專利名稱：構(gòu)建產(chǎn)生氨基酸的細(xì)菌的方法,及通過發(fā)酵該經(jīng)構(gòu)建的產(chǎn)生氨基酸的細(xì)菌以制備氨基酸 ...的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明是關(guān)于構(gòu)建一種具有高產(chǎn)量的產(chǎn)生氨基酸能力的細(xì)菌突變株的方法，以及經(jīng)發(fā)酵作用由此突變株產(chǎn)生L-氨基酸的方法。
構(gòu)建經(jīng)由發(fā)酵而產(chǎn)生氨基酸的突變株的方法大致可分為兩種。一種是應(yīng)用化學(xué)突變劑將突變隨機(jī)導(dǎo)入DNA中，另一種是通過基因重組作用。就后者方法而言，可經(jīng)由加強(qiáng)關(guān)于此物質(zhì)生物合成代謝路徑的基因，或通過減弱一會破壞此物質(zhì)的酶基因，從而得到目的物質(zhì)生產(chǎn)能力增強(qiáng)的菌株?；诖擞^點(diǎn)，為加強(qiáng)目的基因而在細(xì)胞中利用一個其染色體能獨(dú)立復(fù)制的質(zhì)粒。
然而利用質(zhì)粒加強(qiáng)目的基因的方法有一些問題，特別是目的基因的加強(qiáng)程度由所用質(zhì)粒的拷貝數(shù)而測定。因此有一些種類的目的基因拷貝數(shù)過多而導(dǎo)致表達(dá)過度進(jìn)而嚴(yán)重抑制生長，反而所要物質(zhì)的產(chǎn)生力較低。在此種情況下雖然使用低拷貝數(shù)的質(zhì)粒對目的基因的加強(qiáng)程度較低，但對質(zhì)粒的種類有多種限制，且對目的基因的表達(dá)程度不能進(jìn)行自由調(diào)整。
另一問題是質(zhì)粒的復(fù)制通常不穩(wěn)定，且質(zhì)粒常被移除。
舉例來說，特開昭61-26818公開了一來源于產(chǎn)生谷氨酸的棒狀菌的重組DNA，此重組DNA包含-DNA片段，它具有產(chǎn)生谷氨酸脫氫酶(GDH)的基因(glutamate dehydrogenase gene)，以及含有細(xì)胞內(nèi)自動復(fù)制的必要基因的-DNA片段。本文也公開了導(dǎo)入此重組DNA到-細(xì)胞內(nèi)，而形成GDH強(qiáng)化株，通過微生物生長而促進(jìn)物質(zhì)(譬如氨基酸和蛋白質(zhì)等)的產(chǎn)生。
另一方面，在日本專利2,520,895中，將上述的重組DNA導(dǎo)入棒狀桿菌中得到一具有增強(qiáng)酶活性的菌株，且通過發(fā)酵此菌株而產(chǎn)生L-谷氨酸。然而L-谷氨酸的產(chǎn)生及產(chǎn)量并不令人滿意。因此，需要進(jìn)一步增強(qiáng)L-谷氨酸的產(chǎn)生力。而增強(qiáng)方法已達(dá)成，亦即將含有衍生自產(chǎn)生谷氨酸的棒狀菌的產(chǎn)生谷氨酸脫氫酶基因和異檸檬酸合成酶基因(ICDH)兩種基因的重組DNA轉(zhuǎn)入產(chǎn)生谷氨酸的棒狀菌內(nèi)。
更進(jìn)一步，特表平6-502548公開棒狀桿菌的表達(dá)，和含有一棒狀桿菌菌株和一分泌匣的分泌系統(tǒng)；此分泌匣包含用于在此菌株中表達(dá)的第一功能性DNA序列，用于編碼氨基酸多肽和/或蛋白質(zhì)的第二DNA序列，以及插入介于第一DNA序列和第二DNA序列間的第三DNA序列，其中的第三DNA序列編碼的蛋白質(zhì)要素是選自PS1和PS2可保證由該棒狀桿菌進(jìn)行此氨基酸，多肽和/或蛋白質(zhì)的分泌。具體而言，多肽的分泌已公開于文中。特別的是誘發(fā)棒狀桿菌菌株的NTG突變作用，且篩選一具有4-氟谷氨酸(4FG)抗性的突變株，由于4FG類似谷氨酸，因此以PCGL141轉(zhuǎn)化之。文中也公開可從類似抗性細(xì)菌中取得加強(qiáng)表達(dá)GDH的菌株。文中也公開觀察到GDH啟動子核苷酸序列251到266的突變作用。
發(fā)明的公開本發(fā)明目標(biāo)是提供一方法構(gòu)建一突變株，使其不需使用質(zhì)粒就能適當(dāng)加強(qiáng)控制目的基因的表達(dá)，且可通過重組作用或突變作用產(chǎn)生高產(chǎn)量的氨基酸。
本發(fā)明的另一目標(biāo)是提供一GDH啟動子，在棒狀桿菌菌株中不需要嚴(yán)重增加副產(chǎn)物天冬氨酸和丙氨酸的量就具有產(chǎn)生高產(chǎn)量谷氨酸的能力。
本發(fā)明的另一目標(biāo)是提供一具有上述GDH啟動子序列的GDH基因。
本發(fā)明的進(jìn)一步目標(biāo)是提供一具有上述基因的棒狀桿菌菌株，且能產(chǎn)生L-谷氨酸。
本發(fā)明的進(jìn)一步目標(biāo)是提供一方法，通過發(fā)酵作用產(chǎn)生氨基酸，其中應(yīng)用所構(gòu)建的產(chǎn)生氨基酸的微生物。
本發(fā)明的進(jìn)一步目標(biāo)是提供一產(chǎn)生谷氨酸的發(fā)酵方法，通過利用產(chǎn)生谷氨酸棒狀菌在低成本下增加谷氨酸的產(chǎn)量。
本發(fā)明已有效的解決上述問題，在染色體上改變氨基酸生物合成基因的啟動子而控制目的基因的表達(dá)量。特別的是本發(fā)明已有效解決上述問題，是通過在啟動子的特異區(qū)域-35區(qū)域或-10區(qū)域?qū)胍惶厥獾耐蛔儭?br> 亦即本發(fā)明提供一產(chǎn)生具有增強(qiáng)的氨基酸或核酸產(chǎn)生力的棒狀菌的方法，步驟包括在棒狀菌染色體上的氨基酸或核酸生物合成基因的啟動子序列引起突變而使其接近共有序列，或以重組作用在棒狀菌染色體上的氨基酸或核酸生物合成基因的啟動子序列中導(dǎo)入一變化而使其接近共有序列，得到棒狀細(xì)菌的突變株，培養(yǎng)此突變株，并篩選能大量產(chǎn)生指定的氨基酸或核酸的突變株。
本發(fā)明也提供一產(chǎn)生谷氨酸脫氫酶(GDH)基因的啟動子，其中該啟動子具有選自位于-35區(qū)域的CGGTCA,TTGTCA,TTGACA和TTGCCA的至少一種DNA序列和/或-10區(qū)域TATAAT序列或ATAAT已被其它堿基取代序列，且此序列不抑制啟動子功能。
本發(fā)明也提供一具有上述啟動子的谷氨酸脫氫酶基因。
本發(fā)明也提供一具有上述基因的產(chǎn)L-谷氨酸棒狀菌。
本發(fā)明也提供一通過發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸和核酸的方法，包括培養(yǎng)通過上述方法所構(gòu)建的氨基酸和核苷酸生產(chǎn)能力增強(qiáng)的棒狀菌，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以及在培養(yǎng)基中累積目的氨基酸和核酸，并從培養(yǎng)基中收集此氨基酸。
本發(fā)明也提供一通過發(fā)酵生產(chǎn)L-谷氨酸和核酸的方法，包括在液態(tài)培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)L-谷氨酸的對4-氟谷氨酸抗性的棒狀菌，以及在培養(yǎng)基中累積L-谷氨酸，并從培養(yǎng)基中收集此氨基酸。
附圖簡述

圖1顯示含有突變啟動子的GDH基因的構(gòu)建流程。
圖2顯示含有突變啟動子的CS基因的構(gòu)建流程。
圖3顯示攜帶lacZ為報告基因的穿梭載體的構(gòu)建流程。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式本發(fā)明中的“產(chǎn)生谷氨酸的棒狀菌”包括以往歸類為短桿菌屬而現(xiàn)在統(tǒng)歸于棒狀桿菌屬的細(xì)菌(Int.J.Syst.Bacteriol.,41,255(1981))，或包括與棒狀桿菌屬非常接近的短桿細(xì)菌屬。因此本發(fā)明中應(yīng)用的突變株可從如下所述的屬于棒狀桿菌屬或短桿菌屬的棒狀谷氨酸生產(chǎn)菌來進(jìn)行誘導(dǎo)。另外，本說明書中未提及谷氨酸生產(chǎn)性的時候，將棒狀桿菌屬細(xì)菌及短桿菌屬細(xì)菌僅叫做棒狀菌。嗜乙酰乙酸棒狀桿菌 ATCC 13870醋谷棒狀桿菌 ATCC 15807美棒狀桿菌 ATCC 15991谷氨酸棒狀桿菌 ATCC 13032分叉短桿菌 ATCC 14020乳酸發(fā)酵短桿菌 ATCC 13869百合棒狀桿菌 ATCC 15990黃色短桿菌 ATCC 14067梅拉司克棒狀桿菌 ATCC 17965糖短桿菌 ATCC 14066伊馬瑞短桿菌 ATCC 14068薔薇短桿菌 ATCC 13825嗜硫短桿菌 ATCC 19240嗜氨微桿菌 ATCC 15354產(chǎn)熱氨棒狀桿菌 AJI 2310(FERM 9246)所產(chǎn)生的氨基酸并沒有特別限制，只要是由相關(guān)合成基因及其啟動子可證實(shí)的即可。關(guān)于生物合物的有效酶實(shí)施例包括谷氨酸發(fā)酵作用中的GDH，檸檬酸合成酶(CS)，異檸檬酸合成酶(ICDH)，丙酮酸脫氫酶(PDH)和烏頭酸酶(ACO)。
賴氨酸發(fā)酵過程所用的酶包括生物合成酶，譬如天冬氨酸激酶(AK)，二氫吡啶二羧酸合成酶；二氫吡啶二羧酸還原酶，二氨基庚二酸脫氫酶和二氫基庚二酸脫羧酶。涉及賴氨酸薄膜排出的賴氨酸排出蛋白質(zhì)(lysE基因)也是有效的。
精氨酸發(fā)酵過程所用的酶包括N-乙酰谷氨酸合成酶，N-乙酰谷氨酸激酶，N-乙酰谷氨酸磷酸還原酶，乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶，N-乙酰鳥氨酸酶；鳥氨酸轉(zhuǎn)氨基甲酰酶，精氨基琥珀酸合成酶，和精氨基琥珀酸酶。，通過這些酶進(jìn)行催化反應(yīng)形成氨基酸。這些酶是有效用的。這些酶是依序分別由argA,argB,argC,argD,aegE,argF,argG和argH所編碼的酶。
絲氨酸發(fā)酵過程所用的有效酶包括3-磷酸甘油酸脫氫酶，磷酸絲氨酸轉(zhuǎn)氨酶，磷酸絲氨酸磷酸酶等等。
苯丙氨酸發(fā)酵過程所用的有效酶包括生物合成酶，譬如脫氧阿拉賓庚酸磷酸合成酶(deoxyarabinohepturonic acid phosphoric acid syntheticenzyme),3-去氫奎尼酸合成酶，3-去氫奎尼酸脫水酶，莽草酸脫氫酶，莽草酸激酶，5-烯醇丙酮基莽草酸-3-磷酸合成酶，分支酸(chorismic acid)合成酶，分支酸變位酶，代丙酮酸脫水酶(prephenatedehydroratase)等等。糖代謝酶譬如轉(zhuǎn)酮醇酶，轉(zhuǎn)醛醇酶，磷酸烯醇丙酮酸合成酶等等亦有效。
除了上述苯丙氨酸發(fā)酵所需的各種有效酶及上述絲氨酸發(fā)酵所需的各種有效之外，色氨酸發(fā)酵過程所用的有效酶包括屬于色氨酸操縱子的酶。
脯氨酸發(fā)酵過程所用的有效酶包括γ-谷氨酸激酶，γ-谷氨酸半醛脫氫酶，吡咯啉-5-羧化還原酶，和上述谷氨酸發(fā)酵所需的各種有效酶。
谷氨酸發(fā)酵過程所用的有效酶包括谷酰氨酸合成酶，和上述谷氨酸發(fā)酵所需的各種有效酶。
在肌苷的產(chǎn)生中，加強(qiáng)5-磷酸核糖基1-二磷酸合成酶，5-磷酸核糖基1-二磷酸轉(zhuǎn)氨基酶，磷酸核糖基氨基咪唑羧酰氨轉(zhuǎn)甲?；傅鹊鹊谋磉_(dá)被認(rèn)為是有用的。
在鳥苷的產(chǎn)生中，加強(qiáng)5′-肌苷酸脫氫酶和5′-黃苷酸氨基酶，5-磷酸核糖基1-二磷酸合成酶，5-磷酸核糖基1-二磷酸轉(zhuǎn)氨基酶，磷酸核糖基氨基咪唑羧酰氨轉(zhuǎn)甲酰基酶等等的表達(dá)被認(rèn)為是有用的。
在腺苷的產(chǎn)生中，加強(qiáng)腺苷琥珀酸合成酶和5-磷酸核糖基1-二磷酸合成酶，5-磷酸核糖基1-二磷酸轉(zhuǎn)氨基酶，磷酸核糖基氨基咪唑羧酰氨轉(zhuǎn)甲?；傅鹊鹊谋磉_(dá)被認(rèn)為是有用的。
在核苷酸的產(chǎn)生中，加強(qiáng)磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶，肌苷激酶，鳥苷激酶和腺苷激酶的表達(dá)被認(rèn)為是有用的。
在本發(fā)明中產(chǎn)生氨基酸的棒狀菌突變株的取得，是在一產(chǎn)生氨基酸的棒狀菌的染色體上的所要的氨基酸-生物合成基因的啟動子序列造成突變而得，此類啟動子序列如上述的GDH，以化學(xué)劑導(dǎo)致突變，或通過基因重組導(dǎo)入一突變而使其接近共有序列。
“共有序列”一詞是指在各種啟動子序列中出現(xiàn)頻率最高的堿基序列。共有序列包括那些位于大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的序列。大腸桿菌的共有序列敘述于Diane K.Hawley and William R.McClure Nuc.Acid.Res.11:2237-2255(1983)，枯草桿菌的共有序列敘述于Charles etal.Mol.Gen.Genet 186:339-346(1982)。
突變可如GDH般只在一啟動子造成，或如GDH，檸檬酸合成酶(CS)和異檸檬酸合成酶(ICDH)在兩個或更多啟動子序列造成突變。
在本發(fā)明中所得到的突變株，經(jīng)培養(yǎng)能產(chǎn)生大量所指定的氨基酸。
目前已證明谷氨酸的發(fā)酵作用中，衍生自產(chǎn)生谷氨酸的棒狀桿菌微生物的GDH在其上游部分具有其啟動子序列[Sahm et al.,MolecularMicrobiology(1992),6,317-326]。
