專利名稱：經微生物學方法制備假單胞菌酸a抗生素的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于制備抗生素假單胞菌酸A(Pseudomonic acid A)(莫匹羅星)的微生物學方法。
假單胞菌酸A的化學結構測定如由式(I)描述的那樣，為9-{4[5S(2S，3S-環(huán)氧-5S-羥基-4S-甲基己基)-3R，4R-二羥基-四氫吡喃-2S-基]-3-甲基丁-2(E)-烯酰氧基}壬酸[E.B.Chain和G.Mellows，J.C.S.Chem.Comm.847-848(1974)；R.G.Alexander，J.P.Clayton，K.Luk，N.H.Rogers，T.J.King，J.C.S.Perkin I.561-565(1978)] 已知熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)能夠產生假單胞菌酸A。按英國專利1,395,907號，熒光假單胞菌NCIB 10586菌株能夠生物合成由假單胞菌酸A和它的在C2和C3碳原子之間的雙鍵處于順式位置的異構體和假單胞菌酸B組成的假單胞菌酸復合體。成分比例為4.5∶4.5∶1。然而，按照日本專利申請52-70083號，熒光假單胞菌Y-11633菌株能夠生物合成由以9∶0.5∶0.5的比例存在的假單胞菌酸A、假單胞菌酸B和另外兩種具有未知結構的成分組成的假單胞菌酸復合體。
本發(fā)明也涉及在深層通氣的條件下能夠生物合成假單胞菌酸A的假單胞菌培養(yǎng)物，其基本上由新的假單胞菌屬菌株19/26號組成。
本發(fā)明還涉及新的假單胞菌屬菌株19/26號的生物純的培養(yǎng)基。
圖的簡述

圖1為假單胞菌屬菌株19/26號(NCAIM(P)B001235)產生的假單胞菌酸復合體的HPLC色譜圖。
發(fā)明詳細描述在尋找細菌產生的抗微生物抗生素過程中，在含有為預防真菌生長的10μg/ml對羥苯乙基三甲基銨和5μg/ml環(huán)己酰亞胺的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，分離到20,000種微生物。
在不同的革蘭氏陽性和革蘭氏陰性試驗微生物上，檢查所分離的菌株的搖瓶培養(yǎng)基的抗菌有效性和它們對治療實踐中出現(xiàn)的對抗生素抵抗的變種。通過應用抗生素抵抗的試驗微生物，我們想促進識別具有新的作用模式的抗菌抗生素。
在上述的檢查過程中，選擇了稱作“菌株19/26號”的細菌分離物。最初，已從阿根廷收集的土壤樣品得到該微生物。其培養(yǎng)液分別對枯草酸桿菌(Bacillus subtilis)ATCC 6633、金黃色葡萄球菌SMITH、耐青霉素金黃色葡萄球菌1110、未編號的肺炎鏈球菌菌株、化膿鏈球菌A 115 ROBB、糞產堿桿菌(Alcaligenes faecalis)140001、支氣管敗血性博代氏桿菌(Bordetella bronchiseptica)ATCC 4617、克雷伯氏肺炎桿菌ATCC10031、耐美他西林和耐氨基糖苷類的金黃色葡萄球菌MRSA 1190R和兩種未編號的肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae)和流感嗜血桿菌菌株具有明顯的抗菌作用。之后，從菌株19/26號的培養(yǎng)液分離到其抗菌代謝產物，且化學結構分析結果發(fā)現(xiàn)與假單胞菌酸A一致。
