專利名稱：含有穩(wěn)定化類維生素a的柔和化妝品組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種皮膚和毛發(fā)用的化妝品組合物，其釋放類維生素A(retinoid)，具有改進的類維生素A穩(wěn)定性并對于皮膚來說也是柔和的。
已知類維生素A具有寬泛的皮膚益處例如皮膚增亮、皺紋處理、油的控制。不幸的是，類維生素A不穩(wěn)定，尤其是在水的存在下。然而，化妝品組合物幾乎總含有大量的水，從而提供美學(xué)可接受的表觀和觸覺特性。另一個與使用類維生素A有關(guān)的缺點在于其刺激性，尤其是當(dāng)以相對高濃度涂敷和/或涂敷在敏感皮膚上時。因此，含有改進的穩(wěn)定性的類維生素A并對于皮膚來說柔和的化妝品組合物是商業(yè)上所希望的。
一種水包油乳狀液化妝品組合物含有(a)溶解在流體油中的類維生素A，(b)聚合乳化劑。
除了在操作和對比例中，或者另外清楚地指出，本說明書中表示物質(zhì)的量或反應(yīng)條件、物質(zhì)的物理性質(zhì)和/或使用的所有數(shù)值均理解是用詞“約”修飾。所有的量是以最終組合物的重量計，除非另外說明。
在此所用的術(shù)語″皮膚″包括面部、頸部、胸部、背部、臂、手、腿和頭皮上的皮膚。
溶解在流體油中的類維生素A本發(fā)明組合物含有類維生素A。適用的類維生素A包括但不限于視黃基酯、視黃醇、視黃醛和視黃酸，優(yōu)選視黃醇或視黃基酯。術(shù)語“視黃醇”包括視黃醇的下列異構(gòu)體全反式視黃醇、13-順式-視黃醇、11-順式-視黃醇、9-順式-視黃醇、3，4-二脫氫-視黃醇；3，4-二脫氫-13-順式-視黃醇；3，4-二脫氫-11-順式-視黃醇；3，4-二脫氫-9-順式-視黃醇。優(yōu)選的異構(gòu)體是全反式視黃醇、13-順式-視黃醇、3，4-二脫氫-視黃醇、9-順式-視黃醇。首選全反式視黃醇，這歸因于其廣泛的商業(yè)可得性。
視黃基酯是視黃醇的酯。術(shù)語“視黃醇”定義如上。適用于本發(fā)明的視黃基酯是視黃醇的C1-C30酯，優(yōu)選C2-C20酯，并且首選C2、C3和C16酯，因為它們通常更易得到。視黃基酯的實例包括但不限于棕櫚酸視黃基酯、甲酸視黃基酯、乙酸視黃基酯、丙酸視黃基酯、丁酸視黃基酯、戊酸視黃基酯、異戊酸視黃基酯、己酸視黃基酯、庚酸視黃基酯、辛酸視黃基酯、壬酸視黃基酯、癸酸視黃基酯、十一烷酸視黃基酯、十二烷酸視黃基酯、十三烷酸視黃基酯、肉豆蔻酸視黃基酯、十五烷酸視黃基酯、十七烷酸視黃基酯、硬脂酸視黃基酯、異硬脂酸視黃基酯、十九烷酸視黃基酯、花生四烯酸視黃基酯、山崳酸視黃基酯、亞油酸視黃基酯、油酸視黃基酯。
本發(fā)明優(yōu)選的酯選自棕櫚酸視黃基酯、乙酸視黃基酯和丙酸視黃基酯，因為這些酯商業(yè)上可得性最高因而價格低廉。亞油酸視黃基酯和油酸視黃基酯也因其功效而優(yōu)選。
類維生素A在本發(fā)明中的用量至少約0.001％，優(yōu)選約0.001％-約10％，更優(yōu)選該用量是約0.01％-約1％，首選約0.01％-約0.5％。
存在于本發(fā)明組合物中的類維生素A溶解在流體油中以便改進類維生素A的儲存穩(wěn)定性。以使類維生素A在25℃下以至少0.1g類維生素A/100g該油的量溶解的方式來選擇適用的流體油。優(yōu)選類維生素A以至少2g視黃酸/100g的該油的量溶解，首選以2-80g類維生素A/100g該油的量溶解。
作為舉例說明，視黃醇結(jié)晶在不同油中的溶解度如下所述油 溶解度，重量％礦物油 34.2Cetiol OE 80棕櫚酸異硬脂基酯 44C12-15烷基苯甲酸酯 85甘油三油酸酯/角鯊烯(6∶1) 56.4環(huán)甲基硅酮 2.7聚二甲基硅氧烷 0.49通過下列方法測定類維生素A在油中的溶解度。將以超過在該油中的預(yù)定溶解度的已知重量的純類維生素A加入到該油中。向該混合物中加入甲醇以溶解全部類維生素A晶體。使用氮氣噴射以保證全部甲醇從油中蒸發(fā)。使類維生素A過夜重結(jié)晶。經(jīng)0.45微米濾器過濾該樣本。通過UV光譜在適當(dāng)波長(視黃醇是325nm)下測定濾液在異丙醇中的已知稀釋液并且相對于類維生素A在異丙醇中的校準標準測定類維生素A的濃度。
適用的流體油包括但不限于脂肪酸或醇的酯和烴類，優(yōu)選脂肪酸或醇的單酯，只要它們滿足本文所述的溶解度要求。首選的是，流體油選自棕櫚酸異硬脂基酯、水楊酸三癸酯、C12-15辛酸酯、硬脂酸異丙酯、肉豆蔻酸異丙酯和棕櫚酸異丙酯，或者其任意混合物。二辛基醚，例如商品名為Cetiol OE，也被包括為首選的油。
硅油也可以含在所述的組合物中。這些優(yōu)選選自含約3-約9，優(yōu)選約4-約5個硅原子的環(huán)狀或直鏈聚二甲基聚硅氧烷。其它硅油還可以包括例如聚烷基硅氧烷、聚烷基芳基硅氧烷和聚醚硅氧烷共聚物(例如聚二甲基硅氧烷共聚醇)。在此使用的聚烷基硅氧烷包括，例如在25℃下粘度為約5-約100,000厘沲的聚二甲基硅氧烷，優(yōu)選在25℃下粘度為約10-約400厘沲的聚二甲基硅氧烷。
所述的油可以單用或者與彼此成為混合物。
所述的油的用量使選定量的類維生素A溶解然而不影響本發(fā)明組合物的舒適觸覺特性。
聚合乳化劑本發(fā)明組合物使用聚合乳化劑，以提高該組合物中類維生素A的穩(wěn)定性。聚合乳化劑使水進入到油相中的擴散最小化并由此使類維生素A暴露于水最小化，由此獲得類維生素A的改進了的穩(wěn)定性。
適用的聚合潤濕劑一般屬于下面兩種(b1)兩性嵌段共聚物；(b2)含有用疏水基團改性的親水性主鏈的聚合物。
所述的嵌段共聚物可以是二嵌段(AB體系結(jié)構(gòu))或三嵌段(ABA或BAB體系結(jié)構(gòu))。為了舉例說明，A嵌段是親水性的，例如聚環(huán)氧乙烷、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、硅氧烷、瓜耳膠和生物聚合物(阿拉伯膠、蛋白質(zhì)、明膠)。B嵌段是疏水性的，例如聚環(huán)氧丙烷、聚異丁烯和聚苯乙烯。
對于疏水改性的聚合物，主要組成或主鏈是疏水性的。沿這個主鏈和/或在末端，接枝有疏水基團(例如鏈烷烴(C12-C30))。這些聚合物由BASF、Rohm&Haas、BF Goodrich等在聚合乳化劑種類下制造。例如●BASF(Pluracares)●B.F.Goodrich(Pemulens，Carbopol 1382)●Rohm&Haas(Aculyn 22)●Whitco(Silwet)這些分子主要是親水性的并且可以溶解在極性溶劑(水、甘油)中。然而，該聚合物也含有疏水域，其使該聚合物可溶于非極性或有機相例如油。
