益生菌組合物及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了益生菌組合物及其制備方法。本發(fā)明所公開的益生菌組合物，所述益生菌組合物主要由下述重量百分比的物質(zhì)制備而成：嗜酸乳桿菌菌粉1％?3％、干酪乳桿菌菌粉0.5％?1.5％、乳雙歧桿菌菌粉1％?3％、甘露低聚糖5％?8％、圓苞車前子粉3％?5％、低聚果糖40％?60％、玉米低聚肽粉2％?5％、菊粉3％?5％、藍莓粉5％?8％和麥芽糊精10％?25％。本發(fā)明所制備的益生菌組合物不僅能有效調(diào)節(jié)腸道菌群，同時也能增強人體的免疫力。
【專利說明】
益生菌組合物及其制備方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及食品領域，尤其涉及益生菌組合物及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 益生菌(Probiotics)-字源自希臘語，原意味"對生命有益"的意思，益生菌多分 布于人體腸道，廣泛包含乳酸桿菌（LactobaciIIus species)、乳酸球菌（Lactococcus species)、腸球菌（Entrococcus species)、雙歧桿菌菌屬（Bifidobacterium species)部 分菌種及部分酵母菌(yeast)等多種菌類。
[0003] 甘露低聚糖又稱甘露寡聚糖，是從酵母培養(yǎng)細胞壁中提取的一類新型抗原活性物 質(zhì)，廣泛存在于魔芋粉、瓜爾豆膠、田箐膠及多種微生物細胞壁內(nèi)。它具有低熱、穩(wěn)定、安全 無毒等良好的理化性質(zhì)。
[0004] 圓苞車前子，Psyllium是Ginuceae科的一種草藥，原產(chǎn)于印度、伊朗，在地中海地 區(qū)國家，如法國、西班牙等國亦有栽培。圓苞車前草莖粗短，葉長橢圓形，種子含珊瑚木苷 (Aucubine )、酵素、脂肪、黏膠質(zhì)(Muci Iage)等成分。圓荀車前草的種子外殼經(jīng)加工磨碎后， 稱為圓苞車前子殼粉，或洋車前子纖維(PsyIlium Husk Powder)。
[0005] 低聚果糖又稱蔗果低聚糖，是由1~3個果糖基通過β( 2-I)糖苷鍵與蔗糖中的果 糖基結合生成的蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖等的混合物。
[0006] 玉米低聚肽粉，拉丁文名稱為Cornoligopeptidespowder，其是以玉米蛋白粉為原 料，經(jīng)調(diào)漿、蛋白酶酶解、分離、過濾、噴霧干燥等工藝生產(chǎn)而成的。
[0007] 菊粉（Inulin)是一類天然果聚糖的混合物，來源于菊苣根(拉丁學名：Cichorium intybus var. sativum，Asteraceae)。以菊苣根為原料，去除蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)后，經(jīng)噴霧干 燥等步驟獲得菊粉。果聚糖是果糧單元通過(2-1)鏈聯(lián)接而成并以葡萄糖單元終止的碳水 化合物，通常商品化菊粉中果聚糖的平均聚合度為2 - 60,其中含有少量的低聚果糖。
[0008] 隨著現(xiàn)今社會生活節(jié)奏加快，加之人們飲食營養(yǎng)失調(diào)、長期運動不足，各種益生菌 制品不斷推陳出新，最普遍常見的便是添加有益生菌的飲料制品或食品組成物。但目前的 益生菌制品多為調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，功效較單一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 為了彌補以上領域的不足，本發(fā)明公開了一種益生菌組合物，該組合物不僅能有 效調(diào)節(jié)腸道菌群，同時也能增強人體的免疫力。
[0010] 本發(fā)明所提供的益生菌組合物，主要由下述重量百分比的物質(zhì)制備而成：嗜酸乳 桿菌菌粉1%-3%、干酪乳桿菌菌粉0.5%-1.5%、乳雙歧桿菌菌粉1%-3%、甘露低聚糖 5%-8%、圓苞車前子粉3%-5%、低聚果糖40%-60%、玉米低聚肽粉2%-5%、菊粉3%-5%、藍莓粉5%-8%和麥芽糊精10%-25%。
[0011]優(yōu)選地，所述益生菌組合物由下述重量百分比的物質(zhì)制備而成：嗜酸乳桿菌菌粉 2%-3%、干酪乳桿菌菌粉1 %-1.5%、乳雙歧桿菌菌粉2%-3%、甘露低聚糖7%-8%、圓苞 車前子粉3 %-5 %、低聚果糖40 %-60 %、玉米低聚肽粉2 %-5 %、菊粉3 %-5 %、藍莓粉5 %-8 %和麥芽糊精10 %-23 %。
[0012] 所述益生菌組合物由下述重量百分比的物質(zhì)制備而成:嗜酸乳桿菌菌粉2%、干酪 乳桿菌菌粉1 %、乳雙歧桿菌菌粉2%、甘露低聚糖8%、圓苞車前子粉3%、低聚果糖50%、玉 米低聚肽粉2 %、菊粉5 %、藍莓粉5 %、麥芽糊精22 %。
[0013] 所述益生菌組合物由下述重量百分比的物質(zhì)制備而成:嗜酸乳桿菌菌粉3%、干酪 乳桿菌菌粉1 %、乳雙歧桿菌菌粉3%、甘露低聚糖8%、圓苞車前子粉5%、低聚果糖60%、玉 米低聚肽粉2%、菊粉3%、藍莓粉5%、麥芽糊精10%。
[0014] 所述益生菌組合物由下述重量百分比的物質(zhì)制備而成:嗜酸乳桿菌菌粉1%、干酪 乳桿菌菌粉0.5%、乳雙歧桿菌菌粉1.5%、甘露低聚糖5%、圓苞車前子粉3%、低聚果糖 50%、玉米低聚肽粉2%、菊粉3%、藍莓粉5%、麥芽糊精10%。