例如，如下可得到本發(fā)明的GDH啟動子、具有該GDH啟動子序列的GDH基因以及具有該基因的生產(chǎn)L-谷氨酸的棒狀桿菌菌株。
以UV，X-射線或放射線等處理，或以突變誘發(fā)劑處理以得到一可在包含4-氟谷氨酸的瓊脂板培養(yǎng)基中生長的抗4-氟谷氨酸菌株。也就是突變作用處理過的菌株涂于包含4-氟谷氨酸瓊脂平板上生長，因4-氟谷氨酸的濃度可抑制親代生長而分離出可生長的突變株。
更進(jìn)一步，GDH基因的啟動子序列可用各種突變序列通過定位突變的方法置換之，而各序列和GDH活性間的關(guān)系可檢查其L-谷氨酸高克隆力。
本發(fā)明中特別優(yōu)選位于產(chǎn)生GDH基因啟動子-35區(qū)域的DNA序列，至少有-DNA序列是選自CGGTCA,TTGTCA,TTGACA和TTGCCA和/或位于啟動子-10區(qū)域TATAAT的DNA序列，或以其它堿基置換TATAAT中的ATAAT堿基而不抑制啟動子功能者。位于-10區(qū)域的TATAAT中的ATAAT以其它堿基置換而不抑制啟動子功能者可以選擇使用的理由如下因?yàn)橛^察到只以“T”置換野生型-10區(qū)域序列的CATAAT的第1個“C”(表1中的p6-4)就明顯增加GDH的比活性，因此認(rèn)為以另一堿基置換是可行的。
如上敘述的GDH基因的啟動子序列敘述于Sahm et al.,MolecularMicrobiology(1992),6,317-326。其中敘述為序列號1。而GDH基因其本身的序列也敘述于Sahm et al.,Molecular Microbiology(1992),6,317-326，亦為序列號1。
同樣的，亦可在檸檬酸合成酶(CS)或異檸檬酸合成酶(ICDH)的啟動子中產(chǎn)生突變。
如此，則GDH啟動子具有選自位于-35區(qū)域CGGTCA，TTGTCA,TTGACA和TTGCCA的至少一個DNA序列和/或位于-10區(qū)域的TATAAT或其ATAAT堿基已被其它堿基置換但不抑制啟動子功能的序列。本發(fā)明也提供具有上述啟動子產(chǎn)生谷氨酸脫氫酶的基因。
CS的啟動子具有位于-35區(qū)域中的TTGACA序列和/或位于-10區(qū)域中的TATAAT序列，且沒有任何序列會抑制啟動子功能。本發(fā)明也提供具有上述啟動子的CS基因。
使用于ICDH的啟動子是具有在-35區(qū)域第一個或第二個啟動子(位點(diǎn))的TTGCCA或TTGACA序列，和/或在-10區(qū)域第一個或第二個啟動子(位點(diǎn))的TATAAT序列，但不抑制啟動子的功能。本發(fā)明也提供具有上述啟動子的icd基因。
使用于PDH的啟動子是在-35區(qū)域具有TTGCCA序列和/或在-10區(qū)域TATAAT序列，且引序列不抑制啟動子的功能。本發(fā)明也提供具有上述啟動子的PDH基因。
本發(fā)明也提供具有上述基因的產(chǎn)L-谷氨酸的棒狀菌。
精氨基琥珀酸合成酶的啟動子具有是選自位于-35區(qū)域的TTGCCA，TTGCTA和TTGTCA的至少一個DNA序列和/或位于-10區(qū)域的TATAAT序列或以其它堿基置換位于TATTAT中的ATAAT堿基，但序列不抑制此啟動子功能。本發(fā)明也提供具有上述啟動子的精氨基琥珀酸合成酶。
本發(fā)明也提供具有上述基因的產(chǎn)生精氨酸的棒狀菌。
培養(yǎng)本發(fā)明的棒狀菌可得到氨基酸，以產(chǎn)生L-谷氨酸為佳，是在液態(tài)培養(yǎng)基中形成所指定的氨基酸并通過累積，并從此培養(yǎng)基中收集氨基酸。
使用于培養(yǎng)本發(fā)明的上述菌株細(xì)菌的液態(tài)培養(yǎng)基是包含碳源，氮源，無機(jī)鹽，生長因子等等的一般培養(yǎng)基。
碳源包括碳水化合物類的葡萄糖，果糖，蔗糖，糖蜜和淀粉水解物；醇類的乙醇和甘油；和有機(jī)酸類的醋酸。氮源包括硫酸銨，硝酸銨，氯化銨，磷酸銨，醋酸銨，氨，蛋白胨，肉萃取物，酵母菌萃取物和玉米漿。當(dāng)使用需特別營養(yǎng)的突變株時，則以標(biāo)準(zhǔn)品或天然物質(zhì)形式將所要求的物質(zhì)加入培養(yǎng)液中。
在生物素限制之下棒狀桿菌常產(chǎn)生L-谷氨酸。因此，在培養(yǎng)基中需限制生物素的量或?qū)⒈砻婊钚詣┗蚯嗝顾氐葘ι锼鼐咭种朴绊懙奈镔|(zhì)加入培養(yǎng)基中。
發(fā)酵作用最好以搖動培養(yǎng)方法或有氧轉(zhuǎn)動培養(yǎng)方法在有氧條件下進(jìn)行，而培養(yǎng)液pH維持在5到9持續(xù)2到7天。以尿素，碳酸鈣，氣態(tài)氨，氨水等等控制pH值。培養(yǎng)溫度以24～37℃為佳。
利用離子-交換樹脂方法或結(jié)晶法等常用方法控制液體培養(yǎng)液中L-谷氨酸的產(chǎn)生和累積。L-谷氨酸的分離可通過吸附在陰離子交換樹脂或通過中和結(jié)晶作用。
根據(jù)本發(fā)明，在產(chǎn)生氨基酸的棒狀菌氨基酸-生物合成基因的啟動子區(qū)域?qū)胍煌蛔儊碚{(diào)控目的基因的表達(dá)，因此可得到高產(chǎn)量的指定氨基酸。此外，根據(jù)本發(fā)明的細(xì)菌并未發(fā)生任何目的基因的流失，與質(zhì)粒相較之下能穩(wěn)定得到高產(chǎn)量的指定氨基酸。如此，本發(fā)明具重要的工業(yè)價值。
本發(fā)明提供各種啟動子，特別是GDH的啟動子能賦予產(chǎn)生氨基酸的能力，特別是谷氨酸，在棒狀菌菌株內(nèi)不需增加副產(chǎn)物天冬氨酸和丙氨酸的量就可得高產(chǎn)量谷氨酸。
在本發(fā)明中，將產(chǎn)生L-谷氨酸的棒狀菌導(dǎo)入突變，使所得菌株的突變發(fā)生在GDH基因的啟動子區(qū)域中，而此菌株對4-氟谷氨酸具抗性，且能在培養(yǎng)基中得到高產(chǎn)量的谷氨酸。因此，本發(fā)明非常有助于工業(yè)上的利用。
下列實(shí)施例將更進(jìn)一步例證本發(fā)明。實(shí)施例1突變的GDH啟動子的制作以下列的定位突變方法制備突變的GDH啟動子(1)具有各種突變形式的啟動子的GDH基因的制備野生型棒狀菌GDH基因啟動子-35區(qū)域和-10區(qū)域的序列顯示在序列1。野生型的啟動子序列已發(fā)表于[Molecular Microbiology(1992),6,317-326]。
攜帶具有突變啟動子的GDH基因的質(zhì)粒制備方法如下如圖1所示，以“細(xì)菌基因組DNA純化試劑盒”(Advanced Genetic TechnologiesCorp.)制備野生型棒狀桿菌ATCC 13869的染色體基因作為模板，通過PCR在GDH基因的上游和下游序列中擴(kuò)增GDH基因。兩末端皆為平端。所得產(chǎn)物插入到質(zhì)粒pHSG 399(Takara Shuzo Co.,Ltd.)的SmaⅠ位點(diǎn)。然后從具有棒狀桿菌復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒pSAK 4中取得復(fù)制起點(diǎn)，將之插入到該質(zhì)粒的SalⅠ位點(diǎn)而得到質(zhì)粒pGDH。通過此方法，可使用序列表中所顯示的GDH基因上游引物序列1到6為引物，得到具有上述各別啟動子序列的GDH基因。利用測序測定確認(rèn)PCR擴(kuò)增片段中任何突變，和啟動子序列中的非突變序列。pSAK4的構(gòu)建如下質(zhì)粒pHK4(特開平5-7491)具有衍生自質(zhì)粒pHM 1519[Agric.Biol.Chem.,48,2901-1903(1984)]的復(fù)制起點(diǎn)，而pHM1519能在已得到的棒狀桿菌中自動復(fù)制，因此以BamHⅠ和KpnⅠ消化而得到具有復(fù)制起點(diǎn)的DNA片段。然后使用DNA平端試劑盒(Blunting kit of Takara Shuzo Co.,Ltd.)處理得到平端的DNA片段。然后連結(jié)SalⅠ連接子(linker)所得的產(chǎn)生插入pHSG 299(Takara Shuzo Co.,Ltd.)的SalⅠ位點(diǎn)而得到質(zhì)粒pSAK4。(2)比較具有各啟動子序列的GDH的表達(dá)程度如上述所制備的質(zhì)粒以電穿孔作用(特開平2-207791)導(dǎo)入野生型的棒狀菌菌株中。為比較這些菌株的GDH表達(dá)程度，GDH的比活性的測定是依照Sahm et al.的上述方法。結(jié)果顯示在表1。
表1
ATCC 1369／p 6-到ATCC 1369／p 6-分別相對應(yīng)到序列號2到6。除了下列劃線部分改變之外，這些序列與序列號I(野生型)相同序列號1. 5'- TTAATTCTTTGTGGTCATATCTGCGACACTGCCATAATTTGAACGT -Y2. CGGTCA CATAAT3. TGGTCA TATAAT4. TTGACA TATAAT5. TTGCCA TATAAT6. TTGTCA TATATT這些序列是雙鏈線形合成DNA。實(shí)施例2突變株菌株的制備(I)誘發(fā)對抗4-氟谷氨酸的突變株菌株AJ113029是公開在WO 96／06180中的產(chǎn)生谷氫酸的突變株菌株。雖然在31.5℃的培養(yǎng)溫度下不能產(chǎn)生谷氨酸，但若培養(yǎng)在37℃之下即使沒有生物素-抑制劑也能產(chǎn)生谷氨酸。在此實(shí)施例中，利用乳酸發(fā)酵短桿菌AJ 13029菌株作為親代以衍生突變株菌株。當(dāng)然除了AJ 13029之外的產(chǎn)生谷氨酸菌株可使用作為親代，來衍生具4-氟谷氨酸抗性的突變株菌株。
將菌株AJ 13029的微生物培養(yǎng)于31.5℃的CM2B瓊脂培養(yǎng)基(表2)24小時以取得細(xì)胞。以250微克/毫升的N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍于30℃處理30分鐘。然后將具有存活率1％的細(xì)胞懸浮液涂于含有4-氟谷氨酸(4FG)的瓊脂平板培養(yǎng)基(表3)。于31.5℃培養(yǎng)20到30小時可形成菌落。在此實(shí)驗(yàn)中，首先制備含有1毫克/毫升4FG的斜面培養(yǎng)基，然后其上制備相同培養(yǎng)基但不含4FG的平面培養(yǎng)基。如此，則可在瓊脂培養(yǎng)基表面得到4FG濃度梯度。當(dāng)上述所得的突變株細(xì)胞接種于此平板時，在此菌株的生長限制邊界會形成一界線。采集在含有較高濃度4FG的區(qū)域所形成的菌落。因此從約10,000突變株菌株得到約50個菌株可抗4FG。
表2 CM2B瓊脂培養(yǎng)基成分 濃度蛋白胨(E本制藥社制)1.0％酵母菌萃取物(Ditco Co.)1.0％NaCl 10.5％d-生物素 10微克/升瓊脂1.5％(pH7.2以KOH調(diào)整)
表3瓊脂培養(yǎng)基成分 數(shù)量/每1公升水葡萄糖10克MgSO4·7H2O1克FeSO4·7H2O0.01克MnSO4·4-6H2O 0.01克鹽酸硫胺素 0.2毫克d-生物素 0.05毫克(NH4)2SO45克Na2HPO4·12H2O 7.1克KH2PO41.36克瓊脂 15克(2)4FG抗性突變株菌株的產(chǎn)生L-谷氨酸能力的確認(rèn)約50個上述(1)所得的突變株菌株和親代AJ 13029菌株產(chǎn)生谷氨酸的能力確認(rèn)如下所述。
將AJ 13029和突變株菌株分別于31.5℃的CM2B瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)20到30小時。然后培養(yǎng)在具有表4中所示的“培養(yǎng)基A”的液態(tài)培養(yǎng)中，而此培養(yǎng)是在31.5℃搖動培養(yǎng)。約22小時后加入表4中所示的最終濃度的B培養(yǎng)基。然后溫度轉(zhuǎn)移到37℃并再培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)完全之后，以生物素分析儀(Asahi Chemical Industry Co.,Ltd.)檢驗(yàn)是否形成L-谷氨酸。結(jié)果發(fā)現(xiàn)50個菌株的培養(yǎng)中，有兩個菌株的谷氨酸產(chǎn)量高于親代菌株，且GDH活性較高(菌株A和菌株B)。測定此二菌株的GDH活性發(fā)現(xiàn)這兩個菌株的特殊GDH活性皆增加(表5)。以E.R.Bormann et al.[Molecular Microbiol.,6,317-326(1996)]的方法測定GDH活性。分析GDH的堿基序列發(fā)現(xiàn)突變點(diǎn)只在GDH的啟動子區(qū)域內(nèi)(表6)。
