專利名稱：與PEG－IFN－α結(jié)合的霉酚酸酯Mofetil的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過服用(i)α-干擾素或聚乙二醇化的α-干擾素和(ii)霉酚酸可作藥用的鹽或其前藥治療肝臟疾病，尤其是丙型肝炎。
干擾素(IFNs)是一族天然存在的有諸如抗病毒，免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤這些特征性生物功效的小蛋白和糖蛋白，作為對一些疾病的反應(yīng)，特別是對病毒感染的反應(yīng)，大多數(shù)動物有核細(xì)胞可產(chǎn)生和分泌干擾素。
干擾素系統(tǒng)的意義不僅僅在更多的抗病毒保護(hù)機(jī)制方面，它還有比此更廣的意義。在許多病毒性的、惡性的、血管原的、過敏性的、炎性的和纖維化的不同疾病方面，都可顯示出IFNs的意義(A.Billiau(1984)，Elsevier Sciences Publisher B.V.，VOL.，25-28)。
人類干擾素的四種不同種類已有描述(Peska等，(1987)，Ann.Rev.Biochem，56，727-777和Emanuel和Peska(1993)，J.Biol.Chem.，268，12565-12569)。從自然資源中提純IFNs以及利用重組DNA技術(shù)制備IFNs已經(jīng)成為許多出版物的主題。重組干擾素的制備方法是已知的，例如見《自然》295，(1982)，503-508，《自然》284，(1980)，320-326，《自然》290，(1981)，20-26，Nucleic Acids Res.8(1980)，4057-4074，也可見歐洲專利Nos.32134，43980和211148。
在IFNs家族中，IFN-α是IFNs的優(yōu)勢種類，它可以通過刺激外周血白細(xì)胞(Peska等，loc.cit.；Have等，(1975)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA72，2185-2187；Cavalieri等，(1977)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA74，3287-3291)，和類淋巴母細(xì)胞與類成粒細(xì)胞系(Familletti等，(1981)，Antimicrob.Agents.Chemother.，20，5-9)而產(chǎn)生。作為生長和分化的重要調(diào)節(jié)因子，IFN-α影響細(xì)胞通訊和免疫控制。在治療慢性肝炎如慢性丙型肝炎方面常常用到IFN-α。
事實(shí)上，對慢性丙型肝炎病毒感染(CHC)的治療，IFNs方法是唯一獲得承認(rèn)的單療法。治療的目標(biāo)是為了在結(jié)束治療后6個月獲得可持續(xù)性病毒反應(yīng)(外周血中檢測不到丙型肝炎病毒RNA，(HCV-RNA)＜100拷貝/毫升)。然而，在治療慢性丙型肝炎病毒感染方面，干擾素所發(fā)揮的效力還不能令人滿意，在總的CHC群體中僅有5-20％用IFN-α單療法導(dǎo)致了持續(xù)性反應(yīng)的發(fā)生(Fried等，(1995)，“丙型肝炎的療法”，Semin.LiverDis.，15(1)，82-91)。此外，在治療初期IFNs通常產(chǎn)生類似流感的癥狀。
主要由于IFNs能被很快地從系統(tǒng)中清除掉，所以有理由相信IFNs不會獲得最大臨床應(yīng)用潛力。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)結(jié)合有聚乙二醇(PEG)的IFN-α降低這種清除作用，而且在II期研究中，最近顯示一種PEG IFN-α2A的共軛物可造成病毒持續(xù)性下降，在非硬化CHC中36％已經(jīng)降到了檢測不到的水平(Shiffman M，Pockros PJ，Reddy Rk等，“聚乙二醇化α-2A干擾素(PEG)與標(biāo)準(zhǔn)干擾素(IFN)在治療慢性丙型肝炎方面的隨機(jī)、對照、多中心、升高劑量II期試驗(yàn)”，Gastroneterology 1999，116(pt2)1275.Abstract LO418)。在隨后對硬化的CHC病人進(jìn)行III期研究中，證實(shí)29％有持續(xù)性病毒反應(yīng)。(Heathcote J，Shiffman ML，Coolsley G，等，“對代償性肝硬化CHC患者每周一次用α-2A干擾素(PEG-IFN)的效力和安全性進(jìn)行多種民族評估”《肝病學(xué)》(Hepatology)1999，30(增刊)316A)。