同時，對選擇的產生假單胞菌酸A的菌株進行分類研究。首先，使用裝配ID 32 GN條的Bio-Merieux ATB表達，用選擇的密切相關的菌株進行初步比較研究。后者適宜于相對快(如屬的水平)的所給出的未知菌株的分類鑒定方法，如果它的診斷性質能夠顯示出所需的與至少一種這些被確認的菌株的高度表型相似性，這些被確認的菌株加入在設備的數(shù)據(jù)庫中。用這個設備分別對14種不同的糖和14種有機酸的32次試驗，能夠測定所研究的未知菌株碳源利用圖譜，加入到一種用生長因子復合體完全的基本培養(yǎng)基中。在接種和經過48小時孵育時間后，借助自動濁度測量法，在標明生長強度(反應)分別為+或-或？的發(fā)育微量培養(yǎng)上，進行利用試驗結果評價。通過設備軟件，評價同步研究的生物化學試驗結果。所得到的菌株19/26號的生理學-生物化學數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫中列出的菌株數(shù)據(jù)相一致(在該情況中，這樣的菌株總數(shù)為114種，其中有14種屬于不同的假單胞菌種類銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)I和II、產堿假單胞菌(Pseudomonas alcaligenes)、熒光假單胞菌I和II、門多薩假單胞菌(Pseudomonas mendocina)、嗜溫假單胞菌(Pseudomonas mesophilica)、皮氏假單胞菌(Pseudomonas pickettii)、類鼻疽假單胞菌(Pseudomonaspseudomallei)、泡囊假單胞菌(Pseudomonas vesicularis)、洋蔥假單胞菌(Pseudomonas cepacia)、缺陷假單胞菌(Pseudomonas diminuta)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)和旋氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri))。按照這個相關實驗的結果，證實菌株19/26號為假單胞菌屬的一個成員。
在菌株19/26號的屬的水平上成功鑒定后，我們嘗試借助經典分類研究方法在種的水平上鑒定它。
在以非孢子形成的革蘭氏陰性桿菌的形式存在的適宜的固體培養(yǎng)基上，菌株19/26號的培養(yǎng)基能夠增加0.6-1.1至1.3-4.0微米。這些是靠極性鞭毛主動游動的。這些專性需氧的化能有機營養(yǎng)桿菌僅能夠氧化侵蝕(attack)葡萄糖。它們不能發(fā)酵且不能用硝酸鹽作為末端電子受體被修復，但顯示陽性催化酶反應。它們在簡單的合成培養(yǎng)基上不能發(fā)展可見菌落且對它們的增殖總是需要生長因子。在最佳條件下生長，它們的菌落呈精氨酸二水解酶陽性，產生熒光色素但在細胞中不能檢測多-β-羥基-丁酸鹽的存在和聚集。
菌株19/26號的其它特征如下在41℃下不能觀察到它的菌落發(fā)展；它從蔗糖中不產生果聚糖，不水解明膠和淀粉，其呈氧化酶陽性，且不利用葡萄糖、2-酮基-葡糖酸鹽、海藻糖和內消旋肌醇作為單一碳源。
所有這些診斷性質將假單胞菌菌株19/26號與以下菌種清楚地分開銅綠假單胞菌、熒光假單胞菌、綠葉假單胞菌、致金色假單胞菌、丁香假單胞菌、綠黃假單胞菌、菊苣假單胞菌、旋氏假單胞菌、門多薩假單胞菌、產堿假單胞菌、類產堿假單胞菌和惡臭假單胞菌。菌株19/26號能夠僅在用(0.2-1.0％)酵母提取物、玉米浸漬液或其它的含有不同種類生長因子的復合天然營養(yǎng)物制備的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。
在這些特殊診斷性質的基礎上，認為菌株19/26號能夠屬于所謂“非典型假單胞菌種”有機體。這樣的“非典型假單胞菌種”未來可加入到新建立的細菌分類群中(N.J.Palleroni，“Psuedomonaceae”Bergeys Manual of Systematic Bacteriology，1，141-219，N.R.Krieg和J.G.Holt編輯，BaltimoreWilliams and Wilkins，1984)。
菌株19/26號于1996年7月16日保藏于匈牙利布達佩斯國立農業(yè)和工業(yè)微生物保藏中心，保藏號為NCAIM(P)B 001235。