所述的聚合乳化劑在本發(fā)明組合物中的濃度約0.01％-約10％，優(yōu)選約0.1％-2％，為了使用量最小而最優(yōu)選是約0.1％-約0.5％。首選的聚合乳化劑是Pemulen TR1、Pemulen TR2、Aculyn 22和Pluracares，因為這些在化妝品上可接受和有效。
優(yōu)選地，本發(fā)明組合物基本上不含有常規(guī)乳化劑例如硬脂?；樗徕c、PEG-100硬脂酸酯和鯨蠟硬脂醚(ceteareth)。一般地，常規(guī)乳化劑在本發(fā)明組合物中的含量小于2％，優(yōu)選小于1％，首選小于0.5％。如果確實使用，優(yōu)選使用非離子乳化劑例如吐溫。
組合物的穩(wěn)定性本發(fā)明組合物使組合物中的類維生素A具有顯著改進的穩(wěn)定性。具體地，組合物中類維生素A的半衰期在50℃下優(yōu)選至少是約20天，更優(yōu)選在50℃下至少約40天，首選在50℃下至少約70天。
類維生素A半衰期的測定″半衰期″定義為在指定溫度下使類維生素A降解至其初始濃度的一半時的時間。
將制劑置于50℃的烘箱內(nèi)用于加速的穩(wěn)定性研究。通過下述HPLC法在時間間隔分析類維生素A以評估穩(wěn)定性。該研究證明，類維生素A的降解作用遵守一級動力學(xué)。所以，為了測定反應(yīng)的半衰期，將剩余類維生素A濃度的自然對數(shù)相對于保存時間繪圖得到斜率為k的直線。斜率k是在時間倒數(shù)單位中類維生素A氧化的速率。視黃醇的半衰期是通過比率1n2/k測定。
類維生素AHPLC分析的方法帶有Millennium32軟件和光電二極管陣列檢測器的WatersMillipore系統(tǒng)用于收集HPLC數(shù)據(jù)。色譜條件如下所述柱Phenonaenex I nertsil 5μ ODS 2 150×4.60mm流速1.0mL/min注射體積30μLUV檢測325nm用光電二極管陣列流動相90/10甲醇/水運轉(zhuǎn)時間15分鐘溫度4℃保留時間約8.7分鐘為了制備具有最終類維生素A濃度在標準曲線范圍內(nèi)、小于10ppm的樣本溶液，首先將0.2g霜劑樣本與2.5g水混合且渦旋形成漿液。此后，向該漿液中加入甲醇得到50ml的最終總重量并且再次渦旋。樣本隨后用配有0.45μm濾器的一次性注射器過濾。所有樣本均一式三份制備用于HPLC分析。
保濕劑保濕劑優(yōu)選含在本發(fā)明組合物中給皮膚提供濕潤益處。適用的保濕劑是多元醇并且包括但不限于甘油(即丙三醇)，除甘油以外可以加入其中的保濕劑包括山梨糖醇、丙二醇、丁二醇、己二醇、乙氧基化葡萄糖和己三醇。保濕劑在本發(fā)明組合物中的濃度是至少10％。優(yōu)選濃度至少2％，一般在約2％-約90％的范圍內(nèi)。優(yōu)選約5％-約60％，為了使?jié)駶櫼嫣幾罴鸦走x約10％-約35％。首選的保濕劑是甘油和山梨糖醇-美容上優(yōu)選、低成本且高效。
彈性體彈性體是一種優(yōu)選的任選成分含在本發(fā)明組合物中。彈性體賦予絲質(zhì)感。這些材料是高度交聯(lián)的硅氧烷聚合物和硅油的混合物。供應(yīng)商來源包括GE Silicones(Waterford，NY)，Dow Corning(Midland，MI)，和Rhodia Silicones(Cranbury，NJ)。彈性體的含量優(yōu)選是0％-30％，優(yōu)選1％-15％，首選1％-10％。首選地，為了有助于分散彈性體并為了皮膚光滑性，彈性體以與附加揮發(fā)性硅油(環(huán)甲基硅酮類和聚二甲基硅氧烷類)的聯(lián)合形式存在。在這種情況中，揮發(fā)性硅油的含量是約0％-約25％，優(yōu)選約1％-約10％。
適當(dāng)彈性體的實例
類維生素A增效劑本發(fā)明的優(yōu)選組合物含有類維生素A增效劑。
據(jù)信，視黃醇酯和視黃醇在皮膚中按照

圖1所示機理酶促轉(zhuǎn)化為視黃酸。
某些化合物抑制ARAT/LRAT、視黃醛還原酶、CRABPII和視黃酸氧化作用(后者是通過細胞色素P450體系催化的)，而某些其他化合物促進視黃醛脫氫酶。此類化合物總稱為″增效劑″并且在上表中編為B1-B5組。所述的增效劑，單用或彼此合用，通過增加可用于轉(zhuǎn)化為視黃酸的視黃醇的量和抑制視黃酸的降解來增強類維生素A的作用。增效劑與類維生素A(例如視黃醇、視黃基酯、視黃醛、視黃酸)聯(lián)合作用。
本發(fā)明組合物優(yōu)選含有組合物重量約0.0001％-約50％、優(yōu)選約0.001％-約10％、首選約0.001％-約5％的增效劑或增效劑組合。
本發(fā)明組合物中包括的增效劑或其組合選自下列組(a)增效劑，選自B1，B2；B3；B4，B5；
(b)增效劑的二元組合，選自B1/B2；B1/B3；B1/B4；B1/B5；B2/B3，B2/B4；B2/B5，B3/B4；B3/B5；B4/B5；(c)增效劑的三元組合，選自B1/B2/B3；B1/B2/B4；B1/B2/B5；B1/B3/B4；B1/B3/B5；B1/B4/B5；B2/B3/B4；B2/B3/B5；B2/B4/B5；B3/B4/B5；(d)增效劑的四元組合，選自B1/B2/B3/B4；B1/B2/B3/B5；B1/B2/B4/B5；B1/B3/B4/B5；B2/B3/B4/B5；和(e)五組增效劑的組合B1/B2/B3/B4/B5。
本發(fā)明中含有的作為增效劑的化合物是基于在表A所列的某些濃度下這些化合物通過如部分2.1-2.7中所述的對于特定酶的體外微粒體試驗的能力而選擇的。本發(fā)明包括這樣的增效劑，即使沒有在此詳細提及。換言之，如果一種化合物在下述試驗中充分抑制或促進酶，它將與類維生素A聯(lián)合作用，模擬視黃酸對角蛋白細胞(皮膚細胞)的作用，并且由此屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。
