專利名稱：人睪丸發(fā)育特異性蛋白－12基因編碼蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于人類基因組技術(shù)領(lǐng)域。
本發(fā)明所述人睪丸發(fā)育特異性蛋白-12基因(testis developmentspecific protein gene 12,NYD-SP12)是發(fā)明人在南京醫(yī)科大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)江蘇省重點實驗室用基因芯片方法篩選獲得，首先制備人睪丸功能基因表達(dá)芯片，通過比較胚胎和成年人睪丸功能基因的表達(dá)，獲得差異表達(dá)克隆，經(jīng)序列測定證明為全長cDNA，為2072bp；其開放閱讀框架為1794 bp，其編碼597個氨基酸。查閱基因庫，該基因為新基因。由于該基因是成人睪丸高表達(dá)，因此發(fā)現(xiàn)的人睪丸發(fā)育特異性蛋白-12基因可能與睪丸發(fā)育有關(guān)，用該基因克隆可制備成融合蛋白，用該蛋白免疫家兔，可獲得單克隆和多克隆抗體，該基因也可用于制備睪丸功能基因表達(dá)芯片。融合蛋白也可能成為相關(guān)疾病治療的基因藥物由于人睪丸發(fā)育特異性蛋白-12基因在Genbank數(shù)據(jù)庫中尚無人的同源基因，本發(fā)明人對于該基因的結(jié)構(gòu)和功能研究成果全都是開創(chuàng)性的。美國國家生物技術(shù)情報中心(National Centerfor BiotechnologyInformation,NCBI)已正式接受該基因為Genbank的新成員，接受號為AF345909。1 gggggatcag gcctcgcagt gggacgttgg gaagccggtg ttggcagatg ctgtggctgg61 gaggagtcca gagcttcgcc ctgtccccgc ggggctgagc cacaactgct taggagtttt121 gggcaggatc gatggatgca ggaagcagta ggagtttgga gaatgcagtg aataggatct181 atcatgatca gcttgttcca aagataaaca caagcaagaa aatgtccacc ttagcgcacc241 cacctaacat cctggaaatg tcacaagaga ttaagaaaaa ctgtggaggt aaacaggtag301 aaatcacact tgaaagaaca aaaatgacaa agggcatcaa agaaaaacaa agcaatgatt361 tagagaaagc agcctttaaa cggaaggcag aaggtgaaga aaagccaact agaaagaaac421 aggcaaagat aacagaactt gacaatcagt taatcaccat gcctctgcct cacatcccct481 taaagaacat aatggatgtg gaaatgaagt tggtctacat tgatgaagtg ggtgttcgct541 atgagtttgt agagtccttc atgtctactg ggagtcagcc aacatgccaa gctgctgaaa601 tagtagaccc tttgagtgta cataatttca gctttctgcc tcagattgac aaatggcttc661 aggtagcctt aaaggatgcc agctcttgct atagacaaaa gaaatacgcc ttggcagcag721 gacagttcag aacagcactt gagctttgca gcaaaggagc agttctggga gaaccatttg781 atgcacctgc tgaagatata gcaagcgtgg caagtttcat tgagacaaag cttgttacct841 gttatctacg gatgaggaaa ccagatcttg ccctgaatca tgcacacagg agcattgttt901 taaacccagc ctatttccgg aatcatcttc gtcaagcaac agtgtttaga tgtctggaga961 ggtattcaga ggctgcccgg agtgccgtga ttgctgacta catgttctgg cttggtggag1021 gaagggaaga gagcataagc aagctcatca