按照本發(fā)明優(yōu)選方法，以保藏號NCAIM(P)B 001235保藏的假單胞菌屬菌株19/26號用于制備基本純的假單胞菌酸A。所選擇的菌株能夠使用蛋白胨、牛肉膏、玉米浸漬液、酵母提取物、酪蛋白和大豆粉作為氮源。除以上氮源以外，碳源例如葡萄糖、甘油和葵花油能夠以不同的組合使用。
盡管天然來源的培養(yǎng)基成分含有無機鹽，向接種培養(yǎng)基中加入一些無機鹽(例如銨、鈣、鐵、鋅、銅、鎂、錳、鈉或鉀鹽)仍是有利的。優(yōu)選硫酸鎂、二氯化錳、硫酸亞鐵、氯化鋅、硫酸銅II、硫酸銨、磷酸二氫鉀、氯化鈉和碳酸鈣。
在4℃下，在含有蛋白胨-酪蛋白的斜面瓊脂培養(yǎng)基上進行菌株的維持，每兩周將它新鮮轉移。為維持假單胞菌酸A的生產力，菌株能夠經深度冷凍培養(yǎng)基或以冷凍干燥形式適宜貯存。
在發(fā)酵期間，將假單胞菌種19/26號菌株接種到適宜的培養(yǎng)基上并在半浸漬和通氣發(fā)酵條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)基的pH優(yōu)選設置在中性值(pH＝大約7.0)，培養(yǎng)溫度在大約20℃至大約30℃之間，優(yōu)選在大約24℃至大約26℃之間。依發(fā)酵條件而定，50-60小時后能夠達到抗生素生產力的最大值。在發(fā)酵期間形成的假單胞菌酸復合體包含基本純的假單胞菌酸A，盡管作為生物合成的結果，也形成了少量的式(II)假單胞菌酸B和式(III)假單胞菌酸C。 經瓊脂擴散微生物方法，測定假單胞菌酸抗菌復合體的抗菌活性。培養(yǎng)基為含有牛肉膏-蛋白胨-葡萄糖的瓊脂，其pH為6.5且試驗有機體為枯草桿菌ATCC 6633。經微生物學方法得到的活性值主要表示假單胞菌酸A的量，因為其它假單胞菌酸成分的量非常小，且相對于成分A，它們對試驗-微生物的特異活性-尤其是在成分B的情況下-被認為更弱。
在發(fā)酵期間，通過高效液相色譜法(HPLC)測定在發(fā)酵液體培養(yǎng)基中準確量的假單胞菌酸A和伴隨的次要成分，其中經乙醇稀釋兩次的液體培養(yǎng)基的超聲處理和離心的樣品的上清液被研究(裝置LKB2248泵、LKB 2141 UV檢測器(在222nm下分析)，柱Nucleosil C810μm(BST)，洗脫液乙腈和0.1M NH4H2PO4溶液(pH5.0)的混合物(35∶65)，流速1.2ml/min)，保留時間假單胞菌酸A(PSA)為8.5min，假單胞菌酸B(PSB)為6.0min，且假單胞菌酸C(PSC)為22.5min。
在圖1中能夠看到經假單胞菌屬19/26號菌株生物合成的假單胞菌酸抗菌復合體的HPLC色譜圖。該色譜圖表明經基本純的假單胞菌酸A的發(fā)酵酸19/26號菌株得到假單胞菌酸復合體。假單胞菌酸B和假單胞菌酸C成分的總量低于5％。以這種方式證明假單胞菌屬19/26號菌株能夠以比早先公開的產生假單胞菌酸復合體的熒光假單胞菌菌株以更優(yōu)良的組合來生物合成抗生素。這個事實對工業(yè)生產是有利的。
通過以下實施例闡明本發(fā)明的方法。然而，本發(fā)明應不受其限制。
在25℃下，將接種的瓊脂斜面培養(yǎng)基孵育24小時，并把細胞懸浮于5ml生理鹽水溶液(懸浮液中的細胞數(shù)109-1010/ml)中。在500ml錐形瓶中，將得到的1ml懸浮液接種到滅菌的100ml的I-21標記的接種培養(yǎng)基中。I-21培養(yǎng)基組分如下葡萄糖 10g甘油 5g玉米浸漬液 3g硫酸銨 2g
磷酸二氫鉀 0.4g硫酸鎂-水(1∶7)0.4g二氯化鎂-水(1∶2) 0.03g碳酸鈣 4g葵花油 2g用自來水稀釋至1000ml。滅菌前培養(yǎng)基的pH設定為7.0。