[0015] 所述益生菌組合物由下述重量百分比的物質(zhì)制備而成:嗜酸乳桿菌菌粉3%、干酪 乳桿菌菌粉1.5 %、乳雙歧桿菌菌粉3%、甘露低聚糖7 %、圓苞車前子粉4.5 %、低聚果糖 40%、玉米低聚肽粉5 %、菊粉5 %、藍莓粉8 %、麥芽糊精23 %。
[0016] 所述益生菌組合物由下述重量百分比的物質(zhì)制備而成:嗜酸乳桿菌菌粉2.5%、干 酪乳桿菌菌粉1.5%、乳雙歧桿菌菌粉1 %、甘露低聚糖5%、圓苞車前子粉5 %、低聚果糖 60%、玉米低聚肽粉5%、菊粉5%、藍莓粉5%、麥芽糊精10%。
[0017] 本發(fā)明還公開了一種制備所述益生菌組合物的方法。
[0018] 本發(fā)明所公開的制備所述益生菌組合物的方法，包括以下步驟：
[0019] (1)按重量百分比將嗜酸乳桿菌菌粉、干酪乳桿菌菌粉和乳雙歧桿菌菌粉混合均 勻得到混合物A;
[0020] (2)按重量百分比將圓苞車前子粉和玉米低聚肽粉混合均勻得到混合物B;
[0021] (3)按重量百分比將所述混合物A與菊粉混合均勻得到混合物C，按重量百分比將 所述混合物B與藍莓粉混合均勻得到混合物D;
[0022] (4)按重量百分比將所述混合物C、所述混合物D與甘露低聚糖混合均勻得到混合 物E;
[0023] (5)按重量百分比將所述混合物E與麥芽糊精混合均勻得到混合物F;
[0024] (6)按重量百分比將所述混合物F與低聚果糖混合均勻即得本發(fā)明的益生菌組合 物。
[0025] 所述益生菌組合物在調(diào)節(jié)腸道菌群和/或增強人體的免疫力中的應用也屬于本發(fā) 明的保護范圍。
[0026] 本發(fā)明所制備的益生菌組合物中所選用的原料均為食品原料或國家允許用于保 健食品的原料，用量上嚴格限制在一定范圍，所以安全有效，無毒副作用。
【申請人】在廣泛研 究以上采用的各原料對調(diào)節(jié)腸道菌群和增強人體免疫力的作用的基礎上，嘗試了大量的組 合，但只在以上組合中觀察到協(xié)同作用。本發(fā)明所制備的益生菌組合物不僅能有效調(diào)節(jié)腸 道菌群，同時也能增強人體的免疫力。
【具體實施方式】
[0027] 實施例1、制備益生菌組合物
[0028] 該實施例中所用的原料嗜酸乳桿菌菌粉、干酪乳桿菌菌粉、乳雙歧桿菌菌粉、甘露 低聚糖、圓苞車前子粉、低聚果糖、玉米低聚肽粉、菊粉、藍莓粉和麥芽糊精均可從商業(yè)途徑 購買得到。
[0029] 制備益生菌組合物的方法，包括以下步驟：
[0030] (1)按重量百分比將嗜酸乳桿菌菌粉、干酪乳桿菌菌粉和乳雙歧桿菌菌粉混合均 勻得到混合物A;
[0031] (2)按重量百分比將圓苞車前子粉和玉米低聚肽粉混合均勻得到混合物B;
[0032] (3)按重量百分比將所述混合物A與菊粉混合均勻得到混合物C，按重量百分比將 所述混合物B與藍莓粉混合均勻得到混合物D;
[0033] (4)按重量百分比將所述混合物C、所述混合物D與甘露低聚糖混合均勻得到混合 物E;
[0034] (5)按重量百分比將所述混合物E與麥芽糊精混合均勻得到混合物F;
[0035] (6)按重量百分比將所述混合物F與低聚果糖混合均勻即得本發(fā)明的益生菌組合 物。
[0036] 經(jīng)長期實踐，得到具有協(xié)同作用配比（以重量百分比為單位）的益生菌組合物，如 表1所示。
[0037] 表1實施例1制備得到的益生菌組合物

[0040] 根據(jù)以上配比制備得到不同的益生菌組合物，對這些組合物進行如下功能試驗。 [0041 ] 一、益生菌組合物調(diào)節(jié)腸道菌群
[0042] ( - )益生菌組合物調(diào)節(jié)腸道菌群動物實驗
[0043] 1材料和方法
[0044] 1.1樣品:本實施例所制備的益生菌組合物，人體口服推薦量為每日2次，每次1袋， 成人體重按60kg計算，折合劑量為0.0667g/kg · bw。
[0045] 1.2實驗動物與實驗環(huán)境條件：SPF級ICR種雄性小鼠40只，體重18g~22g，由湖南 斯萊克景達實驗動物有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(湘)2011-0003,實驗條 件為屏障環(huán)境，實驗期間環(huán)境溫度22°C~23°C，濕度52%~58%，實驗動物使用許可證號為 SYXK(湘）2010-0010。
[0046] 1.3劑量選擇及樣品處理:根據(jù)人體口服推薦量，設益生菌組合物低、中、高劑量分 別為〇.333g/kg · bw、0.667g/kg · bw、2.000g/kg · bw(分別相當于人體推薦劑量的5、10、30 倍）。試驗時，分別取益生菌組合物3.33g、6.67g、20.0 Og加蒸餾水定容至200ml，按0.2ml/ IOg · bw體積給小鼠灌胃，每天一次，連續(xù)14天。對照組灌胃予以等體積的蒸餾水。
[0047] 1.4主要儀器與試劑
[0048] 1.4.1主要儀器電子天平，CO2水套培養(yǎng)箱，厭氧培養(yǎng)箱。
[0049] 1.4.2主要試劑伊紅-美藍培養(yǎng)基、TSC培養(yǎng)基、疊氮鈉-結晶紫-七葉苷培養(yǎng)基、LBS 培養(yǎng)基、改良BBL培養(yǎng)基、樣品稀釋液等。
[0050] 1.5實驗方法
[0051]實驗前無菌采集小鼠糞便適量，置已稱重的帶玻璃珠的干燥滅菌小試管中，再稱 重，計算出小鼠糞便的重量，加入無菌稀釋液，稀釋10倍，振蕩1分鐘，再依次進行10倍系列 稀釋，選擇合適的稀釋度，分別接種在各培養(yǎng)基上，按要求進行培養(yǎng)。據(jù)糞便中雙歧桿菌的 基礎水平將40只小鼠分入對照組和低、中、高劑量組，每組10只小鼠，按1.3中劑量設置灌胃 14天，最后一次灌胃后24h，再次無菌采集小鼠糞便，同上檢測腸道菌群。各腸道菌群的培養(yǎng) 基和培養(yǎng)條件為： 腸桿菌： 伊紅-美藍瓊脂培養(yǎng)基 37°C 24h需氧培養(yǎng) 腸球菌： 疊氮鈉-結晶紫-七葉苷瓊脂培養(yǎng)基 37Γ 48h需氧培養(yǎng)
