)；由Altenburger(美國專利5,185,146)鑒定、后來被稱為MVA-HLR的MVA；由Anton Mayr(Mayr，A.等 Infection 3；6-14)鑒定、后來被稱為MVA 575(ECACC V00120707)的MVA(第575代)；和MVA-Vero，參見PCT/EP01/02703(WO 01/68820)(病毒原種，第49代，#20，22.03.99粗制品，滴度4.2×107TCID50/ml)。
所用的原代細胞和細胞系是CEF雞胚成纖維細胞(從SPF卵新鮮制備)；HeLa人類宮頸腺癌(上皮)，ATCC CCL-2；
143B人類骨肉瘤TK-，ECACC 91112502；HaCaT人角質(zhì)細胞系，Boukamp等1988，J Cell Biol 106(3)761-771；BHK幼年倉鼠腎，ECACC 85011433；Vero非洲綠猴腎成纖維細胞，ECACC 85020299；CV1非洲綠猴腎成纖維細胞，ECACC 87032605。
為了進行感染，將不同的細胞以5×105細胞/孔的濃度接種在6孔板中添加了2％FCS的DMEM(Gibco，目錄號61965-026)中，在5％CO2中37℃保溫過夜。除去細胞培養(yǎng)基，細胞被大約moi 0.05的病毒在37℃，5％CO2中感染1小時(對于感染而言，推測細胞數(shù)在過夜后加倍)。對不同細胞類型進行每次感染所用的病毒量為5×104TCID50，將它稱為輸入量(Input)。細胞然后用DMEM洗3次，最后添加1ml DMEM，2％FCS，將平板在37℃，5％CO2中保溫96小時(4天)。通過將平板凍存在-80℃而終止感染，以備滴定分析。
滴定分析(用痘苗病毒特異性抗體進行免疫)為了對病毒量進行滴定，將測試細胞(CEF)以1×104細胞/孔的濃度，接種在含有RPMI(Gibco，目錄號61870-010)，7％FCS，1％抗生素/抗真菌素(Gibco，目錄號15240-062)的96孔板上，在5％CO2中37℃保溫過夜。將感染實驗的6孔板凍融3次，用RPMI生長培養(yǎng)基制備10-1-10-12的稀釋液。將病毒稀釋液分配至測試細胞上，在5％CO2中37℃保溫5天，使得產(chǎn)生CPE(致細胞病變效應)。將測試細胞固定(丙酮/甲醇1∶1)10min，用PBS洗滌，與在保溫緩沖液中1∶1000稀釋的痘苗病毒特異性多克隆抗體(QuartettBerlin，目錄號9503-2057)室溫(RT)保溫1小時。用PBS(Gibco，目錄號20012-019)洗滌兩次，加入已在保溫緩沖液(PBS，含3％FCS)中1∶1000稀釋的HPR-偶聯(lián)型抗-兔抗體(Promega Mannheim，目錄號W4011)室溫保溫1小時。將細胞再用PBS洗2次，與染色液(10ml PBS+200μl鄰聯(lián)茴香胺在100％乙醇中的飽和溶液+15μl新鮮配制的H2O2)一起保溫，直至可見到棕色斑點(2小時)。去掉染色液，加PBS以終止染色反應。將每個顯示棕色斑點的孔標記為CPE陽性孔，用Kaerber的公式計算滴度(基于TCID50的試驗)(Kaerber，G.1931.Arch.Exp.Pathol.Pharmakol.162，480)。
用所述病毒以低感染復數(shù)(即每個細胞接受0.05的感染復數(shù)(5×104TCID50))感染兩個平行組，其中一組為CEF和BHK，預計它們能容許MVA；另一組為CV-1，Vero，Hela，143B和HaCat，預計它們不能容許MVA。然后，去掉病毒接種物，將細胞洗3次以除去任何殘余的未被吸附的病毒。使感染持續(xù)4天，從中制備病毒提取物，然后在CEF細胞上滴定。表1和圖1顯示了滴定分析的結果，其中的值為感染4天后產(chǎn)生的病毒總量。
據(jù)顯示，所有病毒如預計的那樣在CEF細胞(雞胚成纖維細胞)中良好擴增，因為這是所有MVA的容許細胞系。此外還顯示，所有病毒在BHK(倉鼠腎細胞系)中有良好擴增。MVA-Vero的表現(xiàn)最佳，因為BHK是一種容許細胞系。
