專利名稱：包含一種支持材料和至少一種細(xì)胞調(diào)節(jié)因子和/或細(xì)胞增殖促進(jìn)劑的新型藥物形態(tài)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型藥物形態(tài)，其包含一種支持材料和至少一種細(xì)胞調(diào)節(jié)因子和/或細(xì)胞增殖促進(jìn)劑。
“細(xì)胞調(diào)節(jié)因子”應(yīng)理解為生化介質(zhì)，該介質(zhì)由細(xì)胞分泌并能參與細(xì)胞機(jī)制，例如參與細(xì)胞的發(fā)育、生長(zhǎng)或活化，所述介質(zhì)尤其指細(xì)胞因子、趨化因子及生長(zhǎng)因子，后者尤其優(yōu)選。所述細(xì)胞調(diào)節(jié)因子可以為天自的、合成的或重組的。
“細(xì)胞增殖促進(jìn)劑”應(yīng)理解為一種天然、重組或合成分子，該分子調(diào)節(jié)細(xì)胞調(diào)節(jié)因子的信號(hào)傳輸路徑，并且對(duì)細(xì)胞增殖具有活化作用，一個(gè)實(shí)例為神經(jīng)鞘氨醇磷酸膽堿。
此外，本發(fā)明在作為一種植入片使用方面也具有極高的應(yīng)用價(jià)值，其中，該生物降解性支持材料能夠在入植位置逐漸釋放細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，尤其是生長(zhǎng)因子和/或細(xì)胞增殖促進(jìn)劑。
皮膚損傷的修復(fù)涉及一系列復(fù)雜的細(xì)胞過程，包括傷口的收縮、炎癥細(xì)胞的局部蓄積、血管再生、基質(zhì)細(xì)胞(成纖維細(xì)胞、組織細(xì)胞等)的活化和增殖、細(xì)胞外基質(zhì)(膠原等)的成分的合成及上皮形成。
上述過程在體內(nèi)由不同的細(xì)胞因子、趨化因子及廿烷類調(diào)節(jié)。
上述物質(zhì)包括成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子系列(或FGFs)，該系列目前已知有22種形式；這些因子在對(duì)其靶細(xì)胞的特異性上存在差異，并且其中一些因子，如FGF-1或FGF-2，具有能夠調(diào)節(jié)在傷口愈合中涉及的所有類型的細(xì)胞的生長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)。
另一有價(jià)值的系列為神經(jīng)生長(zhǎng)因子系列(或NGFs)，該系列可參與神經(jīng)組織、神經(jīng)肌肉組織及神經(jīng)上皮組織的再生。
因此，制造出一種能夠用于且留在損傷治療位置、同時(shí)保留其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的刺激活性的藥物形態(tài)具有重大意義。
因此，本發(fā)明涉及一種藥物形態(tài)，其包含一種支持材料和至少一種細(xì)胞調(diào)節(jié)因子和/或細(xì)胞增殖促進(jìn)劑，其特征是以重量計(jì)，支持材料的至少90％，優(yōu)選為至少95％，由一種基于亞甲基丙二酸酯(methylidene malonate)的組合物組成，其包含—以重量計(jì)，0至10％的一種或多種分子式為(I)的亞甲基丙二酸酯 其中—A和B獨(dú)立地為基團(tuán)(a)或(b) 其中，R1和R2獨(dú)立地為線型或分支烷基基團(tuán)，該基團(tuán)具有1至6個(gè)碳原子，n為1至5之間的一個(gè)整數(shù)；—以重量計(jì)，10至90％，且優(yōu)選為50至90％的一種或多種分子量小于或等于6000的亞甲基丙二酸酯寡聚物，且其由分子式為(II)的重復(fù)單元組成 其中，A和B的定義與上文同；以及—以重量計(jì)，10至90％，且優(yōu)選為10至50％的一種或多種分子量大于6000的亞甲基丙二酸酯聚合物，且其由分子式為(II)的重復(fù)單元組成。
“分子量大于6000”應(yīng)特別理解為分子量大于9000，特別是大于12000，尤指大于25000，優(yōu)選大于50000且甚至高達(dá)600000。
在本說明書中，“分子量”應(yīng)理解為聚苯乙烯(PS)等效物的重均分子量Mw，以g/mol表示，并且通過凝膠滲透層析(GPC)且采用經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)聚苯乙烯聚合物校準(zhǔn)的層析裝置進(jìn)行測(cè)量。
