利用微生物處理煙草廢棄物生產(chǎn)牲畜飼料配料的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明的實(shí)施方式涉及煙田廢棄物回收再利用技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明的實(shí)施方式涉及一種利用微生物處理煙草廢棄物生產(chǎn)牲畜飼料配料的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]我國是世界上烤煙產(chǎn)量最高、種植面積最大的國家，2014年度全國烤煙原煙調(diào)撥量達(dá)到4100萬擔(dān)(一擔(dān)為50公斤)，種植面積約為2000萬畝。煙草植株一生經(jīng)歷苗期、團(tuán)棵期、旺長期和成熟期，除了具有工業(yè)適用性的煙葉葉片外，煙草植株其他部位，如煙桿、煙根、煙花、煙杈、腋芽、打葉除掉的頂葉和腳葉作為煙草廢棄物，大量丟棄在田間，既造成了污染，也是巨大的浪費(fèi)。
[0003]2011年3月份國家煙草專賣局提出了“優(yōu)化等級結(jié)構(gòu)，提高優(yōu)質(zhì)煙葉的有效供給能力”的戰(zhàn)略部署，對于大田煙葉的采收標(biāo)準(zhǔn)提出了更高的要求，勢必造成田間產(chǎn)生更多的工業(yè)不適用煙葉，而煙草葉片中含有多種豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、糖類、纖維素、果膠等，其中蛋白質(zhì)含量達(dá)到8% -15%。蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，沒有蛋白質(zhì)就沒有生命。一種好的牲畜飼料，要求含有較高比例的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，而田間打葉去除掉的煙草頂葉和腳葉中，蛋白質(zhì)含量高，且蛋白質(zhì)質(zhì)量好。雖然豆類植物蛋白質(zhì)含量豐富，是牲畜飼料的優(yōu)質(zhì)來源，但豆類如豌豆中，含有胰蛋白酶抑制因子、外源植物凝集素、致胃腸脹氣因子，不宜生喂。蛋白質(zhì)被吸收的最終形態(tài)是氨基酸和部分小分子多肽，直接將飼料中的蛋白質(zhì)降解為氣基酸和多狀，能提尚蛋白質(zhì)的吸收率。此外，煙葉中由于含有2%?4%左右的煙喊，利用降煙堿菌株將煙葉中的煙堿大部分代謝，轉(zhuǎn)化為氨基酸和其他含氮化合物，提高其作為飼料的安全性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用微生物處理煙草廢棄物生產(chǎn)牲畜飼料配料的方法，有效利用降蛋白微生物對廢棄煙葉進(jìn)行處理，將大分子蛋白質(zhì)部分降解為小分子多肽和氨基酸，利用降煙堿微生物將煙堿代謝轉(zhuǎn)化為氨基酸和其他含氮化合物，將處理后的煙葉作為常規(guī)飼料的配料對牲畜進(jìn)行喂養(yǎng)，豐富了原常規(guī)飼料的營養(yǎng)并降低喂養(yǎng)成本。
[0005]為解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明的一種實(shí)施方式采用以下技術(shù)方案:
[0006]一種利用微生物處理煙草廢棄物生產(chǎn)牲畜飼料配料的方法，它包括以下步驟:
[0007](I)將廢棄的煙草頂葉和腳葉粉碎得到粉碎料，粉碎料的直徑為0.75?0.85cm ；
[0008](2)將具有降蛋白作用的芽孢桿菌菌株活化后發(fā)酵培養(yǎng)使菌液中菌體濃度達(dá)到17?10 1(lcfu/ml，然后按照步驟(I)所述粉碎料質(zhì)量10%?20%的噴施比例將菌液噴灑在所述粉碎料的表面；
[0009](3)將具有降煙堿作用的芽孢桿菌菌株活化后發(fā)酵培養(yǎng)使菌液中菌體濃度達(dá)到17?101(lCfu/ml，然后按照步驟(I)所述粉碎料質(zhì)量5%?10%的噴施比例將菌液噴灑在所述粉碎料的表面；
[0010](4)將噴灑了上述兩種菌液的粉碎料混合均勻后在遮陰、排水通暢的角落堆放3?5天獲得飼料配料；
[0011](5)將所述飼料配料按照牲畜飼料質(zhì)量10%?30%的比例添加到牲畜飼料中喂養(yǎng)牲畜。
[0012]步驟(2)所述的菌液和步驟(3)所述的菌液可以同時(shí)噴灑在粉碎料上，也可以先噴灑步驟(2)所述的菌液，再噴灑步驟(3)所述的菌液，或者先噴灑步驟(3)所述的菌液，再噴灑步驟(2)所述的菌液。
[0013]進(jìn)一步的技術(shù)方案是:所述具有降蛋白作用的芽孢桿菌菌株的制備方法是:
[0014]A、初篩