aactgtattg gcaggccatg attgaggaag1081 ccatcaccag agctgaatct ttctcggtta tgtacacacc atttgcgaca aaaataagag1141 ctgataaaat agaaaaagta aaagatgctt tcacaaaaac tcatcctgca tatgcagagt1201 atatgtacac agatcttcaa gcactccaca tgttgcctca gacagttgac tggtcatctt1261 ttcctcccca acaatatctc ttgactcttg ggttcaaaaa caaagatgat ggaaaatttt1321 tggaaaaaat atcaagcagg aagctgccga tattcacaga gcataaaaca cctttcggtc1381 tgaccagaga agatacagtg aggcaaatgg agacaatggg gaagcgaatc ttgccaatat1441 tggattttat tagaagcacc caattgaatg ggagttttcc tgcatcctca ggtgtgatgg1501 agaagttgca atatgccagc ctcctcagcc agctgcagag agtaaaggag cagtcccagg1561 tgattaatca agcaatggca gagctagcaa ccattcccta cctacaggac atcagtcaac1621 aggaggcaga attgctgcag tcactaatgg cagatgctat ggacaccctt gaaggaagaa1681 gaaacaataa tgaacgtgtg tggaatatga tccaaaaggt tggacaaatt gaagattttc1741 tataccaatt agaggacagt ttcttaaaaa ctaaaaaact tgagaactgc tcgaaggcaa1801 aaaacaaaaa tgaagcgact tcaaactgtt cagcaaaggt agtcattagg gagcaggcac1861 taccactaag atatcccaga agaagaggca agggcatcca ctccaatgcc cacctagtac1921 tgtgaagctg gataacaaaa gcttgtcacc aaaagaaaga ggtggtattc ccctcagttc1981 atctttacca aagacactct atgtttcatt aatctcaact ggcagcaata aatattctca2041 gcaagttgga ctcgaaaaaa aaaaaaaaaa aa人睪丸發(fā)育特異性蛋白-12基因cDNA序列MDAGSSRSLENAVNRIYHDQLVPKINTSKKMSTLAHPPNILEMSQEIKKNCGGKQVEITLERTKMTKGIKEKQSNDLEKAAFKRKAEGEEKPTRKKQAKITELDNQLITMPLPHIPLKNIMDVEMKLVYIDEVGVRYEFVESFMSTGSQPTCQAAEIVDPLSVHNFSFLPQIDKWLQVALKDASSCYRQKKYALAAGQFRTALELCSKGAVLGEPFDAPAEDIASVASFIETKLVTCYLRMRKPDLALNHAHRSIVLNPAYFRNHLRQATVFRCLERYSEAARSAVIADYMFWLGGGREESISKLIKLYWQAMIEEAITRAESFSVMYTPFATKIRADKIEKVKDAFTKTHPAYAEYMYTDLQALHMLPQTVDWSSFPPQQYLLTLGFKNKDDGKFLEKISSRKLPIFTEHKTPFGLTREDTVRQMETMGKRILPILDFIRSTQLNGSFPASSGVMEKLQYASLLSQLQRVKEQSQVINQAMAELATIPYLQDISQQEAELLQSLMADAMDTLEGRRNNNERVWNMIQKVGQIEDFLYQLEDSFLKTKKLENCSKAKNKNEATSNCSAKVVIREQALPLRYPRRRGKGIHSNAHLVL人睪丸發(fā)育特異性蛋白-12基因開放閱讀框架氨基酸序列本發(fā)明的目的是鑒于人睪丸發(fā)育特異性蛋白-12基因是本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的全新基因，目前人類對此基因的認(rèn)識和了解僅限于本發(fā)明人所做的科學(xué)研究工作。由于該基因是與睪丸特異功能相關(guān)的基因，而且是胚胎低表達(dá)，成人高表達(dá)，因此該基因很可能與睪丸的發(fā)育有關(guān)，其異常表達(dá)可能影響男性的生殖功能，因此該基因的研究可用于①通過制備該基因的融合蛋白，用于研究該基因與睪丸功能的關(guān)系，還可能成為一種治療男性睪丸相關(guān)疾病的生物藥品。