霉酚酸(MPA)是一活性劑，它通過非競爭和可逆性抑制肌苷單磷酸脫氫酶(IMP-DH)抑制B和T淋巴細(xì)胞的增生。IMP-DH是鳥嘌呤核苷酸體內(nèi)合成途徑的關(guān)鍵酶。霉酚酸酯mofetil，MPA的嗎啉代乙基酯前藥，已經(jīng)被證實(shí)作為一種免疫抑制劑在排異反應(yīng)的治療中特別是在肝移植受體中發(fā)生作用。它已被單獨(dú)使用或和環(huán)胞苷菌素A和皮質(zhì)甾類結(jié)合使用(J.Neyts and E.declercq，(1998)，Antiviral Research 40，53-56；Gong等，“免疫抑制劑對HBV體外復(fù)制的影響”和K.P.Platz等，(1998)，Elsevier Science Inc.，2232-2233)。
IFN-α與霉酚酸可作藥用的鹽或前藥的結(jié)合可能在治療肝病，尤其是慢性病毒性丙型肝炎方面發(fā)揮重要作用。
實(shí)際應(yīng)用該項(xiàng)發(fā)明結(jié)合療法的IFN-α的劑量是3-6百萬國際單位，每周用藥三次。本發(fā)明中結(jié)合療法的實(shí)際應(yīng)用較好的劑量是每周用藥三次，3百萬國際單位。實(shí)際應(yīng)用本發(fā)明結(jié)合療法的PEG-IFN-α的劑量是40-270μg，每周一次。較好的劑量選擇是180μg，一周一次。實(shí)際應(yīng)用本發(fā)明MPA或其前藥或可作藥用的鹽(例如MMF)的劑量是每天用藥250-2000mg，較好的選擇劑量500-1000mg。日用藥劑量可每天分成2-4次服用。
換算的結(jié)果1mg IFN-α為2.7×108國際單位。因此，3百萬國際單位IFN-α為11.1μg IFN-α。
本發(fā)明尤其涉及將IFN-α與霉酚酸的可作藥用的鹽或其前藥結(jié)合用于被HCV感染的患者，以降低病毒感染的嚴(yán)重程度。該用途包括給患者結(jié)合服用第一和第二兩種組分，其中第一組分由藥物組合物構(gòu)成。該組合物含有MPA的前藥或可作藥用的鹽作為活性成分，其含量為治療上有效降低病毒感染的嚴(yán)重程度，且第二組分由注射溶液組成，該注射液含有IFN-α或聚乙二醇化的IFN-α共軛物作為活性成分，其含量為治療上有效降低病毒感染的嚴(yán)重程度。上述組分應(yīng)至少服用一段時間，以保證在該段時間后該病人外周血中HCV-RNA的含量降到低于100拷貝/毫升的水平。
更具體地，本發(fā)明涉及用IFN-α與霉酚酸的可作藥用的鹽或其前藥的結(jié)合來治療丙型肝炎病毒感染的患者。該用途包括給患者結(jié)合服用(i)由藥物組合物構(gòu)成的第一組分，該藥物組合物含有作為活性成分的下式化合物的可作藥用的鹽 或下式化合物 其中Y是 Z是氫或-(CO)R，R是低級烷基或芳基。其中足夠藥量的第一組分是按每日約250-2000mg的量給藥。
(ii)由注射液構(gòu)成的第二組分，該注射液含有作為活性成分的α-干擾素或聚乙二醇化的α-IFN共軛物，其中第二組分的活性成分，每周服用三次，每次3-6百萬國際單位。所述組分在約24-72周時期內(nèi)被結(jié)合服用。
意外地發(fā)現(xiàn)服用本發(fā)明兩種組分導(dǎo)致外周血中HCV-RNA的含量在例如停止服藥后24周降至低于100拷貝/毫升的水平。
另一方面，本發(fā)明涉及到一藥盒，該藥盒中含有第一組分和第二組分，第一組分含有一種或多種口服單位劑量形式的活性成分，每個單位含有活性成分約250-2000mg，該活性成分是MPA可作藥用的鹽或其前藥。第二組分包含有一瓶或一系列瓶，每瓶中含有單個或多個注射液劑量，每劑量中含有活性成分α-干擾素或聚乙二醇化的α-干擾素約40-270μg。