[0052] 產(chǎn)氣莢膜梭菌：TSC瓊脂培養(yǎng)基 37Γ 24h厭氧培養(yǎng) 乳桿菌： LBS瓊脂培養(yǎng)基 37°C 48h 5%C02培養(yǎng) 雙歧桿菌: 改良BBL瓊脂培養(yǎng)基 37°C 48h厭氧培養(yǎng)
[0053] 1.6實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計
[0054]用ExceKSpss軟件進行統(tǒng)計分析。用Spss軟件比較各實驗組與對照組數(shù)據(jù)時，先 對數(shù)據(jù)進行方差齊行檢驗，若方差齊，采用單因素方差分析進行總體比較，發(fā)現(xiàn)差異再用 Dunnett法進行多個劑量組與一個對照組均數(shù)間的兩兩比較。若方差不齊則對原始數(shù)據(jù)進 行適當?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，滿足方差齊性檢驗后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計;若變量轉(zhuǎn)換后仍未達 到方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)總體比較有差異，則采用不要求方差齊性的 Tamhan^ sT2檢驗進行兩兩比較。對照組及各劑量組實驗前后自身菌數(shù)比較采用配對t檢 驗。
[0055] 1.7結果判定
[0056]比較實驗前后自身及組間雙歧桿菌、乳桿菌、腸球菌、腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌的變 化情況，實驗組實驗前后自身比較差異有顯著性，或?qū)嶒灪髮嶒灲M與對照組組間比較差異 有顯著性、且實驗組實驗前后自身比較差異有顯著性，符合以下一項，可以判斷受試樣品動 物實驗結果陽性。
[0057] 1.7.1糞便中雙歧桿菌和/或乳桿菌明顯增加，產(chǎn)氣莢膜梭菌減少或不增加，腸桿 菌、腸球菌無明顯變化。
[0058] 1.7.2糞便中雙歧桿菌和/或乳桿菌明顯增加，產(chǎn)氣莢膜梭菌減少或不增加，腸桿 菌和/或腸球菌明顯增加，但增加的幅度低于雙歧桿菌/乳桿菌增加的幅度。
[0059] 2.結果
[0060] 2.1益生菌組合物對小鼠體重的影響
[0061] 見表1-1。實驗前后受試物組動物體重及實驗期間體重增長與對照組比較，差異無 顯著性(P>0.05)。
[0062] 表1-1益生菌組合物對小鼠體重的影響（i±S,g)
[0065] 2.2益生菌組合物對小鼠腸桿菌數(shù)量的影響
[0066] 見表1-2。實驗前、實驗后腸桿菌數(shù)各劑量組與對照組比較均無顯著性差異（P> 0.05)。對照組及各劑量組實驗前后自身比較，腸桿菌數(shù)量均無顯著性差異(P>0.05)。
[0067]表1-2益生菌組合物對小鼠腸桿菌數(shù)量的影響
[0069] 2.3益生菌組合物對小鼠腸球菌數(shù)量的影響
[0070] 見表1-3。實驗前、實驗后腸球菌數(shù)各劑量組與對照組比較均無顯著性差異（P> 0.05)。對照組及各劑量組實驗前后自身比較，腸球菌數(shù)量均無顯著性差異(P>0.05)。
[0071 ]表1-3益生菌組合物對小鼠腸球菌數(shù)量的影響
[0073] 2.4益生菌組合物對小鼠腸道產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量的影響
[0074] 見表1-4。實驗前、實驗后產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量各劑量組與對照組比較均無顯著性差 異(P>0.05)。對照組及各劑量組實驗前后自身比較，產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量均無顯著性差異(P> 0.05)〇
[0075] 表1-4益生菌組合物對小鼠腸道產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量的影響
[0077] 2.5益生菌組合物對小鼠腸道乳桿菌數(shù)量的影響
[0078]見表1-5。實驗前各組腸道乳桿菌數(shù)比較無顯著性差異(P>0.05)，實驗后高劑量組 腸道乳桿菌數(shù)與對照組比較有顯著性差異(P<〇.05)，中、高劑量組實驗前后自身比較差異 有顯著性(P<0.05)，對照組實驗前后自身比較差異無顯著性(P>0.05)。
[0079]表1-5益生菌組合物對小鼠腸道乳桿菌數(shù)量的影響
[0081 ] 2.6益生菌組合物對小鼠腸道雙歧桿菌數(shù)量的影響
[0082]見表1-6。實驗前各組腸道雙歧桿菌數(shù)比較無顯著性差異(P>0.05)，實驗后高劑量 組腸道雙歧桿菌數(shù)與對照組比較有顯著性差異(P<〇.05)，高劑量組實驗前后自身比較差 異有顯著性(P<〇.05)，對照組實驗前后自身比較差異無顯著性(P>0.05)。
[0083]表1-6益生菌組合物對小鼠腸道雙歧桿菌數(shù)量的影響

[0086] 3 小結