在Vero細胞(猴腎細胞系)中的復制情況是，MVA-Vero如預計的那樣有良好的擴增，即比輸入量高1000倍。MVA-HLR和MVA-575也都有良好擴增，分別比輸入量高33倍和10倍。只有MVA-BN在這些細胞中不能向其它病毒一樣進行良好擴增，它僅比輸入量高2倍。
在CV1細胞(猴腎細胞系)中的復制情況是，MVA-BN在該細胞系中高度減毒。其病毒量比輸入量低200倍。MVA-575也未能超出輸入水平，其略顯負擴增，即比輸入量低16倍。MVA-HLR的擴增情況最佳，它比輸入量高30倍；其次是MVA-Vero，比輸入量高5倍。
最感興趣的是比較這些病毒在人類細胞系中的生長動力學。就143B細胞(人類骨癌細胞系)中的繁殖性復制而言，只有MVA-Vero顯示了超出輸入量的擴增(超出3倍)。所有其它病毒的擴增未超過輸入水平，但MVA-HLR與MVA-BN，以及與MVA575之間有較大差距。MVA-HLR為“邊界水平”(比輸入量低1倍)，MVA-BN的減毒程度最大(比輸入量低300倍)，其次是MVA-575(比輸入量低59倍)?？偟目磥?，MVA-BN在人類143B細胞中的減毒程度最高。
在HeLa細胞(人類宮頸癌細胞)中的復制情況顯示，MVA-HLR在該細胞系中擴增良好，甚至比它在容許性BHK細胞中的情況還要好(Hela＝比輸入量高125倍；BHK＝比輸入量高88倍)，MVA-Vero也可以在該細胞系中擴增(比輸入量高27倍)。但MVA-BN在這些細胞系中減毒，MVA-575也是，但減毒程度稍小(MVA-BN＝比輸入量低29倍，MVA-575＝比輸入量低6倍)。
在HaCat細胞(人類角質(zhì)細胞系)中的復制情況表明，MVA-HLR在該細胞系中擴增良好(比輸入量高55倍)。MVA-Vero能適應這種細胞系，MVA-575能在這種細胞系中擴增(分別比輸入量高1.2倍和1.1倍)。只有MVA-BN被證實減毒(比輸入量低5倍)。
結論是，MVA-BN是這一組病毒中減毒程度最高的病毒株MVA-BN在人類胚腎細胞(293ECACC 85120602)中擴增比為0.05-0.2(數(shù)據(jù)未包括在表1中)，它在143B細胞中的擴增比約為0；在HeLa細胞中約為0.04；在HaCat細胞中約為0.22，以上都表明，它在人類細胞系中極度減毒。此外，MVA-BN在CV1細胞中的擴增比約為0.0。只有在Vero細胞中能觀察到擴增(擴增比為2.33)，但仍不及其在容許性細胞系如BHK和CEF中的水平(見表1)。故MVA-BN是唯一在人類細胞系143B，Hela，HaCat和293中都顯示出小于1的擴增比的已知MVA病毒株。
MVA-575的表現(xiàn)類似于MVA BN，但減毒程度不及MVA-BN。
MVA-HLR在參與測試的所有細胞系中都有良好擴增(在143B細胞中除外)，因此可將它視為在除了143B細胞以外的所有細胞系中都具有復制競爭力。有1例顯示其在人類細胞系(HeLa)中的擴增甚至優(yōu)于其在容許細胞系(BHK)中的擴增。
MVA-Vero在所有細胞系中都顯示擴增，但程度不及MVA-HLR(除了在143B中的情況以外)。但考慮減毒水平，還不能將其視為與MVA-BN或MVA-575相同的“一類”。
2.體內(nèi)復制鑒于某些MVA病毒株可在體外復制，用轉基因小鼠模型AGR129檢查了不同的MVA株體內(nèi)復制的能力。這種小鼠中，IFN受體I型(IFN-α/β)和II型(IFN-γ)的基因以及RAG中有毀壞。由于這些毀壞，該小鼠不具有IFN系統(tǒng)，不能產(chǎn)生成熟的B細胞和T細胞，因此免疫力嚴重受損，對復制型病毒高度易感。對6只一組的小鼠用107pfu的MVA-BN，MVA-HLR或MVA572(曾在德國應用于120,000人)進行免疫(i.p)，每日監(jiān)控臨床表征。所有接種了MVA HLR或MVA 572的小鼠分別在28天和60天內(nèi)死亡。尸檢表明，大多數(shù)器官中有嚴重病毒感染的常見表現(xiàn)，通過標準空斑試驗從卵巢中回收到MVA(108pfu)。相反，接種了相同劑量的MVA-BN(對應于保藏株ECACC V00083008)的小鼠存活期為90天以上，并且不能從器官或組織中回收到MVA。