根據(jù)其一優(yōu)選的特征，在上文給出的分子式(I)和(II)中—A為基團(tuán)(a)，其中R1為乙基基團(tuán)；以及—B為基團(tuán)(b)，其中R2為乙基基團(tuán)，且n為1。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，以重量計(jì)，該支持材料的至少90％，且優(yōu)選為至少95％由一種基于亞甲基丙二酸酯的組合物組成，其包含—以重量計(jì)，50至90％的一種或多種亞甲基丙二酸酯寡聚物，其分子量小于或等于6000，優(yōu)選為小于或等于3000，且由分子式為(II)的重復(fù)單元組成；以及—以重量計(jì)，10至50％的一種或多種分子量大于6000的亞甲基丙二酸酯聚合物。
根據(jù)其一優(yōu)選的特征，基于亞甲基丙二酸酯的組合物包含
—以重量計(jì)，55至65％的一種或多種亞甲基丙二酸酯寡聚物，其分子量小于或等于3000，尤其是介于300與1000之間，且由分子式為(II)的重復(fù)單元組成；以及—以重量計(jì)，35至45％的一種或多種亞甲基丙二酸酯聚合物，其分子量大于6000，優(yōu)選大于9000，特別是介于12000與25000之間。
其它基于亞甲基丙二酸酯的優(yōu)選組合我包含—以重量計(jì)，40至80％且優(yōu)選為40至60％的一種或多種亞甲基丙二酸酯寡聚物，其分子量小于或等于6000，優(yōu)選小于或等于3000，且由分子式為(II)的重復(fù)單元組成；以及—以重量計(jì)，20至60％且優(yōu)選為40至60％的一種或多種亞甲基丙二酸酯聚合物，其分子量大于6000，優(yōu)選大于9000，更優(yōu)選介于12000與25000之間。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的特征，可用于本發(fā)明之目的的細(xì)胞調(diào)節(jié)因子為生長(zhǎng)因子。優(yōu)選地，生長(zhǎng)因子可從下列因子中選擇，如，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGFs)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)或幾種上述因子的聯(lián)合。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的特征，生長(zhǎng)因子可單獨(dú)使用或以與配體的復(fù)合物使用。實(shí)際上，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子系列與其天然配體(通常存在于組織中，如肝素、硫酸類肝素或硫酸類肝素蛋白聚糖)形成各種復(fù)合物，該類復(fù)合物在生理?xiàng)l件下極為穩(wěn)定。
優(yōu)選使用堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，又稱為FGF-2，作為與硫酸類肝素或硫酸類肝素蛋白聚糖的復(fù)合物。
在上述復(fù)合物中，F(xiàn)GF-2與硫酸類肝素的摩爾比特別為1∶1至1∶20，尤其為1∶1.5至1∶10。
在與硫酸類肝素蛋白聚糖的復(fù)合物的情況中，F(xiàn)GF-2與硫酸類肝素蛋白聚糖可以特別是1∶0.01至1∶0.5的摩爾比存在于所述復(fù)合物中。
本發(fā)明所述的藥物形態(tài)的制備包括將細(xì)胞調(diào)節(jié)因子或細(xì)胞增殖促進(jìn)劑，尤其是生長(zhǎng)因子，單獨(dú)地或以與配體的復(fù)合物的形式引入支持材料中。
支持材料可通過這樣一種方法制備，在該方法中，單體和/或寡聚物和/或聚合物的預(yù)定混合物通過改變反應(yīng)條件而在原位產(chǎn)生。
或者，支持材料可通過對(duì)不同量的單體和/或寡聚物和/或聚合物加以混合來制備—所述寡聚物和聚合物已預(yù)先制備好—以使各組分中的任一組分具有預(yù)定的比例。
然后，將細(xì)胞調(diào)節(jié)因子和/或細(xì)胞增殖促進(jìn)劑的水溶液加入到支持材料中。
或者，若通過將不同量的預(yù)先制備的單體和/或寡聚物和/或聚合物加以混合來獲得支持材料，則可在制備所述支持材料的一個(gè)步驟期間將細(xì)胞調(diào)節(jié)因子和/或細(xì)胞增殖促進(jìn)劑的水溶液加入支持材料中。
在上述兩種情況下，該加入的實(shí)現(xiàn)方式使細(xì)胞調(diào)節(jié)因子和/或細(xì)胞增殖促進(jìn)劑不發(fā)生任何變性，且使其位于該支持材料的表面上和/或結(jié)構(gòu)中。