[0087] 在本實驗室條件下，經(jīng)口灌胃給予小鼠0.333g/kg · bw、0.667g/kg · bw、2.000g/ kg · bw劑量的益生菌組合物14天，實驗前后自身比較及實驗后組間比較，小鼠腸道腸球菌、 腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌均無顯著性差異（P>〇 . 05)。實驗前后自身比較，0.667g/kg · bw、 2.000g/kg · bw劑量組小鼠腸道乳桿菌數(shù)及2.000g/kg · bw劑量組腸道雙歧桿菌數(shù)顯著增 加(P<0.05)，實驗后2.000g/kg · bw劑量組小鼠腸道乳桿菌數(shù)、雙歧桿菌數(shù)與對照組比較 顯著增加(P<〇.05)。提示本發(fā)明的益生菌組合物對動物具有調(diào)節(jié)腸道菌群作用。
[0088] (二)益生菌組合物調(diào)節(jié)腸道菌群人體試食試驗
[0089] 1材料和方法
[0090] 1.1樣品
[0091 ]本實施例所制備的益生菌組合物;安慰劑作為對照。人口服每日2次，每次2克。 [0092] 1.2受試對象：
[0093] 1.2.1納入標準:經(jīng)體檢合格符合下列條件的自愿受試者。
[0094] 1.2.1.1-個月內(nèi)未患過胃腸疾病者。
[0095] 1 · 2 · 1 · 2-個月內(nèi)未服用過抗生素者。
[0096] 1.2.2受試者排除標準:年齡在65歲以上者，妊娠或哺乳期婦女，過敏體質(zhì)及對本 品過敏者；合并有心血管、腦血管、肝、腎和造血系統(tǒng)等嚴重疾病及內(nèi)分泌疾病，精神病患 者;停服受試樣品或中途加服其它藥物，無法判斷功效或資料不全者;短期內(nèi)服用與受試功 能有關的物品，影響到對結果的判斷者。
[0097] 1.3試驗方法
[0098] 采用組間對照設計和自身對照設計。將符合納入標準并保證配合試驗的自愿受試 者，按菌群狀況隨機分為試食組和對照組，并盡可能考慮影響結果的主要因素如年齡、性 另IJ、飲食因素等，進行均衡性檢驗。受試者按推薦劑量服用樣品或安慰劑，連續(xù)14天。試驗期 間不改變原來的飲食習慣，正常飲食。
[0099] 2觀察指標
[0100] 各項觀察指標于試食試驗開始及結束時各測定一次。
[0101] 2.1安全性指標
[0102] 2.1.1-般體格檢查:試驗前詳細詢問受試者健康情況，了解受試者的精神、睡眠、 飲食、大小便等情況，并測量體重、血壓、心率，對所有受試者進行常規(guī)體格檢查及必要的實 驗室檢查。
[0103] 2.1.2血常規(guī):紅細胞計數(shù)、白細胞計數(shù)、血紅蛋白含量測定等。
[0104] 2.1.3尿常規(guī):PH值、包細胞、尿糖等。
[0105] 2.1.4糞便常規(guī)。
[0106] 2.1.5血生化檢查(僅在試驗開始前檢查一次）：血清總蛋白（TP)、白蛋白（ALB)、谷 丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、膽固醇(CH0L)、甘油三酯(TG)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、 尿酸(UA)、血糖(GLU)測定。
[0107] 2.1.6心電圖、腹部B超、胸透等檢查(僅在試驗開始前檢查一次）。
[0108] 2.1.7不良反應觀察
[0109] 2.2功效指標
[0110]于試食受試物前和連續(xù)服用受試物14天后，分別采集受試者糞便，進行10倍系列 稀釋，選合適稀釋度，分別接種在各培養(yǎng)基上，按下列要求進行培養(yǎng)，然后對培養(yǎng)物進行菌 落計算。 腸桿菌： 伊紅-美藍培養(yǎng)基 37°C 24h需氧培養(yǎng) 腸球菌： 疊氮鈉-結晶紫-七葉苷培養(yǎng)基 37°C 48h需氧培養(yǎng) 產(chǎn)氣莢膜梭菌:TSC培養(yǎng)基 37°C 24h厭氧培養(yǎng)
[0111] 擬桿菌： 改良GAM培養(yǎng)基 37°C 48h厭氧培養(yǎng) 乳桿菌： LBS培養(yǎng)基 37°C 48h 5%C02培養(yǎng) 雙歧桿菌: 改良BBL培養(yǎng)基 37°C 48h厭氧培養(yǎng)
[0112] 3.結果判定
[0113] 符合以下任一項，且試食組試食前后自身比較及試食后試食組與對照組比較，差 異均有顯著性，可以判定該受試樣品具有調(diào)節(jié)腸道菌群功能的作用。
[0114] 3.1糞便中雙歧桿菌和/或乳桿菌明顯增加，產(chǎn)氣莢膜梭菌減少或不增加，腸桿菌 和/或腸球菌、擬桿菌明顯增加，但增加的幅度低于雙歧桿菌/乳桿菌增加的幅度。
[0115] 4.統(tǒng)計學處理
[0116] 資料結果用均數(shù)土標準差表示，自身配對資料采用配對t檢驗，試食組合對照組之 間在方差齊性的前提下，均數(shù)比較采用成組t檢驗，否則進行變量轉(zhuǎn)化后滿足方差齊性后采 用t檢驗，如果方差仍然不齊，米用秩和檢驗。
[0117] 5.結果
[0118] 雙盲法觀察結束揭曉:服食1號者為安慰劑，服食2號者為益生菌組合物。
[0119] 5.1-般情況:初始試驗人群試食組52例，對照組52例，試食前后，受試者精神、睡 目民、飲食、大小便狀況未見異常。對照組：男/女為19/33,年齡為49.31 ±8.70歲;試食組:男/ 女為18/34,年齡為48.67±8.72歲。
[0120] 5.2安全性觀察
[0121] 5.2.1體重、血壓、心率、尿常規(guī)、大便常規(guī)、血常規(guī)指標
[0122] 見表2-1。食用受試物14天后，試食組和對照組體重、血壓、心率均未見明顯異常改 變，尿常規(guī)、大便常規(guī)、血常規(guī)指標均在正常范圍內(nèi)，提示樣品對機體健康無明顯損害。
[0123] 表2-1試食前后體重、血壓、心率、尿、大便、血常規(guī)變化情況（i±s) L0125J 5.2.2血生化指標