具體地，本發(fā)明涉及含有第一組分和第二組分的藥盒，第一組分含有一種或多種口服單位劑量形式的活性成分，每個單位含有活性成分約250-2000mg，該活性成分為具有下面通式的化合物， 其中Y是 Z是氫。第二組分包含有一瓶或一系列瓶，每瓶中含有單個或多個注射液的劑量，每劑量中含有約40-270μg聚乙二醇化的α-干擾素共軛物作為活性成分。本發(fā)明的詳細(xì)描述MPA是一具有如下通式的已知化合物， 由藥物組合物構(gòu)成的本發(fā)明第一組分含有作為活性成分的MPA前藥或其可作藥用的鹽，其含量為降低病毒感染的嚴(yán)重程度的治療有效量。
這里所用的術(shù)語“MPA可作藥用的鹽”是指任一常規(guī)鹽或堿加鹽，它保留有生物學(xué)的效力和MPA的特性，并由一合適的無機(jī)或有機(jī)酸或有機(jī)或無機(jī)堿形成。優(yōu)選的是陽離子鹽，例如，堿金屬的鹽，特別是鈉鹽。霉酚酸鈉是已知的，例如見WO97/38689這里所用的術(shù)語“MPA前藥”是指在生理?xiàng)l件下，被轉(zhuǎn)化成MPA或可通過溶劑分解后轉(zhuǎn)化成MPA的化合物，MPA的前藥在治療時可能不具有活性，但是在體內(nèi)可轉(zhuǎn)化成MPA。
優(yōu)選的MPA前藥是下式化合物 其中Y是 Z是氫或-(CO)R，R是低級烷基或芳基。
這些化合物可從美國專利4753935中獲知，該美國專利特此以參考文獻(xiàn)的方式并入本文，最優(yōu)選的是MMF化合物(Z是氫)。
由注射液構(gòu)成的第二組分，含有活性成分IFN-α或聚乙二醇化的IFN-α共軛物，在療效劑量下降低病毒感染的嚴(yán)重程度。
本文所用的術(shù)語“IFN-α”指源于任何天然材料(例如，白細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、淋巴細(xì)胞)或由此衍生來的材料(例如細(xì)胞系)或那些用重組DAN技術(shù)制備的材料。IFN-α克隆和由此進(jìn)行的直接表達(dá)，尤其是在大腸桿菌中表達(dá)，在許多出版物中均有詳細(xì)記載。IFN-α的制備方法是已知的，例如見Goeddel等，(1980)，《自然》284，316-320和(1981)，《自然》290，20-26，和歐洲專利Nos.32134，43980和211148。IFN-α有許多種形式，象IFN-αI，IFN-α2及進(jìn)一步的它們的亞型，包括但不限于IFN-α2A，IFN-α2B，IFN-α2C和IFN-α2II(也稱作IFN-αII或w-IFN)。本發(fā)明中優(yōu)先使用IFN-α2A。IFN-α2A的制備在歐洲專利NOs.43980和211148中已有描述。
本發(fā)明中用到的IFN-α可和聚合物如聚二醇(取代的或未被取代的)結(jié)合，例如聚乙二醇，形成PEG-IFN-α?？衫矛F(xiàn)有技術(shù)中各種已知的連接物完成結(jié)合，尤其是在歐洲專利申請公開號0510356和593868以及歐洲專利申請?zhí)?7108261.5中已公開的那些連接物。聚合物優(yōu)選聚乙二醇的分子量在300-30000道爾頓，且一個或多個聚合物，優(yōu)選1-3個聚合物和IFN-α結(jié)合。
更優(yōu)選的是反應(yīng)物連到例如賴氨酸的伯氨基上或IFN-α的N末端。反應(yīng)物也可連到例如絲氨酸的羥基上，一個或多個PEGs結(jié)合到IFN-α，優(yōu)先選用的是1到3個。
更優(yōu)選的是具有下面通式的反應(yīng)物， 其中共兩個單甲氧基PEG(m-PEG)鏈和賴氨酸相連，一個經(jīng)氨基甲酸酯(氨基甲酸乙酯)鍵連在α和ε氨基上，并且賴氨酸羧基被激活成琥珀酰亞氨基酯。該反應(yīng)物可通過常規(guī)方式，利用已知的方法獲得(Monfardini等，“用于蛋白質(zhì)修飾的支鏈單甲氧基聚乙二醇”，Bioconjugate Chem.662，1995)。該已知方法適用于其中R為低級烷基且具有所需數(shù)目n的反應(yīng)物。反應(yīng)物可從Shearwater Polymers，Inc.(Huntsville，Alabama)獲得。優(yōu)選的PEG平均分子量約是20000道爾頓，在PEG2-NHS中提供的PEG總質(zhì)量大約為40000道爾頓(其它的分子量可通過常規(guī)方式，改變作為上式反應(yīng)物的PEG-乙醇起始物的n的數(shù)值獲得)。