將體外研究和體內(nèi)研究的數(shù)據(jù)綜合，可明顯看出，MVA-BN比其親本株或MVA-HLR商業(yè)株的減毒程度更高。
實施例2體內(nèi)免疫學數(shù)據(jù)以下實驗用于比較MVA-BN與其它MVA相比的不同劑量和接種方案。
2.1.不同的MVA株刺激免疫應答的能力不同具有復制競爭力的痘苗病毒株在小鼠中誘導較強的免疫應答，高劑量時是致死的。盡管MVA已高度減毒，并且在哺乳動物細胞中的復制能力減弱，但在不同MVA株之間減毒程度有不同。事實上，MVABN看上去比其它MVA株，甚至比親本株MVA 575減毒程度更高。為確定減毒程度的這種差別是否影響MVA誘導保護性免疫應答的效力，在痘苗病毒致死攻擊模型中比較了不同劑量的MVA BN和MVA 575。保護水平通過攻擊后第4天測出的卵巢中痘苗病毒滴度的減少來確定，這樣可以定量評估MVA的不同劑量和不同毒株。
致死攻擊模型不含具體病原體的6-8周齡雌性BALB/c(H-2d)小鼠(n＝5)用不同劑量(102，104或106TCID50/ml)的MVA BN或MVA 575免疫(i.p.)。MVA-BN和MVA-575已在CEF細胞中繁殖，并已經(jīng)過蔗糖純化，用Tris pH7.4配制。3周后，以相同劑量的相同MVA株對小鼠進行加強免疫，2周后用具有復制競爭力的痘苗病毒株進行致死攻擊(i.p.)。使用WR-L929 TK+或IHD-J病毒株作為具有復制競爭力的痘苗病毒(縮寫為“rVV”)。對照小鼠接種安慰劑疫苗。保護作用通過標準空斑試驗測定攻擊后第4天在卵巢中的滴度減少來確定。為此，在攻擊后第4天處死小鼠，取卵巢，在PBS(1ml)中勻漿，用VERO細胞進行標準空斑試驗來測定病毒滴度(Thomson等，1998，J.Immunol.1601717)。
兩次接種了104或106TCID50/ml的MVA-BN或MVA-575的小鼠受到完全保護，表現(xiàn)為攻擊后第4天卵巢中的rVV滴度100％減少(圖2)。參與攻擊的病毒被清除。但在較低劑量水平，MVA-BN或MVA575的保護水平不同。兩次接種102TCID50/ml的MVA575的小鼠未受到保護，表現(xiàn)為卵巢中rVV滴度很高(平均3.7×107pfu+/-2.11×107)。相反，接種相同劑量的MVA-BN的小鼠，其卵巢中的rVV滴度顯著減少(96％)(平均0.21×107pfu+/-0.287×107)。接受安慰劑疫苗的對照小鼠的平均病毒滴度為5.11×107pfu(+/-3.59×107)(圖2)。
兩種MVA株都在小鼠體內(nèi)誘導了對抗致死性rVV攻擊的保護性免疫應答。雖然這兩種MVA株在較高劑量都同等地有效，但在亞最佳劑量時，它們的效力有明顯差別。MVA-BN在誘導對抗致死性rVV攻擊的保護性免疫應答方面比其親本株MVA-575更有效，這可能與MVA-BN比MVA-575減毒程度高有關。
2.2.MVA-BN在初次-加強接種方案中2.2.1.用不同的天花疫苗接種小鼠后誘導抗MVA抗體MVA-BN與其它MVA以及此前用于根治天花的痘苗病毒株進行了效力比較。這些包括，用產(chǎn)生于CEF細胞中的痘苗病毒株Elstree和Wyeth經(jīng)由尾部劃破方式進行單個免疫，和用原德國天花根治項目中使用的MVA572進行免疫。此外，將MVA-BN和MVA 572都作為前-疫苗，接著經(jīng)由劃破方式接種Elstree，然后比較。每組8只BALB/c小鼠，所有MVA接種(1×107TCID50)都是在第0和第3周皮下給予。加強免疫的2周后，對小鼠給予痘苗病毒(IHD-J)攻擊，4天后測定卵巢中的滴度。所有疫苗和方案都誘導了100％的保護作用。