表4發(fā)成分培養(yǎng)基A 培養(yǎng)基B葡萄糖3克/100毫升 5克/100毫升KH2PO40.14克/100毫升0.14克/100毫升MgSO4·7H2O 0.04克/100毫升0.04克/100毫升FeSO4·7H2O 0.001克/100毫升 0.001克/100毫升MnSO4·4H2O 0.001克/100毫升 0.001克/毫升(NH4)2SO41.5克/100毫升 2.5克/100毫升黃豆蛋白質(zhì)水解水溶液 1.5克/100毫升 0.38毫升/100毫升鹽酸硫胺素 0.2毫克/升0.2毫克/升生物素 0.3毫克/升0.3毫克/升抗發(fā)泡劑 0.05毫升/升 0.05毫升/升CaCO35克/100毫升 5克/100毫升pH7.0(以KOH調(diào)整)表5突變株菌株的谷氨酸形成和GDH活性菌株 Glu(g/dl)GDH比活性相對值A(chǔ)J 130292.6 7.7 1.0FGR12.9 23.13.0FGR23.0 25.93.4表6突變株菌株GDH啟動子區(qū)域中的堿基序列菌株 GDH啟動子序列-35- 10AJ 13029 TGGTCATTCTGTGCGACACTGC CATAATFGR1 TGGTCATTCTGTGCGACACTGC TATAATFGR2 TTGTCAT-CTGTGCGACACTGC TATAAT實(shí)施例3導(dǎo)入突變到產(chǎn)生谷氨酸棒狀菌的CS基因啟動子區(qū)域內(nèi)在此實(shí)施例中，一菌株能加強(qiáng)編碼谷氨酸脫氫酶(GDH)和檸檬酸合成酶(CS)基因的啟動子。(1)gltA基因的克隆棒狀菌的gltA基因的堿基序列是編碼檸檬酸合成酶，且已被證明[Microbial.140,l817-1828(1994)]。以這些序列為基礎(chǔ)的合成引物顯示在序列號7和序列號8。另一方面，使用細(xì)菌基因組DNA純化試劑盒(Advanced Genetic Technologies Corp.)制作乳酸發(fā)酵短桿菌ATCC 13869的染色體DNA。加入無菌水到0.5微克染色體DNA,10微微摩爾的各寡核苷酸，8微升dNTP混合物(每一各2.5毫摩爾濃度)，5微升10×La Taq緩沖液(Takara Shuzo Co.,Ltd.)和2單位La Taq(Takara Shuzo Co.,Ltd.)的混合液中使其最終PCR反應(yīng)液為50微升。此反應(yīng)液于94℃30秒(變性)，55℃15秒(退火)和72℃3秒(延長的)條件下進(jìn)行30循環(huán)的PCR，以熱循環(huán)器TP 240(Takara Shuzo Co.,Ltd.)擴(kuò)增包含gltA基因及其啟動子的3 kbp DNA片段。之后以SUPRECO2(Takara Shuzo Co.,Ltd.)純化所得的擴(kuò)增片段，然后使其平端。應(yīng)用寶酒造公司的Bluntmg kit進(jìn)行平端化處理。將此產(chǎn)物與SmaⅠ完全消化的pHSG 399(Takara Shuzo Co.,Ltd.)混合以連接起來。使用DNA連接試劑盒ver 2(Takara Shuzo Co.,Ltd.)進(jìn)行連接作用。連接反應(yīng)完全后，將之轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM 109感受態(tài)細(xì)胞(Takara Shuzo Co.,Ltd.)內(nèi)。將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂到含有10微克/毫升IPTG(異丙基β-D-硫化半乳糖苷)，40微克/毫升X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷)和40微克/毫升氯霉素的L培養(yǎng)基(含有10克/升bactotryptone，5克/升細(xì)菌酵母菌萃取物，5克/升NaCl和15克/升瓊脂；pH7.2)。過夜培養(yǎng)之后，挑起白色菌落并單個培養(yǎng)這些轉(zhuǎn)化菌落菌株。
以堿性方法(由日本生物工學(xué)會編輯和培風(fēng)館發(fā)行的生物工學(xué)實(shí)驗(yàn)書，p.105,1992)從已轉(zhuǎn)化菌株制備質(zhì)粒。并制備限制酶圖譜，相同于顯示在圖2的限制酶圖譜，命名為“pHSG 399CS”。(2)導(dǎo)入突變到gltA啟動子中使用Mutan-Super Express Km(Takara Shuzo Co.,Ltd.)將突變導(dǎo)入gltA啟動子區(qū)域內(nèi)。此方法具體描述如下。以EcoRⅠ和SalⅠ完全消化pHSG 399CS以得到含有g(shù)ltA基因的EcoRⅠ-SalⅠ片段，然后與用EcoRⅠ和SalⅠ完全消化的pKF 19kM(Takara Shuzo Co.,Ltd.)片段連接起來。連接完全之后將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM 109(Takara Shuzo Co.,Ltd.)感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)。將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂于含有10微克/毫升IPTG,40微克/毫升X-Gal和25微克/毫升卡那霉素(kanamycin)的L培養(yǎng)基。過夜培養(yǎng)之后，挑起白色菌落并分離單個菌落，獲得轉(zhuǎn)化體。從這些轉(zhuǎn)化菌株中制備質(zhì)粒并將那些含有g(shù)ltA基因者命名為pKF 19CS。
使用pKF 19CS為模板和顯示在序列號9,10及11的序列的末端磷酸化的合成DNA為引物以及附屬在Mutan Super Express Km的選擇引物。將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌MV 1184(Takara Shuzo Co.,Ltd.)感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)。然后將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂于含有25微克/毫升卡那霉素的L-培養(yǎng)基。過夜培養(yǎng)之后，挑起出現(xiàn)的白色菌落，分離單個菌落，獲得轉(zhuǎn)化體。從這些轉(zhuǎn)化菌株中制備質(zhì)粒DNA。通過Sanger方法[J.Mol.Biol.,143,161(1980)]以合成的序列號12 DNA序列測定gltA啟動子位點(diǎn)的堿基序列。具體而言，以染劑終止測序試劑盒(AppliedBiosystems)和Genetic Analyzer ABl 310(Applied Biosystems)分析測定堿基序列。以顯示在表7的序列所置換的gltA啟動子區(qū)域的產(chǎn)物分別命名為pKF 19CS1,pKF 19CS2和pKF 19CS4。
表7-35區(qū)域 -10區(qū)域pKF 19CS ATGGCT TATAGCpKF 19CS1 ATGGCT TATAACpKF 19CS2 ATGGCT TATAATpKF 19CS4 TTGACA TATAAT(3)突變株gltA質(zhì)粒的構(gòu)建步驟(2)中所構(gòu)建的pKF 19CS,pKF 19CS1,pKF 19CS 和pKF19CS4以SalⅠ和EcoRⅠ(Takara Shuzo Co.,Ltd.)完全消化。另一方面，具有衍生自質(zhì)粒pAM 330[特開昭58-67699]而能在棒狀菌中自動復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒pSFK 6(Japanese Patent Application No.Hei 11-69896)，使用EcoRI和SalⅠ完全分解，所得片段與含有g(shù)ltA的2.5kb片段連接在一起。連接完全之后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM 109感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)。將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂于含有10微克/毫升IPTG,40克/毫升X-Gal和25微克/毫升卡那霉素的L-培養(yǎng)基。過夜培養(yǎng)之后，挑起白色菌落并分離出單個菌落，獲得轉(zhuǎn)化體。從轉(zhuǎn)化菌株中制備質(zhì)粒。這些含有g(shù)ltA基因的質(zhì)粒分別命名為pSFKC,pSFKC1,pSFKC2和pSFKC4。(4)測定突變株gltA質(zhì)粒在棒狀菌內(nèi)的CS表達(dá)量將上述步驟(3)所構(gòu)建的質(zhì)粒導(dǎo)入乳酸發(fā)酵短桿菌ATCC 13869內(nèi)。具體而言，此過程是以電脈沖法(特愿平2-07791)進(jìn)行。使用含有25微克/毫升卡那霉素的CM2B平板培養(yǎng)基(包含10克/升bactotrypton,10克/升細(xì)菌酵母菌萃取物，5克/升NaCl,10微克/升生物素和15克/升瓊脂；pH7.0)于31℃篩選轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。培養(yǎng)兩夜之后取得單個的菌落。這些含有pSKFC,pSKFC1,pSKFC2和pSKFC4的轉(zhuǎn)化體分別命名BLCS,BLCS1,BLCS2和BLCS4。將轉(zhuǎn)化體接種在含有表8中所示的成分的培養(yǎng)基中。然后于31℃培養(yǎng)到葡萄糖完全消耗完之前。離心培養(yǎng)液以分離菌體。以含有200毫摩爾濃度谷氨酸鈉的50毫摩爾濃度tris緩沖液(pH7.5)清洗細(xì)胞，然后再以相同溶液懸浮之。以UD-201(TOMY)超聲波破碎之后離心(10,000g)20分鐘，移除剩余仍未破碎的細(xì)胞而得到一粗酶溶液。根據(jù)Methods Enzymol.13,3-11(1969)測定檸檬酸合成酶的活性。具體而言，將此粗酶溶液加入含有100毫摩爾濃度Tris HCl(pH8),0.1毫摩爾濃度DTNB,200毫摩爾濃度谷氨酸鈉和0.3毫摩爾濃度乙?；o酶A的反應(yīng)液中，然后以日立分光光度計在30℃,412nm測定其吸光度增加，以此最為背景值。更進(jìn)一步，加入草醋酸至其最終濃度為0.5毫摩爾濃度。測定在412nm時增加的吸光度，從背景值推算獲得檸檬酸合成酶的活性。以Protein Assay(BIO-RAD)測定粗酶溶液中的蛋白質(zhì)濃度。使用牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。結(jié)果顯示在表9中?？梢源_認(rèn)，與野生型gltA啟動子相比，突變型gltA啟動子的檸檬酸合成酶活性增加。
表8成分濃度葡萄糖50克/升KH2PO41克/升MnSO4·7H2O 0.4毫克/升FeSO4·7H2O 10毫克/升黃豆蛋白質(zhì)水解物 20毫克/升生物素0.5毫克/升鹽酸硫胺素2毫克/升2毫克/升表9菌株吸光度/分/毫克相對活性相對活性ATCC 13869 6.81.0ATCC 13869/pSFKC38.8 5.7 1.0ATCC 13869/pSFKC1 57.1 8.4 1.21ATCC 13869/pSFKC2 92.5 13.6 1.9ATCC 13869/pSFKC4 239.4 35.2 4.8(5)導(dǎo)入突變gltA基因到溫度敏感性質(zhì)粒內(nèi)為將含有突變gltA啟動子序列的基因整合插入到染色體中，則使用已知的在棒狀菌內(nèi)復(fù)制的溫度敏感性質(zhì)粒的方法來進(jìn)行(特開平5-7491)。使用pSFKT7(特愿平11-81693)作為質(zhì)粒載體，在棒狀菌內(nèi)其復(fù)制對溫度敏感。使用SalⅠ和BstPⅠ完全消化pKFCS1,pKFCS2和pKFCS3并使其平端，作為突變gltA啟動子序列。然后與已用SmaⅠ完全消化的pSFKT2連接起來。連接完全之后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM 109(Takara Shuzo Co.,Ltd)的感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)。將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂于含有10微克/毫升IPTG,40微克/毫升X-Gal和25微克/毫升卡那霉素的L-培養(yǎng)基。過夜培養(yǎng)之后，挑起白色菌落并分離單個菌落，獲得轉(zhuǎn)化體。從已轉(zhuǎn)化品素中制備質(zhì)粒。含有g(shù)ltA基因的溫度敏感性穿梭載體命名為pSFKTC1,pSFKTC2和pSFKTC4。(6)導(dǎo)入突變gltA啟動子到染色體內(nèi)將pSFKTC1,pSFKTC2和pSFKTC4以電脈沖法分別導(dǎo)入乳酸發(fā)酵短桿菌FGR2菌株。使用含有25微克/毫升卡那霉素的CM2B平板培養(yǎng)基于25℃篩選轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。導(dǎo)入之后所得的菌株培養(yǎng)于CM2B液態(tài)培養(yǎng)基，然后以稀釋濃度為每一平板103到105cfu涂于含有25微克/毫升卡那霉素的CM2B平板上于34℃培養(yǎng)。如此，則具有溫度敏感性的質(zhì)粒的菌株由于在此溫度之下質(zhì)粒復(fù)制受到抑制而變成對溫度敏感，所以不會形成菌落。另一方面，質(zhì)粒DNA整合插入到染色體的菌株者因可形成菌落而能被篩選出來而取得個別分開的菌落。然后從此菌株提取染色體DNA作為模板，應(yīng)用序列號8和13為引物進(jìn)行PCR。之后確認(rèn)約3kb的擴(kuò)增片段。如此則證明此菌株已經(jīng)由同源重組作用將衍生自溫度敏感性質(zhì)粒的突變gltA基因整合插入到宿主染色體接近gltA基因中。衍生自pSFKTC1，2和4的菌株分別命名為BLCS11,BLCS12和BLCS14。(7)gltA啟動子-取代菌株的取得首先，從BLCS11，BLCS12和BLCS14菌株得到突變gltA基因通過同源性重組作用整合插入到染色體的卡那霉素敏感性菌株。將此質(zhì)粒整合插入的菌株稀釋后涂于CM2B平板上并于34℃培養(yǎng)。形成菌落之后復(fù)印到含有25微克/毫升卡那霉素的CM2B平板上，然后于34℃培養(yǎng)。如此則得到卡那霉素敏感性菌株。