優(yōu)選具有下面通式的聚乙二醇化的IFN-α共軛物 其中R和R′分別是低級烷基，x是NH或O，n和n′是其和為600-1500的整數(shù)，在所述共軛物中聚乙二醇的平均分子量約26000-66000道爾頓。最優(yōu)選的是具有下式的聚乙二醇化的α-干擾素 其中n和n′分別為420或520。該聚乙二醇化的IFN-α共軛物是已知的，例如見歐洲專利申請EP809996，該專利以參考文獻(xiàn)的方式并入本文。
實(shí)際中應(yīng)用本發(fā)明，是給肝病患者服用IFN-α和霉酚酸可作藥用的鹽或其前藥。
特別指出的是，本發(fā)明中已經(jīng)描述了IFN-α與霉酚酸可作藥用的鹽或其前藥的結(jié)合，該結(jié)合對治療病毒感染是有效的，尤其是對慢性丙型肝炎。
根據(jù)本發(fā)明，通過分別用藥，霉酚酸可作藥用的鹽或其前藥和IFN-α的結(jié)合用藥協(xié)同促進(jìn)了慢性丙型肝炎的治療，這種協(xié)同效應(yīng)導(dǎo)致可持續(xù)性反應(yīng)。“可持續(xù)性反應(yīng)”意味著以HCV-RNA拷貝數(shù)表示的外周血中HCV的量例如在結(jié)束用兩種組分后24周時低于100拷貝/毫升。
以外周血中HCV-RNA拷貝數(shù)/毫升表示的外周血中HCV的量由已知的方法測定，用于測定含量的體外診斷藥盒可商業(yè)性的購得。例如AmplicorHCV Monitor Test(定量檢測敏感度至1000拷貝/毫升)，AmplicorHepatitis C Virus(HCV)Test(定量檢測敏感度至100拷貝/毫升)，CobasAmplicorTMHepatitis C Virus Test(自動定量檢測敏感度至100拷貝/毫升)，Cobas AmplicorTMHCV Monitor Test(自動定量檢測敏感度至1000拷貝/毫升)(每種藥盒都可從羅氏診斷系統(tǒng)公司(Branchburg，NJ))，實(shí)施例中已給出用于測定含量的優(yōu)選方法。
IFN-α或聚乙二醇化的IFN-α的注射液通過腸道外途徑給藥，優(yōu)先選用的是皮下注射(sc)或肌肉注射(im)。優(yōu)選的是MPA可作藥用的鹽或其前藥以口服單位劑量形式，更優(yōu)選的是以膠囊，丸劑，袋劑或片劑的形式用到病人身上，同時結(jié)合IFN-α或聚乙二醇化的IFN-α的非腸道用藥。
當(dāng)然，兩種藥物的其它服用方式，例如通過鼻噴、經(jīng)皮、栓劑、緩釋藥劑形式等等，也在被考慮使用。只要適當(dāng)?shù)膭┝吭谳斔瓦^程中沒有被破壞活性成分，則任何一種用藥方式都可發(fā)揮作用。
可以有效降低丙型肝炎感染嚴(yán)重程度的任何數(shù)量和任何期間服用本發(fā)明的組分。
一般說來，在約24周到約72周的一段時期內(nèi)，第一組分和第二組分一起服用是優(yōu)選用的用藥方式，較好的時間在約24-48周，最優(yōu)選的時間是約48周。
一般來說，注射液的活性成分(IFN-α或聚乙二醇化的IFN-α)的劑量約0.5-3.6μg/kg體重，每周用藥一次。一般情況下，MPA可作藥用的鹽或其前藥的劑量約3-40mg/kg體重，優(yōu)選用5-36mg/kg體重，最優(yōu)選的是12-25mg/kg體重，每日用藥。根據(jù)病人的需要和病人治療后的反應(yīng)，該劑量水平可由醫(yī)生來調(diào)整，或高或低于這里所述的劑量。
根據(jù)病人需要，可按醫(yī)生開出的任一藥單的劑量形式服用該藥。例如兩種組分每種藥劑可以單劑量或多劑量形式服用。
治療有效量的IFN-α或PEG-IFN-α與治療有效量的MPA或其一前藥或可作藥用的鹽(例如MMF)可以同時、部分同時、分開或依次服用。治療有效量的MPA或其一前藥或可作藥用的鹽(例如MMF)與治療有效量的IFN-α或PEG-IFN-α可結(jié)合使用。IFN-α或PEG-IFN-α的服用可在病人服用MPA或其一前藥或可作藥用的鹽(例如MMF)的同一時期或不同時期。