本發(fā)明的支持材料的特征基本在于，其主要由一種基于亞甲基丙二酸酯的組合物組成，該組合物本身主要由分子量小于或等于6000且優(yōu)選為小于或等于3000的單體和/或寡聚物組成。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選特征，該組合物主要由分子量小于或等于6000的一種或多種寡聚物及分子量大于或等于6000的一種或多種聚合物組成。
這種組合物具有粘度和生物粘附特性，該等特性使其可單獨(dú)地或與其它生物相容的成分混合用于治療真皮和真皮表皮損傷，特別是將本發(fā)明的藥物形態(tài)用作植入片。
另外，這些可在本發(fā)明范圍內(nèi)使用的基于亞甲基丙二酸酯的組合物是可生物降解的并釋放乙醇和羥基乙酸，一般認(rèn)為在所使用的劑量下釋放出的乙醇和羥基乙酸對(duì)生物無毒。該生物降解性對(duì)于生長(zhǎng)因子的釋放，尤其是對(duì)于包含在支持材料的寡聚物或聚合物結(jié)構(gòu)中的生長(zhǎng)因子在要治療的損傷部位的釋放極為有用。
此外，優(yōu)選地，基于亞甲基丙二酸酯的該組合物能夠使細(xì)胞調(diào)節(jié)因子或細(xì)胞增殖促進(jìn)劑在其所用介質(zhì)中保持穩(wěn)定，該穩(wěn)定性是可測(cè)量的，特別是通過在一段時(shí)間內(nèi)保持它們的生物活性并與介質(zhì)中游離的該類型因子的活性進(jìn)行比較來進(jìn)行測(cè)量。
所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員可容易地制備這些基于亞甲基丙二酸酯的組合物，任選地通過在適當(dāng)?shù)娜軇┲袑⑵浞謩e制備的組分(單體、寡聚物、聚合物組分)簡(jiǎn)單地進(jìn)行混合，并隨后將溶劑蒸發(fā)掉來制備。
因此，亞甲基丙二酸酯單體在葉輪泵真空條件下脫氣至恒重以除去聚合抑制劑(SO2)后，可通過對(duì)應(yīng)于專利US 4 931 584和US 5 142098的專利EP 0 283 346中所描述的方法制備，這些專利引入本文作參考。
亞甲基丙二酸酯寡聚物及聚合物可通過陰離子法或自由基法由上述單體合成。
關(guān)于基于亞甲基丙二酸酯且由一種或多種寡聚物和一種或多種聚合物的混合物制成的優(yōu)選組合物，這些組合物也可通過一個(gè)步驟獲得；各組分的相對(duì)比例可通過改變聚合介質(zhì)中的陰離子或自由基引發(fā)劑的濃度來調(diào)節(jié)。
因此，所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員可容易地調(diào)節(jié)基于亞甲基丙二酸酯的上述組合物的物理化學(xué)特性，以獲得本發(fā)明的支持材料。
一般而言，除了上述基于亞甲基丙二酸酯的上述組合物外，本發(fā)明的支持材料的其它組分最多可占該材料的10％(以重量計(jì))。
當(dāng)然，這些組分將被選擇用來與上述基于亞甲基丙二酸酯的組合物共同形成均勻的混合物。
這些組分可具有各種不同的特性，可具有疏水性或親水性，或來源于天然或合成。
下列為可特別地提及的該類組分的實(shí)例—聚氰基丙烯酸酯，優(yōu)選為聚氰基丙烯酸烷基酯；—聚甲基丙烯酸烷基酯；—生物相容性聚氨基甲酸乙酯；—聚氧化烯；—聚氨基酸；以及—聚乙烯醇。
一般而言，這些組分將以與上述基于亞甲基丙二酸酯的組合物的混合物的形式存在于支持材料中。
應(yīng)注意，在不超出本發(fā)明范圍的情況下，這些組分也能以單體單元的形式存在于支持材料中，該單體單元存在于無規(guī)、多嵌段(multiblock)或接枝共聚物中，該共聚物包含具有上述分子式(II)的亞甲基丙二酸酯單元。
這些基于亞甲基丙二酸酯的共聚物可通過所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的常規(guī)聚合技術(shù)來制備，其中可以提及通過離子法進(jìn)行的聚合、通過自由基法進(jìn)行的聚合或(對(duì)于多嵌段或接枝共聚物而言)共聚物前體序列連接技術(shù)，這些序列已預(yù)先在鏈的未端進(jìn)行了適當(dāng)?shù)墓δ芑?br> 這些除亞甲基丙二酸酯之外的組分也能以單體單元的形式存在于支持材料中，這些單體單元連接起來形成同聚物或無規(guī)、多嵌段或接枝共聚物，其中不含有具有化學(xué)式(II)的亞甲基丙二酸酯。
通常，形成上述組分的單體單元可從聚丙烯酸酯、多糖及聚氧化烯的組分單體單元中選擇。
在可用于本發(fā)明范圍內(nèi)的聚丙烯酸酯組分單體單元中可以提及氰基丙烯酸烷基酯、甲基丙烯酸烷基酯及衣康酸酯。
一般而言，在用于本發(fā)明范圍內(nèi)的基于亞甲基丙二酸酯的共聚物的單體單元中，至少50％將由亞甲基丙二酸酯組成。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)特征，本發(fā)明涉及一種藥物組合物，該藥物組合物包含一種上述藥物形態(tài)以及一種藥學(xué)可接受的賦形劑。
