專利名稱：降血壓、抗腫瘤化合物的制藥用途的制作方法
本專利申請為分案申請，原案申請?zhí)枮?9116290.0，申請日為1999.07.16。
本發(fā)明涉及兩種具有降血壓、抗腫瘤活性的化合物及其制備方法，以及它們在制備藥物中的應(yīng)用。
自從1929年弗萊明從真菌中發(fā)現(xiàn)青霉素以來，真菌的代謝產(chǎn)物成為了藥物的豐富來源，絕大多數(shù)臨床應(yīng)用的抗生素都來源于真菌和細(xì)菌，真菌的代謝產(chǎn)物還有其他的藥用價值，如抗腫瘤，治療心血管疾病，免疫調(diào)節(jié)劑，酶抑制劑等。由于海洋環(huán)境的特殊性，海洋真菌能提供陸生真菌無法提供的代謝產(chǎn)物。國際上已從海洋真菌中發(fā)現(xiàn)了一些結(jié)構(gòu)獨特的化合物，分別具有抗菌，抗病毒，抗腫瘤和神經(jīng)心血管方面的活性。例如從Acremonium ehrysogenum產(chǎn)生的頭孢菌素，已發(fā)展為一大類半合成抗生素的先導(dǎo)，廣泛應(yīng)用于臨床，還有其他的一些例子見Kerstin Liberra的文章《Marine fungi a profile resource of biologically activenatural products？》[Pharmazie 50(1995)H.9583-588]，國際上這方面的研究從八十年代以來呈加速發(fā)展的趨勢。
本發(fā)明的目的在于提供一類新的具有潛在藥用價值的化合物及其提取分離方法，以及它們在制備降血壓、抗腫瘤藥物中的用途。
真菌Halorosellinia oceanicum系從亞熱帶海洋生態(tài)環(huán)境中分離得到，其子囊果單個或成組排列，缺乏良好發(fā)育的子囊，在以燕麥瓊脂為批培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，接種4個星期后，菌落可長滿培養(yǎng)基表面，生長初期，菌落呈白色，被散毛，緊貼于培養(yǎng)基，并呈不規(guī)則的環(huán)紋，有致密，完整的邊緣，而后環(huán)紋有顏色逐漸加深，培養(yǎng)物的底面沒有顏色。子囊果單個或數(shù)個并生，線狀或環(huán)狀，在新鮮培養(yǎng)物上呈革質(zhì)，子囊中有8個孢子，子囊孢子單列，或在子囊頂部呈部分雙列，為灰綠色或不透明的褐色，子囊孢子壁光滑，稍厚，無附著物或附生孢子，子囊孢子芽裂通?？稍诒硞?cè)清晰見到，直而明顯。該屬真菌的代謝產(chǎn)物研究還未見有報道。
發(fā)明人由南海海洋真菌Halorosellinia oceanicum 323的發(fā)酵培養(yǎng)物中提取分離到二種結(jié)構(gòu)新穎的化合物，其結(jié)構(gòu)是由苯乙胺與不規(guī)則取代二萜構(gòu)成，這一結(jié)構(gòu)是沒有先例的。
本發(fā)明化合物如下列式(A)和式(B)所示(以下分別簡稱為化合物A和B)
本發(fā)明化合物A和B可以從真菌Halorosellinia oceanicum 323的發(fā)酵液中提取分離而得到。
本發(fā)明所用的的真菌Halorosellinia oceanicum 323已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，中國，武漢大學(xué)校內(nèi))，保藏號為CCTCC No99008，保藏日為1999年5月31日。