本發(fā)明提供了一種對治療丙型肝炎病毒有用的藥盒。該藥盒含有第一組分和第二組分，第一組分含有一種或多種口服單位劑量形式的活性成分，每個單位含有活性成分約250-2000mg(優(yōu)先選用的是500-1000mg)，其中活性成分是MPA的可作藥用的鹽或其前藥。第二組分包含有一瓶或一系列瓶，每瓶中含有單個或多個注射液的劑量，每劑量中含有約40-270μg(優(yōu)先選用的是180μg)的活性成分α-干擾素或聚乙二醇化的α-干擾素共軛物。
優(yōu)選的是，第一組分含有足夠量單位以致于病人在約1-4周的期間內(nèi)每天服用的活性成分量約為2g。并且第二組分含有足夠的劑量以致于在約1-4周的期間內(nèi)每周服用約為180μg的α-干擾素或聚乙二醇化的α-干擾素共軛物。
優(yōu)選的是，第一組分的活性成分是有如下通式的霉酚酸酯mofetil 其中Y是 Z是氫或-(CO)R，R是低級烷基或芳基。
最優(yōu)選的是，第一組分的活性成分是下面通式的化合物 其中Y是 和Z是氫。
優(yōu)選的是每一注射液劑量的活性成分是聚乙二醇化的α-2a干擾素共軛物，更優(yōu)選下式聚乙二醇化的α-2a干擾素共軛物 其中R和R′分別是低級烷基，x是NH或O，n和n′是其和為600-1500的整數(shù)。在所述的共軛物中聚乙二醇的平均分子量約26000-66000道爾頓。
最優(yōu)選的是，每一注射液劑量的活性成分是下式聚乙二醇化的α-2a干擾素共軛物 其中n和n′獨(dú)立地為420或520。
如下面的實(shí)施例所示，通過對照的臨床實(shí)驗(yàn)舉例說明本發(fā)明。這些實(shí)施例僅在于說明，而不是限定本發(fā)明。
患者最好沒有其它形式的肝病(包括硬化)、貧血、肝細(xì)胞癌、先天性嚴(yán)重抑郁癥或其它的精神病、心臟病、腎病、癲癇失控或嚴(yán)重的視網(wǎng)膜病。藥物制劑制劑1片劑
制劑2
1Bulk PEG-IFN以水溶液的形式提供在20mM醋酸鈉中，緩沖pH值為6，含50mM氯化鈉，所需的量是根據(jù)實(shí)際蛋白含量和原藥物質(zhì)的實(shí)際密度計算出來。理論上PEG-IFN的含量是1.3mg/mL，理論密度為1.002g/mL。2氯化鈉的量必須校正，且醋酸鈉和冰醋酸已包括在原藥中。3等量的不同濃度的也可用。4藥溶液密度(20C)是1.004g/mL。治療每位患者口服制劑1，每天兩次，用48周。另外，每位患者皮下注射制劑2，每周一次，用48周?；拘軈?shù)基本效能參數(shù)是可維持病毒反應(yīng)的比例(在24周治療結(jié)束后隨訪期間檢測不到HCV-RNA(＜100拷貝/毫升))。
為了檢測HCV-RNA，首先從血清或血漿中分離出HCV-RNA，它是通過用離液劑裂解病毒顆粒，然后用乙醇沉淀RNA而完成。在有溶菌試劑下，第二種目標(biāo)序列(標(biāo)準(zhǔn)物)被引進(jìn)。優(yōu)選的是，該標(biāo)準(zhǔn)物是非感染性的，351個核苷酸體外轉(zhuǎn)錄的RNA分子，其引物結(jié)合區(qū)與HCV靶序列的結(jié)合區(qū)相同。優(yōu)選的是，這一標(biāo)準(zhǔn)物含有KY78和KY80引物結(jié)合區(qū)，并且與HCV靶RNA一樣產(chǎn)生相同長度(244堿基)產(chǎn)物及堿基組成。從HCV靶擴(kuò)增子標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增子的探針結(jié)合區(qū)域被擴(kuò)增分化成標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增子。標(biāo)準(zhǔn)物要經(jīng)歷樣品的制備，反轉(zhuǎn)錄，擴(kuò)增和檢測這幾步，標(biāo)準(zhǔn)物彌補(bǔ)了抑制的影響并且控制擴(kuò)增過程以容許HCV-RNA的精確定量分析。