用這些不同疫苗或方案誘導的免疫應答在攻擊前的動物體內(nèi)予以檢測。使用那些測量中和抗體的水平，T細胞的增殖，T細胞的細胞因子(IFN-γ和IL-4)產(chǎn)生和IFN-γ產(chǎn)生的試驗。MVA-BN所誘導的T細胞應答水平用ELlspot測定，該水平大體上等效于其它MVA和經(jīng)證實有生物等效性(bio-equivalence)的痘苗病毒。在不同的接種方案之后，每周分析抗MVA抗體的滴度，結果表明，用MVA-BN進行接種，比其它接著方案顯著增加了抗體應答的速度和程度(圖11)。事實上，用MVA-BN進行接種，在第2，4，和5周(在進行加強免疫的第4周的1周后)時，抗MVA抗體滴度顯著高于用MVA 572進行接種的小鼠體內(nèi)的水平(p＞0.05)。于第4周進行了加強免疫后，MVA BN組的抗體滴度也顯著高于接受痘苗病毒株Elstree或Wyeth單一接種的小鼠體內(nèi)的滴度。這些結果清楚表明，用MVA-BN進行兩次接種，比用傳統(tǒng)的痘苗病毒株(Elstree和Wyeth)進行經(jīng)典的單一接種誘導了更高水平的抗體應答，還證實了第1.5節(jié)的發(fā)現(xiàn)MVA-BN比其它MVA株的致免疫性更強。
2.2.2.在流感病毒攻擊模型中，MVA-初次和加強免疫方案產(chǎn)生了與DNA-初次MVA-加強免疫方案相同水平的保護作用對MVA初次-加強免疫方案產(chǎn)生高親合力CTL應答的效力進行評估，并與此前報道的DNA初次/MVA加強免疫方案的效力進行比較。兩種方案用由DNA載體或MVA-BN編碼的鼠的多表位構建體進行評估，對CTL的誘導水平用ELISPOT進行比較，就應答的親合力而言，測試的是流感病毒攻擊后所提供的保護程度。
構建體編碼鼠的多表位(10種CTL表位，包括流感病毒，卵清蛋白)的DNA質(zhì)粒已有描述(Thomson等，1998，J.Immunol.1601717)。將這種鼠的多表位插入MVA-BN的缺失位點II，所述MVA-BN是在CEF細胞上繁殖，經(jīng)蔗糖純化，并配制在Tris pH7.4中。
接種方案在本項研究中使用不含具體病原體的6-8周齡雌性BALB/c(H-2d)小鼠。用每組5只小鼠進行ELISPOT分析，用每組6只小鼠進行流感病毒攻擊實驗。這些小鼠用編碼鼠的多表位的MVA或DNA以不同的初次-加強免疫方案進行接種，詳見結果部分。在用DNA進行接種的情況中，小鼠被麻醉，對其已麻醉的四頭肌注射50μg無內(nèi)毒素的質(zhì)粒DNA(在50μl PBS中)一次。用MVA進行初次免疫時，是每只小鼠靜脈給予107pfu MVA-BN或每只小鼠皮下給予107pfu或108pfu MVA-BN。初次免疫的3周后進行加強免疫。用質(zhì)粒DNA進行加強免疫的方式與用DNA進行初次免疫的方式(見上述)一樣。為了建立CTL應答，在末次加強免疫的2周后，用流感CTL表位肽(TYQRTRALV)，P.Berghei表位肽(SYIPSAEKI)，巨細胞病毒肽表位(YPHFMPTNL)和/或LCV肽表位(RPQASGVYM)在脾細胞上進行ELISPOT試驗(Schneider等，1998，Nat.Med.4；397-402)。在攻擊試驗中，小鼠被麻醉，鼻內(nèi)(i.n.)感染亞致死劑量的ressortant流感病毒Mem71(4.5×105pfu，在50ml PBS中)。在感染后第5天，取肺，在Madin-Darby犬腎細胞系中用標準流感病毒空斑試驗測定雙份病毒滴度。
結果