本發(fā)明的藥物形態(tài)或包含該形態(tài)的藥物組合物可局部給藥或通過注射給藥。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及上述藥物形態(tài)在下列方面的用途制造一種植入片，或制備一種用藥時(shí)與傷口接觸的組合物，或制備一種用于治療皮膚損傷或真皮或真皮表皮損傷—例如燒傷(尤其是二度和三度燒傷)、潰瘍、褥瘡、皮膚潰瘍或靜脈曲張性潰瘍—的藥物。
其進(jìn)一步涉及上述藥物形態(tài)在神經(jīng)組織、神經(jīng)肌肉組織或神經(jīng)上皮組織再生用藥物的制備中的用途。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)特征，本發(fā)明涉及一種治療皮膚損傷和真皮或真皮表皮損傷—尤其是燒傷的方法，其特征在于，它由向所述損傷或傷口施用有效量的上述藥物形態(tài)組成。
下面將通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說明，但并不意味著對(duì)本發(fā)明加以限制。實(shí)施例1本發(fā)明的藥物形態(tài)的制備，其含有FGF-2/硫酸類肝素復(fù)合物將40mg亞甲基丙二酸酯單體(1-乙氧羰基-1-乙氧羰基亞甲氧羰基乙烯)置于低真空下，以除去聚合抑制劑(二氧化硫)，并在2ml丙酮中溶解，然后將其置入一個(gè)25ml的燒瓶中。進(jìn)行15分鐘的磁力攪拌。
然后一次性加入0.4ml濃度為0.1N的NaOH，繼續(xù)進(jìn)行磁力攪拌。
磁力攪拌約進(jìn)行20分鐘。獲得體積為2.4ml的溶液，其中含40mg支持材料。在真空下將丙酮蒸發(fā)后，上述材料將減少至其原有體積的1/5。
這樣，就得到了一種支持材料，其由一種亞甲基丙二酸酯組合物組成，該組合物包含90％的分子量約為3000的寡聚物及10％的分子量在約20000與25000之間的聚合物。
在室溫下加入相等體積的含有FGF-2/硫酸類肝素復(fù)合物(以下稱為FGF-2/HS)的水溶液。
該復(fù)合物預(yù)先制備，方法是將2種成分在100μl濃度為5mM、pH值為7.6的Tris緩沖液中混合，并在室溫下對(duì)該混合物進(jìn)行2小時(shí)的磁力攪拌。
表1中列出的各種復(fù)合物利用通過電泳純化的人重組FGF-2(TEBU，法國(guó))和硫酸類肝素(SIGMA)來制備，其分子量為7.5kD。
表1

加入FGF-2/硫酸類肝素復(fù)合物后，將該混合物迅速蒸發(fā)至體積為0.5至0.7ml，然后在真空條件下在一個(gè)烘箱中將其蒸發(fā)一整夜，直至其完全干燥為止。
這樣生成40mg本發(fā)明的一種藥物形態(tài)。實(shí)施例2對(duì)包含F(xiàn)GF-2/HS復(fù)合物的藥物形態(tài)對(duì)細(xì)胞增殖的刺激活性的評(píng)價(jià)將本發(fā)明的包含實(shí)施例1中的FGF-2/HS復(fù)合物的藥物形態(tài)與條件培養(yǎng)液接觸，所述條件培養(yǎng)液即一種培養(yǎng)基，細(xì)胞已在其中培養(yǎng)了2-3天，因此該培養(yǎng)基含有由這些細(xì)胞分泌的酶，其源于Caco-2人腸上皮細(xì)胞(ATCC第HTB-37號(hào))的培養(yǎng)物。
在37℃下，將上述藥物形態(tài)與該培養(yǎng)基接觸，其比率為1ml培養(yǎng)基中加入40mg該藥物形態(tài)，接觸時(shí)間為24小時(shí)。在500g下離心10分鐘，以2.5％v/v(5μl每200μl)的比率將上清液加入休眠BP-A31細(xì)胞的培養(yǎng)基中。
所采用的BP-A31細(xì)胞系為小鼠成纖維細(xì)胞的BP-A31細(xì)胞系(化學(xué)轉(zhuǎn)化的3T3成纖維細(xì)胞，其表達(dá)高水平的FGF受體—T.Buchou等，Exp.Cell.Res.，1988，174(2)，411-420)。
在24孔板中以每加樣孔40000個(gè)細(xì)胞的比率(或在96孔板中以每加樣孔8000個(gè)細(xì)胞的比率)在含有8％的胎牛血清和抗生素的DMEM(GIBCO)中培養(yǎng)24小時(shí)。
然后，在加入處于相同培養(yǎng)基的測(cè)試樣品之前，將它們?cè)诓缓醒宓呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)48小時(shí)，得到休眠培養(yǎng)物并并增強(qiáng)其對(duì)外源FGF的敏感度。
在37℃下培養(yǎng)24小時(shí)后，使用MTT測(cè)定法(T.Mosmann，J.Immunol.Meth.，1983，65，55-63)估測(cè)增殖率。