為HCV選擇靶RNA序列取決于從HCV基因組中鑒別出在各種HCV基因型中顯示最大保守性的區(qū)域。在已知的HCV基因型中，HCV基因組5’非翻譯區(qū)已經(jīng)顯示了有RNA序列的最大保守性。優(yōu)先使用的是引物KY78和KY80來確定在HCV基因組高度保守的5’非翻譯區(qū)244個核苷酸序列(Young，K.，Resnick和Myers，T.，1992，“結(jié)合反轉(zhuǎn)錄酶—聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試驗(yàn)檢測丙型肝炎病毒RNA”，《臨床微生物學(xué)雜志》，31882-886)。捕獲探針序列和引物序列被定位在5’非翻譯區(qū)最保守的區(qū)域(Bukh，j.，Purcell，R.H.和Miller，R.H.，1992，“丙型肝炎病毒5’非編碼序列分析”，《國家科學(xué)院學(xué)報》，美國，894942-4946)。
反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增反應(yīng)在熱穩(wěn)定重組酶嗜熱菌DNA聚合酶(rTth pol)作用下發(fā)生，在鎂離子和合適的緩沖液下，rTth pol聚合酶具有反轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶的活性，這就允許在同一反應(yīng)混合物里反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增都發(fā)生。
把已處理過的樣品加到反應(yīng)管里擴(kuò)增混合物中，反應(yīng)管中反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增都在進(jìn)行。下游或反義引物(KY78)在5’端被生物素化，上游或有意義引物(KY80)沒有被生物素化。加熱反應(yīng)混合物以允許下游引物針對HCV靶RNA和HCV標(biāo)準(zhǔn)物RNA發(fā)生特異性退火，在脫氧三磷酸核苷酸(dNTPs)過量存在情況下，包括脫氧腺苷、脫氧鳥苷、脫氧胞苷、脫氧尿苷(替代脫氧胸苷)三磷酸，rTth pol延伸已退火的引物以形成一DNA鏈(cDNA)互補(bǔ)于靶RNA。
隨著HCV靶RNA和HCV標(biāo)準(zhǔn)RNA的反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)混合物被加熱以變性RNAcDNA的雜交并且露出引物的靶序列。隨著引物的冷卻，上游引物(KY80)于cDNA鏈退火，rTth pol延伸引物，第二條DNA鏈被合成，完成了PCR的第一個循環(huán)，生成HCV和標(biāo)準(zhǔn)RNA靶區(qū)域雙鏈DNA拷貝，反應(yīng)混合物再次被加熱分開已形成雙鏈的DNA，并且露出引物的靶序列。隨著混合物的冷卻，引物KY78和KY80退火成靶DNA，在dNTPs過量存在情況下，rTth pol沿著靶模板延伸已退火的引物，產(chǎn)生244堿基對的雙鏈DNA分子，命名為擴(kuò)增子。按照設(shè)計的循環(huán)次數(shù)重復(fù)這一過程，擴(kuò)增反應(yīng)僅發(fā)生在HCV基因組上引物間的區(qū)域，整個HCV基因組并未被擴(kuò)增。
利用尿嘧啶-N-糖苷酶，UNG和脫氧尿苷三磷酸(dNTP)，可獲得臨床樣品靶核苷酸的選擇性擴(kuò)增。尿嘧啶-N-糖苷酶(UNG)識別和催化含有脫氧尿苷的DNA鏈的分解，而對含有胸苷的DNA無作用。自然存在的DNA中并不存在有脫氧尿苷，但由于在Master Mix試劑中利用脫氧尿苷酸而不是胸苷三磷酸作為一種dNTP，所以脫氧尿苷存在于擴(kuò)增子里。因此，僅在擴(kuò)增子里含有脫氧尿苷，脫氧尿苷使被污染的擴(kuò)增子在靶DNA擴(kuò)增子里易于被尿嘧啶-N-糖苷酶(UNG)破壞。Master Mix試劑中包括的尿嘧啶-N-糖苷酶(UNG)通過在C-1位置打開脫氧核糖鏈，催化含有尿苷殘基的DNA在脫氧尿苷殘基處裂解。當(dāng)在第一個熱循環(huán)步驟里于堿性pH Master Mix中加熱時，擴(kuò)增子DNA鏈在脫氧尿苷處被打斷，從而使得DNA不可擴(kuò)增。當(dāng)溫度高于55℃時，即在整個熱循環(huán)過程中尿嘧啶-N-糖苷酶(UNG)沒有活性，因而不能破壞靶擴(kuò)增子。擴(kuò)增后，通過加入變性溶液使任何殘留的酶變性，因而阻止任一靶擴(kuò)增子的降解。已證實(shí)在每一個PCR里至少有103拷貝的含有脫氧尿苷的HCV擴(kuò)增子被尿嘧啶-N-糖苷酶(UNG)滅活。