在單獨使用DNA疫苗的情況中，誘導的針對4種由鼠的多表位編碼的H-2d表位的CTL較少，僅可檢測到針對P.Berghei表位(SYIPSAEKI)和淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒表位(RPQASGVYM)的弱應答。相反，在DNA初次MVA加強免疫(107pfu MVA-BN，皮下給予)的方案中，誘導了顯著更多的針對SLY的CTL(增加8-倍)和針對RPQ的CTL(增加3-倍)，還觀察到針對第3種表位鼠巨細胞病毒表位(YPHFMPTNL)的應答(圖3A)。但是，在用107pfu MVA-BN皮下給予進行初次和加強免疫的方案中，誘導的應答水平與用DNA然后用MVA-BN免疫誘導的水平相同(圖3A)。令人驚訝的是，當僅用MVA-BN(107TCID50)免疫一次的情況中，誘導的針對三種表位的CTL在數(shù)量上沒有顯著差別，說明用MVA-BN進行第二次免疫并未顯著增強CTL應答。
此前已顯示，在用其它MVA株進行接種的情況中，皮下給予107pfuMVA是最沒有效力的途徑和病毒濃度，尤其是與靜脈免疫相比(Schneider等1998)。為了確定最佳免疫方案，在改變病毒量或改變給藥模式的情況下，重復進行上述實驗。在一個實驗中，靜脈接種107pfu MVA-BN(圖3B)。在另一實驗中，皮下給予108pfu MVA-BN(圖3C)。在這些實驗中，MVA-BN初次-加強免疫與DNA初次MVA加強免疫方案相比，針對所有三種CTL表位誘導出較高的的平均CTL數(shù)。與皮下給予107pfu MVA-BN相比，靜脈接種107pfu MVA-BN和皮下給予108pfu都顯著增強了CTL應答，這清楚表明，在針對載體已有免疫力的情況下，MVA-BN可用于增強CTL應答。
2.2.3.MVA-BN nef疫苗在SIV感染的獼猴中的效力為測定MVA-BN nef疫苗的效力，在用有毒力的SIV原代分離物進行攻擊后，評估病毒載量和疾病的延遲。該研究還測定了MVA-BN是否可用于在已對MVA具有免疫力的免疫受損型猴子體內(nèi)安全地增強免疫應答。
接種方案兩組(n＝6)獼猴(Macaca mulalta)，在第0，8和16周時，通過肌肉內(nèi)大丸劑注射的方式單獨接種MVA-BN或接種重組MVA-BN nef。在第22周，所有猴子用來自未經(jīng)培養(yǎng)的原代獼猴PBMC的50 MID50致病性細胞結合型SIV原種(1XC)通過靜脈途徑進行攻擊。頻繁監(jiān)控動物的臨床狀態(tài)，定期取血樣測定病毒血癥，免疫參數(shù)，以及完整的血液學參數(shù)和血液臨床化學參數(shù)。將出現(xiàn)AIDs樣疾病的猴子處死，對幸存的猴子在接種后監(jiān)控99周。在第100周時，幸存的猴子全部用MVA-BN tat免疫(i.m.)，并在第102周和第106周用相同的MVA-BN再次免疫。
用MVA-BN或MVA-BN nef接種后都未觀察到副作用。用SIV感染猴子后，病毒血癥水平陡然升高，在感染的2周后達到峰值(圖4)。由于組內(nèi)存在較大的標準差，MVA-BN nef接種組與MVA-BN接種組的平均SIV水平無顯著差異。但在MVA-BN nef接種組中，SIV載量總體上比對照組(MVA-BN)低10倍。此外，感染的35周后(初步觀察階段)，6只接種了MVA-BN nef的猴子中，僅1只因病情嚴重不得不被實施安樂死，而6只對照猴子中有4只被實施安樂死(圖5)。疾病的發(fā)生與較高的病毒載量明顯相關，因此在感染后對動物再觀察29周。MVA BN nef疫苗傾向于比對照組更延遲疾病的進展，甚至在感染后第46周時，6只MVA-BN nef動物有5只存活(圖5)。但在感染后第59周時，nef接種組的另兩只動物被處以安樂死，僅余5只動物存活(3只來自MVA-BN nef組，2只接種的是MVA-BN)。測定這12只猴子體內(nèi)抗MVA-BN抗體的滴度，結果清楚表明，MVA-BN能增強免疫應答，即使在已具有對MVA的免疫力的情況下也是如此(圖6)。用MVA-BN或MVA-BN nef進行初次免疫后，所有猴子產(chǎn)生了對抗MVA的抗體應答，平均滴度為1000。這種抗體應答在第二次免疫接種后得到顯著增強，這清楚表明，MVA可用于健康猴子體內(nèi)引發(fā)-增強免疫應答。這些抗體滴度逐漸下降，雖然在免疫后第49周時滴度達到平臺期，但在第99周時抗MVA抗體的平均滴度為2000。
