專利名稱：一種利用休止細胞渥堆發(fā)酵煙梗制備煙用香料的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及煙用香料制備技術領域，更具體地，本發(fā)明涉及一種利用休止細胞渥堆發(fā)酵處理煙梗制備煙用香料的方法。
背景技術：
發(fā)展中式卷煙，形成具有典型特色的產(chǎn)品，改善中式卷煙與國外卷煙的質(zhì)量差距， 尤其是在卷煙抽吸香氣方面的不足，提高國內(nèi)外市場競爭力，是我國卷煙行業(yè)發(fā)展中需要解決的問題之一。在卷煙中添加香精香料，是一種能夠有效改善卷煙抽吸品質(zhì)的方式。其中，添加煙草來源的香料能夠極為有效地提升卷煙自身特有香氣的含量，同時也能在一定程度上降低焦油含量，而且，添加煙草來源的香料，由于其來源的一致性，具有較高的安全保障，所以，開發(fā)煙源香料成為煙用香料開發(fā)中的一個主要方向。在煙草工業(yè)中，煙梗常常被視為生產(chǎn)中的副產(chǎn)物。我國是一個卷煙消費和生產(chǎn)的大國，每年都有數(shù)十萬噸的煙梗被廢棄，既造成了環(huán)境污染，也是對生物資源的浪費。如何能夠更進一步地利用煙梗，使原本的廢物變廢為寶，是我國乃至世界煙草行業(yè)都在密切關注的一個研究熱點?？蒲腥藛T對煙?；瘜W成分進行了研究和分析，尤其是分析了煙梗中的主要香氣成分后，與煙葉的香氣成分進行對比，發(fā)現(xiàn)煙梗中所含的致香成分和煙葉中的致香成分在種類上基本一致，所不同的僅僅是含量上有所差別。特別是煙梗中含有的天然植物素，例如主要的煙氣特征香——煙堿、煙酸、茄尼醇等，具有較高的含量，在混合煙葉組配方中有極大的開發(fā)利用價值。目前國內(nèi)煙草行業(yè)對于煙梗的利用，主要集中在將其制備成再造煙葉、膨脹梗絲等作為煙草原料添加到葉組配方中；或者是將其制備成煙梗提取物，作為再造煙葉的組成部分使用。就煙梗提取物來說，目前由于原料和制備工藝的限制，含有較高的木質(zhì)素、蠟質(zhì)等燃燒后會產(chǎn)生不良吸味的成分，煙香尚顯不足。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術制備的煙梗提取物香氣不足、抽吸品質(zhì)不佳這一缺陷，提供一種可以有效減少煙梗提取物中的木質(zhì)氣，并補充甜香等優(yōu)雅香氣，以改善煙梗提取物的抽吸品質(zhì)，有效提升煙草本香，降低刺激、增加煙梗提取物豐富性的利用休止細胞渥堆發(fā)酵煙梗制備煙用香料的方法。本發(fā)明目的通過以下技術方案予以實現(xiàn)?！N利用休止細胞渥堆發(fā)酵煙梗制備煙用香料的方法，其特征在于，方法如下
①休止細胞制備將分離自煙葉表面的產(chǎn)香菌株在LB液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，離心棄去培養(yǎng)基后收集菌株待用；配制磷酸鹽緩沖液，緩沖液的濃度控制在其滲透壓可滿足細胞生長所需滲透壓；將離心收集的產(chǎn)香菌株全部接于磷酸鹽緩沖液中，在20-37°C培養(yǎng)20-72 小時，制得休止細胞待用；
②微生物渥堆發(fā)酵處理在煙梗中加入2-5倍水滅菌，將休止細胞依照滅菌煙梗總質(zhì)量按比例接菌，接菌量控制在總質(zhì)量的0. 5-10% ；接菌后將煙梗和休止細胞混勻后在 20-37°C渥堆培養(yǎng)發(fā)酵M-120小時獲得發(fā)酵產(chǎn)物；