由于含有類維生素A并且優(yōu)選含有類維生素A增效劑，本發(fā)明組合物有效預(yù)防和處理干燥皮膚、痤瘡、光損傷的皮膚、皺紋的出現(xiàn)、老年斑、老化的皮膚，提高角質(zhì)層的柔韌性、增量皮膚色澤、控制皮脂分泌并且通常提高皮膚的質(zhì)量。該組合物可以用于改善皮膚脫屑和表皮分化。
增效劑在本發(fā)明產(chǎn)品中的存在顯著改善類維生素A的性能。
所述的增效劑是通過部分2.1-2.7所述的體外微粒體研究的化合物。適用于本發(fā)明的化合物在表A所列的濃度下抑制或促進酶至至少是表A中所列的寬泛百分比。
表A增效劑試驗濃度和抑制/增強百分率ARAT/LRAT試驗(鑒定B1增效劑)
視黃醇脫氫酶試驗(鑒定B2增效劑)
視黃醛還原酶試驗(鑒定B3增效劑)
CRABPII拮抗劑試驗(鑒定B4增效劑)
視黃酸氧化作用試驗(鑒定B5增效劑)
用于測定本發(fā)明含有所述化合物的適合性的體外微粒體試驗如下所述
1.材料全反式視黃醇、全反式視黃酸、棕櫚酰CoA、二月桂?；字Ｄ憠A、NAD和NADPH購自Sigma Chemical公司。用于微粒體試驗的類維生素A的儲備液是在HPLC級乙腈中制備。用于HPLC分析的所有類維生素A標準儲備液是在乙醇中制成，在-70℃的N2氣氛下儲存并當(dāng)不儲存時保持在琥珀色光下的冰上。其它化學(xué)品和抑制劑商購自化妝品材料供應(yīng)商或化學(xué)公司例如Aldrich或International Flavors andFragrances。
2.方法2.1 RPE微粒體的分離(改進自J.C.Saari & D.L.Bredberg，″視網(wǎng)膜色素上皮中CoA和非CoA依賴的視黃醇酯化作用″，J.Bill.Chem.263，8084-8090(1988))。
50g冷凍的除去視網(wǎng)膜和房水的對切牛眼杯得自W.L.LawsonCo.，Lincoln，NE，U.S.A。將眼睛冷凍過夜并用鑷子揭去有色的虹膜。各眼杯用2×0.5mL冷的緩沖液(0.1M PO4/1mM DTT/0.25M蔗糖，pH7)洗滌，用人造刷子或橡膠淀帚擦洗掉深色細胞。將該細胞懸浮液加入到虹膜并在燒杯中用聚四氟乙烯攪拌棒攪拌數(shù)分鐘。該混懸液經(jīng)粗濾器(Spectra/Por 925μl孔徑聚乙烯篩)過濾除去大顆粒，并且所得深色混懸液用帶有馬達驅(qū)動的聚四氟乙烯均化器的Glas-Col均化。將細胞勻漿離心在20,000g(Sorvaal RC-5B型離心機，帶有SS34轉(zhuǎn)鼓，在2.5×10cm管中，14,000RPM)下離心30分鐘。所得上清液在150,000g(Beckman L80型超速離心機，帶有SW50.1轉(zhuǎn)鼓，在13×51mm管中，40,000RPM)下進一步離心60分鐘。所得小顆粒用Heat Systems Ultrasonics Inc.的W185D型Sonifier細胞破裂器分散在5mL 0.1M PO4/5mM DTT，pH7緩沖液中，并且所得微粒體分散體等分在小管中并且儲存在-70℃下。微粒體的蛋白濃度是通過BioRad染料結(jié)合試驗、利用BSA作為標準來測定。
2.2大鼠肝臟微粒體的分離(R.Martini & M.Murray，″在大鼠肝臟微粒體視黃酸4-羥基化作用中的P450 3A酶的參與″，ArchivesBiochem.Biophys.303，57-66(1993))。
將約6g的冷凍大鼠肝臟(由Accurate Chemical and ScientificCorp.提供的Harlan Sprague Dawley大鼠得到)在3體積的0.1M三羥甲基氨基甲烷/0.1M KCl/1mM EDTA/0.25M蔗糖，pH7.4緩沖液中用Brinkmann Polytron均化。所得的組織混懸液進一步在上述馬達驅(qū)動的聚四氟乙烯均化器中均化。所得勻漿依次在10,000g下離心30分鐘，在20,000g下離心30分鐘和在30,000g下離心15分鐘，并且所得上清液在105,000g下超速離心80分鐘。小顆粒在約5mL的上述0.1M PO4/0.1mM EDTA/5mM MgCl2，pH7.4緩沖液中超聲并在-70℃下保存為等份試樣。蛋白濃度按照上述方法測定。
2.3 ARAT和LRAT活性的試驗(鑒定B1)下列方法是J.C.Saari & D.L.Bredberg，″牛視網(wǎng)膜色素上皮微粒體的ARAT & LRAT活性″，Methods Enzymol.190，156-163(1990)中所述方法的一個改進。制備下面的緩沖液并儲藏在4℃下0.1M PO4/5mM二硫代蘇糖醇，pH 7.0(PO4/DTT)。在試驗當(dāng)天，每毫升緩沖液加入2mg BSA，得到PO4/DTT/BSA工作緩沖液。1mM視黃醇底物在乙腈中制備并保藏在安瓿瓶中氮氣和-20℃下。制備在工作緩沖液內(nèi)的4mM棕櫚酰-CoA溶液(等份保藏)和在乙醇中的4mM二月桂酰磷脂酰膽堿溶液并且儲藏在-20℃下。抑制劑制備成在H2O、乙醇、乙腈或DMSO中的10mM儲備溶液。用含50μg/ml丁基化羥基甲苯(BHT)的純乙醇制備終止液，并且將含有50μg/mL BHT的己烷溶液用于萃取。
向2英錢小玻璃瓶中按照下面順序加入PO4/DTT/BSA緩沖液達到500μL的總體積，5μL?；w(4mM棕櫚酰-CoA和/或二月桂酰磷脂酰膽堿)，5μL抑制劑或溶劑空白(10mM儲備或進一步的稀釋液)，隨后加入約15μg的RPE微粒體蛋白(約15μL的約1mg/mL微粒體蛋白等份)。溫育5分鐘。在37℃下使反應(yīng)溫度平衡且隨后加入5μl的1mM視黃醇。蓋上瓶子，渦旋5秒且在37℃下溫育30-90分鐘。加入0.5mL乙醇/BHT終止該反應(yīng)。加入3mL己烷/BHT萃取類維生素A，渦旋該管數(shù)秒數(shù)次且在低速下離心5分鐘以加快分離各層。除去己烷上層加入到潔凈的瓶中，并且用另一份3mL己烷/BHT按照上述方法再次萃取水層。合并己烷層且通過在37℃氮氣流下在熱鋁塊上干燥蒸發(fā)己烷。干燥的殘余物儲藏在-20℃下直至HPLC分析。通過如下積分HPLC信號，分別定量分析棕櫚酸視黃基酯和月桂酸視黃基酯的量，得出ARAT和LRAT活性。
注意溫育溶液含有40μM?；w，100/μM或更少的抑制劑，10μM視黃醇，約30μg/mL微粒體蛋白，和約0.1M PO4，pH7/5mM DTT/2mg/mL BSA。加入視黃醇后的所有步驟在黑暗或琥珀光下進行。
2.4視黃醇脫氫酶活性的試驗(鑒定B2)制備下列儲備液50mM KH2PO4，pH7.4緩沖液，無菌過濾。