MTT(溴化二甲基噻唑二苯基四唑鎓)為一種黃色的染料，其與活細(xì)胞接觸被細(xì)胞的線粒體呼吸鏈還原為MTT甲。
MTT甲為藍(lán)紫色晶體，其溶解時(shí)產(chǎn)生一種與活細(xì)胞數(shù)目成比例的染色作用。
采用的測(cè)量程序如下—在每一加樣孔(NUNCLON DELTA 96孔板)中加入200μl細(xì)胞懸浮液；—在溫度為37℃、空氣95％/CO25％的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案確定，即，含血清時(shí)為24小時(shí)，不含血清時(shí)為48小時(shí)，加入產(chǎn)物且無血清時(shí)為24小時(shí)；
—在不除去培養(yǎng)基的情況下在每一加樣孔中加入20μl濃度為5mg/ml的MTT溶液，該濃度為5mg/ml的MTT儲(chǔ)備溶液在生理血清中制備并已在0.22μm的濾器中進(jìn)行過濾滅菌；—在溫度為37℃、空氣95％/CO25％的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為2小時(shí)30分鐘；—在500g下離心10分鐘，以將上清液除去，此后，用抽吸法除去培養(yǎng)基；以及—將以下列比例制備的200μl提取液加入每一加樣孔中的細(xì)胞液10gSDS(十二烷基硫酸鈉)50ml DMF(二甲基甲酰胺)50ml 蒸餾水用一滴乙酸將pH值調(diào)整為4.7。
將碟振搖1小時(shí)或在37℃下放置一整夜，在顯微鏡下進(jìn)行檢查，以確保所有的甲基甲均已溶解。
讀數(shù)使用僅含有該提取液的讀數(shù)空白在570nm處(LabsystemsMultiscan MS ELISA平板讀數(shù)器)讀取。
結(jié)果以24小時(shí)期間的細(xì)胞增殖百分比(與未加入生長(zhǎng)因子的對(duì)照培養(yǎng)物比較)表示，如下文表2所示表2

上述結(jié)果表明，本發(fā)明的藥物形態(tài)刺激BP-A31細(xì)胞的增殖。實(shí)施例3包含F(xiàn)GF-2/HS復(fù)合物的新型藥物形態(tài)的制備及評(píng)價(jià)將40mg的材料置入20ml的試管中，該材料由不同百分比的亞甲基丙二酸酯寡聚物及聚合物組成，該寡聚物及聚合物由1-乙氧羰基-1-乙氧羰基亞甲氧羰基乙烯單體制備而成。將該材料在1ml丙酮中溶解，持續(xù)振搖15分鐘。在真空條件下將丙酮蒸發(fā)后，該材料體積降低至原來的1/5，即200μl。
在室溫下加入等體積的包含F(xiàn)GF-2/HS復(fù)合物的水溶液。該復(fù)合物預(yù)先如上所示(實(shí)施例1)制備，并在室溫下對(duì)混合物進(jìn)行磁力攪拌，時(shí)間為2小時(shí)。加入FGF-2/HS復(fù)合物后，直接在真空條件下將混合物蒸發(fā)一整夜，直至其完全干燥為止。由此獲得40mg的一種藥物形態(tài)。
制備本發(fā)明的三種藥物形態(tài)，它們的寡聚物/聚合物比例不同，該差異影響粘度和生物粘附特性，所述比例分別為40/60(最固體的形態(tài))，60/40及80/20(最液體的形態(tài))。
本發(fā)明的上述三種藥物形態(tài)的寡聚物/聚合物比例不同并且可以含有或不含有FGF-2/HS復(fù)合物，按照實(shí)施例1中所描述的方案使它們與BP-A31細(xì)胞接觸，以確定該藥物形態(tài)的毒性以及包含F(xiàn)GF-2/HS復(fù)合物的藥物形態(tài)對(duì)增殖的刺激活性。
表3中給出的結(jié)果比較了各種藥物形態(tài)對(duì)增殖的作用，所述藥物形態(tài)的差異在于其寡聚物/聚合物比例不同且含有或不含有FGF-2/HS復(fù)合物。該結(jié)果對(duì)應(yīng)于培養(yǎng)基中含有3.1％的藥物形態(tài)的情況。上述結(jié)果以24小時(shí)期間的細(xì)胞增殖百分比(與不加入支持材料的對(duì)照培養(yǎng)物比較)表示。
表3

上述結(jié)果表明，配制在本發(fā)明的三種藥物形態(tài)中的FGF-2對(duì)細(xì)胞增殖具有刺激活性。另外，在不存在FGF-2/HS復(fù)合物的情況下，增殖百分比仍大于100％，這表明該三種支持材料在使用的劑量下均未表現(xiàn)出可檢測(cè)到的毒性。實(shí)施例4將FGF-2/HS復(fù)合物配制在藥物形態(tài)中對(duì)FGF-2生物活性的穩(wěn)定性的影響一方面，使用的材料為實(shí)施例3中的三種藥物形態(tài)，其中支持材料由比例不同(以重量計(jì))的亞甲基丙二酸酯寡聚物和聚合物組成；且另一方面，為自由(未經(jīng)配制的)FGF-2。將該3種藥物形態(tài)及自由FGF-2在4℃下存放7、14和21天后，與未加入生長(zhǎng)因子的對(duì)照培養(yǎng)物進(jìn)行比較，以實(shí)施例2中描述的MTT測(cè)定法對(duì)細(xì)胞增殖刺激活性進(jìn)行24小時(shí)的測(cè)量。