[0015]先用酪蛋白20.0g/L、NaC15.0g/L、瓊脂15.0g/L制培養(yǎng)基，調(diào)pH為7.2，滅菌后備用；稱取煙田土壤樣品1g加入90ml無菌水中，在搖床上室溫振蕩20min，靜置20?30s即成KT1稀釋液；吸取ImllO ―1稀釋液加入9ml無菌水中，吹吸3次即成10 _2稀釋液；以此類推，連續(xù)稀釋制成10_3、10_4、10_5稀釋液；取各種稀釋度菌液Iml放入直徑9cm的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，將上述培養(yǎng)基熔化后冷卻至50°C，迅速倒入無菌培養(yǎng)皿中，每皿15ml，混合均勻，待凝固后在37°C恒溫培養(yǎng)7天，挑取產(chǎn)生透明圈的菌落分離純化后接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中得到菌液，30°C、120rpm條件下振蕩培養(yǎng)18?20h，備用；
[0016]B、復(fù)篩
[0017]將麩皮、水、濃度1%的葡萄糖溶液按照1kg: 1L:1L的比例混合均勻制成復(fù)篩培養(yǎng)基，將復(fù)篩培養(yǎng)基分裝在三角瓶中，滅菌，趁熱抖散，冷卻至40°C以下后接種步驟A備用的菌液，接種量為三角瓶中復(fù)篩培養(yǎng)基質(zhì)量的10 %，35?37 °C培養(yǎng)48h，39 °C烘干后測定中性蛋白酶活性，篩選出產(chǎn)蛋白酶能力最強(qiáng)的菌株；
[0018]C、煙葉發(fā)酵
[0019]將步驟B篩選出來的產(chǎn)蛋白酶能力最強(qiáng)的菌株接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，30°C、120rpm條件下振蕩培養(yǎng)18h得到種子培養(yǎng)液備用；取煙葉50g放入三角瓶中，滅菌，冷卻后接種種子培養(yǎng)液50ml，30°C靜置培養(yǎng)30天，檢測煙葉中蛋白質(zhì)含量，蛋白質(zhì)含量最低的三角瓶中為具有降蛋白作用的芽孢桿菌菌株。
[0020]具有降蛋白作用的芽孢桿菌菌株能夠降解蛋白質(zhì)，將大分子蛋白質(zhì)部分降解為小分子多肽和氨基酸，提高蛋白質(zhì)利用率。
[0021]更進(jìn)一步的技術(shù)方案是:步驟A所述接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基得到的菌液振蕩培養(yǎng)至OD值達(dá)到0.7?0.8時(shí)停止振蕩培養(yǎng)。
[0022]更進(jìn)一步的技術(shù)方案是:步驟B中所述三角瓶分裝復(fù)篩培養(yǎng)基的量為每500ml三角瓶分裝麩皮干重30?40g的復(fù)篩培養(yǎng)基。
[0023]更進(jìn)一步的技術(shù)方案是:所述具有降煙堿作用的芽孢桿菌菌株的制備方法是:
[0024]a、制備培養(yǎng)基
[0025]富集培養(yǎng)基的制備:按照蛋白胨5.0g/L, NaCll.0g/L, K2HPO4L Og/L、瓊脂1.5g/L溶解于水中，調(diào)pH為7.0，滅菌，冷卻后加入煙堿2000mg/L ；
[0026]初篩培養(yǎng)基和復(fù)篩培養(yǎng)基的制備:按照K2HPO4L 0g/L, MgSO40.5g/L、濃度0.1 %的MnSO4溶液lml/L、濃度0.1 %的FeSO 4溶液3ml/L、瓊脂1.5g/L溶解于水中，調(diào)pH為6.0?7.0，滅菌，若冷卻后加入煙堿4000mg/L得到初篩培養(yǎng)基，若冷卻后加入煙堿2000mg/L得到復(fù)篩培養(yǎng)基；
[0027]種子培養(yǎng)基的制備:按照牛肉膏3.0g/L、蛋白胨5.0g/L、NaC13.0g/L溶解于水中，調(diào)pH為7.0，滅菌；
[0028]發(fā)酵培養(yǎng)基的制備:將50g煙葉盛于三角瓶中，滅菌；
[0029]b、初篩
[0030]在煙葉基地取煙田土壤10g，加入10ml富集培養(yǎng)基中，30°C靜置培養(yǎng)48h獲得富集培養(yǎng)液，然后取Iml富集培養(yǎng)液接種于裝有50°C初篩培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，混合均勻，凝固后于30°C恒溫培養(yǎng)箱7天，挑取菌落劃線分離純化三次后保藏備用；
[0031]C、復(fù)篩
[0032]將初篩得到的菌株接種于復(fù)篩培養(yǎng)基中，30°C、120rpm條件下振蕩培養(yǎng)96小時(shí)，HPLC檢測發(fā)酵液中煙堿的含量，挑選出煙堿含量降低的培養(yǎng)基，獲得其中的菌株；
[0033]d、煙葉發(fā)酵
[0034]將復(fù)篩得到的菌株接種于種子培養(yǎng)基中，30°C、120rpm條件下振蕩培養(yǎng)18小時(shí)，轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基，于30°C靜置培養(yǎng)30天，檢測到煙堿含量降低，該復(fù)篩得到的菌株即為具有降煙堿作用的芽孢桿菌菌株。