10mM在DMSO中的全反式視黃醇(Sigma R7632)。
200mM煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸鈉鹽(NADP)(Sigma N0505)在無菌水中。
40mM試驗化合物在適當(dāng)溶液(水，緩沖液，乙醇，氨仿或DMSO)中。
大鼠肝臟微粒體在50mM KH2PO4，pH7.4緩沖液(4μg/μl)中的1∶10稀釋液。
在帶有螺旋蓋的2英錢小玻璃瓶中按照次序加入緩沖液，達到400μl的終體積，25μl稀釋微粒體(最終＝100μg)-用煮沸的微粒體作為對照并且用正常微粒體用于試驗樣本。
4μl的200mM NADP(最終＝2mM)1μl的40mM試驗化合物(最終＝100μM)8μl的10mM視黃醇(最終＝200μM)小瓶在37℃的振搖水浴中溫育45分鐘。向各瓶中加入500μl冰冷乙醇終止該反應(yīng)。用冰冷己烷(2.7ml/次萃取)萃取類維生素A2次。在第一次萃取過程中向各瓶中加入乙酸視黃基酯(5μl的900μM儲備液)作為檢測各樣本中萃取效率的手段。將樣本渦旋10秒，之后在1000rpm、5℃下在Beckman GS-6R離心機中輕微離心5分鐘。每次萃取之后將含類維生素A的己烷上層與水層分離置于潔凈的2英錢小瓶中。在氮氣的細流下蒸發(fā)己烷。干燥的殘余物保藏在-20℃下直至HPLC分析。
2.5視黃醛還原酶活性的試驗(鑒定B3)用下列替代品按照上述方法制備所有儲備液10mM全反式視黃醛(Sigma R2500)在DMSO中-代替視黃醇。
200mM煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，還原形式，四鈉鹽(NADPH)(SigmaN7505)在無菌水中-代替NADP。
在帶有螺旋蓋的2英錢小玻璃瓶中，按照順序加入下列緩沖液，達到400μl的終體積。
25μl稀釋微粒體(最終＝100μg)-用煮沸的微粒體作為對照并且用正常微粒體用于試驗樣本。
4μl的200mM NADPH(最終＝2mM)1μl的40mM試驗化合物(最終＝100μM)3μl的10mM視黃醛(最終＝75μM)遵照如上述相同的溫育和萃取方法。
2.6 CRABPII拮抗劑(鑒定B4)2.6.1.CRABPII的合成a.表達體系將基因CRABPII克隆于pET 29a-c(+)質(zhì)粒(Novagen)?？寺〉幕蚴窃趶娛删wT7轉(zhuǎn)錄和翻譯信號的控制下。T7聚合酶的來源是由宿主細胞大腸桿菌BLR(DE3)pLysS(Novagen)提供。后者在lacUV5的控制下，在IPTG存在的誘導(dǎo)下，具有T7聚合酶的染色體副本。
所述的質(zhì)粒按照制造商方案(Novagen)通過轉(zhuǎn)化作用轉(zhuǎn)移到大腸桿菌BLR(DE3)pLysS細胞中。
b.引入將轉(zhuǎn)化細胞的過夜培養(yǎng)物以1∶100稀釋到含50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素的2×YT中。在37℃下振搖時細胞生長，直至在600nm下的OD達到0.6-0.8。隨后加IPTG至1mM的終濃度并且該培養(yǎng)物繼續(xù)培養(yǎng)2小時。通過在5000g下室溫離心10分鐘收獲細胞。小顆粒儲藏在-20℃下。
2.6.2.純化按照Norris和Li，1997所述方法進行純化。
a.細胞溶解使冷凍的小顆粒在室溫下融化并再懸浮在1-2個小顆粒體積的新制細胞溶解緩沖液(50mM Tris-HCl，pH8，10％(w/v)葡萄糖，1mMEDTA，0.05％(w/v)疊氮化鈉，0.5mM DTT，10mM MnCl2，2.5mM苯基甲基磺酰氟，2.5mM芐脒，6yg/mL DNase)中。溶胞產(chǎn)物在室溫下溫育30分鐘。通過超聲(10,000psi下六個30秒脈沖交替以在冰上的5個30秒延遲)進行進一步溶胞。通過在15000rpm和4℃下離心1小時除去溶胞產(chǎn)物的不溶性部分并將上清液保藏在-20℃下。
b.在Sephacryl S300上的凝膠過濾室溫下將步驟a.的上清液加載到sephacryl S-300(Pharmacia)的2.5×100cm柱上。洗脫緩沖液是20mM Tris-HCl，pH8，0.5mM DTT，0.05％疊氮化鈉(緩沖液A)。流速是2mL/分鐘。收集的2-mL餾份在280nm下檢測其紫外吸光度。呈現(xiàn)峰的餾份通過SDS-page測試出CRABPII的存在。
c.陰離子交換色譜2mL的含CRABPII的凝膠過濾餾份加載在季胺陰離子交換柱FPLC(快速蛋白液體色譜)型monoQ(Pharmacia)上。CRABPII用由100％緩沖液A-30％緩沖液B的梯度緩沖液(100％緩沖液B＝緩沖液A+250mM NaCl)在室溫下20分鐘內(nèi)洗脫。每分鐘收集1mL餾分。再次通過SDS page檢測CRABPII的存在。將CRABPII儲藏在4℃下，之后用帶有小瓶平臺附件的Micromodulyo 1.5K(Edwards High VacuumInternational)冷凍干燥。將干燥的樣本保存在室溫下直至其用于結(jié)合試驗。
d.CRABPII存在的檢測CRABPII的表達和純化利用變性SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)分析在7-15％聚丙烯酰胺凝膠(Biorad)上驗證。將10μL樣本與10μL的2×加載緩沖液(100mM Tris-HCl pH6.8，4％SDS，0.2％BPB，20％甘油，1mM DTT)混合并且通過加熱(80℃下2分鐘)變性。樣本加載在凝膠上，該凝膠浸漬在1×Tris-甘氨酸緩沖液(Biorad)中，并且室溫下施加恒定電流(25mA)1小時。用考馬斯藍染色之后，根據(jù)用基準點(Benchmark)預(yù)染色蛋白梯(Gibco BRL)測定的分子量鑒定蛋白。
用蛋白質(zhì)印跡法確定CRABPII的存在。在SDS-PAGE上分離的蛋白質(zhì)用Biorad盒轉(zhuǎn)移到Immobilon-P轉(zhuǎn)移膜(Millipore)上。轉(zhuǎn)移發(fā)生在1×Tris-甘氨酸緩沖液(Biorad)+10％甲醇中。施加3小時電流(60mA)使蛋白遷移通過該膜。此后，該膜用在1×TBS中的5％干乳室溫下封阻1小時，并在同樣的緩沖液中4℃下過夜探測CRABPII(小鼠反克隆5-CRA-B3的1/1000稀釋液)的初級抗體。次日，該膜用PBS(3×5分鐘)洗滌且隨后用次級抗體，過氧化物酶偶聯(lián)的抗小鼠抗體(ECLTM，Amersham)的1∶2000稀釋液在室溫下溫育1小時。該膜用1×PBS(3×5分鐘)洗滌并且用ECL檢測試劑盒按照制造商說明(Amersham)來測定蛋白質(zhì)。