[0126] 見表2-2。食用受試物前試食組和對照組血生化指標均在正常范圍內(nèi)。
[0127] 表2-2試食前生化指標(5士s):
[0130] 5.2.3腹部B超、心電圖、X線胸部透視檢測，均在正常范圍。
[0131] 5.2.4試食期間未見明顯不良反應。
[0132] 5.3功效指標：
[0133] 試食試驗前后腸道菌群數(shù)量變化見表2-3。試食前，對照組和試食組腸道菌群數(shù)量 比較，P值均大于0.05,提示兩組之間具有可比性。試食后試食組乳桿菌和雙歧桿菌數(shù)量與 試食前及對照組試驗后比較增加，差異皆有顯著性(P<〇.05);試食后產(chǎn)氣莢膜梭菌、腸桿 菌、腸球菌和擬桿菌數(shù)量無明顯變化(P > 0.05)。
[0134]表2-3試食前后腸道菌群數(shù)量變化(Cfu/g糞便，log X土 s)
[0136] 注:與試食前比較*P<0.05，與對照組比較*P<0.05
[0137] 5.4脫失率
[0138] 經(jīng)過14天試驗后，試驗組有0例受試者因間斷服用受試品無法判斷效果被篩除;對 照組有〇例受試者因間斷服用受試品無法判斷效果被篩除。最后有效試驗人群試食組52例， 對照組52例。見表2-4。
[0139] 表2-4試驗脫失率
[0141] 6 小結
[0142] 將受試者按菌群狀況隨機分為試食組和對照組，分別服用益生菌組合物或安慰 劑，14天后結果表明：試食組乳桿菌和雙歧桿菌數(shù)量與試食前比較增加，差異有顯著性(P< 0.05);試食后試食組乳桿菌和雙歧桿菌數(shù)量顯著高于對照組(P<0.05);試食后產(chǎn)氣莢膜 梭菌不增加，腸桿菌、腸球菌和擬桿菌數(shù)量無明顯變化。試食后，體重、血壓、心率、尿、大便、 血常規(guī)等各項檢測指標均未見明顯異常改變，試食期間未觀察到明顯不良反應。根據(jù)評價 標準，提示本實施例制備的益生菌組合物具有調(diào)節(jié)人體腸道菌群的作用。
[0143] 二、益生菌組合物增強免疫力功能試驗
[0144] 1材料和方法
[0145] 1.1樣品:本實施例制備的益生菌組合物，人體口服推薦量為每日2次，每次1袋，成 人體重按60kg計算，折合劑量為0.0667g/kg · bw。
[0146] 1.2實驗動物與分組：ICR種雌性小鼠200只，體重18g~22g，由湖南斯萊克景達實 驗動物有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK (湘）2011 -0003。每40只小鼠為一大 組，共五大組。免疫I組，進行碳廓清實驗;免疫π組，進行小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞 實驗；免疫m組，進行遲發(fā)型變態(tài)反應實驗；免疫IV組，進行臟體比值測定、半數(shù)溶血值 (HC5q)的測定和抗體生成細胞數(shù)的測定；免疫V組，進行ConA誘導的小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化實 驗、NK細胞的活性測定。每大組40只小鼠按體重隨機分為4小組，即對照組和低、中、高劑量 組，每組10只小鼠。
[0147] 1.3實驗條件:為屏障環(huán)境，實驗期間環(huán)境溫度22°C~23°C，濕度52%~58%，實驗 動物使用許可證號為SYXK (湘)2010-0010。
[0148] 1.4劑量選擇及樣品處理:據(jù)人體口服推薦量，設本實施例益生菌組合物低、中、高 劑量分別為〇.333g/kg · bw、0.667g/kg · bw、2.000g/kg · bw(分別相當于人體推薦劑量的 5、10、30倍）。試驗時，分別取樣品3.338、6.678、20.0(^加蒸餾水定容至2001111，按0.21111/ IOg · bw體積給小鼠灌胃，對照組灌胃予以等體積的蒸餾水。每天一次，連續(xù)灌胃至少30天。
[0149] 1.5主要儀器與試劑:動物臺秤、分析天平、潔凈工作臺、二氧化碳培養(yǎng)箱、離心機、 722分光光度計、恒溫水浴箱、酶標儀、顯微鏡等。
[0150] 無菌手術器械、游標卡尺、微量注射器、細胞計數(shù)器、24孔和96孔平底細胞培養(yǎng)板， 96孔U型細胞培養(yǎng)板、玻璃器皿、紗布、試管、玻片架、200目篩網(wǎng)、計時器、血色素習慣、載玻 片等。
[0151] SRBC、生理鹽水、Hank ' s液、RPMI1640培養(yǎng)液、小牛血清、青鏈霉素 、ConA、1 %冰醋 酸，lmo 1/L的HCL溶液，酸性異丙醇、MTT、PBS緩沖液(Ph7.2-7.4)、補體(豚鼠血清）、SA緩沖 液、瓊脂糖、都氏試劑、YAC-I細胞、乳酸鈉、硝基氯化四氮唑、吩嗪二甲酯硫酸鹽、氧化型輔 酶I、0.2mo 1/L的Tr i s-HCL緩沖液、2.5 % Tr i ton、印度墨汁、0.1 %的碳酸鈉、雞紅細胞、甲 醇、Giemsa染液等。
[0152] 1.6實驗方法：
[0153] 1.6.1臟器/體重比值測定:稱重后處死小鼠，去除脾臟和胸腺，在電子分析天平上 稱重，計算臟/體比值。
[0154] 1.6.2遲發(fā)型變態(tài)反應(DTH)(足跖增厚法）
[0155] 小鼠腹腔注射2% (v/v)SRBC(0.2ml/每鼠）致敏后4天，測量左后足跖部厚度，然后 再測量部位皮下注射20%(v/v)SRBC(0.2ml/每鼠），于注射后24h測量左后足跖部厚度，同 一部位測量三次，取平均值。以攻擊前后足跖厚度差值(足跖腫脹度)來表示DTH的程度。
[0156] 1.6.3ConA誘導的小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗(MTIti)
