RS固體培養(yǎng)基平板（平板D);②將干 酪乳桿菌（Lactobacillus casei Shirota)的誘變后代涂布其中一個平板后，再用纖維素 膜影印至另一個平板，使平板C和平板D互為影印平板；③在平板C與平板D的同一位置， 平板C出現(xiàn)菌落而平板D未出現(xiàn)菌落，或平板C上的菌落顯著大于平板D上的菌落，則該菌 落甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型干酪乳桿菌，命名為LcS-Mef，保藏于MRS固體培養(yǎng)基（斜面）中。
[0129] (3)BN-NKPQQ-RWX-512 的活化培養(yǎng)
[0130] 將保存于豆芽汁獼猴桃汁固體培養(yǎng)基（斜面）中的BN-NKPQQ-RWX-512取一環(huán)，接 種至豆芽汁獼猴桃汁液體培養(yǎng)基活化，培養(yǎng)溫度35°C，培養(yǎng)結(jié)束菌種密度達到10 9cfu/mL左 右。
[0131] (4)LcS-Met_ 的活化培養(yǎng)
[0132] 將保存于MRS固體培養(yǎng)基（斜面）中的LcS_Met_取一環(huán)，接種至MRS液體培養(yǎng)基 37°C活化培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束菌種密度達到10 9cfu/mL左右。
[0133] (5)富含NK和PQQ的獼猴桃汁的發(fā)酵制備
[0134] 將活化的BN-NKPQQ-RWX-512與LcS-Met_混合，使混合菌液中二者密度比為 1:5 (1 X 108CFM/mL: 5 X 108CFM/mL)，混合菌液以5 %接種量接種含獼猴桃汁的發(fā)酵培養(yǎng)基， 37°C六層紗布封口培養(yǎng)36h，得到富含NK和PQQ的獼猴桃汁。含獼猴桃汁的發(fā)酵培養(yǎng)基中 所含豆芽汁、酪氨酸、谷氨酸和麥芽糖對BN-NKPQQ-RWX-512合成NK和PQQ進行代謝調(diào)控， 豆芽汁有利于納豆芽孢桿菌增殖，麥芽糖有利于NK合成，而PQQ由酪氨酸和谷氨酸通過肽 鍵連接環(huán)化而成。發(fā)酵結(jié)束后，獼猴桃汁中NK活力664U/mL，PQQ含量83ng/mL。所獲得的 獼猴桃汁富含納豆激酶和吡咯喹啉醌，具有獼猴桃汁固有的滋味和發(fā)酵后特有的風(fēng)味。
[0135] 本發(fā)明中采用色譜法測定PQQ，具體步驟參照"Noji N, Nakamura T，Kitahata N, et al. Simple and sensitive method for pyrroloquinoline quinone(PQQ)analysis in various foods using liquid chromatography/electrospray-lonization tandem mass spectrometry. J Agri Food Chem，2007, 55 (18): 7258-7263.'，〇
[0136] 本發(fā)明中采用瓊脂糖-纖維蛋白原平板法測定NK活力。測定步驟：將發(fā)酵液過濾 后點種在瓊脂糖-纖維蛋白平板上，37°C孵育18h，以尿激酶作為標準品，通過測量透明圈 直徑計算納豆激酶相當(dāng)于尿激酶的活力單位（U/mL)。
【主權(quán)項】
1. 一種富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的發(fā)酵獼猴桃汁的制作方法，其特征在于，包括以 下步驟： 1) 、將產(chǎn)納豆激酶兼吡咯喹啉醌的納豆芽孢桿菌10261和納豆芽孢桿菌10263分別進 行亞硝基胍誘變；然后混合二者誘變后代，進行細胞融合傳代培養(yǎng)，高通量篩選得到高產(chǎn)納 豆激酶兼吡咯喹啉醌的納豆芽孢桿菌，命名為納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-512 ; 2) 、將干酪乳桿菌進行亞硝基胍誘變，從中篩選出甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型的干酪乳桿菌， 命名為干酪乳桿菌LcS-Met_; 3) 將納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-512和干酪乳桿菌LcS-Met_*發(fā)酵獼猴桃汁，得到 富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的獼猴桃汁。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的發(fā)酵獼猴桃汁的制作方法，其 特征在于，步驟1)中，所述的高通量篩選具體包括：①制備2個平板豆芽汁獼猴桃汁固體培 養(yǎng)基，其中一個將小鼠抗PQQ IgG單抗PQQ-mAb配入，形成平板A，另一個將瓊脂糖-纖維 蛋白配入，形成平板B ;②將納豆芽孢桿菌10261和納豆芽孢桿菌10263的誘變?nèi)诤虾蟠?布其中一個平板后，再用纖維素膜影印至另一個平板，使平板A和平板B互為影印平板；③ 平板A中，高產(chǎn)吡咯喹啉醌的誘變?nèi)诤虾蟠渲車纬扇庋劭梢姵恋砣?，根?jù)沉淀圈直 徑大小可肉眼判斷產(chǎn)吡咯喹啉醌量大?。虎芷桨錌中，高產(chǎn)納豆激酶的誘變?nèi)诤虾蟠?周圍形成透明圈，根據(jù)透明圈直徑大小可肉眼判斷產(chǎn)納豆激酶活力高低；⑤平板A與平板 B中，高產(chǎn)吡咯喹啉醌菌落與高產(chǎn)納豆激酶菌落處于同一位置者，即為高產(chǎn)納豆激酶兼吡咯 喹啉醌的納豆芽孢桿菌。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的發(fā)酵獼猴桃汁的制作方法，其 特征在于，步驟1)中，所述的平板豆芽汁獼猴桃汁固體培養(yǎng)基以IL計，由以下量的組分組 成： 獼猴桃汁 100?150mL; 庶糖 4.0?6.Og; 瓊脂 1.5?2.0g; 豆芽汁 余量。