制備本發(fā)明化合物A和B的方法包括以下步驟；a.真菌Halorosellinia oceanicum 323 CCTCC NoM99008的種子培養(yǎng)培養(yǎng)基成分按重量比為葡萄糖0.5-1.5、酵母提取物0.05-0.15、蛋白胨0.1-0.3、瓊脂1-1.5、氯化鈉3-5、水100，制成試管斜面，挑取菌株接入斜面，30-35℃培養(yǎng)5-7天；b.真菌Halorosellinia oceanicum 323 CCTCC NoM99008的發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基成分按重量比為葡萄糖0.5-1.5、酵母提取物0.05-0.15、蛋白胨0.1-0.3、氯化鈉3-5、水100、將斜面中培養(yǎng)好的菌株挑入發(fā)酵培養(yǎng)基，于室溫25-35℃靜置1-2月；c.將上述培養(yǎng)好的發(fā)酵液過濾除去菌體；d.將發(fā)酵液加熱濃縮至原液體積的1/3-1/5，用乙酸乙酯萃取多次，濃縮乙酸乙酯萃取液，在硅膠柱中進(jìn)行色譜分離，以乙酸乙酯∶石油醚＝1％-100％為洗脫劑梯度洗脫；e.收集70％-90％的乙酸乙酯∶石油醚洗脫液，濃縮得白色針狀結(jié)晶，得到A、B混合物，在甲醇中多次重結(jié)晶，分離A與B。
動物實驗表明，化合物A、B和異丙腎上腺素均能抑制回腸段的自動節(jié)律收縮，化合物A、B在終濃度為5×10-6-5×10-3mg/ml的劑量范圍內(nèi)，緩慢松弛平滑肌，至15min時完全松弛，并且平滑肌的松弛可持續(xù)2.5小時(每間隔20分鐘沖洗一次)，而異丙腎上腺素松弛作用快，沖洗后約20分鐘可恢復(fù)，異丙腎上腺素的終濃度為5×10-5mg/ml。
本發(fā)明化合物對兔血管平滑肌的作用，在終濃度為5×10-6-5×10-3mg/ml，能抑制腎上腺素引起的兔主動脈血管平滑肌的收縮，濃度大于5×10-3mg/ml時直接松弛兔主動脈血管平滑肌。
本發(fā)明化合物劑量為0.2mg/kg在麻醉大鼠試驗中具有明顯的降壓效果，維持時間2小時仍未恢復(fù)。
本發(fā)明化合物A與B均能抑制腫瘤細(xì)胞株的生長，在以口底癌細(xì)胞株為靶細(xì)胞的MTT還原法檢測抗腫瘤活性試驗中，化合物A的半數(shù)致死量IC50為124μg/ml，化合物B的IC50為129μg/ml。
上述結(jié)果表明，化合物A、B具良好的松弛平滑肌的作用，且持續(xù)時間長于現(xiàn)有藥物異丙腎上腺素，化合物有A、B具有明顯的降壓效果，維持時間2小時仍未恢復(fù)。同時化合物A與B均能有效抑制腫瘤細(xì)胞株的生長。所以，本發(fā)明化合物A或/和B可用于制備降血壓和抗腫瘤藥物。
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實施例1化合物A、B的分離制備方法a.真菌Halorosellinia oceanicum 323 CCTCC NoM99008的種子培養(yǎng)培養(yǎng)基成分按重量比為葡萄糖0.5-1.5、酵母提取物0.05-0.15、蛋白胨0.1-0.3、瓊脂1-1.5、氯化鈉3-5、水100，制成試管斜面，挑取菌株接入斜面，30-35℃培養(yǎng)5-7天；b.真菌Halorosellinia oceanicum 323 CCTCC NoM99008的發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基成分按重量比為葡萄糖0.5-1.5、酵母提取物0.05-0.15、蛋白胨0.1-0.3、氯化鈉3-5、水100、將斜面中培養(yǎng)好的菌株挑入發(fā)酵培養(yǎng)基，于室溫25-35℃靜置1-2月；c.將上述培養(yǎng)好的發(fā)酵液過濾除去菌體；d.將發(fā)酵液加熱濃縮至原液體積的1/3-1/5，用乙酸乙酯萃取多次，濃縮乙酸乙酯萃取液，在硅膠柱中進(jìn)行色譜分離，以乙酸乙酯∶石油醚＝1％-100％為洗脫劑梯度洗脫；e.收集70％-90％的乙酸乙酯∶石油醚洗脫液，濃縮得白色針狀結(jié)晶，得到A、B混合物，在甲醇中多次重結(jié)晶，分離A與B。
A和B均為白色針狀結(jié)晶，A熔點280℃(分解)，B熔點274℃(分解)。