純化CRABPII的濃度用BSA試劑盒(Pierce)測定。
2.6.3.放射性結(jié)合試驗220pmol的CRABPII在20mM Tris-HCl緩沖液pH 7.4中與15pmol的放射性全反式視黃酸(NEN)以70μl的總體積溫育。對于競爭性試驗，向混合物中過量加入另一種配體(6670∶1,670∶1或70∶1)。該反應(yīng)在室溫下避光進行1小時。為了從結(jié)合的全反式視黃酸中分離出未結(jié)合的全反式視黃酸，使用6kD截止的微量色譜柱(Biorad)。用Microplex歧管按照制造商的說明(Pharmacia)棄去貯存緩沖液。將樣本加載在柱上并且在重力下在30分鐘內(nèi)進行分離。濾液中出現(xiàn)與CRABPII結(jié)合的視黃酸(″RA″)，而柱中保留了游離的RA。通過閃爍計數(shù)器測定濾液的放射性。
2.7 NADPH依賴性視黃酸氧化作用的試驗(鑒定B5)下列方法是R.Martini & M.Murray，″大鼠肝臟微粒體視黃酸4-羥基化作用中P450 3A酶的參與″，Archives Biochem.Biophys.303，57-66(1993)所述方法的一個改進。制備下列試驗緩沖液并儲存在4℃下0.1M PO4/0.1mM EDTA/5mM MgCl2，pH7.4。在試驗的當(dāng)天，在緩沖液中制備60mM NADPH溶液。按照上述方法制備抑制劑儲備液、酸化的乙醇/BHT終止液，和己烷/BHT。1mM視黃酸工作溶液是通過用乙醇稀釋15mM儲備液(在DMSO中)來制成的。
向2英錢小瓶中依次加入下列試驗緩沖液得到500μL的終體積，20μL 60mM NADPH，5μL抑制劑或溶劑空白，隨后加入約2mg的大鼠肝臟微粒體蛋白。在37℃下溫育5分鐘，隨后加入5μL的1mM視黃酸工作溶液。
在37℃下繼續(xù)溫育60分鐘-瓶子不加蓋，因為該氧化過程除NADPH以外還需要分子O2。按照上述方法用酸化的乙醇/BHT終止并用己烷/BHT萃取。按照下述方法通過積分HPLC信號定量分析快速洗脫的極性視黃酸代謝產(chǎn)物(推測是4-氧代視黃酸)。
注意加入視黃酸之后的所有步驟是在避光或在琥珀色光線下進行。最終的培育溶液含有2.4mM NADPH，100μM或更少的抑制劑，10μM視黃酸，約4mg/mL大鼠肝臟微粒體蛋白和約0.1M PO4/0.1mM EDTA/5mM MgCl2。
單個類維生素A的HPLC分析通過HPLC定量的類維生素A的樣本是通過將各瓶中的殘余物用100μL的甲醇溶解來制成。將該溶液轉(zhuǎn)移到150μL玻璃錐形管內(nèi)，該玻璃錐形管置于1mL套瓶中，蓋緊并且置于Waters 715自動取樣器中。立刻注射60μL的等份試樣并分析類維生素A的含量。
該色譜儀由Waters 600梯度控制器/泵、Waters 996光電二極管陣列檢測儀和Waters 474掃描熒光檢測器組成。類維生素A分析采用兩種HPLC方案。對于ARAT和LRAT試驗，視黃醇和視黃醇酯的分離是采用Waters 3.9×300mm C18 Novapak反相分析柱和Waters SentryNovapak C18保護柱使用調(diào)至流速為1mL/分鐘的80∶20(v/v)甲醇/THF等度流動相洗脫10分鐘而進行的。在325nm下測定洗脫液的吸光度并在325ex/480em下測定熒光。較短的Waters 3.9×150mm C18Novapak反相分析柱和Waters Sentry NovaPak C18保護柱用于分離用于視黃醇和視黃酸氧化試驗的視黃酸和醇，試驗采用A.B.Barua，″水溶性化合物Gluconomides的分析″，Methods Enzymol.189，136-145(1990)所述梯度體系的一個改進方法。該體系由68∶32(v/v)甲醇/含10mM乙酸銨的水至4∶1(v/v)甲醇∶二氯甲烷的20分鐘線性梯度組成，并有5分鐘以1mL/分鐘的流速的保持。在300nm-400nm監(jiān)測柱洗脫液。
這些方案的選擇是基于各試驗清晰拆分有關(guān)的視黃酸、醇、醛、和/或酯的能力和分離的相對速度。單個類維生素A的HPLC鑒定是基于未知峰的保留時間與已知確定類維生素A標準物的峰的保留時間的精確匹配以及未知峰相對于已知確定類維生素A的UV光譜分析(300-400nm)。
適用于本發(fā)明的增效劑包括但不限于下表B1-B5所列的增效劑。
ARAT/LRAT抑制劑(B1)種類 化合物 ％抑制 總TG ％抑制 ％抑制 ％抑制 ％抑制總TG(IC50) ARAT ARAT LRAT LRAT(-ROH/RE) (10μM) (100μm) (10μm) (100μm)類胡蘿卜素藏花酸 3.75E-05 15％ 34％ 015％脂肪酸酰胺& 乙?；拾贝?.78E-06 19％+/-1262％+/-1110％+/-1050％+/-18其它表面活性劑脂肪酸酰胺& C13β-羥基酸/酰胺 17％28％ 25％其它表面活性劑脂肪酸酰胺& 蓖麻油MEA 3.25E-05其它表面活性劑脂肪酸酰胺& 椰油酰胺丙基甜菜堿 25％其它表面活性劑脂肪酸酰胺& 椰油羥乙基咪唑啉2.84E-0768％ 68％其它表面活性劑脂肪酸酰胺& 椰油酰胺-MEA(或椰油基 11％13％ 34％其它表面活性劑一乙醇酰胺)脂肪酸酰胺& 甘油-PCA-油酸酯 41％+/-6 58％+/-2其它表面活性劑種類 化合物 ％抑制 總TG ％抑制 ％抑制 ％抑制 ％抑制總TG(IC50) ARAT ARAT LRAT LRAT(-ROH/RE) (10μM) (100μm) (10μm) (100μm)脂肪酸酰胺& 己酰胺 20％其它表面活性劑脂肪酸酰胺& 己酰基鞘氨醇9.99E-0528％+/-4 37％+/-9其它表面活性劑脂肪酸酰胺& 羥乙基-2-羥基-C12酰胺 3.29E-0535％ 35％其它表面活性劑脂肪酸酰胺& 羥乙基-2-羥基-C16酰胺 25％ 30％其它表面活性劑脂肪酸酰胺& 月桂?；“彼? 20％其它表面活性劑脂肪酸酰胺& 利多卡因12％ 0其它表面活性劑脂肪酸酰胺& 亞油酰胺-DEA(或亞油酰 59％ 12％+/-1343％+/-3 11％+/-9 51％+/-15其它表面活性劑二乙醇酰胺)