在

圖1中以圖形方式顯示了上述結(jié)果，其中，以天數(shù)表示的在4℃下的存放時(shí)間在橫坐標(biāo)上繪出，增殖百分比在縱坐標(biāo)上繪出。
圖中采用下列符號(hào)-◆-代表一種藥物形態(tài)，其包含一種支持材料以及FGF-2/HS復(fù)合物，其中，該支持材料由40％的寡聚物和60％的聚合物組成；-×-代表一種藥物形態(tài)，其包含一種支持材料以及FGF-2/HS復(fù)合物，其中，該支持材料由60％的寡聚物和40％的聚合物組成；-▲-代表一種藥物形態(tài)，其包含一種支持材料以及FGF-2/HS復(fù)合物，其中，該支持材料由80％的寡聚物和20％的聚合物組成；-■-代表自由(未經(jīng)配制的)FGF-2。
結(jié)果表明，該三種藥物形態(tài)至少在21天內(nèi)保持了FGF-2對(duì)細(xì)胞增殖的刺激活性。相反，自由(未經(jīng)配制的)FGF-2的活性僅在最早期(零天)與配制在本發(fā)明的藥物形態(tài)中的FGF-2的刺激活性相當(dāng)，該自由FGF-2的生理活性迅速喪失(7天后)。實(shí)施例5包含生長(zhǎng)因子PDGF和TGF-β的藥物形態(tài)的制備及其穩(wěn)定性研究將PDGF及TGF-β配制在一種包含60％(以重量計(jì))的亞甲基丙二酸酯寡聚物和40％(以重量計(jì))的亞甲基丙二酸酯聚合物的材料中，該寡聚物及聚合物由1-乙氧羰基-1-乙氧羰基亞甲氧羰基乙烯單體制備而成。每40mg材料使用100ng PDGF或TGF-β，如實(shí)施例3中所述。然后，按照實(shí)施例1中描述的方案將本發(fā)明的含有或不含有生長(zhǎng)因子的藥物形態(tài)與L929成纖維細(xì)胞接觸，并且通過MTT測(cè)定法確定PDGF或TGF-β對(duì)細(xì)胞增殖的刺激作用。
結(jié)果以24小時(shí)期間的細(xì)胞增殖百分比(與未經(jīng)處理的對(duì)照培養(yǎng)物比較)表示，如下表4所示。
表4

上述結(jié)果表明，與FGF-2的情況相同，生長(zhǎng)因子PDGF及TGF-β均表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞增殖的刺激活性。支持材料本身(不含生長(zhǎng)因子)對(duì)細(xì)胞沒有作用。實(shí)施例6含有生長(zhǎng)因子NGF的藥物形態(tài)的制備及其活性研究NGF在與FGF-2相似的劑量水平上(20至100ng/ml之間)刺激神經(jīng)元細(xì)胞，如PC12大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞或Neuro2A神經(jīng)母細(xì)胞瘤的分化。這些細(xì)胞停止增殖并產(chǎn)生軸突延伸，這一點(diǎn)成為表示其分化的形態(tài)判據(jù)。
將NGF配制在包含60％(以重量計(jì))的亞甲基丙二酸酯寡聚物和40％(以重量計(jì))的亞甲基丙二酸酯聚合物的支持材料中(每40mg材料配制1μg NGF，如實(shí)施例2所述)，上述寡聚物和聚合物由1-乙氧羰基-1-乙氧羰基亞甲氧羰基乙烯單體制備而成。按照實(shí)施例1中描述的方案將本發(fā)明的含有或不含NGF的藥物形態(tài)與PC12與Neuro2A神經(jīng)元細(xì)胞接觸。對(duì)細(xì)胞分化的刺激作用通過確定(在標(biāo)準(zhǔn)化網(wǎng)格中計(jì)數(shù))軸突延伸超過或等于1個(gè)細(xì)胞直徑的細(xì)胞百分比進(jìn)行定量分析。
結(jié)果以出現(xiàn)軸突的細(xì)胞的百分比(與未經(jīng)處理的培養(yǎng)物比較)表示，如下文表5所示。
表5

上述結(jié)果表明，本發(fā)明的該藥物形態(tài)中的NGF表現(xiàn)出對(duì)神經(jīng)元分化的生物活性。支持材料本身(不含NGF)對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞不具有任何作用。因此，含有NGF的該藥物形態(tài)提供了一種刺激神經(jīng)元修復(fù)的方法。實(shí)施例7含有鞘氨醇磷酸膽堿(SPC)的一種藥物形態(tài)的制備及其對(duì)成纖維細(xì)胞的活性的研究代謝產(chǎn)物鞘氨醇磷酸膽堿(SPC)確定了一類新的細(xì)胞內(nèi)第二信使，其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)表現(xiàn)出廣譜生物活性。當(dāng)前關(guān)于SPC的文獻(xiàn)數(shù)據(jù)顯示，其刺激許多休眠或呈指數(shù)增長(zhǎng)的多種細(xì)胞類型的增殖。