化合物A的試驗數(shù)據(jù)元素分析C30H37NO6(A與B相同)％ 碳 氫 氮A實測值 70.86 7.532.25B實測值 71.03 7.582.37計算值 71.01 7.302.76MS(FAB)m/z509，490，479，448，430，412，402，388，357，348，289，265，254，172，165，91，77。IR(KBr)cm-13416，3233，3128，2973，2974，2860，1743，1693，1454，1370，1271，1229，1046，1011，962，906，779，744，702。UV(CHCl3)λmax nm238(ε12845)，260(ε11379)，281(ε7706)1HNMR(CDCl3，TMS)ppm7.32(t，8，8Hz，2H)，7.26(t，8，8Hz，1H)，7.14(d，8Hz，2H))，6.11(dd，2，15.5Hz，1H)，5.72(bs，1H)，5.69(dd，10，15.5Hz，1H)，3.24(bs，1H)，2.85(t，10，10Hz，1H)，2.81(dd，5，13.5Hz，1H)，2.74(dq，7，12.5Hz，1H)，2.70(d，3.5，7Hz，1H)，2.68(dd，9.5.13.5Hz，1H)，2.51(ddd，10.5，12.5，13Hz，1H)，2.15(dd，3.5，5Hz，1H)，2.27(s，3H)，1.51(s，3H)，1.21(d，6.5Hz，3H)，0.94(d，6.5Hz，3H)，1.92(br，2H)13C-NMR(CDCl3)C 210.24，173.73，169.66，147.5，137.16，77.67，53.28CH 134.04，132.25，130.56，127.52，127.02，69.77，77.10，53.56，49.85，46.91，42.27，32.60，129.07×2，128.88×2CH2114.41，45.18，37.68CH324.12，20.79，19.35，13.6化合物B的試驗數(shù)據(jù)MS(FAB)m/z508，490，479，60，448，43，412，48，20，89，79，19，165，136，120，107，9177，65，51IR(KBr)cm-13416，3198，3121，2973，2924，2853，1743，1700，1461，1377，1236，1046，1011，962UV(CHCl3)λmax nm238(ε6457)，281(ε2660)，301(ε1875)，328(ε1640)1HNMR(CDCl3，TMS)ppm7.32(t，7，7Hz，2H)，7.25(t，7，7Hz，1H)，7.17(d，7Hz，2H)，6.01(dd，2，15.5，1H)，5.90(t，2，2Hz，1H)，5.89(dd，15.5，10.5Hz，1H)，5.34(ddd，15.5，10.5，5.5H2，1H)，5.16(dd，2，15.5Hz，1H)，3.78(d，10Hz，1H)，3.34(dd，7.5，6.5Hz，1H)，2.96(dd，7.5，14Hz，2H)，2.74(dq，7，12.5Hz，1H)，2.471(bs，1H)，2.26(s)，1.70(s，3H)，1.51(s，3H)，1.46(s，3H)，1.20(d，7Hz，3H).13C-NMR(CDCl3)ppmC 210.00，174.40，169.60，137.60，131.40，126.30，77.86，52.64，CH 134.11，131.99，131.0，128.35，127.02，75.02，68.10，60.28，50.46，49.84，42.44，129.10×2，128.92×2.CH244.79，37.64CH324.32，2.79，19.36，17.17，13.84實施例2化合物A、B對豚鼠回腸平滑肌的作用a.分別精確稱取化合物A、B各15mg，先用8滴二甲亞砜溶解，然后緩慢加入雙蒸水配制的生理鹽水定容10ml，配制成1.5mg/ml的濃度。