PCR擴(kuò)增后，加入變性溶液使HCV擴(kuò)增子和標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增子被化學(xué)變性，形成單鏈DNA。將變性擴(kuò)增子的等分試樣加到覆有HCV-特異性(如KY150)和標(biāo)準(zhǔn)物-特異性(如SK535)寡核苷酸探針的微孔板的各個孔中，通過與MWP結(jié)合的寡核苷酸探針的雜交，HCV和標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增子分別被結(jié)合到HCV和標(biāo)準(zhǔn)物孔。為在大的動力學(xué)范圍內(nèi)獲得定量結(jié)果，在MWP中分析變性擴(kuò)增子的系列稀釋液。
雜交反應(yīng)之后，MWP被沖洗除去未結(jié)合的材料，并且生物素-辣根過氧化酶共軛物被加到MWP的各個孔中。生物素-辣根過氧化酶結(jié)合生物素標(biāo)記的擴(kuò)增子，該生物素標(biāo)記的擴(kuò)增子被結(jié)合到MWP上的靶特異性寡核苷酸探針(HCV或標(biāo)準(zhǔn)物)所捕捉。MWP再次被沖洗除去未結(jié)合的共軛物，含有過氧化氫和3，3’5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)的底物溶液被加到孔中，在過氧化氫存在下，結(jié)合的生物素-辣根過氧化酶催化TMB氧化形成有色的復(fù)合物。加入弱酸終止反應(yīng)，并且利用自動微孔板讀數(shù)器在450nm處測量出光密度。
在檢測的線性范圍內(nèi)，MWP每孔中光密度(OD)值和孔中HCV擴(kuò)增子或標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增子的含量成比例。相應(yīng)地，計算的總OD值與每一反轉(zhuǎn)錄/PCR擴(kuò)增反應(yīng)中存在的HCV RNA或標(biāo)準(zhǔn)RNA的量成正比。從總HCVOD與總標(biāo)準(zhǔn)OD的比例和標(biāo)準(zhǔn)RNA的輸入數(shù)，利用下面的公式可計算出各個樣品中HCV-RNA的量。 其中總HCV OD＝計算的HCV擴(kuò)增子總OD值總QS OD＝計算的QS擴(kuò)增子總OD值輸入的HCV QS拷貝數(shù)/PCR＝每個反應(yīng)中QS拷貝數(shù)200＝轉(zhuǎn)化拷貝數(shù)/PCR成拷貝數(shù)/毫升的因子數(shù)結(jié)果通過用上述實(shí)施例中的所述兩種配方給藥，未曾預(yù)料地發(fā)現(xiàn)，接受治療病人中有高于20％患者外周血中HCV-RNA的量在結(jié)束治療后24周降到了低于100拷貝/毫升的水平。
權(quán)利要求
1.治療有效量的IFN-α或PEG-IFN-α結(jié)合治療有效量的霉酚酸可作藥用的鹽或其前藥用于制備治療肝病患者的藥物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中霉酚酸可作藥用的鹽或其前藥的足夠療效量是每日約250-2000mg。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中IFN-α的足夠療效量是3-6百萬國際單位，每周用藥三次。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中PEG-IFN-α的足夠療效量是約40-270μg，每周一次用藥。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4的用途，其中IFN-α是IFN-α2A。