一種松木層孔菌超臨界萃取物作為抑菌劑的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種松木層孔菌提取物的應(yīng)用，特別涉及一種松木層孔菌超臨界萃取 物作為抑菌劑的應(yīng)用。 (二）
【背景技術(shù)】
[0002] 每年世界上食品因微生物腐敗造成的損失不計其數(shù)，食品腐敗變質(zhì)不僅會使食品 喪失營養(yǎng)價值，還會造成食物中毒。為了延長食品貯運和保藏期限，在食品加工過程中除殺 (滅）菌外，還普遍采用通過添加防腐劑的手段，使微生物喪失活性、延緩或阻止其生長。食 品防腐劑按來源通常分為合成防腐劑與天然防腐劑兩大類。目前國內(nèi)外大量使用的食品防 腐劑仍以化學(xué)合成為主，如對羥基苯甲酸酯、苯甲酸、山梨酸及其鹽類等化學(xué)合成防腐劑。 但是，經(jīng)過長期的應(yīng)用和研究發(fā)現(xiàn)，這些化學(xué)防腐劑對人體都會有或多或少的毒害作用，尤 其在長期使用或過量使用時，一些合成防腐劑還存在誘癌性、致畸性和易引起食物中毒等 問題。
[0003]相比上述的化學(xué)合成防腐劑，天然防腐劑，尤其是食品來源，或經(jīng)長期使用的藥用 植物或真菌來源，不僅具有安全無毒的優(yōu)點，而且通常還具有一定的營養(yǎng)和保健功效。隨著 社會和經(jīng)濟(jì)發(fā)展，消費者健康意識的增強(qiáng)，天然防腐劑已成為研究和開發(fā)的趨勢。
[0004] 食藥真菌是一類具有較高營養(yǎng)或藥用價值的高等真菌，普遍具有抗腫瘤、降血糖、 降血脂、抗病毒和增強(qiáng)免疫力等諸多功效。另外一些食藥真菌的子實體或菌絲體的提取物 也顯示了一定的防腐抑菌作用，如樺褐孔菌、紅菇、松乳菇、楊樹菇、木蹄層孔菌、蒙古口蘑、 巨大口蘑、棘托竹蓀、虎奶菇、大禿馬勃、大球蓋菇、鮑魚菇、巴西蘑菇等。但有些采用了有毒 有害的有機(jī)溶劑萃取，從安全性考慮，不可避免對食品應(yīng)用有少許殘留，因此無實際食品的 防腐應(yīng)用價值，另外有機(jī)溶劑易燃易爆，生產(chǎn)安全性也較差。如2009年，劉迎秋等人采用紙 片法研究了樺褐孔菌的水、甲醇、丙酮、氯仿、石油醚提取物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌 的抑制作用，發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌各提取物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有不同程度的抑制作 用。2009年，方熹君等人研究表明，在10~40mg/mL的濃度范圍內(nèi)，虎奶菇發(fā)酵液不同組 分的抑菌作用大小依次為正丁醇萃取物 > 乙酸乙酯萃取物> 萃余發(fā)酵液，正己烷萃取物無 活性。2010年，陳敬華等人申請的"具有抑菌活性的竹蓀子實體提取物及其應(yīng)用"（申請?zhí)?201010578196. 4)，長裙竹蓀子實體經(jīng)過粉粹，過篩，分別依次用石油醚、乙醚、乙酸乙酯、無 水乙醇、甲醇經(jīng)索氏提取器提取，提取液分別減壓濃縮至干，得到各溶劑提取物，各提取液 對常見致病、致腐微生物有較好的抑制作用。
[0005] 本發(fā)明涉及的松木層孔菌（Phellinuspini)，又名松針層孔菌、松白腐菌、 黃芝、松黃靈、紅緣樹舌、松生層孔、紅緣層孔菌，隸屬于擔(dān)子菌門、傘菌綱，銹革孔菌目 (Hymenochaetales)，銹革孔菌科（Hymenochaetaceae)，木層孔菌屬（Phellinus)，是一種 能引起樹材腐朽的白腐真菌，主要寄生于云杉、落葉松等針葉樹活立木上，集中產(chǎn)地在東 北、華北、西北、西南等原始森林地區(qū)。已有研究表明松木層孔菌在抑制腫瘤、治療肝炎、提 高免疫力、降血糖、抗氧化等方面顯示了較強(qiáng)的功效。但尚未發(fā)現(xiàn)松木層孔菌及其提取物在 防腐抑菌方面的報道。
[0006] 超臨界流體萃?。╯upercriticalfluidextraction，簡稱SFE)，是近幾十年發(fā)展 起來的一種新興分離技術(shù)，與傳統(tǒng)的化學(xué)溶劑萃取法相比，具有無化學(xué)溶劑消耗和殘留、無 污染、利于熱敏物質(zhì)萃取和產(chǎn)物的生物活性保留高等特點。
[0007] 本發(fā)明通過超臨界萃取，得到的松木層孔菌提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌 和枯草芽孢桿菌均顯示了較好的抑菌效果，工藝和制備過程安全，不涉及有毒有害溶劑，是 一種良好的天然抑菌劑，同時可能還兼有松木層孔菌原有的增強(qiáng)免疫和抗癌等功效。 (三）

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明目的是提供一種從松木層孔菌中超臨界萃取得到的天然抑菌劑，具有使用 安全性高的特點，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌具有抑菌性，且超臨界萃取 是非極性，可用于油脂類的抑菌劑，以期應(yīng)用于食品的防腐和貯藏保鮮。
[0009] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0010] 本發(fā)明提供一種松木層孔菌超臨界萃取物作為抑菌劑的應(yīng)用，所述超臨界萃取物 是將松木層孔菌子實體進(jìn)行超臨界CO2萃取獲得的萃取物，所述超臨界萃取條件為：以CO2 為超臨流體，萃取壓力為20~40MPa，時間1~3h，溫度30°C-50°C，OV流速為10~20g/ min。通常得到的萃取物呈浸膏狀。