②制備特異性抗體基因編碼蛋白的特異性抗體是研究基因結(jié)構(gòu)和功能的不可缺少的重要工具，人睪丸發(fā)育特異性蛋白-12基因編碼蛋白的多克隆和單克隆抗體，可用作免疫組織化學(xué)染色、ELISA、免疫電鏡、免疫共沉淀等多種根據(jù)免疫學(xué)原理設(shè)計的檢測方法，可用于該基因編碼蛋白在組織細(xì)胞中的定位和定量研究，也可用于各種生物樣本(如血液、精液、尿液等)中的含量變化研究以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究等。因此，該抗體有可能用于制備與人睪丸發(fā)育特異性蛋白-12基因表達(dá)異常相關(guān)疾病診斷試劑盒，并有可能用于制備抗生育藥物。
③制備基因診斷芯片將功能基因用于制備基因診斷芯片是基因開發(fā)研究的一個重要方面，在疾病診斷(如男性不育、性功能低下)和藥物篩選等方面均具有重要意義。本發(fā)明技術(shù)方案1．人睪丸發(fā)育特異性蛋白-12基因融合蛋白的制備以人睪丸發(fā)育特異性蛋白-12基因開放閱讀框的核苷酸序列與質(zhì)粒pDESTTM15制備成GST-SP2-pDEST15表達(dá)質(zhì)粒，在無NaCl的LB中30℃培養(yǎng)到0.5OD600，經(jīng)0.3MNaCl誘導(dǎo)后，超聲粉碎后經(jīng)GST親和層析柱純化，得到純化的融合蛋白。
2．人睪丸發(fā)育特異性蛋白-12基因編碼蛋白特異性多克隆抗體取融合蛋白與載體蛋白KLH(Keyhole Limpet Hymocyanin)結(jié)合，經(jīng)透析后再與完全/不完全佐劑(Complete/Incomplete Freund’sAdjuvant)等量混合，免疫新西蘭兔(背部皮下注射)，每隔3～4周激發(fā)注射一次，共三次，于三個月后取血分離血清。以免疫前動物血清作為對照做ELISA，測定各免疫兔血清中抗體滴度。篩選高滴度血清，進(jìn)一步用抗原作競爭抑制免疫試驗確定抗體的特異性。根據(jù)ELISA結(jié)果確定其用于免疫組織化學(xué)染色的稀釋倍增數(shù)為1∶200～500。
3．人睪丸發(fā)育特異性蛋白-12基因編碼蛋白特異性單克隆抗體取融合蛋白與載體蛋白KLH(Keyhole Limpet Hymocyanin)結(jié)合，經(jīng)透析后再與完全/不完全佐劑(Complete/Incomplete Freund’sAdjuvant)混合，免疫Balb/C小鼠(腹腔內(nèi)注射)，隔周一次，連續(xù)2-3次，融合前靜脈加強(qiáng)一次，用ELISA方法證實抗體的產(chǎn)生后，取脾臟分離脾細(xì)胞，然后與骨髓瘤細(xì)胞融合產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞。陽性克隆經(jīng)多次亞克隆，直至獲得分泌抗人睪丸發(fā)育特異性蛋白-12抗體的單克隆雜交瘤細(xì)胞株。
4．人睪丸發(fā)育特異性蛋白-12基因用于制備睪丸功能基因表達(dá)芯片(1)以獲取的人睪丸發(fā)育特異性蛋白-12基因的核苷酸序列設(shè)計引物，擴(kuò)增全長的人睪丸發(fā)育特異性蛋白-12基因序列，用作點膜的樣品。
(2)用英國BioRobotics自動點膜儀將標(biāo)本點在8×12cm尼龍膜上，每一標(biāo)本點2個點，每點的DNA量約幾ng。；陽性對照8個housekeeping genes (a.ribosomal protein S9；b.Actin gamma；c.glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase；d.hypoxanthine.phosphoribosyltransferase 1；e.H.sapiens mRNA for 23KD highly basicprotein；f.ubiqnitin C；g.Phospholipase A2；h.ubiquitin carboxy Ⅰ-ferminal esterase LⅠ)。陰性對照加λ噬菌體DNA和P-blue質(zhì)粒。