種類 化合物 ％抑制 總TG ％抑制 ％抑制 ％抑制 ％抑制總TG(IC50) ARAT ARAT LRAT LRAT(-ROH/RE) (10μM) (100μm) (10μm) (100μm)脂肪酸酰胺& 亞油酰胺-MEA(或亞 1.61E-05 14％ 35％ 20％+/-8 35％其它表面活性劑油酰一乙醇酰胺)脂肪酸酰胺& 亞油酰胺丙基二甲基 69％+/-18 75％+/-4其它表面活性劑胺脂肪酸酰胺& 亞油甲氨64％+/-1543％+/221其它表面活性劑脂肪酸酰胺& 肉豆蔻酰肌氨酸 41％+/-1411％+/-11其它表面活性劑脂肪酸酰胺& 油酰甜菜堿 2.80E-0547％其它表面活性劑脂肪酸酰胺& 棕櫚酰胺-MEA 6％ 23％ 12％ 33％其它表面活性劑脂肪酸酰胺& 硬脂基羥基酰胺 10％ 10％其它表面活性劑脂肪酸酰胺& Utrecht-1 21％ 43％ 54％ 51％ 48％+/-6其它表面活性劑種類 化合物 ％抑制 總TG ％抑制 ％抑制 ％抑制 ％抑制總TG(IC50) ARAT ARAT LRAT LRAT(-ROH/RE) (10μM) (100μm) (10μm) (100μm)脂肪酸酰胺& Utrecht-2 3.47E-06 42％ 83％+/-9 51％ 92％+/-3其它表面活性劑黃烷類柑桔黃素33％ 14％香料 烯丙基α-紫羅蘭酮 16％+/-1422％+/-2317％+/-1036％/-7香料 α-二氫大馬酮 3.35E-04 67％+/-2783％+/-1287％+/-6 98％+/-1香料 α＝紫羅蘭酮9.27E-0445％+/-27 49％+/-30香料 α-甲基紫羅蘭酮 67％ 77％香料 α-松油醇 26％ 25％香料 β-二氫大馬酮 45％ 84％ 52％ 92％香料 Brahmanol 70％ 75％香料 大馬酮 23％ 70％ 29％ 79％香料 δ-二氫大馬酮 58％ 87％ 64％ 95％
種類 化合物 ％抑制 總TG ％抑制 ％抑制 ％抑制 ％抑制總TG(IC50) ARAT ARAT LRAT LRAT(-ROH/RE) (10μM) (100μm) (10μm) (100μm)香料 二氫α-紫羅蘭 13％ 18％香料 乙基Saffranate 51％ 49％香料 葑醇12％ 4％香料 γ-甲基紫羅蘭酮 21％ 38％香料 異丁基紫羅蘭酮 8％ 45％香料 異環(huán)香葉醇 18％ 16％香料 異二氫大馬酮80％ 92％香料 Lyral 1.27E-0476％ 71％香料 檀香23％ 12％香料 檀香醇 15％ 43％香料 Timberol34％ 33％香料 吐納麝香(Tonalid) 50％ 33％香料 特拉賽麝香 41％ 21％(Traseolid)其他 椰油三甲基銨-C1 27％其他 烏索酸(Urosolic 1.46E-0621％ 28％acid)非環(huán)狀香料檸檬醛 20％非環(huán)狀香料香茅醇 30％ 0非環(huán)狀香料法呢醇 9.35E-05 23％+/-1853％+/-1810％+/-7 53％+/-19非環(huán)狀香料香葉醇 7.83E-03 13％ 32％非環(huán)狀香料香葉草基香葉醇 38％+/-1281％+/-6 16％+/-9 77％+/-13非環(huán)狀香料里那醇(Linatool)28％ 0
種類 化合物 ％抑制 總TG ％抑制 ％抑制 ％抑制 ％抑制總TG(IC50) ARAT ARAT LRAT LRAT(-ROH/RE) (10μM) (100μm) (10μm) (100μm)非環(huán)狀香料壬二烯醛20％(Nonadieneal)非環(huán)狀香料假紫羅蘭酮 12％ 37％磷脂 二辛基磷脂酰乙醇胺 23％ 50％+/-2 017％+/-17脲二甲基咪唑烷酮 22％脲咪唑烷基脲 35％
視黃醇脫氫酶激活劑(B2)種類 化合物 ％增高視黃醇脫氫酶磷脂 磷脂酰膽堿 增高21％磷脂 鞘磷脂 增高26％視黃醛還原酶抑制劑(B3)種類 化合物 總TG(IC50) ％抑制視黃醛還原酶醛香草醛 9.70E-03 6％脂肪酸花生酸 20％脂肪酸花生酸 49％脂肪酸亞油酸 1.63E-04 62％+/-2脂肪酸亞麻酸 1.34E-04 54％+/-16脂肪酸肉豆蔻酸1.72E-05 26％其他 安吖啶 6.26E-06 22％+/-8其他 卡貝索酮3.61E-07 26％+/-2其他 甘草次酸8.64E-06 38％+/-1磷脂 磷脂酰乙醇胺 37％CRABPII拮抗劑(B4)種類 化合物 總TG(IC50) ％抑制CRABPII脂肪酸反油酸 6.50E-05 ＞50％脂肪酸十六碳二酸 1.30E-04 ＞50％脂肪酸12-羥基硬脂酸 2.91E-05 ＞50％脂肪酸異硬脂酸6.88E-05 ＞50％脂肪酸亞麻籽油 ＞50％
視黃酸氧化抑制劑(B5)種類 化合物 總TG(IC50) ％抑制 ％抑制視黃酸 視黃酸(10μM)(100μM)咪唑 聯(lián)苯芐唑 89％ 100％咪唑 氯咪巴唑4.47E-06 80％ 92％咪唑 克霉唑76％ 85％咪唑 益康唑88％ 100％咪唑 酮康唑 1.85E-07 84％ 84％咪唑 咪康唑 2.78E-07 74％ 86％脂肪酸酰胺&月桂基羥乙基咪唑啉 4.67E-07其它表面活性劑脂肪酸酰胺&油基羥乙基咪唑啉3.02E-05 54％ 80％其它表面活性劑黃烷類 槲皮酮 6.29E-05 40％ 74％香豆素 香豆素喹啉 (7H-苯并咪唑[2，1-a]8.59E-07苯并[de]-異喹啉-7-酮喹啉 羥基喹啉(2-羥喹啉) 3.64E-04喹啉 美替拉酮(2-甲基-1，2-47％二-3-吡啶基-1-丙烷在下述轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶試驗中優(yōu)選的增效劑或其組合在10mM的濃度時至少抑制50％的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(此后稱為″Tgase″)。
TGase試驗
轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶試驗轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶試驗和角化細胞分化在表皮的末期分化過程中，在細胞四周的內(nèi)表面上形成一個15nm厚的蛋白層，稱作角化膜(CE)。該CE由許多不同的蛋白組成，這些蛋白在至少兩種表皮中表達的不同轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TGases)的作用下、通過形成Nε-(γ-谷氨?；?賴氨酸異二肽鍵交聯(lián)在一起。Tgase I大量表達在表皮的分化層中，尤其是顆粒層中，但在未分化的基底表皮中不存在。因此TGase I是表皮角質(zhì)細胞分化的有效標記并且TGase I水平高表示分化狀態(tài)較高?；贓LISA的TGase I試驗，使用TGase I抗體，用于評估在下列實施例中的培養(yǎng)角質(zhì)細胞的分化狀況。
將角質(zhì)細胞(按照上述方法培養(yǎng))以4,000-5,000細胞/孔的密度鋪板在96孔平板中200μl培養(yǎng)基內(nèi)。培養(yǎng)2-3天后，或者直至細胞的約50％融合后，將該培養(yǎng)基更換為含有試驗化合物的培養(yǎng)基(每個試驗五份)。令細胞繼續(xù)培養(yǎng)96小時，此后抽出培養(yǎng)基并將平板保存在-70℃下。從冷凍器取出平板，并且細胞用200μl的1×PBS洗滌兩次。細胞在室溫下(R/T)與TBS/5％BSA(洗滌緩沖液，牛血清白蛋白)溫育。此后加入TGase初級抗體50μl用洗滌緩沖液1∶2000稀釋的單克隆抗Tgase I Ab B.C.。該初級抗體在37℃下溫育2小時且隨后用洗滌緩沖液漂洗6次。此后細胞與50μl用洗滌緩沖液1∶4,000稀釋的二級抗體(Fab片段，得自Amersham的過氧化物酶偶聯(lián)的抗小鼠IgG)在37℃下溫育2小時，隨后用洗滌緩沖液漂洗3次。用洗滌緩沖液漂洗之后，該細胞用PBS漂洗3次。為了顯色，在R/T和避光(在鋁箔下)下，細胞與100μl底物溶液(4mg鄰苯二胺和3.3μl 30％H2O2在10ml 0.1M檸檬酸緩沖液pH 5.0中)溫育整5分鐘。通過加入50μl的4N H2SO4終止該反應(yīng)。在96孔平板UV分光光度計中在492nm下讀取樣本的吸光度。在5份重復(fù)試樣中，4份用兩種抗體處理，第5份用作Tgase背景對照。測定TGase水平且表示為對照百分比。
測定出轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶且在表B1-B5中以下列之一表示(i)％(增效劑+視黃醇抑制/對照抑制)-％(ROH抑制/對照抑制)，其測定出增效劑+視黃醇引起的TGase抑制作用比視黃醇單用的加和效果，或(ii)IC50值，當(dāng)多個增效劑濃度的抑制作用被測試時-它提供增效劑濃度，該濃度與10-7M的恒定視黃醇濃度一起，抑制50％的TGase。
增效劑的最佳組B1化合物
B2化合物
B3化合物
B4化合物
B5化合物
其它任選的成分結(jié)晶脂肪酸結(jié)晶脂肪酸是任選的成分。優(yōu)選地，該脂肪酸含有12-22個碳原子，因為此類酸便宜且是美學(xué)上最可接受的。首選的脂肪酸是硬脂酸。此處所用的術(shù)語″酸″不排除脂肪酸的鹽的存在，這取決于最終組合物的pH。例如，可以存在鈉、鉀或銨鹽。鹽量包括在脂肪酸的量內(nèi)。本發(fā)明組合物優(yōu)選含有至少0％的脂肪酸，首選0.1％-18％。
本發(fā)明組合物首選進一步含有選自抗氧化劑、還原劑、螯合劑及其混合物的成分來提高類維生素A的穩(wěn)定性。這些組分提供附加水平的對類維生素A氧化作用的防護效果。本發(fā)明制劑的抗氧化劑、還原劑和螯合劑的常用實例可以參見CTFA International CosmeticIngredient Dictionary第4版，The Cosmetic，Toiletry，andFragrance Association，Inc.，Washington，D.C.，1991。
優(yōu)選的還原劑是亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、硫代亞硫酸鈉或其它硫醇，例如硫代甘油、硫脲、巰基乙酸、半胱氨酸等。優(yōu)選的抗氧化劑是rac-6-羥基-2，5，7，8-四甲基色滿-2-甲酸(trolox)、沒食子酸丙酯、三羥基苯甲酸正丙酯、叔丁基對苯二酚和丁基化羥基甲苯(BHT)、丁基化羥基苯甲醚(BHA)、生育酚乙酸酯、棕櫚酸抗壞血酸酯、氫醌、二丁基氫醌等。
螯合劑的適當(dāng)實例包括，但不限于，EDTA，檸檬酸，酒石酸，有機氨基膦酸類和有機膦酸組分，包括某些Monsanto制造的市售DequestTM類化合物。優(yōu)選1-羥基乙烯，(1.1-二膦酸)。
有機氨基膦酸是含有至少一個膦酸基團和至少一個氨基的有機化合物。在此所用的適當(dāng)有機氨基膦酸組分包括氨基亞烷基多(亞烷基膦酸)和次氮基三亞甲基膦酸。此類有機氨基膦酸組分的實例包括某些Monsanto制造的市售DequestTM類化合物。
優(yōu)選氨基三(亞甲基膦酸)(Dequest 2006)、二亞乙基三胺五(亞甲基膦酸)和1，6-己二胺四(亞甲基膦酸)。
在此所用的其它適當(dāng)附加重金屬離子多價螯合劑包括次氮基三乙酸和多氨基羧酸類，例如亞乙基二氨基四乙酸或亞乙基三胺五乙酸。
在此使用的其它適當(dāng)附加重金屬離子多價螯合劑是亞氨基二乙酸衍生物，例如2-羥乙基二乙酸或甘油基亞氨基二乙酸。
抗氧化劑在本發(fā)明組合物中的含量是0.01-10％，優(yōu)選0.1-5％，首選0.2-4％。還原劑在本發(fā)明組合物中的含量是0.01-10％，優(yōu)選0.1-5％，首選0.2-4％。螯合劑在本發(fā)明組合物中的含量是0.01-1％，優(yōu)選0.05-0.5％，首選0.05-0.3％。
尤其優(yōu)選的組合物含有0.1％亞硫酸氫鹽、0.7％Dequest 2006和0.2％BHT。
不同類型的活性成分可以存在于本發(fā)明的化妝品組合物中?；钚詣┒x為除潤膚劑和僅僅改善組合物的物理特性的組分之外的皮膚或毛發(fā)有益劑。雖然不限于這種類型，但一般實例包括防曬劑、皮膚增亮劑、曬褐劑。
防曬劑包括阻斷紫外線常用的物質(zhì)。舉例化合物是PABA、肉桂酸和水楊酸的衍生物。例如，可以使用甲氧基肉桂酸辛酯和2-羥基-4-甲氧基二苯酮(也稱作羥苯甲酮)。甲氧基肉桂酸辛酯和2-羥基-4-甲氧基二苯酮分別在商標Parsol MCX和Benzophenone-3下出售。