從卡那霉素敏感性菌株中提取染色體作為模板，應(yīng)用序列號7和8為引物進(jìn)行PCR以制備gltA基因片段。然后使用SUPRECO2(TakaraShuzo Co，Ltd.)純化后以序列號13為引物進(jìn)行測序反應(yīng)測定其中的啟動子區(qū)域的序列。結(jié)果，與表7中的pKF19CS1啟動子序列相同的菌株命名為GB01，與pKF19CS2啟動子序列相同的菌株命名為GB02，以及和pKF 19CS4啟動子序列相同的菌株命名為GB03。當(dāng)質(zhì)粒及復(fù)制的gltA基因從染色體被移除時，原先位于染色體上的野生型gltA基因也一起與載體質(zhì)粒被移除，然而通過質(zhì)粒導(dǎo)入的突變株gltA基因仍留在染色體上。此事實(shí)指出基因取代已發(fā)生。(8)gltA啟動子突變株的檸檬酸合成酶的活性測定檸檬酸合成酶的活性測定可通過步驟(7)中所得到的FGR2,GB01,GB03和FGR2/pSFKC菌株以相同于步驟(4)的方法處理進(jìn)行。結(jié)果顯示在表10。結(jié)果確認(rèn)gltA啟動子取代的菌株的檸檬酸合成酶合性高于其親代菌株。
表10菌株 吸光度/分/毫克相對活性FGR2 7.9 1.0GB01 9.5 1.2GB02 15.0 1.9GB03 31.6 4.0FGR2/pSFKC 61.6 7.8(9)gltA啟動子取代菌株培養(yǎng)的結(jié)果將上述步驟(7)所得的每一菌株接種到含有表11中所顯示的成分的接種培養(yǎng)基中，在31.5℃搖動培養(yǎng)24小時。取300毫升的具有顯示在表11的成分的主要培養(yǎng)基于500毫升玻璃瓶發(fā)酵器中，然后加熱滅菌。取40毫升的上述接種培養(yǎng)物接種到此培養(yǎng)基內(nèi)。然后于31.5℃開始培養(yǎng)，其攪動速率及通氣速率分別控制在800到1300rpm及1/2到1/1vvm。以氣態(tài)氨維持培養(yǎng)液pH值為7.5。初始培養(yǎng)8小時之后將溫度轉(zhuǎn)移到37℃。得20到40小時內(nèi)葡萄糖完全消耗時就終止培養(yǎng)，而L-谷氨酸則形成且累積于培養(yǎng)液中，測定培養(yǎng)液中L-谷氨酸的含量。
結(jié)果如表12中所顯示，GB02和GB03菌株的L-谷氨酸產(chǎn)量有較大改進(jìn)，而非GB01及FGE2/pSFKC菌株。從這些事實(shí)得知這些菌株的谷氨酸產(chǎn)量增加，通過導(dǎo)入突變到gltA啟動子中可增加CS活性2到4倍的好結(jié)果。
表11濃度成分 接種培養(yǎng)基主要培養(yǎng)基葡萄糖50克/升 150克/升KH2PO41克/升2克/升MgSO47H2O 0.4克/升 1.5克/升FeSO47H2O 10毫克/升 15毫克/升MnSO44H2O 10毫克/升 15毫克/升黃豆蛋白質(zhì)水解物 20毫克/升 50毫克/升生物素0.5毫克/升2毫克/升鹽酸硫胺素2毫克/升 3毫克/升表12菌株L-谷氨酸(克/升)FGR28.9GB 01 9.1GB 02 9.4GB 03 9.4FGR2/pSFKC 9.1實(shí)施例4導(dǎo)入突變到谷氨酸產(chǎn)生菌棒狀菌的ICDH基因啟動子區(qū)域中在此實(shí)施例中制備一菌株，能增強(qiáng)編碼谷氨酸脫氫酶，檸檬酸合成酶和異檸檬酸合成酶基因的啟動子。(1)gltA基因的克隆編碼棒狀菌檸檬酸合成酶基因的icd基因堿基序列已被證實(shí)[J.Bacterio1.177,774-782(1995)]。以此序列為基礎(chǔ)，合成如序列號14和15的引物。使用乳酸發(fā)酵短桿菌ATCC 13869的染色體DNA為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增含有icd基因及其啟動子的3kbp DNA片段。所得的擴(kuò)增片段以EcoRⅠ完全消化，然后與已用EcoRⅠ完全消化的pHSG 399(Takara Shuzo Co.,Ltd.)混合以連接起來。完全連接之后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM 109感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)。將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂到含有10微克/毫升IPTG,40微克/毫升X-Gal和40微克/毫升氯霉素的L-培養(yǎng)基上。過夜培養(yǎng)之后，挑起白色菌落并分別培養(yǎng)這些轉(zhuǎn)化菌株得到轉(zhuǎn)化體。
攜帶icd基因的質(zhì)粒命名為pHSG 399icd。(2)導(dǎo)入突變到icd啟動子內(nèi)icd基因啟動子的正確位點(diǎn)目前尚未確定。研究增加icd基因mRNA轉(zhuǎn)錄量的可能性，是通過人為修飾編碼ICDH基因的上游序列成啟動子類似序列而得知。具體而言，在ICDH蛋白質(zhì)的第一個ATG的上游約190bp(第一個啟動子)和約70 bp(第二個啟動子)的位于-10類似區(qū)域的DNA序列中導(dǎo)入突變。使用Mutan-Super Express Km(Takara ShuzoCo,Ltd.)導(dǎo)入突變到icd基因上游區(qū)域內(nèi)。此方法具體敘述如下。使用PstⅠ完全消化pHSG 399icd以得到含有icd基因啟動子的PstⅠ片段。然后將此片段與已使用PstⅠ完全消化的pKF18kM(Takara Shuzo Co.,Ltd.)連接在一起。完全連接之后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM 109(Takara Shuzo Co.,Ltd)感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)。將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂到含有10微克/毫升IPTG,40微克/毫升X-Gal和25微克/毫升卡那霉素的L-培養(yǎng)基上。過夜培養(yǎng)之后，挑起白色菌落并分別培養(yǎng)這些轉(zhuǎn)化菌株。從轉(zhuǎn)化菌株中制備質(zhì)粒，并命名含有icd基因啟動子的質(zhì)粒為pKF18icd。
使用pKF18icd為模板，及序列號16,17,18,19,20和21的5，末端磷酸化合成DNA及一篩選引物進(jìn)行PCR。將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM 109感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)。將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂于含有25微克/毫升卡那霉素的L-培養(yǎng)基上。過夜培養(yǎng)之后分別得到個別的已轉(zhuǎn)化菌株菌落。從被轉(zhuǎn)化菌株中制備質(zhì)粒DNA，并以序列號22的合成DNA使用Sanger的方法[J.Mol.Biol.,143,161(1980)]測定icd啟動子位點(diǎn)的堿基序列。具體而言，使用染劑終止測序試劑盒(Applied Biosystems)測定堿基序列，并使用Genetic Analyzer ABI 310(Applied Biosystems)進(jìn)行分析。以表7中所顯示的序列置換icd啟動子區(qū)域所得的質(zhì)粒分別命名為pKFl8ICD1,pKFl8ICD2,pKFl8ICD3,pKFl8ICD4,pKFl8ICD5hdrpKFl8ICD 6。其中，以PstI完全消化pKFl8ICD2得到含有icd基因的啟動子PstⅠ片段。將此片段與已使用PstⅠ完全消化的pKFl8KM(TakaraShuzo Co.,Ltd.)連接起來。完全連接之后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM 109(Takara Shuzo Co,Ltd.)感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)。將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂于含有10微克/毫升IPTG,40微克/毫升X-Gal和25微克/毫升卡那霉素的L-培養(yǎng)基上。過夜培養(yǎng)之后，挑起白色菌落并分別培養(yǎng)這些轉(zhuǎn)化菌株。從被轉(zhuǎn)化菌株中制備質(zhì)粒，并將含有icd基因啟動子者命名為pKFl8ICD2。使用pKFl8ICD2為模板，及序列號20和21的5′末端磷酸化合成DNA及一篩選引物進(jìn)行PCR。將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM 109感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)。將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂于含有25微克/毫升卡那霉素的L-培養(yǎng)基上。過夜培養(yǎng)之后，分別得到個別的已轉(zhuǎn)化菌株菌落。從被轉(zhuǎn)化菌株制備質(zhì)粒DNA，并以序列號22的合成DNA測定位于icd啟動子位點(diǎn)內(nèi)的堿基序列。以表13中所顯示的序列置換icd啟動子區(qū)域所得的質(zhì)粒分別命名為pKFl8ICD25和pKFl8ICD26。
表13質(zhì)粒 第一個啟動子 第二個啟動子-35-10 -35 - 10pKFl8ICD GCGACT GAAAGT TTTCCA CACCATpKFl8ICD01 GCGACT TATAAT TTTCCA CACCATpKFl8ICD02 TTGACA TATAAT TTTCCA CACCATpKFl8ICD03 TTGACT TAAAGT TTTCCA CACCATpKFl8ICD04 GCGACT TAAAGT TTTCCA TATAATpKFl8ICD05 GCGACT GAAAGT TTGCCA TATAATpKFl8ICD06 GCGACT GAAAGT TTGACA TATAATpKFl8ICD25 TTGACA TATAAT TTGCCA TATAATpKFl8ICD26 TTGACA TATAAT TTGACA TATAAT(3)測定啟動子活性用質(zhì)粒的構(gòu)建為更簡單測定啟動子活性，利用報告基因來間接測定啟動子活性是可行的。理想的報告基因的特性是其活性能簡單被測定，甚至當(dāng)一氨基酸加到N-末端時其活性并不會顯著變低，且不能產(chǎn)生背景反應(yīng)，并具有適合基因操作的限制酶切位點(diǎn)。因?yàn)榇竽c桿菌的β半乳糖苷酶(LacZ)被廣泛使用作為報告基因，且棒狀桿菌屬沒有乳糖同化能力的基因[J.Gen.Appl.Microbiol.,18,399-416(1972)]，因此應(yīng)用LacZ是適宜的報告基因。然后構(gòu)建攜帶LacZ作為報告基因的質(zhì)粒pNEOL(圖3)。此構(gòu)建過程詳細(xì)敘述如下。使用得自大腸桿菌ME 8459(ME8459存放于基因?qū)W國家研究所(日本))的染色體DNA為模板，顯示在序列號23和24的合成DNA為引物進(jìn)行PCR。使用SmaⅠ和BamHⅠ完全消化此PCR產(chǎn)物，然后與已用HindⅢ消化并平端的pKF3(TakaraShuzo Co,Ltd.)片段連接在一起。完全連接之后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM 109(Takara Shuzo Co.,Ltd.)感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)。將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂于含有25微克/毫升卡那霉素的L-培養(yǎng)基上。過夜培養(yǎng)之后，分別得到個別的已轉(zhuǎn)化菌株菌落。從被轉(zhuǎn)化菌株中制備質(zhì)粒。其中取一質(zhì)粒命名為pKF3nptⅡ。然后使用SalⅠ分解pKF3nptⅡ。另一方面，按實(shí)施例1(1)中所敘述的使用SmaⅠ和SalⅠ完全消化并平端pSAK4。將這些片段連接在一起以構(gòu)建一穿梭載體pNEO，它可在棒狀桿菌中復(fù)制。此質(zhì)粒對氯霉素和卡那霉素具抗性。更進(jìn)一步，使用SmaⅠ和Sse 83871完全消化pNEO。所得的結(jié)果片段與已使用PstⅠ和SmaⅠ完全消化的pMC 1871(FarmaciaBiotech)連接在一起。如此，pNEOL能在棒狀菌中復(fù)制，且具有N端缺乏第8氨基酸的LacZ的報告基因的穿梭載體就構(gòu)建完成了(參閱圖3)。(4)突變株icd啟動子活性的測定上述步驟(2)中所構(gòu)建的具有突變icd啟動子的質(zhì)粒，亦即pKFl8ICD1,pKFl8ICD2,pKFl8ICD3,pKFl8ICD4,pKFl8ICD5,pKFl8ICD6,pKFl8ICD25,pKFl8ICD26和pKFl8ICD等，使用SacⅡ和PstⅠ完全分解然后平端。之后與已使用SmaⅠ切割的pNEOL片段連接起來。完全連接之后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM 109感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)。將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂于含有IPTG，X-Gal和40微克/毫升氯霉素的L-培養(yǎng)基中。過夜培養(yǎng)之后，挑起藍(lán)色菌落并分別培養(yǎng)這些轉(zhuǎn)化菌株。