5只幸存的猴子被SIV感染并且免疫受損，表現(xiàn)為CD4計數(shù)低于400/μl血液。為調(diào)查在免疫受損猴子體內(nèi)應用MVA-BN的影響，在初次接種后第100，102和106周時，對這5只動物用MVA-BNtat進行三次接種。第一次MVA-BN tat免疫在這些免疫受損的猴子體內(nèi)顯著增強了抗MVA的抗體應答，6周后，這些猴子接受第三次加強免疫(圖6)。以上結果進一步證實，MVA-BN可以在已有針對MVA的顯著免疫力的情況下增強免疫應答，甚至在免疫受損的猴子體內(nèi)也是如此。盡管這些猴子的免疫應答在用MVA BNtat免疫以后得到加強，但SIV水平仍維持穩(wěn)定，表明用MVA-BN進行免疫是安全的，不影響免疫受損猴子體內(nèi)的SIV水平(圖7)。
本研究證實，MVA-BN可以在免疫受損的獼猴體內(nèi)引發(fā)-增強免疫應答，且MVA-BN免疫是安全的，不影響被SIV感染的動物體內(nèi)病毒血癥的水平。接種MVA-BN nef疫苗的動物體內(nèi)AIDS樣疾病進展的延遲，表明成功產(chǎn)生了針對nef的免疫應答。
2.2.4.對正在接受抗逆轉錄病毒治療的被SIV-感染的猴子進行治療性接種在正接受抗逆轉錄病毒治療的個體體內(nèi)應用基于MVA-BN的治療性HIV疫苗。因此，本研究調(diào)查了編碼多種SIV抗原(gag，pol，env，rev，tat，和nef)的重組MVA，在被SIV感染并用PMPA治療的猴子體內(nèi)的安全性(對SIV水平的影響)和效力。PMPA是一種核苷類似物，能有效對抗HIV和SIV(Rosenwirth，B.等，2000，J Virol 74，1704-11)。
構建體所有重組MVA構建體都在CEF細胞上繁殖，經(jīng)蔗糖純化，并配制在Tris pH7.4中。
接種方案三組(n＝6)獼猴(Macaca mulatta)用50MID50致病性原代SIV分離物(1XC)感染，然后每天用PMPA(60mg/kg，皮下給予)進行治療，連續(xù)19周。在第10周，給動物接種重組MVA-BN(i.m.)或鹽水，并在6周后進行相同的接種。第1組接受MVAgag-poi和MVA-env的混合物，第2組接受MVA-tat，MVA-rev和MVA-nef，第3組接受鹽水。頻繁監(jiān)控動物的臨床狀態(tài)，定期取血樣測定病毒血癥，免疫參數(shù)，以及完整的血液學參數(shù)和血液臨床化學參數(shù)。
所有動物都出現(xiàn)了較高的SIV載量，于感染后第2周達到峰值(圖8)。通過每天用PMPA進行治療，SIV水平下降，在第9周穩(wěn)定至低水平。與以前的研究一樣，在第10和16周接種MVA對SIV水平?jīng)]有影響，說明MVA-BN是免疫受損動物的安全疫苗載體。這些動物一旦終止PMPA治療(第21周)，SIV水平就升高。雖然第1組動物與第3組動物相比，SIV水平下降，但各組動物之間，在結束PMPA治療后，平均SIV載量沒有顯著差異(圖8)。對被SIV感染的T-細胞裂解物進行ELISA發(fā)現(xiàn)，各組動物在感染后第4周產(chǎn)生針對SIV的抗體應答(圖9)。對照組(鹽水)的SIV抗體滴度在PMPA治療期間下降，當終止PMPA治療后迅速上升，反映出抗逆轉錄病毒治療期間SIV水平的下降和隨后增加(圖9)。在接受MVA-tat，MVA-rev和MVA-nef的第2組觀察到SIV抗體滴度的類似模式，很可能反映了這些調(diào)節(jié)蛋白在ELISA試驗所用的SIV感染型T細胞裂解物中較低水平的表達。但與此相反，第1組的抗-SIV抗體滴度在第10周接種了MVA gag-pol和MVA-env后增加，表明重組MVA-BN可以在被(SIV)感染并正接受抗逆轉錄病毒治療的動物體內(nèi)增強對SIV的免疫應答。重要的是，第16周進行了第二次免疫后，抗-SIV抗體滴度增加，這再次表明，MVA可以在免疫受損動物體內(nèi)增強免疫應答，即使在已有針對MVA的免疫力的情況下也是如此(圖8)。第1組的抗-MVA抗體滴度還反映了這種模式，其中初次免疫以后產(chǎn)生了抗體應答，該應答在第二次接種后被顯著增強(圖10)。