(3)將含有該基因的芯片用于人睪丸發(fā)育特異性蛋白-12基因缺失的診斷和藥物篩選33P標(biāo)記抽提待檢標(biāo)本mRNA或DNA，用Random Primer標(biāo)記法標(biāo)記待檢標(biāo)本mRNA或DNA，作為雜交的探針。
雜交將點制好的尼龍膜標(biāo)記探針雜交后，雜交爐(68℃)內(nèi)烘干，用磷屏壓片。
信號掃描和分析用記錄儀分析雜交信號。根據(jù)雜交信號的強(qiáng)弱分析影響人睪丸發(fā)育特異性蛋白-12基因蛋白表達(dá)水平或人睪丸發(fā)育特異性蛋白-12基因的缺失。
權(quán)利要求
1．人睪丸發(fā)育特異性蛋白-12(NYD-SP12)克隆制備的融合蛋白，其特征是NYD-SP12基因全部開放閱讀框氨基酸，序列為MDAGSSRSLENAVNRIYHDQLVPKINTSKKMSTLAHPPNILEMSQEIKKNCGGKQVEITLERTKMTKGIKEKQSNDLEKAAFKRKAEGEEKPTRKKQAKITELDNQLITMPLPHIPLKNIMDVEMKLVYIDEVGVRYEFVESFMSTGSQPTCQAAEIVDPLSVHNFSFLPQIDKWLQVALKDASSCYRQKKYALAAGQFRTALELCSKGAVLGEPFDAPAEDIASVASFIETKLVTCYLRMRKPDLALNHAHRSIVLNPAYFRNHLRQATVFRCLERYSEAARSAVIADYMFWLGGGREESISKLIKLYWQAMIEEAITRAESFSVMYTPFATKIRADKIEKVKDAFTKTHPAYAEYMYTDLQALHMLPQTVDWSSFPPQQYLLTLGFKNKDDGKFLEKISSRKLPIFTEHKTPFGLTREDTVRQMETMGKRILPILDFIRSTQLNGSFPASSGVMEKLQYASLLSQLQRVKEQSQVINQAMAELATIPYLQDISQQEAELLQSLMADAMDTLEGRRNNNERVWNMIQKVGQIEDFLYQLEDSFLKTKKLENCSKAKNKNEATSNCSAKVVIREQALPLRYPRRRGKGIHSNAHLVL
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述針對NYD-SP12基因開放閱讀框氨基酸序列制備的多克隆抗體，其特征是融合蛋白與完全和不完全佐劑混合后，免疫新西蘭兔制備多克隆抗體。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述針對NYD-SP12基因開放讀框氨基酸序列制備的單克隆抗體，其特征是融合蛋白與完全和不完全佐劑混合，免疫Balb/C小鼠，分離脾臟B淋巴細(xì)胞并和骨髓瘤細(xì)胞融合產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞，進(jìn)一步用亞克隆方法、ELISA和抗體分型方法篩選分泌IgG抗體的單克隆，制備單克隆抗體。
4．根據(jù)權(quán)利要求1所述針對將NYD-SP12基因開放讀框氨基酸序列用于制備睪丸功能基因表達(dá)芯片，其特征是PCR擴(kuò)增NYD-SP12基因cDNA，點于芯片用于芯片制備。
5．根據(jù)權(quán)利要求1所述，針對NYD-SP12基因開放讀框氨基酸序列制備融合蛋白，其特征是融合蛋白可作為制備治療相關(guān)疾病的藥物。
全文摘要
本發(fā)明屬于人類基因組技術(shù)領(lǐng)域,所述的人睪丸發(fā)育特異性蛋白－12(testis development specific proteingene12,NYD－SP12)基因全長cDNA序列為2072bp,其開放閱讀框序列為1794bp,其編碼597個氨基酸,該基因在基因庫(Genbank)中的編號為AF345909。本發(fā)明利用NYD－SP12基因克隆制備融合蛋白,并用該蛋白免疫動物制備單克隆和多克隆抗體,同時將基因克隆用于睪丸特異功能基因表達(dá)芯片的制備,表達(dá)蛋白也可能成為治療相關(guān)疾病的基因藥物。
文檔編號A61K38/17GK1318558SQ0111350
公開日2001年10月24日 申請日期2001年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月11日
發(fā)明者沙家豪, 周作民, 李建民 申請人:南京醫(yī)科大學(xué)