從已轉(zhuǎn)化菌株中制備質(zhì)粒。具有能產(chǎn)生ICDH和LacZ融合蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒命名為pNEOICD1,pNEOICD2,pNEOICD3,pNEOICD4,pNEOICD5,pNEOICD6,pNEOICD25,pNEOICD26和pNEOLICD。使用電脈沖法將這些質(zhì)粒和pNEOL導(dǎo)入乳酸發(fā)酵短桿菌ATCC 13869內(nèi)。這些轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的篩選是使用含有25微克/毫升卡那霉素和40微克/毫升X-Gal的CM2B平板培養(yǎng)基(含有10克/升bactotryptone,10克/升細(xì)菌酵母菌萃取物，5克/升NaCl,10微克/升生物素和15克/升瓊脂，pH7.0)在31℃培養(yǎng)兩晚。完全導(dǎo)入之后，形成菌落并分別挑起單個的菌落。含有pNEOICD1,pNEOICD2,pNEOICD3,pNEOICD4,pNEOICD5,pNEOICD6,pNEOICD25,pNEOICD26和pNEOLICD的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分別命名為BLAC1,BLAC2,BLAC3,BLAC4,BLAC5,BLAC6,BLAC25,BLAC26,BLAC和BNEOL。除了BNEO之外，全部轉(zhuǎn)化產(chǎn)生形成藍(lán)色菌落。如實(shí)施例3中的步驟(4)的相同方法，從轉(zhuǎn)化產(chǎn)物制備粗制的酶溶液，除了將細(xì)胞改為由“Z-緩沖液”(含有10毫摩爾濃度KCl，1毫摩爾濃度MgSO4,270微克/100毫摩爾濃度2-ME和NaPi,pH7.5)的緩沖溶液清洗及懸浮之。LacZ的活性測定如下Z-緩沖液與粗制的酶溶液混合。將ONPG溶于Z-緩沖液中至最終濃度為0.8毫克/毫升加入到反應(yīng)混合物中，以Hitachi分光光度計U-3210于30℃測量在420nm的增加吸光度。所得值即為LacZ的活性。粗制的酶溶液中的蛋白質(zhì)濃度以Protein Assay(BIO-RAD)測定。使用半血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。結(jié)果顯示在表14中。結(jié)果確認(rèn)具有icd啟動子突變的發(fā)現(xiàn)ICDH-LacZ融合蛋白質(zhì)的菌株的LacZ活性高于表達(dá)野生型ICDH-LacZ融合蛋白質(zhì)的菌株。
表14菌株 吸光度/分/毫克 相對活性BNEOL未測定 0.0BNEOLI 42 1.0BNEOLI-1 84 2.0BNEOLI-2 168 4.0BNEOLI-3 80 1.9BNEOLI-4 126 3.0BNEOLI-5 139 3.3BNEOLI-6 84 2.0BNEOLI-25 168 4.0BNEOLI-26 170 4.0(5)將突變株icd基因?qū)霚囟让舾行再|(zhì)粒內(nèi)在棒狀菌內(nèi)質(zhì)粒載體pSFKT2(特愿平11-81693)是溫度敏感性的復(fù)制子。使用PstⅠ完全消化pKFl8ICD1,pKFl8ICD2,pKFl8ICD3,pKFl8ICD4,pKFl8ICD5,pKFl8ICD6,pKFICD25和pKFICD26,所得的片段使用作為突變的icd啟動子。然后將此片段與已使用PstⅠ完全消化的pSFKT2連接起來。完全連接之后將之轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM 109(Takara Shuzo Co.,Ltd.)感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)。將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂于含有10微克/毫升IPTG，40微克/毫升X-Gal和25微克/毫升卡那霉素的L-培養(yǎng)基上。過夜培養(yǎng)之后，挑起白色菌落并分別培養(yǎng)這些轉(zhuǎn)化菌株。從已轉(zhuǎn)化菌株中制備質(zhì)粒。含有icd啟動子的溫度敏感性穿梭載體分別命名為pSFKTI1,pSFKTI2,pSFKTI3,pSFKTI4,pSFKTI5,pSFKTI6,pSFKTI25和pSFKTI26。(6)將突變株icd啟動子導(dǎo)入染色體內(nèi)使用電脈沖法將上述步驟(5)中構(gòu)建的質(zhì)粒個自導(dǎo)入乳酸發(fā)酵短桿菌GB 02菌株中。此轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的篩選是在25℃,使用含有25微克/毫升卡那霉素的CM2B平板培養(yǎng)基(含有10克/升bactotryptone，10克/升細(xì)菌酵母菌萃取物，5克/升NaCl,10微克/升生物素和15克/升瓊脂，pH7.0)。導(dǎo)入之后，將培養(yǎng)在CM2B液態(tài)培養(yǎng)基中所得的菌株涂到含有25微克/毫升卡那霉素的CM2B平板上，以每一平板稀釋為103到105cfu的濃度于34℃培養(yǎng)。如此，則具有溫度敏感性的質(zhì)粒的菌株由于在此溫度之下質(zhì)粒復(fù)制受到抑制而變成對卡那霉素敏感，所以不會形成菌落。另一方面，質(zhì)粒DNA整合插入到染色體菌株者因可形成菌落而能被篩選出來而取得單個分開的菌落。從此菌株中提取染色體DNA作為模板，序列號13和15為引物進(jìn)行PCR。之后確認(rèn)約3kb的擴(kuò)增片段。如此則證明此菌株已經(jīng)由同源性重組作用將衍生自溫度敏感性質(zhì)粒的突變icd基因整合插入到宿主染色體icd基因的鄰近位點(diǎn)。(7)icd啟動子取代菌株的取得首先，從如步驟(6)中的敘述通過同源性重組作用將突變icd基因整合插入到染色體的菌株中得到卡那霉素敏感性菌株。將此質(zhì)粒整合插入的菌株稀釋后涂于CM2B平板上并于34℃培養(yǎng)。形成菌落之后于含有25微克/毫升卡那霉素的CM2B平板上培養(yǎng)。如此則得到卡那霉素敏感性菌株。
從卡那霉素敏感性菌株中提取染色體作為模板，序列號14和15為引物進(jìn)行PCR以制備icd基因片段。然后使用SUPRECO2(Takara ShuzoCo.,Ltd.)純化后以序列號22為引物進(jìn)行測序反應(yīng)測定其中的啟動子區(qū)域的序列。結(jié)果，具有衍生自pSFKTI1,pSFKTI2,pSFKTI3,pSFKTI4,pSFKTI5,pSFKT16,pSFKT125和pSFKT126的icd啟動子序列者分別命名為GC01,GC02,GC03,GC04,GC05,GC06,GC25和GC26。當(dāng)質(zhì)粒及復(fù)制的icd基因從染色體被移除時，原先位于染色體上的野生型icd基因也一起與載體質(zhì)粒被移除，然而通過質(zhì)粒導(dǎo)入的突變icd基因仍留在染色體上。(8)icd啟動子突變株的異檸檬酸脫氫酶的活性測定使用上述步驟(7)中所得的8個菌株及GB02菌株應(yīng)用實(shí)施例3(7)中相同方法制備ICDH粗制的酶溶液。ICDH活性的測定如下將粗制的酶溶液加到含有35毫摩爾濃度Tris HCl(pH7.5)，1.5濃度MnSO40.1毫摩爾濃度NADP和1.3毫摩爾濃度異檸檬酸的反應(yīng)溶液中，在30℃使用Hitachi分光光度計U-3210測定340nm時的吸光度增加情形。使用Protein Assay(BIO-RAD)測定粗制的酶溶液中的蛋白質(zhì)濃度。結(jié)果顯示在表15中。結(jié)果確認(rèn)icd啟動子取代菌株的異檸檬酸脫氫酶的活性高于親代菌株。
表15菌株 吸光度/分/毫克 相對活性GB 02 3.91.0GC 01 8.21GC 02 19.1 4.9GC 03 7.01.8GC 04 12.5 3.2GC 05 19.1 4.9GC 06 10.5 2.7GC 025 30.4 7.8GC 026 24.2 6.2(9)icd啟動子取代菌株的培養(yǎng)結(jié)果如實(shí)施例3中步驟(9)的相同方法培養(yǎng)上述步驟(7)中的8個菌株。結(jié)果確認(rèn)使用菌株GC02,GC04,GC05,GC25和GC26時其L-谷氨酸產(chǎn)量有改善，如表16中所顯示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入突變到icd啟動子中所得的菌株的ICDH活性至少增加3倍。
表16菌株 L-谷氨酸(g/l)GB02 9.2GC01 9.0GC02 9.5GC03 9.1GC04 9.4GC05 9.6GC06 9.2GC25 9.9GC26 9.8實(shí)施例5在棒狀菌谷氨酸產(chǎn)生細(xì)菌的PDH基因啟動子區(qū)域?qū)胪蛔?1)從棒狀菌中克隆pdhA基因合成的引物序列號25和26，是篩選自大腸桿菌，綠膿桿菌和結(jié)核桿菌的丙酮酸脫氫酶(PDH)的E1亞單位中具有高同源性的區(qū)域。使用細(xì)菌基因組DNA純化試劑盒(Advanced Genetic Technologies Corp.)從乳酸發(fā)酵短桿菌ATCC 13869中制備染色體DNA作為模板，在PCRTechnology(H.Erlich編輯，Stockton Press發(fā)行，1989)第8頁所敘述的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下進(jìn)行PCR。然后將反應(yīng)液載入瓊脂凝膠中進(jìn)行電泳以確定約1.3 kb的DNA片段被擴(kuò)增。使用合成性的序列號25和26的DNA從兩末端測定所得的堿基序列。以Sanger的方法[J.Mol.Biol.,143,161(1980)]利用DNA測序試劑盒(Applied Biosystems Co.)測定堿基序列。將測定的堿基序列翻譯為氨基酸，并與大腸桿菌，綠膿桿菌和結(jié)核桿菌的丙酮酸脫氫酶的E1亞單位比較，因發(fā)現(xiàn)其中的同源性區(qū)域高。結(jié)果判斷認(rèn)為PCR擴(kuò)增的DNA片段是編碼乳酸發(fā)酵短桿菌ATCC 13869的丙酮酸脫氫酶E1亞單位的pdhA基因的一部分。因此進(jìn)一步克隆此基因的上游及下游。克隆方法如下使用限制酶EcoRⅠ,BamHⅠ,HindⅢ,PstⅠ,SalⅠ和XbaⅠ(Takara Shuzo Co.,Ltd.)消化乳酸發(fā)酵短桿菌ATCC 13869的染色體以得到DNA片段。序列表中的引物序列號27和28使用于克隆上游部分，引物序列號29和30使用于克隆下游部分。利用LA PCR體外克隆試劑盒(Takara Shuzo Co.,Ltd.)進(jìn)行克隆。使用該試劑盒進(jìn)行PCR的結(jié)果，以EcoRⅠ,HindⅢ,PstⅠ,SalⅠ和XabⅠ分解從上游位點(diǎn)分別擴(kuò)增出0.5,2.5,3.0,1.5和1.8 kb的DNA片段；以及使用BamHⅠ,HindⅢ和PstⅠ分解從下游位點(diǎn)分別擴(kuò)增出1.5,3.5和1.0kb的DNA片段。DNA片段的堿基序列以上述的相同方法測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)此擴(kuò)增的DNA片段更進(jìn)一步包含一約920個氨基酸的開放讀碼相及一位于上游的假設(shè)啟動子區(qū)域。由于此開放讀碼相的堿基序列的氨基酸產(chǎn)物與已知的大腸桿菌丙酸酸脫氫酶的E1亞單位具高度同源性，因此顯然此開放讀碼相是編碼乳酸發(fā)酵短桿菌ATCC 13869的丙酸酸脫氫酶E1亞單位的pdhA基因。此開放讀碼相的堿基序列顯示在序列表中的序列號31。序列表中的序列31，也顯示從堿基序列所預(yù)測的氨基酸產(chǎn)物的序列。由于位于蛋白質(zhì)N端的甲硫氨酸殘基是衍生自起始密碼ATG，此氨基酸通常不是蛋白質(zhì)的功能所必需，因此目前已知此甲硫氨酸殘基在翻譯之后會通過勝肽酶作用而被移除。上述的蛋白質(zhì)其N端的甲硫氨酸殘基可能已被移除。然而，在序列表中序列號31的ATG上游6個堿基存在的GTG序列，可能從這兒氨基酸被翻譯。其它微生物譬如大腸桿菌的丙酮酸脫氫酶是由三個次單元E1，E2和E3所組成，且他們的編碼基因通常是操縱子。然而在pdhA基因3kb下游中并沒有可能是丙酮酸脫氫酶E2和E3亞單元的開放讀碼相。但很清楚的是，位于開放讀碼相下游存在一終止子。從這些事實(shí)推測，乳酸發(fā)酵短桿菌ATCC 13869的丙酮酸脫氫酶E2和E3亞單元是位于染色體的另一位點(diǎn)上。(2)構(gòu)建一質(zhì)粒用以擴(kuò)增pdhA目前已有一菌株是將編碼大腸桿菌的PDH三個亞單位的基因?qū)肴樗岚l(fā)酵短桿菌ATCC 13869中，而得到一谷氨酸產(chǎn)量增強(qiáng)的菌株(特愿平10-360619)。然而，乳酸發(fā)酵短桿菌ATCC 13869的PDH中只有編碼E1亞單位的pdhA基因被克隆到，且不知單獨(dú)擴(kuò)增此基因是否能改善氨基酸的產(chǎn)量。在此情形下，因此想單獨(dú)擴(kuò)增pdhA基因看看是否可有效改善氨基酸的產(chǎn)量。