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的發(fā)酵獼猴桃汁的制作方法，其 特征在于，步驟2)中，所述的從中篩選出甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型的干酪乳桿菌，具體包括：① 制備2個平板MRS固體培養(yǎng)基，其中一個將甲硫氨酸配入，為平板C，另一個為單純MRS固 體培養(yǎng)基平板，為平板D ;②將誘變后的干酪乳桿菌涂布其中一個平板后，再用纖維素膜影 印至另一個平板，使平板C和平板D互為影印平板；③在平板C與平板D的同一位置，平板 C出現(xiàn)菌落而平板D未出現(xiàn)菌落，或平板C上的菌落顯著大于平板D上的菌落，則該菌落為 甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型干酪乳桿菌。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的發(fā)酵獼猴桃汁的制作方法，其 特征在于，步驟2)中，所述的平板MRS固體培養(yǎng)基以IL計，由以下量的組分組成： 蛋白胨 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 豐寧檬酸氫二銨 2.Og; 葡萄糖 20.0g; 乙酸鈉 5.0g; 磷酸氫二鉀 2.0g; 硫酸鎂 〇.58g; 硫酸錳 0.25g; 瓊脂 20g; 吐溫 80 l.OmL； 水 余量； 該MRS固體培養(yǎng)基的pH值保持在6. 2?6. 4。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的發(fā)酵獼猴桃汁的制作方法， 其特征在于，步驟3)中，在共發(fā)酵之前，將納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-512和干酪乳桿菌 LcS-Met_分別進行活化培養(yǎng)，納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-512在豆芽汁獼猴桃汁液體培養(yǎng) 基中進行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為34?36 °C，干酪乳桿菌MRS液體培養(yǎng)基中進行 活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為36?38 °C。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的發(fā)酵獼猴桃汁的制作方法，其 特征在于，步驟3)中，所述的豆芽汁獼猴桃汁液體培養(yǎng)基以IL計，由以下量的組分組成： 獼猴桃汁 100?150mL ; 鹿糖 4. 0?6. Og ; 豆芽汁 余量； 所述的MRS液體培養(yǎng)基以IL計，由以下量的組分組成： 蛋白胨 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 檸檬酸氫二銨 2.0g; 葡萄糖 20.0g; 乙酸鈉 5.0g; 磷酸氫二鉀 2.0g; 硫酸鎂 0.58g; 硫酸錳 0.25g; 吐溫 80 l.OmL： 水 余量； 該MRS液體培養(yǎng)基的pH值保持在6. 2?6. 4。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的發(fā)酵獼猴桃汁的制作方法，其 特征在于，步驟3)中，將納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-512和干酪乳桿菌LcS-Met_*發(fā)酵獼 猴桃汁，具體包括：將活化后的納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-512和干酪乳桿菌LcS-MetIg 合，形成混合菌液，將混合菌液接種至含獼猴桃汁的發(fā)酵培養(yǎng)基，紗布封口培養(yǎng)后得到富含 納豆激酶和吡咯喹啉醌的獼猴桃汁。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的發(fā)酵獼猴桃汁的制作方法，其 特征在于，步驟3)中，所述的含獼猴桃汁的發(fā)酵培養(yǎng)基以IL計，由以下量的組分組成： 蔗糖 50.0g; 酪氨酸 〇.5g; 谷氨酸 〇.5g; 麥芽糖 20.0g; Λ7:芽?|· IOOmL; 獼猴桃汁 余量。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的發(fā)酵獼猴桃汁的制作方法， 其特征在于，步驟3)中，所述的獼猴桃汁的制備包括：水中加去皮的獼猴桃果肉，碾磨成漿 汁。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的發(fā)酵獼猴桃汁的制作方法，包括：將產(chǎn)納豆激酶兼吡咯喹啉醌的納豆芽孢桿菌10261和10263分別進行亞硝基胍誘變，然后混合二者誘變后代，進行細胞融合傳代培養(yǎng)，并在基因組重排技術(shù)基礎(chǔ)上進一步采用底物誘導(dǎo)適應(yīng)性策略，高通量篩選得到高產(chǎn)納豆激酶兼吡咯喹啉醌的納豆芽孢桿菌；將干酪乳桿菌進行亞硝基胍誘變，從中篩選出甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型的干酪乳桿菌；將篩選出的納豆芽孢桿菌和干酪乳桿菌共發(fā)酵獼猴桃汁，得到富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的獼猴桃汁。本發(fā)明得到的富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的獼猴桃汁中，吡咯喹啉醌含量達到47-83ng/mL，納豆激酶活力達到367-664U/mL。
【IPC分類】A23L1-29, C12R1-07, C12R1-245, A23L2-02, C12N15-01, C12N15-03
【公開號】CN104522771
【申請?zhí)枴緾N201410751066
【發(fā)明人】張哲滔, 鄧惟, 阮子琦, 吳淵, 莫凡
【申請人】杭州元佩特生物科技有限公司
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2014年12月10日...