在25℃下，于搖床(260RPM，振幅10cm)上將含有移種培養(yǎng)基的燒瓶振搖18-20小時。之后，將50ml(1％)的振搖培養(yǎng)基接種到E-5標記的5升培養(yǎng)液中，在121℃下，于10升夾套發(fā)酵罐中滅菌45分鐘。E-5培養(yǎng)基的組分如下葡萄糖*50g甘油 50g大豆粉 100g玉米浸漬液 15g氯化鈉 25g碳酸鈣 25g葵花油 10g用自來水稀釋至5升(*葡萄糖在50％溶液中滅菌30分鐘，并與接種物質一起加入到培養(yǎng)基中)。滅菌前培養(yǎng)基的pH設定為7.0。
攪拌培養(yǎng)液并通氣50-60小時。培養(yǎng)液的溫度為25℃，攪拌速率為500RPM，空氣流速為200升/小時。以最小量(每發(fā)酵罐大約20-30ml)使用作為抗泡沫劑的葵花油。
假單胞菌酸復合體的生物合成在發(fā)酵8-10小時時開始且在培養(yǎng)55-60小時時實驗最大抗菌濃度。
如下進行從發(fā)酵液體培養(yǎng)基中分離假單胞菌酸A。在完成發(fā)酵后，將得到的4.5升培養(yǎng)發(fā)酵液離心，然后用稀(20％)硫酸將上清液(4.06升)的pH調至4.5。然后用2.03升乙酸乙酯將酸化液提取兩次。分離這些相并經離心從乳液狀有機相制備清晰的相。真空蒸發(fā)合并的提取液。將得到的粗產物(2.45g)溶解于25ml氯仿-甲醇-99.5％乙酸(93∶5∶2)的混合液中，且將得到的溶液填充到從245g的Kieselgel60(粒子大小0.063-0.2mm；Reanal)和用以上溶劑混合物制備的柱(高∶直徑＝28∶5)上。用以上溶劑混合物洗脫。在洗脫過程中，收集50ml流分并經薄層層析法分析流分中假單胞菌酸A的含量，使用Kieselgel60(DC-Alufolien；105554，默克)吸附劑和氯仿-甲醇-99.5％乙酸(90∶8∶2)展開溶劑混合物。從Kieselgel 60柱上洗脫的流分34-50包含假單胞菌酸A。合并這些餾分(850ml)并同時將冷卻的280ml水加入到得到的溶液中。在此之后，用1N氫氧化鈉水溶液將溶液混合物的pH調至4.5。從水相中分離有機溶液，然后經280ml氯仿再次提取水相。真空蒸發(fā)合并的提取液，如此能夠得到純的假單胞菌酸A。
柱色譜餾分14-15含有來自次要成分的假單胞菌酸C，而餾分54含有來自次要成分的假單胞菌酸B，通過以上寫出的方法能夠以純的形式回收它們。
使用以上顯示的結構式(I)的位次編號系統(tǒng)，描述所分離的假單胞菌酸成分的光譜特征。假單胞菌酸A的光譜特征紫外光譜(10μg/ml，在95％乙醇溶液中)λmax＝222nmE1cm1%=303.6]]>紅外光譜(KBr)νOH3483和3306，νC＝O1728(COOCH2)，1720(COOH)cm-11H-NMR譜(CDCl3，δTMS＝0)δ[ppm]， 偶合常數(shù)(Hz) 歸屬(積分)，峰裂數(shù)5.75(1H)q4J2，15＝1.1 2-H4.08(2H)t3J8′，9′＝6.4 9′-H23.72-3.93(4H)m5-H；7-H；13-H；16-Ha3.55(1H)dd2J16a，16b＝11.8；3J16b，t＝2.6 16-Hb3.48(1H)dd3J5，6＝8.4；3J6，7＝3.2 6-H2.82(1H)td3J9，10＝6.3；3J10，11＝2.3 10-H2.74(1H)dd3J10，11＝2.3；3J11，12＝7.811-H2.60(1H)dd2J4a，4b＝14.5；3J4a，5＝2.74-H22.28-2.36(3H)m4-Hb；2′-H22.20(3H)d4J2，15＝1.1 15-H32.02(1H)m 8-H1.61-1.76(6H)m9-H2；3′-H2；8′-H21.33-1.43(9H)m 12-H；4′-H2；5′-H2′；6′-H2；7′-H21.22(3H)d3J13，14＝6.414-H30.94(3H)d3J12，17＝7.017-H313C-NMR譜(CDCl3溶液，δTMS＝0)δ[ppm]歸屬δ[ppm] 