b.豚鼠擊昏剖取回腸，用預(yù)冷的臺氏營養(yǎng)液(1000mlH2O，NaCl 8g，KCl 0.2g，MgCl20.1g，NaH2PO4.2H2O 0.05g，NaHCO31g，CaCl20.2g，葡萄糖1g，pH7.4)沖洗腸管中的食物殘渣，然后剪成3厘米的長度，兩端用蛙心夾夾住，置于灌流浴槽中，下端蛙心夾固定于浴槽底部，上端蛙心夾用線連接二道生理記錄儀(成都儀器廠，LMS-2B)的拉力換能器，回腸段的自動節(jié)律收縮被記錄下來，浴槽中臺氏營養(yǎng)液恒溫35℃，通入純氧，回腸段掛上去時施加1g的拉力，平衡40min開始(每20min換臺氏營養(yǎng)液一次)。先記錄一段回腸正常收縮的曲線，然后分別加入和陽性對照藥異丙腎上腺素。
試驗結(jié)果如下化合物A、B和異丙腎上腺素均能抑制回腸段的自動節(jié)律收縮，化合物A、B在終濃度為5×10-6-5×10-3mg/ml的劑量范圍內(nèi)，緩慢松弛平滑肌，至15min時完全松弛，并且平滑肌的松弛可持續(xù)2.5小時(每間隔20分鐘沖洗一次)，而異丙腎上腺素松弛作用快，沖洗后約20分鐘可恢復(fù)，異丙腎上腺素的終濃度為5×10-5mg/ml。
結(jié)果表明化合物A、B具有良好的松弛平滑肌的作用，且持續(xù)時間長于現(xiàn)有藥物異丙腎上腺素。
實施例3化合物A、B對兔主動脈條的作用新西蘭大白兔一只，去頭致昏，開胸，迅速取出其胸主動脈，放入預(yù)冷通氧氣的Lock氏液(1000ml H2O，NaCl 9g，KCl 0.35g，MgSO4.7H2O 0.35g，KH2PO40.16g，NaHCO31g)中，快速洗盡血污，然后小心剪去血管外的結(jié)蹄組織，與管縱徑成45度角剪成寬2-3mm動脈條供試驗用。
取2cm左右長度的動脈條，兩端用蛙心夾夾住，置于恒溫38℃的灌流浴槽中，浴液中通入氧氣，下端蛙心夾固定于浴槽底部，上端蛙心夾用線連接拉力換能器，用二道生理記錄儀(成都儀器廠，LMS-2B)記錄血管條的收縮力。動脈條在灌流浴槽中，平衡80min開始試驗，此間每隔20分鐘換一次Lock氏液，加入濃度5×10-3mg/ml的化合物A，可松弛血管，加入終濃度1.6×10-6mg/ml的腎上腺素，記錄血管條的收縮曲線，待收縮高度不再增加時，沖去，共沖洗3次，40分鐘后待血管條基線恢復(fù)時，先加入5×10-4mg/ml的化合物A作用10分鐘，可見在此濃度下，化合物A無直接松弛血管平滑肌的作用，然后再加入終濃度1.6×10-6mg/ml的腎上腺素，可見此次加入的腎上腺素只能使血管條的收縮增加到原來的1/3，化合物B的結(jié)果與A類似。
試驗結(jié)果表明化合物A在濃度大于5×10-3mg/ml時，直接松弛血管，低于此濃度時，不直接松弛血管平滑肌，但可使腎上腺素對血管收縮力降低?；衔顱的結(jié)果與A類似。
實施例4化合物A、B的降血壓作用SD系大鼠用40mg/ml的戊巴比妥鈉麻醉，背位固定于試驗臺上，剪去頸部毛，切開皮膚，分離左頸總動脈，近心端用動脈夾夾住，遠(yuǎn)心端用絨線扎，用眼科剪在近絨線處剪V形小口，插入充滿肝素生理鹽水的動脈插管，動脈插管與血壓換能器相連，血壓換能器相連接入計算機(jī)控制的三通道生理藥理記錄系統(tǒng)，分離大鼠的右股靜脈并插管，供注射藥物用。待血壓穩(wěn)定后(即血壓收縮曲線平穩(wěn)后)開始試驗。分別注射劑量為0.2mg/kg的化合物A，可見有顯著的降壓作用。
試驗結(jié)果為時間(分鐘) 051560平均動脈壓(Kpa)13.8 8.7 9.0 9.5化合物B的結(jié)果與A類似。
結(jié)果表明化合物A、B具有明顯而持久的降血壓效果。