[0035]具有降煙堿作用的芽孢桿菌菌株能夠降低煙葉廢料中的煙堿，從而減少煙堿對牲畜的影響。
[0036]更進(jìn)一步的技術(shù)方案是:所述滅菌的條件是121°C滅菌30?35分鐘。
[0037]更進(jìn)一步的技術(shù)方案是:步驟(2)所述菌液的噴施比例為質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%?20%。
[0038]更進(jìn)一步的技術(shù)方案是:步驟(3)所述菌液的噴施比例為質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%?10%。
[0039]本發(fā)明所述牲畜是指兔子、豬、牛、羊、雞等。在噴灑兩種菌液到粉碎料表面時(shí)，兩種菌液的噴灑可以同時(shí)進(jìn)行，也可以先后實(shí)施。
[0040]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果之一是:本發(fā)明合理利用了煙草廢棄物，即是對廢棄資源的回收再利用，又是對環(huán)境污染的有效控制。將大田被扔棄的煙草頂葉和腳葉利用生物手段，即利用降蛋白微生物將煙葉中的大分子蛋白質(zhì)降解為小分子多肽和氨基酸，接近蛋白質(zhì)在動(dòng)物體內(nèi)吸收的最終形態(tài)，提高了蛋白質(zhì)的有效利用率，利用降煙堿微生物對煙葉中的煙堿進(jìn)行降解，得到產(chǎn)物為氨基酸和其他含氮化合物，增加了煙葉作為牲畜飼料配料的適用性和安全性。在此過程中，廢棄煙葉被粉碎為直徑0.8cm左右的碎末，提高了微生物菌株的作用效果，發(fā)酵后的煙草碎末按照10%?30%的比例添加到牲畜常用的飼料中，提高了飼料中蛋白質(zhì)的吸收率，節(jié)約了牲畜飼養(yǎng)成本。
[0041]將本專利處理得到的煙草碎末按照10%?30%添加到常規(guī)飼料中對牲畜進(jìn)行飼養(yǎng)，對照組比空白組牲畜體重平均增加5%?10%，節(jié)約經(jīng)濟(jì)成本8%?25%。
【具體實(shí)施方式】
[0042]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0043]一、具有降蛋白作用的芽孢桿菌菌株的分離純化:
[0044]A、初篩
[0045]先用酪蛋白20.0g、NaC15.0g、瓊脂15.0g與蒸餾水定容為IL制培養(yǎng)基，調(diào)pH為
7.2，滅菌后備用；稱取煙田土壤樣品(重慶豐都太平煙葉基地)1g加入90ml無菌水中，在搖床上室溫振蕩20min，靜置25s即成KT1稀釋液；吸取ImllO ―1稀釋液加入9ml無菌水中，吹吸3次即成10_2稀釋液；以此類推，連續(xù)稀釋制成10_3、10_4、10_5稀釋液；取各種稀釋度菌液Iml放入直徑9cm的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，將上述培養(yǎng)基熔化后冷卻至50°C，迅速倒入無菌培養(yǎng)皿中，每皿15ml，混合均勻，待凝固后在37°C恒溫培養(yǎng)7天，挑取產(chǎn)生透明圈的菌落分離純化后接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中得到菌液，30°C、120rpm條件下振蕩培養(yǎng)18?20h，備用;
[0046]B、復(fù)篩
[0047]將麩皮、水、濃度I %的葡萄糖溶液按照1kg: 1L:1L的比例混合均勻制成復(fù)篩培養(yǎng)基，將復(fù)篩培養(yǎng)基分裝在三角瓶中，滅菌，趁熱抖散，冷卻至40°C以下后接種步驟A備用的菌液，接種量為三角瓶中復(fù)篩培養(yǎng)基質(zhì)量的10 %，35 °C培養(yǎng)48h，39 V烘干后測定中性蛋白酶活性，篩選出產(chǎn)蛋白酶能力最強(qiáng)的菌株；
[0048]C、煙葉發(fā)酵
[0049]將步驟B篩選出來的產(chǎn)蛋白酶能力最強(qiáng)的菌株接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，30°C、120rpm條件下振蕩培養(yǎng)18h得到種子培養(yǎng)液備用；取煙葉50g放入三角瓶中，滅菌，冷卻后接種種子培養(yǎng)液50ml，30°C靜置培養(yǎng)30天，檢測煙葉中蛋白質(zhì)含量，蛋白質(zhì)含量最低的三角瓶中為具有降蛋白作用的芽孢桿菌菌株，該菌株用于制備牲畜飼料。
[0050]二、具有降煙堿作用的芽孢桿菌菌株的分離純化:
[0051]富集培養(yǎng)基:將蛋白胨5.0g、NaCll.0g、K2HPO4L 0g、瓊脂1.5g和水定容為1L，pH7.