以已克隆的堿基序列為基礎(chǔ)合成顯示在序列號33和34的引物。使用細(xì)菌基因組DNA純化試劑盒(Advanced Genetic Technologies Corp.)制備乳酸發(fā)酵短桿菌ATCC 13869的染色體為模板，依據(jù)PCR Technology(H.Erlich編輯，Stockton Press發(fā)行，1989)第8頁上敘述的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件進(jìn)行PCR以擴(kuò)增pdhA基因。序列號33的合成引物是對應(yīng)到序列表中序列號32中的pdhA基因第1397堿基到1416堿基。序列號34則是一其堿基為序列表中序列號32中的第5355到5374堿基負(fù)鏈的引物，從5′位點(diǎn)表示。
利用常用方法純化PCR產(chǎn)物，然后與限制酶SalⅠ和EcoT221作用。將此片段與已用SalⅠ和PstⅠ切割的pSFK(特愿平11-69896)經(jīng)由連接試劑盒(Takara Shuzo Co.,Ltd.)連接在一起。之后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109(Takara Shuzo Co.,Ltd.)感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂于含有10微克/毫升IPTG(異丙基-β-D-硫化半乳糖苷)，40微克/毫升X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-d-半乳糖苷)和25微克/毫升卡那霉素的L-培養(yǎng)基(含有10克/升bactotryptone，5克/升細(xì)菌酵母菌萃取物，5克/升NaCl和15克/升瓊脂，pH7.2)。過夜培養(yǎng)之后，挑起白色菌落并單個培養(yǎng)這些被轉(zhuǎn)化的菌落菌株。
以堿性方法(由日本生物工學(xué)會編輯和培風(fēng)館發(fā)行的實(shí)驗(yàn)工學(xué)實(shí)驗(yàn)書，p.105,1992)從已轉(zhuǎn)化菌株制備質(zhì)粒。測定插入到載體中DNA片段的限制酶圖譜，并與序列表中序列號32所發(fā)表的pdhA基因的限制酶圖譜作比較，含有DNA片段的質(zhì)粒若其插入段有相同限制酶圖譜者命名為pSFKBPDHA。(3)將pSFKBPDHA導(dǎo)入到乳酸發(fā)酵短桿菌ATCC 13869和GC25中并評價其發(fā)酵實(shí)驗(yàn)使用電脈沖法(特開平2-207791)將質(zhì)粒pSFKBPDHA轉(zhuǎn)化到乳酸發(fā)酵短桿菌ATCC 13869和GC25內(nèi)而得到已轉(zhuǎn)化菌株。通過導(dǎo)入質(zhì)粒pSFKBPDHA到乳酸發(fā)酵短桿菌ATCC 13869和GC25而得的產(chǎn)生L-谷氨酸轉(zhuǎn)化菌株ATCC 13869/pSFKBPDHA和GC25/pSFKBPDHA的培養(yǎng)如下將所得的ATCC 13869/pSFKBPDHA和GC25/pSFKBPDHA的培養(yǎng)如下將所得的ATCC 13869/pSFKBPDHA和GC25/pSFKBPDHA細(xì)胞培養(yǎng)在含有25微克/毫升卡那霉素的CM2B平板培養(yǎng)基之后，所得的細(xì)胞接種到一培養(yǎng)基中(每1公升包括80克葡萄糖，1克KH2PO4,0.4克MgSO4·7H2O,30克(NH4)2SO4,0.01克FeSO4·7H2O,0.01克MnSO4·7H2O,15毫升黃豆蛋白質(zhì)水解物，200微克鹽酸硫胺素，60微克生物素，25毫克卡那霉素和50克CaCO3；使用KOH調(diào)整pH到8.0)。于31.5℃搖動培養(yǎng)至培養(yǎng)基中的糖分消耗完。所得產(chǎn)物再接種到上述的相同成分的培養(yǎng)基(用于GC25/pSFK6和GC25/pSFKBPDHA)，或刪除生物素的相同成分培養(yǎng)基(用于ATCC 13869/pSF6和ATCC 13869/pSFKBPDHA)，以5％的量于37℃搖動培養(yǎng)至糖分被消耗完。對照組是使用電脈沖法(參考特開平2-207791公報)將質(zhì)粒pSFK6轉(zhuǎn)化到乳酸發(fā)酵短桿菌ATCC 13869和GC25中所得的菌株，pSFK6是得自棒狀桿菌的可以自動復(fù)制的質(zhì)粒，然后如上述的相同方法培養(yǎng)。完全培養(yǎng)之后，使用Biotic Analyzer AS-210(Asahi Chemical Industry Co.,Ltd.)測定培養(yǎng)基中L-谷氨酸累積的量。結(jié)果如表17中所示。
表17菌株 L-谷氨酸生成率(％)ATCC 13869/pSFK6 3.6ATCC 13869/pSFKBPDHA 3.8GC25/pSFK6 5.1GC25/pSFKBPDHA 5.3從這些結(jié)果顯示在乳酸發(fā)酵短桿菌ATCC 13869和GC25中單一擴(kuò)增pdhA基因，能明顯有效改善谷氨酸的產(chǎn)量。(4)構(gòu)建質(zhì)粒用以測定突變的pdhA啟動子活性為制備丙酮酸脫氫酶(PDH)的突變啟動子，將乳酸發(fā)酵短桿菌ATCC 13869已克隆的pdhA基因先測定其啟動子區(qū)域，通過不同的啟動子區(qū)域修飾來測定表達(dá)量的差異，可利用β-半乳糖苷酶活性來測定。
從已克隆且證明的堿基序列推算pdhA基因的啟動子位點(diǎn)，結(jié)果推測很有可能位于序列表中序列號32的第2252到22257及2279到2284的堿基，分別是位于-35區(qū)域及-10區(qū)域。因此合成序列表中序列號35和36中的引物，以來自乳酸發(fā)酵短桿菌ATCC 13869染色體DNA為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增含有pdhA基因啟動子區(qū)域的DNA片段。合成的引物中，序列號35對應(yīng)到序列號32中的堿基2194到2221；但堿基2198已用C取代，且堿基2200和2202已用G取代，且限制酶SmaⅠ的識別序列已被插入。序列號36對應(yīng)到序列號32中的堿基2372到2398；但堿基2393和2394已用G取代，且具有限制酶SmaⅠ的識別序列的反鏈，從5′位點(diǎn)表示。使用細(xì)菌基因組DNA純化試劑盒(Advanced GeneticTechnologies Corp.)制備乳酸發(fā)酵短桿菌ATCC 13869的染色體作為模板，以PCR Technology(H.Erlich編輯，Stockton Press，1989)第8頁所敘述的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下進(jìn)行PCR來擴(kuò)增pdhA基因的啟動子區(qū)域。利用常用的一般方法純化所得的PCR產(chǎn)物，然后使用限制酶SmaⅠ作用之。將此片段與已用限制酶SmaⅠ(實(shí)施例4(3))切割的pNEOL連接在一起，pNEOL能在缺乏LacZ基因啟動子區(qū)域的棒狀菌中復(fù)制(使用連接試劑盒(Takara Shuzo Co.,Ltd.))。之后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM 109感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)(Takara Shuzo Co.,Ltd.)，然后將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂于含有40微克/毫升X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷)和25微克/毫升卡那霉素的L-培養(yǎng)基上(含有10克/升bactotryptone，5克/升細(xì)菌酵母菌萃取物，5克/升NaCl和15克/升瓊脂，pH7.2)。過夜培養(yǎng)之后，挑起藍(lán)色菌落并分別培養(yǎng)這些轉(zhuǎn)化菌株。使用堿性方法(日本生物工學(xué)會編輯，以及培風(fēng)館發(fā)行的生物工學(xué)實(shí)驗(yàn)書，p.105，1992)從已轉(zhuǎn)化菌株中制備質(zhì)粒。通過一般方法測定插入到載體的DNA片段的序列之后，含有此插入段DNA片段的質(zhì)粒命名為pNEOLBPDHAprol。
更進(jìn)一步，為構(gòu)建質(zhì)粒而合成的位于序列表中的序列號37,38和39的引物，其中假設(shè)是啟動子位點(diǎn)的區(qū)域已改變?yōu)榘魻罹鷨幼拥墓灿行蛄?。使用乳酸發(fā)酵短桿菌ATCC 13869染色體DNA為模板，各引物及序列號36的引物進(jìn)行PCR，所擴(kuò)增的DNA片段中的pdhA基因啟動子區(qū)域已改變?yōu)楣灿行蛄?。在合成的引物中，序列?7對應(yīng)到序列號32中的堿基2244到2273；而堿基2255已被C取代，和堿基2257已被A取代；且只有-35區(qū)域已被改為棒狀菌的共有序列。序列號38對應(yīng)到序列號32中的堿基2249到2288；堿基2279和2281已被T取代；且只有-10區(qū)域已被改為棒狀菌的共有序列。序列號39對應(yīng)到序列號32的堿基2249到2288；堿基2255已被C取代，堿基2257已被A取代；以及堿基2279和2281已被T取代；且-35區(qū)域和-10區(qū)域皆改為棒狀菌的共有序列。使用細(xì)菌基因組純化試劑盒(Advanced GeneticTechnologies Corp.)制備乳酸發(fā)酵短桿菌ATCC 13869的染色體作為模板，以PCR Technology(H.Erilich編輯，Stockton Press發(fā)行，1989)第8頁所述的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下進(jìn)行PCR，利用這些引物擴(kuò)增pdhA基因的啟動子區(qū)域，其中的啟動子區(qū)域改為共有序列。所得的PCR產(chǎn)物以常用方法純化，然后以限制酶SmaⅠ作用之。將此片段與已用限制酶SmaⅠ切割的pNEOL利用連接試劑盒(Takara Shuzo Co.，Ltd.)連接起來，其中的pNEOL能在缺乏啟動子區(qū)域的lacZ基因的棒狀菌中復(fù)制。之后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM 109感受態(tài)細(xì)胞(Takara Shuzo Co.,Ltd.)內(nèi)，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂于含有40微克/毫升X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷)和25微克/毫升卡那霉素的L-培養(yǎng)基(包含10克/升bactotryptone，5克/升細(xì)菌酵母菌萃取物，5克/升NaCl和15克/升瓊脂，pH7.2)。過夜培養(yǎng)之后，挑起藍(lán)色菌落并分別培養(yǎng)這些轉(zhuǎn)化菌株。使用堿性方法(日本生物工學(xué)會編輯，以及培風(fēng)館發(fā)行的生物工學(xué)實(shí)驗(yàn)書，p.105,1992)從已轉(zhuǎn)化菌株中制備質(zhì)粒。通過一般方法測定插入到載體的DNA片段的序列，其中只有-35區(qū)域已改為共有序列的質(zhì)粒命名為pNEOLBPDHApro35；所含的DNA片段中的序列只有-10區(qū)域已改為共有序列的質(zhì)粒則命名為pNEOLBPDHApro10；且若質(zhì)粒所含的DNA片段的-35區(qū)域及-10區(qū)域皆改為共有序列者則命名為pNEOLBPDHApro3510 。(5)突變株pdhA啟動子活性的估計使用電脈沖法(特開平2-207791)將這里構(gòu)建的質(zhì)粒pNEOLBPDHApro1，pNEOLBPDHApro10和pNEOLBPDHApro3510和命名的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到乳酸發(fā)酵短桿菌ATCC 13869中而取得被轉(zhuǎn)化菌株。以實(shí)施例4(4)中所敘述的方法測定所得的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的β-半乳糖苷酶活性。啟動子區(qū)域的序列改為共有序列之后的β-半乳糖苷酶活性顯示在表18中，其中將具有pdhA基因啟動子區(qū)域的β-半乳糖苷酶酶活性定為1。