[0157] 無菌取脾，置于盛有適量無菌Hank' s液的小平皿中，制成細胞懸液，經(jīng)200目篩網(wǎng) 過濾。用Hank's液洗2次，每次離心10分鐘（1000r/min)。然后將細胞懸浮于ImL完全培養(yǎng)液 中，計數(shù)活細胞，用RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為3 X IO6個/ml。再將細胞懸液分兩孔加 入24孔培養(yǎng)板中，每孔ImL，在其中一孔加75μΙΧοηΑ液(相當于7.5yg/mL)，另一孔作為對照， 置5 %二氧化碳培養(yǎng)箱，37 °C培養(yǎng)72h。培養(yǎng)結束前4h，每孔輕輕吸去上清液0.7mL，加入 0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，同時加入MTT (5mg/mL) 50yL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h。培養(yǎng) 技術后，每孔加入ImL酸性異丙醇，吹打混勻，使紫色結晶完全溶解。然后分裝到96孔培養(yǎng)板 中，每個孔作3個平行孔，用酶標儀，以570nm波長測定光密度值。淋巴細胞的增殖能力用加 ConA孔的光密度值減去不加 ConA孔的光密度值表示。
[0158] 1 · 6 · 4抗體生成細胞檢測(Jerne改良玻片法）
[0159] 取羊血，用生理鹽水洗滌3次，每次離心（2000r/min) IOmin，將壓積SRBC用生理鹽 水配成2% (v/v)的細胞懸液，每鼠腹腔注射0.2ml。4天后將小鼠處死，取脾，輕輕磨碎，用 Hanks液制成細胞懸液，200目篩網(wǎng)過濾，洗滌、離心2次，最后將細胞懸浮在8ml Hanks液中， 計數(shù)細胞，并將細胞濃度調(diào)整為5 X IO6個/mL。將表層培養(yǎng)基加熱溶解后與等量的PH7.4、2 倍濃度的Hanks液混合，分裝小試管，每管0.5ml，再向管內(nèi)加入用SA液配制的10 % SRBC50yL (V/v)、20yL脾細胞懸液(5\106個>〇，迅速混勻后傾倒于已刷薄層瓊脂糖的玻片上，待瓊 脂糖凝固后將玻片水平扣放在玻片架上，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中溫育1.5h，然后用SA液稀 釋的補體(1:8)加入到玻片凹槽內(nèi)，繼續(xù)溫育1.5h后計數(shù)溶血空斑數(shù)。
[0160] 1.6.5半數(shù)溶血值(HC5q)的測定
[0161] 取羊血，用生理鹽水洗滌3次，每只鼠經(jīng)腹腔注射2 % (v/v，用生理鹽水配制） SRBC0.2ml進行免疫。4天后，摘除眼球取血于離心管內(nèi)，放置約lh，將凝固血與管壁剝離，使 血清充分析出，2000rpm離心10min，收集血清。用SA緩沖液將血清稀釋為200倍，取ImL置試 管內(nèi)，依次加入10% (v/v，用SA緩沖液配制)SRBC 0.5mL，補體ImL(用SA緩沖液按1:8稀釋）。 另設不加血清的對照管（以SA緩沖液代替）。置37°C恒溫水浴中保溫30min后，冰浴終止反 應。2000rpm離心10min，取上清lmL，加都氏試劑3mL。同時取10% (v/v，用SA緩沖液配制） SRBC 0.25mL，加都氏試劑至4mL于另一試管中，充分混勾，放置I Omiη后，于540nm處以對照 管作空白，分別測定各管光密度值。溶血素的量以半數(shù)溶血值(HC5q)表示，按下式計算：
[0162] 半數(shù)溶血值(HC5q)=樣品光密度值/SRBC半數(shù)溶血時的光密度值X稀釋倍數(shù)
[0163] 1.6.6小鼠碳廓清實驗
[0164] 小鼠尾靜脈注射以生理鹽水稀釋4倍的印度墨汁，每IOg體重注射O.lmL，墨汁注入 后立即計時，于注入墨汁后第2、IOmin，分別從內(nèi)眥靜脈叢取血20yL，加入到2ml 0.1% Na2CO3溶液中，搖勻。以0.1 ^Na2CO3溶液作空白對照，用722型分光光度計在60nm波長處比 色測光密度值(0D)。將小鼠處死，取肝、脾，稱重，計算吞噬指數(shù)a。
[0165] 1.6.7小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗(半體內(nèi)法）
[0166] 小鼠腹腔注射20 % (v/v，用生理鹽水配制）的雞紅細胞（2000rpmr，IOmin)懸液 ImL，間隔30min，頸椎脫臼處死，仰位固定于鼠板上，正中剪開腹壁皮膚，經(jīng)腹腔注入生理鹽 水2mL，轉(zhuǎn)動鼠板lmin。取腹腔巨噬細胞洗液ImL，滴于載玻片上，放入墊有濕紗布的搪瓷盒 內(nèi)，置37°C孵箱溫育30min。孵畢，于生理鹽水中漂洗以除去未貼片細胞。晾干，以甲醇:丙酮 (1:1)固定，4% (VZV)Giemsa-磷酸緩沖液染色，用蒸餾水漂洗晾干。油鏡下每片計數(shù)100個 巨噬細胞，按下式計算吞噬率和吞噬指數(shù)：
[0167] 吞噬率％ =吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數(shù)/計數(shù)的巨噬細胞數(shù)X 100
[0168] 吞噬指數(shù)=被吞噬的雞紅細胞總數(shù)/計數(shù)的巨噬細胞數(shù)
[0169] 1.6.8NK細胞活性的測定(乳酸脫氫酶測定法）