③在發(fā)酵產(chǎn)物中加入水，加熱提取并濃縮后制得最終發(fā)酵煙梗提取物，即為煙用香料。當發(fā)酵煙梗提取物中的雜質(zhì)含量過多時，本發(fā)明還可將發(fā)酵煙梗提取物進一步進行乙醇回溶提取，以去除雜質(zhì)。本發(fā)明所述產(chǎn)香菌株取自于煙葉表面的產(chǎn)香微生物。配制磷酸鹽緩沖液的磷酸鹽為磷酸氫鈉、磷酸二氫鈉、磷酸鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀中的一種或幾種，溶液PH值為 7. 0-7. 4 ；溶液濃度要求能夠平衡菌株細胞滲透壓，控制在20-70毫摩爾/升。本發(fā)明利用煙梗作為原料，以分離自煙葉表明的產(chǎn)香微生物作為出發(fā)菌株，通過獨特的休止細胞培養(yǎng)技術，用固體渥堆發(fā)酵的方式進行產(chǎn)香代謝，產(chǎn)生了對后期的煙梗提取物制備起到積極作用的發(fā)酵物，可以有效減少煙梗提取物中的木質(zhì)氣，并補充甜香等優(yōu)雅香氣，改善了煙梗提取物的抽吸品質(zhì)，有效提升煙草本香。將發(fā)酵產(chǎn)物制備煙梗提取物， 得到了抽吸品質(zhì)明顯改善的發(fā)酵煙梗提取物，應用于卷煙中起到了提調(diào)煙香、細膩醇和煙氣、降低刺激性、掩蓋雜氣和改善卷煙吸味的效果。本發(fā)明方法簡便、成本低廉、具有操作性、規(guī)范性和可控性強的特點，且相對于常見的發(fā)酵煙梗提取物的制備方法，用本發(fā)明的方法制備時間明顯縮短，更加便于實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下通過實施例及試驗數(shù)據(jù)，對本發(fā)明做進一步詳細說明。所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。一種利用休止細胞渥堆發(fā)酵煙梗制備煙用香料的方法，其特征在于，方法如下
①休止細胞制備將從取自于煙葉表面的產(chǎn)香微生物中分離出的產(chǎn)香菌株在LB液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，離心棄去培養(yǎng)基后收集菌株待用；配制磷酸鹽緩沖液，磷酸鹽緩沖液的濃度控制在其滲透壓可滿足細胞生長所需滲透壓，控制在20-70毫摩爾/升，溶液PH值為 7. 0-7. 4 ；配制磷酸鹽緩沖液的磷酸鹽為磷酸氫鈉、磷酸二氫鈉、磷酸鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀中的一種或幾種；將離心收集的產(chǎn)香菌株全部接于磷酸鹽緩沖液中，在20-37°C培養(yǎng)20-72小時，制得休止細胞待用；
②微生物渥堆發(fā)酵處理在煙梗中加入2-5倍水滅菌，將休止細胞依照滅菌煙?？傎|(zhì)量按比例接菌，接菌量控制在0. 5-10% (質(zhì)量/質(zhì)量)；接菌后將煙梗和休止細胞混勻后在 20-37°C渥堆培養(yǎng)發(fā)酵M-120小時獲得發(fā)酵產(chǎn)物；
③在發(fā)酵產(chǎn)物中加入水，加熱提取并濃縮后制得最終發(fā)酵煙梗提取物，即為煙用香料。如果發(fā)酵煙梗提取物中雜質(zhì)較多，將發(fā)酵煙梗提取物進一步進行乙醇回溶提取， 去除發(fā)酵煙梗提取物中的雜質(zhì)。實施例1
一種利用休止細胞渥堆發(fā)酵煙梗制備煙用香料的方法，方法如下 ①休止細胞制備選擇一株分離自紅大煙葉表面的產(chǎn)香微生物，如短小芽孢桿菌，提取產(chǎn)香菌株，在LB液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)后，離心棄去培養(yǎng)基后收集菌株并全部轉接入濃度為40毫摩爾/升、PH值為7. 2的磷酸鈉緩沖液中，其滲透壓可滿足細胞生長所需滲透壓，在20°C培養(yǎng)72小時，制得休止細胞待用；