表18菌株 β-半乳糖苷酶活性(相對值)ATCC 13869/pNEOLBPDHAprol 1ATCC 13869/pNEOLBPDHApro106ATCC 13869/pNEOLBPDHApro3510 7.5這些結(jié)果指出假設(shè)的啟動子位點(diǎn)為pdhA基因的啟動子，且可通過改變此區(qū)域的序列為共有序列而改變pdhA的表達(dá)(增加)。此事實(shí)表示通過改變PdhA基因的啟動子區(qū)域，就能不需使用質(zhì)粒而改變表達(dá)量。(6)構(gòu)建質(zhì)粒用以制備啟動子突變的菌株由于已證明可通過在啟動子導(dǎo)入突變而改變PdhA的表達(dá)，因此構(gòu)建質(zhì)粒用以制備PdhA基因啟動子變化的菌株。為構(gòu)建啟動子變化的菌株，因此構(gòu)建三種質(zhì)粒。此三質(zhì)粒分別是其中的-35區(qū)域，-10區(qū)域和兩區(qū)域皆改為共有序列。
以已被克隆的堿基序列為基礎(chǔ)，新合成序列號40和41中的引物。在合成的引物中，序列號40是一反鏈，其堿基序列對應(yīng)于序列號32中的堿基2491到2521的反鏈，其表示法是從5′開始，且在5′末端附著上3個A和4個T。序列號33是一反鏈，對應(yīng)于序列號32中的pdhA基因的堿基5020到5039的反鏈，其表示法是從5′開始。使用序列號33和40為引物，以細(xì)菌基因組DNA純化試劑盒(Advanced GeneticTechnologies Corp.)所制備的乳酸發(fā)酵短桿菌ATCC 13869的染色體為模板，在PCR Technology(H.Erilich編輯，Stockton Press發(fā)行，1989)第8頁所敘述的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下進(jìn)行PCR。更進(jìn)一步使用序列號15和17為引物，乳酸發(fā)酵短桿菌ATCC 13869的染色體為模板進(jìn)行PCR。使用常用方法純化所得到的PCR產(chǎn)物。然后使用通過序列號9和16為引物進(jìn)行PCR，以及使用序列號39和41的PCR產(chǎn)物及序列號33和41為引物進(jìn)行PCR。PCR條件如下在反應(yīng)液中此四個DNA濃度為10微摩爾濃度，沒有使用模板，并使用La tag(Takara Shuzo Co.,Ltd.)。使用一般常用方法純化PCR產(chǎn)物后與限制酶SalⅠ和XhoⅠ作用。所得片段利用連接試劑盒(Takara Shuzo Co.,Ltd.)與已用限制性酶SolⅠ切割的溫度敏感性質(zhì)粒pSFKT2連接在一起，而pSFKT2能在棒狀菌中復(fù)制。之后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM 109感受態(tài)細(xì)胞(Takara Shuzo Co.,Ltd.)內(nèi)，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂有含有10微克/毫升1PTG(異丙基-β-半乳糖苷)，25微克/毫升卡那霉素和40微克/毫升X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷)的L-培養(yǎng)基(包含10克/升bactotryptone，5克/升細(xì)菌酶母菌萃取物，5克/升NaCl和15克/升瓊脂，pH7.2)。過夜培養(yǎng)之后，挑起白色菌落并分別培養(yǎng)這些被轉(zhuǎn)化的菌落菌株。使用堿性方法(由日本生物工學(xué)會編輯，培負(fù)館發(fā)行的生物工學(xué)實(shí)驗(yàn)書，p.105,1992)從已轉(zhuǎn)化菌株中制備質(zhì)粒。之后測序插入到載體的DNA片段，然后與序列號32中所發(fā)表的pdhA基因的堿基序列作比較。含有DNA片段的質(zhì)粒，其中的DNA片段序列只有啟動子的-35區(qū)域和-10區(qū)域改為棒狀菌的共有序列，將此質(zhì)粒命名為pSFKTPDHApro3510。
質(zhì)粒中的pdhA基因啟動子-35區(qū)域改為棒狀菌的共有序列，和pdhA基因啟動子-10區(qū)域改為棒狀菌共有序列的質(zhì)粒，除了分別以序列表中的序列號37和39取代序列號39以外，皆是以上述相同方法構(gòu)建的。這些質(zhì)粒分別命名為pSFKTPDHApro35和pSFKTPDHApro10。(7)啟動子突變菌株的制備pdhA基因啟動子突變菌株的制備是通過同源性重組作用，利用上述步驟(6)中用于制備啟動子突變菌株所構(gòu)建的質(zhì)粒來進(jìn)行。
首先，通過電脈沖法(特開平2-207791)將質(zhì)粒pSFKTPDHApro3510轉(zhuǎn)化到GC 25用以制備啟動子突變菌株。之后轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂于CM2B平板培養(yǎng)基(包括10克/升聚蛋白胨，10克/升細(xì)菌酵母菌萃取物，5克/升NaCl，10微克/毫升生物素和15克/升瓊脂，pH7.2)并在25℃培養(yǎng)以獲取被轉(zhuǎn)化菌株。將此產(chǎn)物于含有CM2B液態(tài)培養(yǎng)基的試管中培養(yǎng)過夜。然后涂于含有25微克/毫升卡那霉素的CM2B平板培養(yǎng)基，在34℃培養(yǎng)以獲取含有通過同源性重組作用將質(zhì)粒pSFKTPDHApro 3510插入到染色體中的一次轉(zhuǎn)化菌株。分離出單一菌落之后，濕涂于CM2B平板培養(yǎng)基在31.5℃培養(yǎng)。菌落開始出現(xiàn)之后，此產(chǎn)物能在含有25微克/毫升卡那霉素的CM2B平板培養(yǎng)基中復(fù)制而得到卡那霉素敏感性菌株。由于有兩種菌株，亦即具有野生型pdhA基因啟動子位點(diǎn)的菌株，和另一具有突變導(dǎo)入的菌株，因此測序此部分。如此可獲得將突變導(dǎo)入pdhA基因啟動子位點(diǎn)的啟動子突變菌株。在此菌株中，pdhA基因的啟動子-35區(qū)域和-10區(qū)域已改為棒狀菌的共有序列。此菌株命名為GD 3510。
除了以質(zhì)粒pSFKTPDHApro35和pSFKTPDHApro10取代質(zhì)粒pSFKTPDHApro3510用以制備啟動子突變菌株之外，使用上述的相同方法獲取pdhA基因啟動子的-35區(qū)域和-10區(qū)域已改為棒狀菌共有序列的菌株。它們分別命名為GD 35和GD 10。(8)pdhA基因啟動子突變菌株的錐形瓶培養(yǎng)結(jié)果的評估將上述所得的三種pdhA基因啟動子突變菌株在錐形瓶中培養(yǎng)以產(chǎn)生L-谷氨酸。將培養(yǎng)于CM2B平板培養(yǎng)基中的啟動子突變菌株GD3510,GD 35,GD 10和GC 25細(xì)胞接種于培養(yǎng)基中(每公升水含有30克葡萄糖，1克KH2PO4,0.4克MgSO4·7H2O,30克(NH4)2SO4,0.01克FeSO4.7H2O,0.01克MnSO4.7H2O,15毫升黃豆水解物，200微克鹽酸硫胺素，60微克生物素和50克CaCO3；使用KOH調(diào)整pH到8.0)。然后在31.5℃搖動培養(yǎng)到培養(yǎng)基中的糖分消耗為止。所得的產(chǎn)物接種到上述相同成分的培養(yǎng)基中，以5％的量于37℃搖動培養(yǎng)到培養(yǎng)基中的糖分消耗為止。培養(yǎng)完全之后，使用Biotic Analyzer AS-210(AsahiChemical Industry Co.,Ltd.)測定液態(tài)培養(yǎng)基中所累積的L-谷氨酸數(shù)量。結(jié)果顯示于表19中。
表19菌株 L-谷氨酸(克/100毫升)GC 25 1.9GD 35 2.0GD 10 2.0GD 35102.1從這些結(jié)果得知所獲得的啟動子突變菌株可提供增強(qiáng)的谷氨酸產(chǎn)量。實(shí)施例6導(dǎo)入突變到棒狀菌精氨酰琥珀酸合成酶基因的啟動子區(qū)域內(nèi)(1)argG基因上游的堿基序列的測定為了以PCR擴(kuò)增黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)的argG基因，因此需測定此ORF上游及下游區(qū)域的堿基序列。以已知的谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicom)argG的ORF堿基序列(GenBank登記號AF 030520)為基礎(chǔ)合成引物，并使用體外LA PCR克隆試劑盒(Takara Shuzo Co.,Ltd.)依據(jù)其說明書進(jìn)行堿基序列的測定。這些引物特別使用具有位于序列號42和43中的堿基序列的寡核苷酸(引物1和2)用于上游區(qū)域，以及具有位于序列號44和45中的堿基序列的寡核苷酸(引物3和4)用于下游區(qū)域。將野生型菌株的黃色短桿菌2247菌株(ATCC 14067)的染色體DNA，以限制酶EcoRⅠ完全消化，使用引物2或3進(jìn)行第1次PCR，和使用引物1或4進(jìn)行第2次PCR來測定argG上游及下游的堿基序列。(2)啟動子位點(diǎn)的預(yù)測將上述序列以購買的軟件(GENETYX)預(yù)測argG基因ORF的上游區(qū)域中類似啟動子的序列。將突變導(dǎo)入最高分?jǐn)?shù)(約第一個ATG的上游120bp)的位點(diǎn)。然后測量此啟動子的活性。(3)導(dǎo)入突變到啟動子序列中，并測定突變株啟動子的活性使用突變導(dǎo)入引物9，10,11,12或13和7(具有序列號50,51,52,53,54或58)用于最高分?jǐn)?shù)的位點(diǎn)，以AJ 12092菌株的染色體DNA為模板進(jìn)行第一次PCR。使用PCR產(chǎn)物作為3′位點(diǎn)的引物，以及具有序列號49的引物8作為5′位點(diǎn)的引物，相同的染色體DNA作為模板進(jìn)行第二次PCR，在可能是啟動子的部分獲得具有突變導(dǎo)入其中的DNA片段。為測定此突變株啟動子的活性，將這些DNA片段插入到啟動子探針載體pNEOL的SmaⅠ位點(diǎn)，而能得到與LacZ報告基因相同方向的質(zhì)粒pNEOL-1,pNEOL-2,pNEOL-3,pNEOL-4和pNEOL-7。使用引物7和8,AJ 12092菌株染色體DNA為模板進(jìn)行PCR所得的DNA片段同樣插入質(zhì)粒pNEOL的LacZ報告基因的上游而獲得對照組質(zhì)粒pNEOL-0。
將pNEOL-0,pNEOL-1,pNEOL-2,pNEOL-3,pNEOL-4和pNEOL-7導(dǎo)入AJ 12092菌株內(nèi)。使用電脈沖法(特開平2-207791)將質(zhì)粒導(dǎo)入。把每一轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂于含有4微克/毫升氯霉素的CM2G平板培養(yǎng)(每1公升純水包含10克聚蛋白胨，10克酵母菌萃取物，5克葡萄糖，5克NaCl和15克瓊脂，pH7.2)，并篩選氯霉素抗性菌株。
將這些菌株——涂于瓊脂培養(yǎng)基(含有0.5克/100毫升)葡萄糖，1克/100毫升聚蛋白胨，1克/100毫升酵母菌萃取物，0.5克/100毫升NaCl和5微克/升氯霉素)，在31.5℃培養(yǎng)20小時。取所得的其中一細(xì)胞接種到一培養(yǎng)基中[包含3克/100毫升葡萄糖，1.5克/100毫升硫酸銨，01克/100毫升KH2PO4，0.04克/100毫升MgSO4，0.001克/100毫升FeSO4，0.01克/100毫升MnSO4，5微克/毫升VB1，5微克/100毫升生物素和45毫克/100毫升(以氮角度而言)的黃豆水解物]。于31.5℃培養(yǎng)18小時，所得細(xì)胞以實(shí)施例4(4)中所敘述的方法測定β-半乳糖苷酶活性。
AJ 12092/pNEOL-0所檢測的β-半乳糖苷酶活性顯示在表20中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)插入到lacZ基因結(jié)構(gòu)上游的DNA片段扮演啟動子的功能。此外，每一質(zhì)粒導(dǎo)入的菌株皆比AJ 12092/pNEOL-0具有較高的β-半乳糖苷酶活性。因此發(fā)現(xiàn)通過導(dǎo)入突變到可能是啟動子序列的菌株，其轉(zhuǎn)錄作用活性增加，結(jié)果顯示在表20中。