實施例5MTT還原法檢測化合物A、B抗腫瘤活性試驗1.材料1.1四脞鹽(MTT)用0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解MTT(3-(4，5-dimethythiazol-z-yl)2，5-diphenytetrazolium bromide，SIGMA〕終濃度5mg/ml，過濾除菌，分裝后4℃避光保存。
1.2MTT裂解液的配制80g的十二烷基磺酸鈉(SDS，華美生物工程公司)溶解在200ml的N-N-二甲基甲酰胺(北京化工廠)中，水浴加熱助溶，加入200ml蒸餾水，用80％乙酸與1N鹽酸(1∶1)混合調(diào)pH至4.7。
1.3靶細(xì)胞的制備KBS細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)a.從液氮罐中取出KBS細(xì)胞的凍存管，迅速置入37℃水浴中，不停搖動使之迅速溶化，無菌操作移入離心管中；b.加全培養(yǎng)液至10ml，1000rpm離心5s，棄上清；c.重復(fù)以上操作一次；d.以全培養(yǎng)液吹打使細(xì)胞混勻后移入培養(yǎng)瓶中，5％CO237℃培養(yǎng)；e.觀察細(xì)胞生長情況，及時更換培養(yǎng)液，分瓶。
1.4 KBS細(xì)胞計數(shù)、96孔板準(zhǔn)備a.選取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化，全培養(yǎng)終止，移入離心管中，加全培至10ml；b.取一滴滴入計數(shù)板一側(cè)凹槽中，顯微鏡下計數(shù)四大格的細(xì)胞總數(shù)、除以4、乘104，即為每毫升培養(yǎng)液所含細(xì)胞數(shù)；c.調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×105ml；d.96孔板置超鏡臺內(nèi)在紫外線下照射4hr，距離30cm以內(nèi)。
1.5化合物A與B的配制取一定量的化合物A、B加入到全培中，調(diào)整濃度為500μg/ml，超聲乳化，過濾除菌，4℃保存。
1.6試驗方法a.96孔板各孔加入KBS細(xì)胞180μl(1×105/ml)，5％CO2、37℃培養(yǎng)4hr。
b.加入不同濃度受試對象各20μl，對照加全培2μl，繼續(xù)培養(yǎng)48hr。
c.每孔去除培養(yǎng)液100μl，加入MTT(5mg/ml各10μl，繼續(xù)培養(yǎng)4hr。
d.每孔加入MTT裂解液100μl，輕輕振蕩5-10min，使顆粒溶解，過夜。
e.酶聯(lián)免疫儀570nm下測定各孔OD值。
f.計算抑制率腫瘤細(xì)胞殺傷率％＝(對照組測定的平均OD值-加藥組測定的平均OD值)/對照組測定的平均OD值×100％。
g.以抑制率對藥物濃度的對數(shù)作圖，求得IC50值。
以lgc為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，求得IC50值。
1.7結(jié)果試驗發(fā)現(xiàn)化合物A、B均能抑制KBS細(xì)胞株生長，其中A的IC50值為124μg/ml；B的IC50值為124μg/ml。
權(quán)利要求
1.下述結(jié)構(gòu)式A和/或B的化合物用于制備降血壓藥物
全文摘要
本發(fā)明涉及A和式B的化合物及其制備方法,以及它們在制備降血壓、抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
文檔編號A61P9/12GK1364461SQ01122589
公開日2002年8月21日 申請日期1999年7月16日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月16日
發(fā)明者林永成, 姜廣策, 周世寧, 許東暉, 王正濂, 關(guān)利平, E·B·G鐘斯 申請人:中山大學(xué)