將SPC配制在包含60％(以重量計(jì))的亞甲基丙二酸酯寡聚物及40％(以重量計(jì))的亞甲基丙二酸酯聚合物的一種支持材料中(每40mg材料配制100μg SPC，如實(shí)施例2所述)，上述寡聚物和聚合物由1-乙氧羰基-1-乙氧羰基亞甲氧羰基乙烯單體制備而成。按照實(shí)施例1中描述的方案將本發(fā)明的含有SPC或其對(duì)照溶劑的藥物形態(tài)與BP-A31成纖維細(xì)胞接觸。此處顯示將3.1％的該藥物形態(tài)加入加樣孔中產(chǎn)生15μM的SPC最終理論濃度的作用。細(xì)胞增殖刺激作用通過MTT測(cè)定法進(jìn)行定量分析。結(jié)果以24小時(shí)期間的細(xì)胞增殖百分比(與未經(jīng)處理的對(duì)照培養(yǎng)物比較)表示，如下文表6所示。
表6

上述結(jié)果表明，含有SPC的本發(fā)明的該藥物形態(tài)表現(xiàn)出對(duì)BP-A31細(xì)胞的增殖的生物刺激活性。該活性與自由SPC的促有絲分裂活性相當(dāng)。
權(quán)利要求
1.包含一種支持材料和至少一種細(xì)胞調(diào)節(jié)因子和/或細(xì)胞增殖促進(jìn)劑的藥物形態(tài)，其特征是以重量計(jì)，至少90％且優(yōu)選為至少95％的支持材料由一種基于亞甲基丙二酸酯的組合物組成，其包含—以重量計(jì)，0至10％的一種或多種分子式為(I)的亞甲基丙二酸酯 其中—A和B獨(dú)立地為基團(tuán)(a)或(b) 其中R1和R2獨(dú)立地為線型或分支烷基基團(tuán)，該基團(tuán)具有1至6個(gè)碳原子，n為1至5之間的一個(gè)整數(shù)；—以重量計(jì)，10至90％且優(yōu)選為50至90％的一種或多種分子量小于或等于6000的亞甲基丙二酸酯寡聚物，且其由分子式為(II)的重復(fù)單元組成 其中A和B的定義與上文同；以及—以重量計(jì)，10至90％且優(yōu)選為10至50％的一種或多種分子量大于6000的亞甲基丙二酸酯聚合物，且其由分子式為(II)的重復(fù)單元組成。
2.如權(quán)利要求1所述的藥物形態(tài)，其特征是在以上給出的分子式(I)和(II)中—A為基團(tuán)(a)，其中R1為乙基基團(tuán)；以及—B為基團(tuán)(b)，其中R2為乙基基團(tuán)并且n為1。
3.如權(quán)利要求1或2所述的藥物形態(tài)，其特征是以重量計(jì)，至少90％且優(yōu)選為至少95％的支持材料由一種基于亞甲基丙二酸酯的組合物組成，其包含—以重量計(jì)，50至90％的一種或多種亞甲基丙二酸酯寡聚物，其分子量小于或等于6000，優(yōu)選為小于或等于3000，并且由分子式為(II)的重復(fù)單元組成；以及—以重量計(jì)，10至50％的一種或多種分子量大于6000的亞甲基丙二酸酯聚合物。
4.如權(quán)利要求3所述的藥物形態(tài)，其特征是基于亞甲基丙二酸酯的上述組合物包含—以重量計(jì)，55至65％的一種或多種亞甲基丙二酸酯寡聚物，其分子量小于或等于3000，并且由分子式為(II)的重復(fù)單元組成；以及—以重量計(jì)，35至45％的一種或多種亞甲基丙二酸酯聚合物，其分子量大于6000，且優(yōu)選為大于9000。
5.如權(quán)利要求4所述的藥物形態(tài)，其特征是基于亞甲基丙二酸酯的上述組合物包含—以重量計(jì)，55至65％的一種或多種亞甲基丙二酸酯寡聚物，其分子量在300至1000之間，并且由分子式為(II)的重復(fù)單元組成；以及—以重量計(jì)，35至45％的一種或多種亞甲基丙二酸酯聚合物，其分子量在12000至25000之間。
6.如權(quán)利要求1或2所述的藥物形態(tài)，其特征是以重量計(jì)，至少90％且優(yōu)選為至少95％的支持材料由基于亞甲基丙二酸酯的組合物組成，其包含—以重量計(jì)，40至80％且優(yōu)選為40至60％的一種或多種亞甲基丙二酸酯寡聚物，其分子量小于或等于6000，優(yōu)選小于或等于3000，并且由分子式為(II)的重復(fù)單元組成；以及—以重量計(jì)，20至60％且優(yōu)選為40至60％的一種或多種亞甲基丙二酸酯聚合物，其分子量大于6000。