歸屬177.8s C-1′ 42.7t，d C-4，C-12166.9s C-139.4d C-8156.0s C-333.9t，t C-9，C-2′117.7d C-231.6t C-4′*74.9d C-528.9t C-5′*71.4d C-13 28.8t C-6′*70.4d C-728.5t C-8′*69.0d C-625.9t C-7′65.3t C-16 24.6t C-3′63.9t C-9′ 20.8q C-1461.3d C-11 19.1q C-1555.6d C-10 12.7q C-17*可交換歸屬化學電離(CI)質譜特征譜數(shù)據(jù)m/z R.I.(％)歸屬501 100[M+H]+327 45 [M+H-HO/CH2/8COOH]+309 16 [m/z327-H2O]+227 33 [C12H19O4]+假單胞菌酸B的光譜特征紫外光譜(10μg/ml，在95％乙醇溶液中)λmax＝222nmE1cm1%=280]]>紅外光譜(薄膜)νOH3418，νC＝O1713(COOCH2，COOH)cm-11H-NMR譜(CDCl3，δTMS＝0)δ[ppm]， 偶合常數(shù)(Hz)歸屬(積分)，峰裂數(shù)5.68(1H)s 2-H4.02(2H)t3J8′，9′＝6.6 9′-H23.7(2H)m7-H，13-H3.55(1H)td3J4a，5＝3J5，6＝9.3；3J4b，5＝1.8 5-H3.41(2H)dd2J16a，16b＝11.016-H23.24(1H)dd3J5，6＝9.3；3J6，7＝2.8 6-H2.92(1H)td3J9，10＝5，6；3J10，11＝2.0 10-H2.69(1H)dd3J10，11＝2.0；3J11，12＝7.2 11-H2.62(1H)dd2J4a，4b＝14.5；3J4a，5＝1.9 4-Ha2.20(2H)t3J2′，3′＝7.4 2′-H22.14(3H)br.s15-H32.10(1H)dd2J4a，4b＝14.5；3J4b，5＝9.3 4-Hb1.85(1H)dd2J9a，9b＝14.3；3J9a，10＝5.3 9-Ha1.20-1.68(14H)m 9-Hb；12-H；3′-H2；4′-H2；5′-H2；6′-H2；7′-H2；8′-H21.14(3H)d3J13，14＝6.4 14-H30.88(3H)d3J12.17＝7.1 17-H3化學電離(CI)質譜特征譜數(shù)據(jù)m/zRI(％)歸屬517100 [M+H]+34370[M+H-HO/CH2/8COOH]+假單胞菌酸C的光譜特征紫外光譜(10μg/ml，在95％乙醇溶液中)λmax＝222nmE1cm1%=307]]>紅外光譜(薄膜)νOH3435，νC＝O1713(COOCH2，COOH)cm-11H-NMR譜(CDCl3，δTMS＝0)δ[ppm]， 偶合常數(shù)(Hz)歸屬(積分)，峰裂數(shù)5.69(1H)s 2-H5.25-5.50(2H)m10-H；11-H4.00(2H)t3J8′，9′＝6.5 9′-H23.88(1H)dd3J6，7＝3J1，2＝3.07-H3.78(1H)dd2J16a，16b＝11.8；3J16a，8＝2.6 16-Ha3.68(1H)dd3J4b，5＝2.5；3J5，6＝9.0 5-H3.55(1H)qd3J12，13＝3J13，14＝6.3 13-H3.49(1H)dd2J16a，16b＝11.8；3J16b，8＝2.016-Hb3.41(1H)dd3J5，6＝9.0；3J6，7＝3.0 6-H2.58(1H)dd2J4a，4b＝13.8；3J4a，5＝2.54-Ha2.20(2H)t3J2′，3′＝7.4 2′-H22.00-2.30(4H)m 4-Hb；9-H2；12-H2.10(3H)m 15-H31.78(1H)m 8-H1.45-1.65(4H)m 3′-H2；8′-H21.15-1.35(8H)m 4′-H2；5′-H2；6′-H2，7′-H21.08(3H)d3J13，14＝6.3 14-H30.92(3H)d3J12，17＝6.8 17-H3化學電離(CI)質譜特征譜數(shù)據(jù)m/zR.I.(％)歸屬48530 [M+H]+28760 [M+H-HO/CH2/8COOH]+