參考文獻Schneider，J.，Gilbert，SC.，Blanchard，TJ.，Hanke，T.，Robson，KJ.，Hannan，CM.，Becker，M.，Sinden，R.，Smith，GL.，和Hill，AVS.1998.Enhancedimmunogenicity for CD8+T cell induction and complete efficacy of malariaDNA vaccination by boosting with modified vaccinia virus Ankara(瘧疾DNA接種經(jīng)改良安卡拉痘苗病毒加強免疫后，增強了對CD8+T細胞誘導的致免疫性和完整效力).Nat.Med.4；397-402.
Thomson，SA.，Sherritt，MA.，Medveczky，J.，Elliott，SL.，Moss，DJ.，F(xiàn)ernando，GJP.，Brown，LE.，和Suhrbier，A.1998.Delivery of multiple CD8cytotoxic T cell epitopes by DNA vaccination(通過DNA接種運送多重CD8細胞毒T細胞表位).J.Immunol.1601717.
表1

感染4天后，病毒擴增，超出輸入水平擴增比＝輸出的TCID50-輸入的TCID50。
所有數(shù)值都是TCID50。

關于微生物保藏的說明(細則13之二)


PCT/RO/134表(1992年7月)

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PCT/RO/134表(1992年7月)

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PCT/RO/134表(1992年7月)
權利要求
(1)具有至少一種下列特征的痘苗病毒(i)能在雞胚成纖維細胞(CEF)以及在幼年倉鼠腎細胞系BHK中進行繁殖性復制，但不能在人類角質(zhì)細胞系HaCat中進行繁殖性復制，(ii)不能在體內(nèi)復制，(iii)在致死攻擊模型中比已知病毒株MVA 575誘導出更高的致免疫性，和/或(iv)在痘苗病毒初次免疫/痘苗病毒加強免疫的方案中，與在DNA-初次免疫/痘苗病毒加強免疫的方案中相比，誘導出至少基本相同的水平的免疫力。
(2)權利要求1的病毒，其中所述病毒不能在以下任何一種人類細胞系中進行繁殖性復制人類胚腎細胞系293，人類骨肉瘤細胞系143B和人類宮頸腺癌細胞系HeLa。
(3)權利要求1或2的病毒及其衍生物，所述病毒在歐洲細胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC)，Salisbury(UK)以保藏號V00083008進行保藏。
(4)權利要求1-3之一的病毒，含有至少一種異源核酸序列。
(5)權利要求4的病毒，其中所述異源核酸序列選自編碼至少一種抗原、抗原性表位、和/或治療性化合物的序列。
(6)基因組或其功能性部分，衍生自權利要求1-5之一所述病毒。
(7)藥用組合物，含有權利要求1-5之一所述病毒和/或權利要求6所述基因組和/或其功能性部分以及一種可藥用載體、稀釋劑和/或添加劑。
(8)疫苗，含有權利要求1-5之一所述病毒和/或權利要求6所述基因組和/或其功能性部分。
(9)作為藥物的權利要求1-5之一所述病毒，權利要求6所述基因組和/或其功能性部分，權利要求7所述組合物或權利要求8所述疫苗，所述藥物在活體動物中，包括在人體中，影響免疫應答，優(yōu)選誘導免疫應答。