[0011] 進(jìn)一步，所述松木層孔菌子實體在萃取前先粉碎，過20~40目篩，40~60°C干 燥，獲得松木層孔菌子實體粉末；然后將粉末加入CO2超臨界萃取儀的萃取釜進(jìn)行CO2超臨 界萃取。
[0012] 進(jìn)一步，優(yōu)選所述萃取壓力為30~40MPa，時間2~3h，溫度30°C-50°C，OV流速 為 15 ~20g/min〇
[0013] 本發(fā)明所述抑菌劑為大腸桿菌抑菌劑、金黃色葡萄球菌抑菌劑或枯草芽孢桿菌抑 菌劑。
[0014] 本發(fā)明所述超臨界萃取物對大腸桿菌或金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為 2. 5mg/mL，對枯草芽孢桿菌的最低抑菌濃度均為5.Omg/mL。
[0015] 本發(fā)明所述松木層孔菌（Phellinuspini)子實體，又名松針層孔菌、松白腐菌、 黃芝、松黃靈、紅緣樹舌、松生層孔、紅緣層孔菌，隸屬于擔(dān)子菌門、傘菌綱，銹革孔菌目 (Hymenochaetales)，銹革孔菌科（Hymenochaetaceae)，木層孔菌屬（Phellinus)，是一種 能引起樹材腐朽的白腐真菌，主要寄生于云杉、落葉松等針葉樹活立木上，集中產(chǎn)地在東 北、華北、西北、西南等原始森林地區(qū)。
[0016] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明對松木層孔菌進(jìn)行安全 性高的超臨界CO2萃取，測定發(fā)現(xiàn)該提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌等 幾種食品常見細(xì)菌均有較好的抑制效果；本發(fā)明所述超臨界萃取物對大腸桿菌或金黃色葡 萄球菌的最低抑菌濃度為2. 5mg/mL，對枯草芽孢桿菌的最低抑菌濃度均為5.Omg/mL;由于 超臨界萃取物是非極性，可用于油脂類的抑菌劑，以期應(yīng)用于食品的防腐和貯藏保鮮。 (四）
【具體實施方式】
[0017] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此：
[0018] 實施例I:
[0019] (1)松木層孔菌萃取物
[0020] 松木層孔菌子實體一剪碎至0. 3-0. 6cm3的小塊一機(jī)械粉碎過30目篩一50°C干 燥一稱取180g-CO2超臨界萃取（超臨界萃取儀：美國Thar超臨界流體超細(xì)微造粒系統(tǒng) SFP，美國Thar科技公司有限公司），萃取壓力為30MPa，時間2h，溫度40°C，OV流速為15g/ min-收集分離釜中棕色油狀萃取物一稱重為I. 56g，得率0. 87% -抑菌測定一松木層孔 菌抑制劑。
[0021] (2)松木層孔菌萃取物性能
[0022] 1.供試菌株：大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌菌株，由浙江工業(yè)大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院微生物實驗室提供，樣本在該實驗室貯藏。
[0023] 2?實驗方法
[0024] 2. 1供試菌株的制備：
[0025] 將所有供試菌種移接入營養(yǎng)瓊脂試管斜面培養(yǎng)基上，每種菌種接多支重復(fù)。并將 接種有大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的斜面培養(yǎng)基置于37°C生化培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24h。每種菌種取2支供試驗用，其余冷藏備用。
[0026] 2. 2菌懸液的制備
[0027] 挑取各菌落接種營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平皿，三種供試菌均培養(yǎng)24h，用無菌生理鹽水洗 脫，分別制成含菌約IO7CFUAiL的菌懸液。
[0028] 具體制備方法：分別挑取少量細(xì)菌孢子至無菌生理鹽水中洗出一玻璃珠打散一制 成菌懸液一調(diào)菌懸液濃度為10 7CFU/mL，備用。
[0029] 2. 3營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板制備：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基3. 2g，加水100ml，pH自然。
[0030] 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基主要成分（g/L):蛋白胨10. 0 ;牛肉浸出粉5. 0 ;氯化鈉5. 0 ;瓊脂 12. 0,pH7. 3±0. 1(25°C)。
[0031] 配制好的培養(yǎng)基，121°C濕熱滅菌30min后，冷卻至50-60°C，無菌操作傾注于干熱 滅菌的培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿15-20mL。
[0032] 2. 4最低抑菌濃度（MIC)測定
[0033] ①分別取步驟（1)制備的松木層孔菌超臨界萃取物，加已滅菌的二甲基亞砜 (DMSO)配制成一定梯度的稀釋液（稀釋濃度分別為10mg/mL，5mg/mL，2. 5mg/mL，I. 25/mL) 作為抑菌原液；并另取一支不加藥品（即松木層孔菌超臨界萃取物）的空白液體培養(yǎng)基作 為對照樣品（用等量二甲基亞砜代替松木層孔菌超臨界萃取物）。
[0034] ②用移液槍移取10yL的菌懸液（IO7CFUAiL)至營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板表面，用三 角涂布棒將其涂布