②微生物渥堆發(fā)酵處理將200g煙梗加入5倍水滅菌后將待用的休止細胞按照滅菌煙?？傎|(zhì)量10%的接種量接菌，充分混勻后在20°C下渥堆培養(yǎng)發(fā)酵M小時，獲得發(fā)酵產(chǎn)物；
③加入發(fā)酵產(chǎn)物質(zhì)量5倍的水，然后加熱回流提取，過濾除去煙梗后經(jīng)濃縮去除大部分水分，制得發(fā)酵煙梗提取物，即為本發(fā)明所需的煙用香料。實施例2
一種利用休止細胞渥堆發(fā)酵煙梗制備煙用香料的方法，方法如下
①休止細胞制備選擇一株分離自津巴布韋煙葉表面的產(chǎn)香微生物，如擲孢酵母菌，提取產(chǎn)香菌株，在LB液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)后，離心收菌并全部轉接入濃度為20毫摩爾/ 升、PH值為7. 0的磷酸鉀緩沖液中，其滲透壓可滿足細胞生長所需滲透壓，在37°C培養(yǎng)20 小時待用；
②微生物渥堆發(fā)酵處理將800g煙梗加入3倍水滅菌后將待用的休止細胞按照滅菌煙?？傎|(zhì)量的0. 5%的接種量接菌，充分混勻后在37°C下渥堆培養(yǎng)發(fā)酵120小時獲得發(fā)酵產(chǎn)物；
③加入發(fā)酵產(chǎn)物質(zhì)量4倍的水，然后加熱回流提取，過濾除去煙梗后經(jīng)濃縮去除大部分水分，制得發(fā)酵煙梗提取物，即為本發(fā)明所需的煙用香料。實施例3
一種利用休止細胞渥堆發(fā)酵煙梗制備煙用香料的方法，方法如下 ①休止細胞制備選擇一株分離自巴西煙葉表面的產(chǎn)香微生物如小球菌，提取產(chǎn)香菌株，在LB液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)后，離心收菌并全部轉接入濃度為70毫摩爾/升、PH值為 7. 4的磷酸二氫鈉緩沖液中，在30°C培養(yǎng)48小時待用。②微生物渥堆發(fā)酵處理將IOOOg煙梗加入2倍水滅菌后，將待用的休止細胞按照滅菌煙?？傎|(zhì)量的2. 5%的接種量接菌，充分混勻后在32°C下渥堆培養(yǎng)發(fā)酵55小時獲得發(fā)酵產(chǎn)物；
③加入發(fā)酵產(chǎn)物質(zhì)量6倍的水，然后加熱回流提取，過濾除去煙梗后經(jīng)濃縮去除大部分水分，制得發(fā)酵煙梗提取物，再用2倍95%乙醇回溶提取，經(jīng)濃縮后去除大部分乙醇，制得最終發(fā)酵煙梗提取物，即為本發(fā)明所需的煙用香料。實施例4
一種利用休止細胞渥堆發(fā)酵煙梗制備煙用香料的方法，方法如下
①休止細胞制備選擇一株分離自秘魯煙葉表面的產(chǎn)香微生物如枯草芽孢桿菌，提取產(chǎn)香菌株，在LB液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)后，離心收菌并全部轉接入濃度為55毫摩爾/升、 PH值為7. 3的磷酸鈉緩沖液中，于25°C培養(yǎng)35小時待用；
②微生物渥堆發(fā)酵處理將2000g煙梗加入3. 5倍水滅菌后，將待用的休止細胞按照滅菌煙?？傎|(zhì)量的5%的接種量接菌，充分混勻后在20°C下渥堆培養(yǎng)發(fā)酵48小時獲得發(fā)酵產(chǎn)物；
③加入發(fā)酵產(chǎn)物質(zhì)量4倍的水，然后加熱回流提取，過濾除去煙梗后經(jīng)濃縮去除大部分水分，制得發(fā)酵煙梗提取物，再用2倍95%乙醇回溶提取，經(jīng)濃縮后去除大部分乙醇，制得最終發(fā)酵煙梗提取物，即為本發(fā)明制得的煙用香料。本發(fā)明所述產(chǎn)香微生物的選擇、產(chǎn)香菌株的分離提取、磷酸鹽緩沖液的配置、菌株接種、加熱提取、濃縮、乙醇回溶提取等均可采用現(xiàn)有技術。 將本發(fā)明的發(fā)酵煙梗提取物作為煙用香料在煙草原料中添加，經(jīng)過加香評吸實驗結果表明，該發(fā)酵煙梗提取物具有明顯提調(diào)煙香、細膩醇和煙氣、降低刺激性、掩蓋雜氣和改善卷煙吸味的效果。