7.如權(quán)利要求1至6中任一權(quán)利要求所述的藥物形態(tài)，其特征是以重量計(jì)，支持材料包含最高可達(dá)10％的一種或多種除基于亞甲基丙二酸酯的上述組合物之外的組分，其形式為單體單元，這些單元與分子式為(II)的亞甲基丙二酸酯單元相連，以形成無規(guī)、多嵌段或接枝共聚物。8、如權(quán)利要求7所述的藥物形態(tài)，其特征是至少50％的所述共聚物的單體單元由亞甲基丙二酸酯單元組成。
9.如權(quán)利要求1至6中任一權(quán)利要求所述的藥物形態(tài)，其特征是以重量計(jì)，支持材料包含最高可達(dá)10％的一種或多種除基于亞甲基丙二酸酯的上述組合物之外的組分，其形式為單體單元，這些單元連接以形成同聚物或無規(guī)、多嵌段或接枝共聚物，其中不含分子式為(II)的亞甲基丙二酸酯。
10.如權(quán)利要求1至9中任一權(quán)利要求所述的藥物形態(tài)，其特征是細(xì)胞調(diào)節(jié)因子是一種天然、合成或重組生長(zhǎng)因子。
11.如權(quán)利要求1至10中任一權(quán)利要求所述的藥物形態(tài)，其特征是生長(zhǎng)因子從下列因子中選擇成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGFs)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)或幾種上述因子的聯(lián)合。
12.如權(quán)利要求1至11中任一權(quán)利要求所述的藥物形態(tài)，其特征是生長(zhǎng)因子單獨(dú)使用或以與配體的復(fù)合物使用。
13.如權(quán)利要求1至12中任一權(quán)利要求所述的藥物形態(tài)，其特征是所述生長(zhǎng)因子為堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(或FGF-2)，配體為硫酸類肝素或一種硫酸類肝素蛋白聚糖。
14.如權(quán)利要求13所述的藥物形態(tài)，其特征是生長(zhǎng)因子FGF-2與硫酸類肝素以1∶1至1∶20且特別是1∶1.5至1∶10的摩爾比復(fù)合。
15.如權(quán)利要求13所述的藥物形態(tài)，其特征是生長(zhǎng)因子FGF-2與硫酸類肝素蛋白聚糖以1∶0.01至1∶0.5的摩爾比復(fù)合。
16.如權(quán)利要求1至15中任一權(quán)利要求所述的藥物形態(tài)，其特征是其含有一種天然、合成或重組細(xì)胞增殖促進(jìn)劑。
17.如權(quán)利要求16所述的藥物形態(tài)，其特征是該細(xì)胞增殖促進(jìn)劑為神經(jīng)鞘氨醇磷酸膽堿。
18.一種藥物組合物，其包含一種如權(quán)利要求1至17中任一權(quán)利要求所述的藥物形態(tài)及一種藥學(xué)可接受的賦形劑。
19.權(quán)利要求1至17中任一權(quán)利要求所述的一種藥物形態(tài)用于生產(chǎn)一種植入片的用途。
20.權(quán)利要求1至17中任一權(quán)利要求所述的一種藥物形態(tài)用于制備欲放置在接觸傷口的位置的組合物的用途。
21.權(quán)利要求1至17中任一權(quán)利要求所述的一種藥物形態(tài)用于制備一種治療皮膚損傷的藥物的用途。
22.如權(quán)利要求21所述的用于制備一種藥物的用途，所述藥物用于治療燒傷，尤其是二度和三度燒傷，潰瘍、真皮和真皮表皮損傷、褥瘡、皮膚潰瘍或靜脈曲張性潰瘍。
23.如權(quán)利要求1至17中任一權(quán)利要求所述的一種藥物形態(tài)用于制備一種用于神經(jīng)組織、神經(jīng)肌肉組織或神經(jīng)上皮組織的再生的藥物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種藥物形態(tài)，其包含一種支持材料和至少一種細(xì)胞調(diào)節(jié)因子和/或細(xì)胞增殖促進(jìn)劑，優(yōu)選為一種生長(zhǎng)因子，其特征是以重量計(jì)，至少90％的支持材料由一種基于亞甲基丙二酸酯(methylidene malonate)的組合物組成，其包含以重量計(jì)，0至10％的一種或多種分子式為(I)的亞甲基丙二酸酯，其中A和B獨(dú)立地為基團(tuán)(a)或(b)，其中，R
文檔編號(hào)A61P9/00GK1446108SQ0181385
公開日2003年10月1日 申請(qǐng)日期2001年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月7日
發(fā)明者尼可·布魯－馬尼耶茲, 伊古尼·米西亞金, 伊利亞·法泰, 派崔克·庫富爾, 帕斯考·布雷東 申請(qǐng)人:法商佛梭公司