(10)權利要求1-5之一所述病毒，權利要求7所述藥用組合物，權利要求8所述疫苗，或權利要求9所述病毒，其中所述病毒，組合物或疫苗在第一次接種(初次接種)和在第二次接種(加強接種)中以治療有效量給予。
(11)權利要求1-5之一所述病毒，和/或權利要求6所述基因組，在制備藥物或疫苗中的用途。
(12)將同源和/或異源核酸序列導入靶細胞的方法，包括用權利要求4或5所述病毒感染靶細胞，或用權利要求6所述基因組轉染靶細胞。
(13)制備肽、蛋白和/或病毒的方法，包括a)用權利要求1或5所述病毒感染宿主細胞，b)在適當條件下培養(yǎng)已被感染的宿主細胞，和c)分離和/或富集由所述宿主細胞產(chǎn)生的肽和/或蛋白和/或病毒。
(14)在動物，包括人，的活體內(nèi)影響免疫應答，優(yōu)選誘導免疫應答的方法，包括對需要治療的動物或人給藥權利要求1-5之一所述病毒，權利要求6所述基因組和/或其功能性部分，權利要求7所述組合物或權利要求8所述疫苗。
(15)權利要求14的方法，包括給藥至少102TCID50(組織培養(yǎng)感染劑量)的病毒。
(16)權利要求14或15的方法，其中所述病毒，組合物或疫苗在第一次接種(初次接種)和第二次接種(加強接種)中以治療有效量給藥。
(17)權利要求14-16之一的方法，其中所述動物為免疫受損的動物。
(18)權利要求14-17之一的方法，其中所述動物事先已具有對痘病毒的免疫力。
(19)權利要求14-18之一的方法，其中所述動物正接受抗病毒治療。
(20)權利要求19的方法，其中所述抗病毒治療是抗逆轉錄病毒治療。
(21)權利要求1-5之一所述病毒，權利要求6所述基因組和/或其功能性部分作為佐劑的用途。
(22)增強對疫苗中所含抗原和/或抗原性表位的特異性免疫應答的方法，包括對將要用所述疫苗進行治療的活體動物，包括人，給藥權利要求1-5之一所述病毒或權利要求6所述基因組作為佐劑。
(23)作為佐劑的權利要求1-5之一所述病毒或權利要求6所述基因組。
(24)一種細胞，優(yōu)選人的細胞，它含有權利要求1-5之一所述病毒，或含有權利要求6所述基因組或其功能性部分。
(25)獲得權利要求1-3之一所述痘苗病毒的方法，包括以下步驟-將一種市售痘苗病毒株，優(yōu)選MVA 575，引入能允許該病毒在其中進行繁殖性復制的非人類細胞中，其中所述非人類細胞優(yōu)選選自CEF細胞和BHK細胞系，-從這些細胞分離/富集病毒顆粒，和-分析所得病毒是否具有至少一種在權利要求1中限定的生物學特性，其中可任選重復上述步驟，直至獲得具有所需復制特性的病毒。
(26)用于初次/加強免疫接種的試劑盒，它在第一個小瓶/容器中包含用于第一次接種(初次接種)的權利要求1-5之一所述病毒，權利要求7所述組合物，權利要求8所述疫苗，或權利要求9所述病毒，在第二個小瓶/容器中包含用于第二次接種(加強接種)的權利要求1-5之一所述病毒，權利要求7所述組合物，權利要求8所述疫苗，或權利要求9所述病毒。
(27)權利要求1-5之一所述病毒，權利要求7所述組合物，權利要求8所述疫苗，或權利要求9所述病毒，用于制備疫苗的用途，其中所述病毒，組合物或疫苗在第一次接種和第二次接種中以治療有效量給藥。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種減毒病毒，它衍生自修飾的安卡拉痘苗病毒，它的特征是失去了在人類細胞系中重復復制的能力。本發(fā)明進一步描述了衍生于該病毒的重組病毒及該病毒或其重組體作為藥物或疫苗的用途。此外，本發(fā)明提供了一種甚至在免疫受損患者，對疫苗病毒已有免疫力的患者或正在接受抗病毒治療的患者中都能誘導免疫應答的方法。
文檔編號A61P37/04GK1476483SQ01819410
公開日2004年2月18日 申請日期2001年11月22日 優(yōu)先權日2000年11月23日
發(fā)明者保羅·查普林, 保羅·豪利, 克里斯廷·邁辛格, 保羅 查普林, 廷 邁辛格, 豪利 申請人:巴法里安諾迪克有限公司