權利要求
1.一種利用休止細胞渥堆發(fā)酵煙梗制備煙用香料的方法，其特征在于，方法如下①休止細胞制備將分離自煙葉表面的產(chǎn)香菌株在LB液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，離心棄去培養(yǎng)基后收集菌株待用；配制磷酸鹽緩沖液，緩沖液的濃度控制在其滲透壓可滿足細胞生長所需滲透壓；將離心收集的產(chǎn)香菌株全部接于磷酸鹽緩沖液中，在20-37°C培養(yǎng)20-72 小時，制得休止細胞待用；②微生物渥堆發(fā)酵處理在煙梗中加入2-5倍水滅菌，將休止細胞依照滅菌煙?？傎|(zhì)量按比例接菌，接菌量控制在總質(zhì)量的0. 5-10%;接菌后將煙梗和休止細胞混勻后在 20-37°C渥堆培養(yǎng)發(fā)酵M-120小時獲得發(fā)酵產(chǎn)物；③在發(fā)酵產(chǎn)物中加入水，加熱提取并濃縮后制得最終發(fā)酵煙梗提取物，即為煙用香料。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種利用休止細胞渥堆發(fā)酵煙梗制備煙用香料的方法，其特征在于，將發(fā)酵煙梗提取物進行乙醇回溶提取，去除發(fā)酵煙梗提取物中的雜質(zhì)。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的一種利用休止細胞渥堆發(fā)酵煙梗制備煙用香料的方法， 其特征在于，所述產(chǎn)香菌株取自于煙葉表面的產(chǎn)香微生物。
4.根據(jù)權利要求1或2所述的一種利用休止細胞渥堆發(fā)酵煙梗制備煙用香料的方法， 其特征在于，所述配制磷酸鹽緩沖液的磷酸鹽為磷酸氫鈉、磷酸二氫鈉、磷酸鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀中的一種或幾種，溶液PH值為7. 0-7. 4 ；溶液濃度要求能夠平衡菌株細胞滲透壓，控制在20-70毫摩爾/升。
全文摘要
一種利用休止細胞渥堆發(fā)酵煙梗制備煙用香料的方法，是將分離自煙葉表面的產(chǎn)香菌株在LB液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，離心收集菌株待用；配制磷酸鹽緩沖液，緩沖液的濃度控制在其滲透壓可滿足細胞生長所需滲透壓；將產(chǎn)香菌株全部接于磷酸鹽緩沖液中，在20-37℃培養(yǎng)20-72小時，制得休止細胞待用；然后在煙梗中加入2-5倍水滅菌，將休止細胞依照滅菌煙?？傎|(zhì)量的0.5-10%接菌；接菌后將煙梗和休止細胞混勻在20-37℃渥堆培養(yǎng)發(fā)酵24-120小時獲得發(fā)酵產(chǎn)物；最后在發(fā)酵產(chǎn)物中加水，加熱提取并濃縮后制得煙用香料。本發(fā)明可以有效減少煙梗提取物中的木質(zhì)氣，并補充甜香氣，以改善煙梗提取物的抽吸品質(zhì)，有效提升煙草本香，降低刺激、增加煙梗提取物豐富性。
文檔編號A24B15/20GK102499462SQ20111037144
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月21日 優(yōu)先權日2011年11月21日
發(fā)明者劉煜宇, 吳長偉, 張勃, 李仙, 畢薇, 端李祥, 鄭琳 申請人:云南瑞升煙草技術(集團)有限公司