[0170]受試小鼠頸椎脫臼處死，無菌取脾，制成脾細胞懸液，用Hank's液洗2次，每次離心 IOmin(1000轉(zhuǎn)/min)，棄上清將細胞漿彈起，加入0.5ml滅菌水20秒，裂解紅細胞后再加入 0 · 5ml2倍Hank's液及8ml Hank's液，1000 rpm離心10min，用ImL含10 % 小牛血清的RPMI1640 完全培養(yǎng)液重懸，用1 %冰醋酸稀釋后計數(shù)，用臺酚蘭染色計數(shù)活細胞數(shù)（活細胞數(shù)應在 95%以上），調(diào)整細胞濃度為2 X IO7個/mL此為效應細胞，取傳代后24h生長良好的YAC-I細 胞用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為4 X IO5個/mL此為靶細胞；取靶細胞和效應細胞 各100μLΧ效靶比50:1)，加入U型96孔培養(yǎng)板中；靶細胞自然釋放孔加靶細胞和培養(yǎng)液各100 yL，靶細胞最大釋放孔加靶細胞和2.5 % Triton各IOOyL;上述各項均設三個平行孔，于37 °C，5 %二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，然后將96孔培養(yǎng)板以1500r/min離心5min，每孔吸取上清 IOOyL置平底96孔培養(yǎng)板中，同時加入LDH基質(zhì)液100yL，根據(jù)室溫反應3-10min，每孔加入 lmol/L的HCL30yL，在酶標儀490nm處測定光密度(0D)。
[0171 ] NK細胞活性=【（反應孔OD-自然釋放孔OD)/(最大釋放孔OD-自然釋放孔OD)】X 100%
[0172] 1.7實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計：用Excel、Spss軟件進行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化和統(tǒng)計分析。用Spss軟件分析 時，先對數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗，若方差齊，采用單因素方差分析進行總體比較，發(fā)現(xiàn)差異 再用Dunnett法進行多個劑量組與一個對照組均數(shù)間的兩兩比較。若方差不齊則對原始數(shù) 據(jù)進行適當?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，滿足方差齊性檢驗后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計;若變量轉(zhuǎn)換后仍 未達到方差齊，則改用秩和檢驗進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)總體比較有差異，則采用不要求方差齊性的 Tamhane ' s檢驗進行兩兩比較。
[0173] 2 結果
[0174] 2.1受試物對小鼠體重的影響
[0175] 見表3-1~表3-5。各劑量組實驗初期、實驗中期、實驗末小鼠體重及實驗期間小鼠 體重增長與對照組比較，差異均無顯著性(P>〇.05)。
[0176] 表3-1免疫I組小鼠體重($ 土s，g)
[0180]表3-3免疫ΙΠ 組小鼠體重(i±s，g)
[0187] 2.2受試物對小鼠免疫器官臟器/體重比值的影響
[0188] 見表3-6。受試物各劑量對小鼠脾臟/體重比值和胸腺/體重比值無顯著影響（P> 0.05)〇
[0189] 表3-6受試物對小鼠免疫器官臟器/體重比值的影響（[土s)
[0191 ] 2.3受試物對小鼠細胞免疫功能的影響
[0192] 2.3.1受試物對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(DTH)的影響
[0193] 見表3-7。中、高劑量組小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應能力與對照組比較顯著提高（P< 0.05)〇
[0194] 表3-7受試物對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(DTH)的影響（
[0196] 2.3.2受試物對小鼠 ConA誘導的淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力的影響
[0197] 見表3-8。高劑量組小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力與對照組比較顯著提高(P<0.05)。
[0198] 表3-8受試物對小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力的影響（孓土s:)
[0200] 2.4受試物對體液免疫的影響
[0201 ] 2.4.1受試物對小鼠抗體生成細胞數(shù)的影響
[0202] 見表3-9。中、高劑量組小鼠抗體生成細胞數(shù)與對照組比較顯著提高(P<0.05)。
[0203] 表3-9受試物對小鼠抗體生成細胞數(shù)的影響（
[0205] 2.4.2受試物對小鼠半數(shù)溶血值(HC5q)的影響
[0206] 見表3-10。高劑量組小鼠半數(shù)溶血值(HC5q)與對照組比較顯著提高(P<0.05)。
[0207] 表3-10受試物對小鼠半數(shù)溶血值(HC5q)的影響（[土s)
[0209] 2.5受試物對小鼠單核-巨噬細胞吞噬功能的影響
[0210] 2.5.1受試物對小鼠單核-巨噬細胞碳廓清的影響
[0211]見表3-11。各劑量對單核-巨噬細胞碳廓清能力未見明顯影響(P>0.05)。
[0212]表3-11受試物對小鼠單核-巨細胞碳廓清的影響（X土