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5的用途，其中肝病是指病毒感染的肝病。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的用途，其中病毒感染是慢性丙型肝炎。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中足夠量的霉酚酸可作藥用的鹽或其前藥的用藥形式是口服。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中足夠量的IFN-α或PEG-IFN-α是非腸道服用。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9的用途，其中首先用一部分治療有效量霉酚酸可作藥用的鹽或其前藥給藥，接著用剩余的治療有效量霉酚酸可作藥用的鹽或其前藥和治療有效量的IFN-α或PEG-IFN-α結(jié)合給藥。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-9的用途，包括在一給定時期內(nèi)給病人結(jié)合服用兩種藥物組分，其中由藥物組合物構(gòu)成的第一組分含有治療有效量活性成分霉酚酸可作藥用的鹽或其前藥，用以降低病毒感染的嚴(yán)重程度，且由注射液構(gòu)成的第二組分含有治療有效量作為活性成分的IFN-α或PEG-IFN-α，用以降低病毒感染的嚴(yán)重程度，一段時期內(nèi)該兩種藥物組分被結(jié)合服用后至少可滿足該段時期后該病人外周血中HCV-RNA的含量低于100拷貝/毫升。
12.含有IFN-α或PEG-IFN-α與霉酚酸可作藥用的鹽或其前藥的藥物，作為結(jié)合制劑被同時、部分同時、分別或依次使用。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的藥物，其中IFN-α是IFN-α2A。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的藥物，其中PEG-IFN-α是PEG-IFN-α2A。
15.根據(jù)權(quán)利要求10-14的藥物，其中肝病是指病毒感染的肝病。
16.根據(jù)權(quán)利要求14的藥物，其中病毒感染是慢性丙型肝炎。
17.一種藥盒包含(a)第一組分含有一種或多種口服單位劑量形式的活性成分，每個單位含有活性成分約250-2000mg，其中的活性成分是霉酚酸可作藥用的鹽或其前藥，(b)第二組分包含有一瓶或一系列瓶，每瓶中含有單個或多個注射液的劑量，每劑量中含有作為活性成分的IFN-α約3-6百萬國際單位或約40-270μgPEG-IFN-α。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的藥盒，其中第一組分含有足夠數(shù)量單位以致于病人在1-4周的時期里每天可服用約2g霉酚酸可作藥用的鹽或其前藥，且第二組分含有足夠的劑量以致于病人在1-4周的時期里每天可服用約180μgIFN-α或PEG-IFN-α。
19.根據(jù)權(quán)利要求17-18的藥盒，其中每注射液劑量的活性成分是PEG-IFN-α。
20.治療肝病患者以降低疾病嚴(yán)重性的方法，該方法包括將治療有效量的α-干擾素或聚乙二醇化的α-干擾素與治療有效量的霉酚酸可作藥用的鹽或其前藥的結(jié)合給病人服用。
全文摘要
治療有效量的IFN－α或PEG－IFN－α與治療有效量的霉酚酸可作藥用的鹽或其前藥的結(jié)合使用制備治療肝病的藥物。一段時期內(nèi)服用該藥,在結(jié)束治療后24周,至少可將該病人外周血中HCV－RNA的含量降到低于100拷貝/毫升的水平。
文檔編號A61P31/14GK1368887SQ00811397
公開日2002年9月11日 申請日期2000年8月8日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月13日
發(fā)明者瑪麗·C·格雷夫斯, 斯蒂芬·C·帕帕斯, 夫瑞德克贊姆 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司