盡管在此已描述本發(fā)明一些目前優(yōu)選的實施方案，對本發(fā)明從屬的領域技術人員顯而易見的是可進行所描述的實施方案的變化和改進，而不背離本發(fā)明的精神和范圍。因此，本發(fā)明打算僅由所附的權利要求需要的內容和法律應用原則來限制。
權利要求
1.一種用于制備假單胞菌酸A的方法，包括以下步驟在深層通氣的條件下，于包含至少一種有機氮或碳源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)能夠生物合成假單胞菌酸A的假單胞菌(Pseudomonas)菌株，和發(fā)酵假單胞菌培養(yǎng)物以便形成假單胞菌酸A，其中所述假單胞菌菌株為保藏于匈牙利布達佩斯國立農業(yè)和工業(yè)微生物保藏中心的假單胞菌屬菌株19/26號，保藏號為NCAIM(P)B001235。
2.權利要求1的方法，其中所述假單胞菌菌株為以保藏號NCAIM(P)B 001235保藏于匈牙利布達佩斯國立農業(yè)和工業(yè)微生物保藏中心的假單胞菌屬菌株19/26號的產生假單胞菌酸A的突變型或變種。
3.權利要求1的方法，該方法還包括分離假單胞菌酸A的步驟。
4.權利要求1的方法，其中所述至少一種有機氮或碳源選自葡萄糖、甘油、葵花油、酪蛋白、大豆粉、蛋白胨、牛肉膏、玉米浸漬液和酵母提取物。
5.權利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基包含至少一種無機鹽。
6.權利要求5的方法，其中所述至少一種無機鹽選自銨、鈣、鐵、鋅、銅、鎂、錳、鈉和鉀鹽和它們的混合物。
7.權利要求6的方法，其中所述至少一種無機鹽選自硫酸銨、碳酸鈣、硫酸亞鐵、氯化鋅、硫酸銅II、硫酸鎂、二氯化錳、氯化鈉和磷酸二氫鉀和它們的混合物。
8.權利要求1的方法，其中所述發(fā)酵在大約20℃至大約30℃之間的溫度下進行。
9.權利要求8的方法，其中所述發(fā)酵在大約24℃至大約26℃之間的溫度下進行。
10.一種在深層通氣的條件下能夠生物合成假單胞菌酸A的假單胞菌培養(yǎng)物，其基本由以保藏號NCAIM(P)B 001235保藏于匈牙利布達佩斯國立農業(yè)和工業(yè)微生物保藏中心的新的假單胞菌屬菌株19/26號組成。
11.一種新的假單胞菌菌株19/26號的生物純的培養(yǎng)物，該菌株保藏于匈牙利布達佩斯國立農業(yè)和工業(yè)微生物保藏中心，保藏號為NCAIM(P)B 001235。
全文摘要
公開用于制備假單胞菌酸A的方法,方法包括在通氣的條件下深層培養(yǎng)能夠生物合成假單胞菌酸A的假單胞菌菌株;且分離要求的化合物。本發(fā)明方法特別包括在大約20℃至大約30℃之間的溫度下,于含有有機氮和碳源和任選含有礦物鹽的培養(yǎng)基上,培養(yǎng)保藏于布達佩斯匈牙利國立農業(yè)和工業(yè)微生物收藏中心的假單胞菌菌株19/26號,保藏號為NCAIM(P)B001235,或它的產生假單胞菌酸A突變型或變種。
文檔編號A61P31/04GK1354798SQ00805878
公開日2002年6月19日 申請日期2000年2月3日 優(yōu)先權日1999年2月3日
發(fā)明者V·斯?jié)蔂? I·朗, I·巴塔, A·特格德斯, K·阿爾布雷希特, J·莫澤斯尼蘇托, I·M·沙波, M·佩特羅茨基, J·埃戴, E·古爾雅斯, G·巴洛 申請人:拜奧蓋爾藥廠有限公司