防曬劑在乳液中的精確用量可以根據(jù)對太陽UV輻射的所需保護程度而變。
另一優(yōu)選的任選成分選自必需脂肪酸(EFA)，即那些所有細胞的質(zhì)膜形成所必需的脂肪酸，在角質(zhì)細胞中EFA缺少使細胞過度增殖。EFA的補充糾正這種現(xiàn)象。EFA也促進表皮的脂質(zhì)生物合成并為表皮的屏障形成提供脂質(zhì)。必需脂肪酸優(yōu)選選自亞油酸、γ-亞麻酸、高-γ-亞麻酸、columbinic acid、二十碳-(n-6，9，13)-三烯酸、花生四烯酸、γ-亞麻酸、二十碳五烯酸、己酸及其混合物。
其它任選成分可以包括著色劑、遮光劑和顏料(例如二氧化鈦、二氧化硅)和香精。這些物質(zhì)的含量可以在組合物的0.001％-20％重量的范圍內(nèi)任意變化。
化妝上可接受的賦形劑本發(fā)明的組合物還可以含有化妝上可接受的賦形劑充當(dāng)組合物中活性成分的稀釋劑、分散劑或載體，使它們在組合物涂敷在皮膚或毛發(fā)上時易于分布。
除水之外的賦形劑可以包括液體或固體軟化劑、溶劑、保濕劑、增稠劑和粉末。特別優(yōu)選的非水載體是聚二甲基硅氧烷和/或聚二甲基苯基硅氧烷。本發(fā)明的聚硅氧烷可以是粘度在25℃下為約10-0,000,000厘沲的那些。尤其理想的是低粘度和高粘度聚硅氧烷的混合物。這些聚硅氧烷購自General Electric公司，商標為Vicasil、SE和SF以及Dow Corning公司的200和550系列。本發(fā)明組合物可以使用的聚硅氧烷的量是在組合物重量的5-95％、優(yōu)選25-90％的范圍內(nèi)。
組合物的應(yīng)用本發(fā)明的組合物主要用來作為一種局部涂敷在人體皮膚或毛發(fā)上的產(chǎn)物，尤其是作為調(diào)理和平滑皮膚的試劑，并且預(yù)防或減少皺紋皮膚或老化皮膚或干燥毛發(fā)的出現(xiàn)。
在使用中，從適當(dāng)容器或涂敷器取少量的組合物，例如1-5ml，涂敷在皮膚或毛發(fā)的暴露區(qū)域，并且如果必要，隨后用手或手指或適當(dāng)裝置鋪展和/或擦抹到皮膚或毛發(fā)內(nèi)。
產(chǎn)品形式和包裝所述的組合物可以包裝在與其粘度和用戶使用目的匹配的適當(dāng)容器內(nèi)。例如，組合物可以簡單貯藏在非變形瓶或擠壓容器中，如管或有蓋子的廣口瓶中。
本發(fā)明也提供一種含有上述定義的化妝可接受組合物的密封容器。
下列具體實施例進一步舉例說明本發(fā)明，但本發(fā)明不局限與此。
實施例1.所有制備在室溫(20-25℃)下用高架攪拌器(1000-2000rpm)進行。
2.在1000-1500rpm下混合含水組分(水，甘油，Pemulen，和防腐劑)在一起，直至Pemulen完全溶劑化。
3.在獨立容器中，在1000rpm下混合各種油(硅油和/或其它任選的油)和彈性體。
4.將BHT和視黃醇加入到步驟3的油混合物中；在1000rpm下混合5-10分鐘。
5.將步驟2中的水相加入到步驟4的油相中，在1000-1500rpm下混合5-10分鐘。
6.最后加入TEA，在1500-2000rpm下混合直至充分混合，5-10分鐘。
注意抗氧化劑例如Dequest 2066，亞硫酸氫鈉，和Na2CO3加入到步驟2的水相中。將Transcutol加入到步驟3的油相中。
B.視黃醇穩(wěn)定性將原型儲存在50℃的安瓿玻璃罐中。從同一罐中在時間為0、1、2、3、4、6、8和12周時取出等分試樣用于視黃醇穩(wěn)定性測定。視黃醇穩(wěn)定性用HPLC測定；各樣本一式三份進行分析。
樣本原型的視黃醇穩(wěn)定性數(shù)據(jù)如下面3個表所示。表1詳列硅油中含有視黃醇的制劑。表2詳列Cetiol油中含視黃醇的制劑。表3詳列在其它油中含有視黃醇的制劑。
表1
表2
表3
雖然本發(fā)明在此描述了一些具體方式，并且參考其某些優(yōu)選實施方式，所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對上述方式進行許多變化、改進和替代，并且這些屬于本發(fā)明請求保護的范圍內(nèi)。所有這些改進和變化屬于本發(fā)明的描述和請求保護的范圍內(nèi)，并且本發(fā)明僅僅由下面權(quán)利要求書的范圍來限定，并且該權(quán)利要求書應(yīng)當(dāng)在合理程度上盡可能廣義地理解。
權(quán)利要求
1.一種水包油乳狀液化妝品組合物，含有(a)溶解在流體油中的類維生素A，(b)聚合乳化劑。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中該組合物還含有約1％-約90％的多元醇保濕劑；
3.權(quán)利要求1的組合物，其中該組合物還含有約0％-約30％的彈性體。
4.權(quán)利要求1的組合物，其中該組合物還含有揮發(fā)性硅油。
5.權(quán)利要求1的組合物，其中該組合物還含有結(jié)晶脂肪酸。
6.權(quán)利要求1的組合物，其中類維生素A的含量至少是該組合物重量的約0.001％。
7.權(quán)利要求1的組合物，其中所述的類維生素A選自視黃酸、視黃醇、視黃基酯、和視黃醛。
8.權(quán)利要求1的組合物，其中所述的類維生素A在25℃時以每約100g的油至少約0.1g的類維生素A的量溶解在所述流體油中。
9.權(quán)利要求1的組合物，其中組合物中類維生素A的半衰期在50℃時至少為約20天。
10.權(quán)利要求1的組合物，還含有類維生素A增效劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含有類維生素A且具有改進的穩(wěn)定性和柔和性的化妝品組合物。尤其優(yōu)選的組合物還含有類維生素A增效劑和多元醇保濕劑。
文檔編號A61K8/06GK1538833SQ01819307
公開日2004年10月20日 申請日期2001年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月22日
發(fā)明者P·錢達, P 錢達, Q·T·－T·法姆, -T 法姆, 林得愉, 賬, 周艷, R·維爾馬, A·利普斯 申請人:荷蘭聯(lián)合利華有限公司