[0215] 2 · 5 · 2受試物對小鼠巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力的影響
[0216] 見表3-12-1、3-12_2。受試物各劑量對小鼠巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力無顯著影 響（Ρ>0·05)。
[0217] 表3-12-1受試物對小鼠巨噬細胞吞噬雞紅細胞吞噬率的影響（^土s)
[0219]表3-12-2受試物對小鼠巨噬細胞吞噬雞紅細胞吞噬指數(shù)的影響（^土S)
[0221] 2.6受試物對小鼠 NK細胞活性的影響
[0222] 見表3-13。中、高劑量組小鼠 NK細胞活性與對照組比較顯著提高(P<0.05)。
[0223] 表3-13受試物對小鼠 NK細胞活性的影響（
[0225] 3結論
[0226] 在本實驗室條件下，經(jīng)口灌胃給予小鼠 0.333g/kg · bw、0.667g/kg · bw、2.000g/ kg · bw劑量的受試物30天，2.000g/kg · bw劑量能增加 ConA誘導的淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力、血清 半數(shù)溶血值，與對照組比較差異有顯著性(P<〇.〇5) ;0.667g/kg · bw、2.000g/kg · bw劑量 能增加小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應能力、抗體生成細胞數(shù)、NK細胞活性，與對照組比較差異有顯著 性(P<0.05);對小鼠體重增長、脾臟/體重比值、胸腺/體重比值、小鼠單核-巨噬細胞碳廓 清能力及巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力無明顯影響(P>〇.05)。提示本實施例制備的益生菌 組合物具有增強免疫力的功能。
【主權項】
1. 一種益生菌組合物，其特征在于:所述益生菌組合物主要由下述重量百分比的物質(zhì) 制備而成：嗜酸乳桿菌菌粉1 %-3%、干酪乳桿菌菌粉0.5%-1.5%、乳雙歧桿菌菌粉1 %-3%、甘露低聚糖5 %-8 %、圓苞車前子粉3 %-5 %、低聚果糖40 %-60 %、玉米低聚肽粉2 %-5%、菊粉3%-5%、藍莓粉5%-8%和麥芽糊精10%-25%。2. 根據(jù)權利要求1所述的益生菌組合物，其特征在于:所述益生菌組合物由下述重量百 分比的物質(zhì)制備而成:嗜酸乳桿菌菌粉2%-3%、干酪乳桿菌菌粉1%-1.5%、乳雙歧桿菌菌 粉2%-3%、甘露低聚糖7 %-8%、圓苞車前子粉3%-5 %、低聚果糖40%-60%、玉米低聚肽 粉2 %-5 %、菊粉3 %-5 %、藍莓粉5 %-8 %和麥芽糊精10 %-23 %。3. 根據(jù)權利要求1或2所述的益生菌組合物，其特征在于:所述益生菌組合物由下述重 量百分比的物質(zhì)制備而成:嗜酸乳桿菌菌粉2%、干酪乳桿菌菌粉1%、乳雙歧桿菌菌粉2%、 甘露低聚糖8 %、圓苞車前子粉3%、低聚果糖50%、玉米低聚肽粉2 %、菊粉5%、藍莓粉5 %、 麥芽糊精22 %。4. 根據(jù)權利要求1或2所述的益生菌組合物，其特征在于:所述益生菌組合物由下述重 量百分比的物質(zhì)制備而成:嗜酸乳桿菌菌粉3%、干酪乳桿菌菌粉1%、乳雙歧桿菌菌粉3%、 甘露低聚糖8 %、圓苞車前子粉5%、低聚果糖60%、玉米低聚肽粉2 %、菊粉3%、藍莓粉5 %、 麥芽糊精10 %。5. 根據(jù)權利要求1所述的益生菌組合物，其特征在于:所述益生菌組合物由下述重量百 分比的物質(zhì)制備而成:嗜酸乳桿菌菌粉1 %、干酪乳桿菌菌粉0.5 %、乳雙歧桿菌菌粉1.5 %、 甘露低聚糖5 %、圓苞車前子粉3%、低聚果糖50%、玉米低聚肽粉2 %、菊粉3%、藍莓粉5 %、 麥芽糊精10 %。6. 根據(jù)權利要求1或2所述的益生菌組合物，其特征在于:所述益生菌組合物由下述重 量百分比的物質(zhì)制備而成：嗜酸乳桿菌菌粉3%、干酪乳桿菌菌粉1.5%、乳雙歧桿菌菌粉 3%、甘露低聚糖7%、圓苞車前子粉4.5%、低聚果糖40%、玉米低聚肽粉5%、菊粉5%、藍莓 粉8%、麥芽糊精23 %。7. 根據(jù)權利要求1所述的益生菌組合物，其特征在于:所述益生菌組合物由下述重量百 分比的物質(zhì)制備而成:嗜酸乳桿菌菌粉2.5 %、干酪乳桿菌菌粉1.5 %、乳雙歧桿菌菌粉1 %、 甘露低聚糖5 %、圓苞車前子粉5%、低聚果糖60%、玉米低聚肽粉5 %、菊粉5%、藍莓粉5 %、 麥芽糊精10 %。8. -種制備權利要求1-7中任一所述的益生菌組合物的方法，包括以下步驟： (1) 按重量百分比將嗜酸乳桿菌菌粉、干酪乳桿菌菌粉和乳雙歧桿菌菌粉混合均勻得 到混合物A; (2) 按重量百分比將圓苞車前子粉和玉米低聚肽粉混合均勻得到混合物B; (3) 按重量百分比將所述混合物A與菊粉混合均勻得到混合物C，按重量百分比將所述 混合物B與藍莓粉混合均勻得到混合物D; (4) 按重量百分比將所述混合物C、所述混合物D與甘露低聚糖混合均勻得到混合物E; (5) 按重量百分比將所述混合物E與麥芽糊精混合均勻得到混合物F; (6) 按重量百分比將所述混合物F與低聚果糖混合均勻即得本發(fā)明的益生菌組合物。9. 權利要求1-7中任一所述的益生菌組合物在調(diào)節(jié)腸道菌群和/或增強人體的免疫力 中的應用。
【文檔編號】A23L33/135GK106072657SQ201610408040
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月8日
【發(fā)明人】曲明, 李文艷, 趙福健
【申請人】天津隆順榕發(fā)展制藥有限公司