表20相對活性(AJ 12092/pNEOL-0=1)AJ 12092 未檢測AJ 12092/pNEOL-01.0AJ 12092/pNEOL-12.8AJ 12092/pNEOL-22.7AJ 12092/pNEOL-31.8AJ 12092/pNEOL-40.8AJ 12092/pNEOL-73.0(4)用于導(dǎo)入突變的質(zhì)粒的構(gòu)建以AJ 12092菌株的染色體DNA為模板，使用引物14和15(具有序列號55和56)進(jìn)行PCR。所得的DNA片段插入克隆用載體pHSG 398(TaKaRa產(chǎn)品)的多克隆位點(diǎn)中的SmaⅠ位點(diǎn)以構(gòu)建質(zhì)粒p0。然后使用限制酶EcoRⅤ和BspHⅠ消化p0，同樣也使用限制酶EcoRⅤ和BsplⅠ消化pNEOL-3和pNEOL-7。所得的DNA片段連接在一起而獲得導(dǎo)入突變的質(zhì)粒p3(衍生自導(dǎo)入突變的引物11的突變株)和p7(衍生自導(dǎo)入突變的引物13的突變株)。(5)將突變導(dǎo)入性質(zhì)粒導(dǎo)入到產(chǎn)生精氨酸的細(xì)菌內(nèi)使用電脈沖法(特開平2-207791)將所得質(zhì)粒導(dǎo)入產(chǎn)生精氨酸的乳酸發(fā)酵短桿菌AJ 12092菌株內(nèi)。由于這些質(zhì)粒的自動復(fù)制功能在短桿菌內(nèi)無效，因此唯有通過同源性重組作用將主要質(zhì)粒插入整合到染色體的菌株才能被篩選為Cm抗性菌株。將突變導(dǎo)入性質(zhì)粒插入整合到染色體者，在含有5微克/毫升氯霉素的CM2G平板培養(yǎng)基(每1公升純水包含10克聚蛋白胨，10克酵母菌萃取物，5克葡萄糖，5克NaCl和15克瓊脂，pH7.2)篩選氯霉素抗性菌株。然后再進(jìn)行一次同源性重組作用從Cm敏感性菌株篩選出將指定的變化序列置換argG基因的啟動子部分的菌株。
因此得到以P3序列取代的菌株(AJ 12092-P3)和P7序列取代的菌株(AJ 12092-P7)。(6)argG基因的克隆以(1)中所測定的堿基序列為基礎(chǔ)，合成具有位于序列號46和47的寡核苷酸(引物5和6)，及黃色短桿菌的染色體DNA為模板進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)進(jìn)行25次循環(huán)，每一循環(huán)包括94℃30秒，55℃1秒，72℃2分鐘及30秒。如此所得的DNA片段克隆到克隆用載體pSTV 29(Takara Shuzo Co.,Ltd.)中多克隆位點(diǎn)的SmaⅠ位點(diǎn)。更進(jìn)一步，將實(shí)施例1中的pSAK4以SalⅠ處理所得的復(fù)制起點(diǎn)片段插入pSTⅤargG的SalⅠ位點(diǎn)而制備pargG。(7)將pargG導(dǎo)入到短桿菌內(nèi)使用電脈沖法(特開平2-207791)將質(zhì)粒pargG導(dǎo)入乳酸發(fā)酵短桿菌AJ 12092菌株內(nèi)。然后將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物于含有4微克/毫升氯霉素的CM2G平板培養(yǎng)基(每1公升純水包括10克聚蛋白胨，10克酵母菌萃取物，5克葡萄糖，5克NaCl和15克瓊脂，pH7.2)篩選氯霉素抗性菌株。(8)啟動子突變菌株的argG活性上述的兩種argG啟動子突變菌株和使用質(zhì)粒通過擴(kuò)增argG所得的菌株(AJ 12092/pargG)測定其argG活性。將這些菌株——涂于瓊脂培養(yǎng)基(含有0.5克/100毫升葡萄糖，1克/100毫升聚蛋白胨，1克/100毫升酵母提取物，0.5克/毫升NaCl和5微克/升氯霉素)，在31.5℃培養(yǎng)20小時。然后將所得的每一細(xì)胞接種到培養(yǎng)基內(nèi)[包含3克/100毫升葡萄糖，1.5克/100毫升硫酸銨，0.1克/100毫升KH2PO4，0.04克/100毫升MgSO4,0.001克/100毫升FeSO4，0.01克/100毫升MnSO4，5微克/毫升VB1，5微克/100毫升生物素和45毫克/100毫升(以氮而言)的黃豆水解物]。在31.5℃培養(yǎng)18小時后，使用已述方法[Journal ofGeneral Microbiology(1990)]測定所得細(xì)胞的ArgG活性。上述兩種ArgG啟動子突變菌株和使用質(zhì)粒通過擴(kuò)增argG所得菌株的ArgG活性顯示在表21中。從表21顯然得知，將突變導(dǎo)入啟動子的AJ 12092-P3的ArgG活性比親代品約高兩倍，而AJ 12092-P7比親代菌株高約3倍。AJ 12092/pargG的ArgG活性比親代菌株高約4.5倍。
表21相對活性(AJ 12092=1)AJ 120921.0AJ 12092 - P3 2.1AJ 12092 - P7 2.9AJ 12092/pargG 4.4(9)由啟動子突變菌株產(chǎn)生精氨酸在錐形瓶內(nèi)培養(yǎng)每一argG啟動子變化的菌株。為對照用，也同樣培養(yǎng)親代菌株AJ 12092和AJ 12092/pargG。將這些菌株各別接種到培養(yǎng)基上(含有0.1克/100毫升KH2PO4，0.04克/100毫升MgSO4，0.001克/100毫升FeSO4，0.01克/100毫升MnSO4，5微克/毫升VB1，5微克/100毫升生物素和45克/100毫升(以氮而言)的黃豆水解物)。然后再涂于瓊脂培養(yǎng)基(包含0.5克/100毫升葡萄糖，1克/100毫升聚蛋白胨，1克/100毫升酵母菌萃取物，0.5/克/100毫升NaCl和5微克/升氯霉素)，于31.5℃培養(yǎng)20小時。然后取這些細(xì)胞培養(yǎng)在含有4克/100毫升葡萄糖和6.5克/100毫升硫酸銨的錐形瓶中，于31.5℃培養(yǎng)到葡萄糖完全消耗為止。使用0.2當(dāng)量濃度的HCl溶液將此培養(yǎng)液稀釋到1/51的濃度測其吸光度(CD 620)，精氨酸的生成量(濃度克/100毫升)及培養(yǎng)時間顯示在表22中。
從表22顯然得知使用argG啟動子突變菌株時，精氨酸的產(chǎn)量增加程度相當(dāng)于使用質(zhì)粒擴(kuò)增argG。啟動子突變菌株AJ 12092-P3和AJ12092-P7的培養(yǎng)時間與親代菌株相同，但質(zhì)粒擴(kuò)增菌株的培養(yǎng)時間較長。由此得知精氨酸產(chǎn)生力高于質(zhì)粒擴(kuò)增菌株。
表22OD 精氨酸 培養(yǎng) 生產(chǎn)力(克/100 時間 (克/100毫毫升) (小時) 升/小時)AJ 12092 0.5021.25 48 0.026AJ 12092-P3 0.5101.47 48 0.031AJ 12092-P7 0.5141.43 48 0.030A.J 12092/pargG 0.5201.47 52 0.028實(shí)施例7將突變導(dǎo)入產(chǎn)生谷氨酸的棒狀菌的GDH基因啟動子區(qū)域內(nèi)(1)突變株gdh質(zhì)粒的構(gòu)建使用定位突變法來構(gòu)建具有實(shí)施例2中所敘述的FGR1菌株和FGR2菌株的GDH啟動子序列的質(zhì)粒。為取得FGR1菌株的GDH啟動子序列，使用序列號57和60的合成DNA為引物及ATCC 13869的染色體DNA為模板進(jìn)行PCR；另一方面也使用序列號58和59的合成DNA及ATCC 13869的染色體DNA為模板進(jìn)行PCR。更進(jìn)一步，以這些PCR產(chǎn)物作為模板，使用序列號57和58的合成DNA為引物進(jìn)行PCR。將所得的PCR產(chǎn)物插入pSFKT 2(特愿平11-69896)的SmaⅠ位點(diǎn)而構(gòu)建出pSFKTG11。為取得FGR2菌株的GDH啟動子序列，使用序列號57和62的合成DNA為引物及ATCC 13869的染色體DNA為模板進(jìn)行PCR；另一方面也使用序列號58和61的合成DNA為引物，及ATCC13869的染色體DNA為模板進(jìn)行PCR。更進(jìn)一步，以這些PCR產(chǎn)物為模板，使用序列號57和58的合成DNA為引物進(jìn)行PCR。所得的PCR產(chǎn)物插入pSFKT2(特愿平11-69896)的SmaⅠ位點(diǎn)而構(gòu)建出pSFKTG07。插入pSFKTG11和pSFKTG07 SmaⅠ位點(diǎn)的DNA片段必需測定其堿基序列，以確認(rèn)除了啟動子區(qū)域以外沒有突變導(dǎo)入GDH內(nèi)。(2)gdh啟動子突變菌株的構(gòu)建使用電脈沖法將pSFKTG 11和pSFKTG 07導(dǎo)入AJ 13092菌株內(nèi)，然后將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物生長于含有25微克/毫升卡那霉素的CM2B平板上，于25℃進(jìn)行篩選。將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在34℃培養(yǎng)，以篩選可在34℃對卡那霉素具抗性的菌株。事實(shí)上有一菌株在34℃對卡那霉素具抗性，表示pSFKTG11或pSFKTG 07整合插入到AJ 13029菌株的染色體中。因此卡那霉素敏感性菌株則從那些質(zhì)粒插入整合到染色體中的菌株中獲得。測定這些菌株的GDH啟動子序列，具有相同于pSFKTG 11和pSFKTG 07的gdh啟動子序列的菌株分別命名為GA01和GA02。(3)gdh啟動子突變菌株的L-谷氨酸產(chǎn)生力的確認(rèn)使用上述實(shí)施例2(2)中的相同方法確認(rèn)菌株GA01和GA02和其親代菌株的谷氨酸產(chǎn)生力。結(jié)果得知GA01和GA02顯著增加谷氨酸的累積，結(jié)果顯示在表23。
表23菌株谷氨酸(克/100毫升)GDH的比活性相對值A(chǔ)J 13029 2.6 7.7 1.0GA01 3.0 22.3 2.9GA02 2.9 27.0 3.5(4)自行克隆(self-cloning)型式的gdh質(zhì)粒的構(gòu)建首先，構(gòu)建自行克隆載體pAJ 220。使用EcoRⅤ和PatⅠ處理pAJ 226(特開昭61-152289)，以制備含有可在棒狀菌內(nèi)自動復(fù)制的區(qū)域的片段。將此片段與約0.7kb的DNA片段連接起來而得到質(zhì)粒AJ 220，而0.7 kb的DNA片段是以EcoRV和PstⅠ處理pAJ 224(J P.KOKAI No.Sho 61-152289)所得到。此質(zhì)粒能在棒狀菌內(nèi)自動復(fù)制，且可使宿主對抗生素-甲氧芐啶具抗性。
使用序列號63和64的合成DNA為引物，野生型棒狀菌ATCC 13869的染色體DNA為模板進(jìn)行PCR。將所得的gdh基因片段插入pAJ 220的BalⅠ位點(diǎn)而構(gòu)建pAJ 220G。啟動子位于靠近pAJ 220的BalⅠ位點(diǎn)，且表達(dá)的增加視基因插入到BalⅠ位點(diǎn)的方向而定。使用電脈沖法將pAJ220G和pGDH導(dǎo)入ATCC 13869內(nèi)。如此構(gòu)建的菌株的GDH活性測定，可通過上述(1)中的方法進(jìn)行。結(jié)果顯示于表24中，導(dǎo)入pAJ 220G的菌株的GDH活性比導(dǎo)入dGDH的菌株高約1.5倍。
表24菌株 GDH比活性相對值A(chǔ)TCC 13869 7.7 1.0ATCC 13869/pGDH82.710.7ATCC 13869/pAJ 220G120.1 15.6(5)gdh活性對產(chǎn)量及副產(chǎn)物天冬氨酸的影響的研究利用電脈沖法將pGDH和pAJ 220G導(dǎo)入AJ 13029內(nèi)。將這些菌株及上述步驟(2)中所得的菌株一一接種到具有表25中所示成分的接種培養(yǎng)基內(nèi)，于31.5℃搖動培養(yǎng)24小時以獲取這些接種物。取300毫升的主要培養(yǎng)基于500毫升的玻璃發(fā)酵瓶內(nèi)，主要培養(yǎng)基成分如表25中所示，然后加熱滅菌。將40毫升的上述的接種培養(yǎng)基內(nèi)的菌株接種到主要培養(yǎng)基內(nèi)，在31.5℃開始培養(yǎng)并伴隨800到1300rpm的轉(zhuǎn)動及1/2到1/1vvm的通氣量。使用氣態(tài)氨維持1/1 pH7.5。開始培養(yǎng)8小時后將溫度移到37℃。約20到40小時內(nèi)葡萄糖完全耗盡時就終止培養(yǎng)，測定所形成及累積在液態(tài)培養(yǎng)基中的L-谷氨酸數(shù)量(表26)。GDH的活性最高可得到約3倍高的產(chǎn)量。當(dāng)GDH活性更進(jìn)一步再提高時，則產(chǎn)量的增強(qiáng)程度就會降低。當(dāng)GDH活性提高到16倍時，產(chǎn)量會稍微減少。使用日立氨基酸分析儀L-8500來分析副產(chǎn)物氨基酸的形成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GDH活性提高時，天冬氨酸和丙氨酸的累積量增加。這些結(jié)果證明下列事實(shí)要增加谷氨酸的產(chǎn)量必需適當(dāng)增加GDH的活性，才不致導(dǎo)致天冬氨酸和丙氨酸的顯著增加。其中一有效方法就是將各種gdh啟動子的突變導(dǎo)入以調(diào)控GDH活性至3倍的親代菌株即可。
表25濃度成分 接種培養(yǎng)主要培養(yǎng)葡萄糖 50克/升150克/升KH2PO41克/升 2克/升MgSO4·7H2O0.4/克/升 1.5克/升FeSO4·7H2O10毫克/升 15毫克/升MnSO4·4H2O10毫克/升 15毫克/升黃豆蛋白質(zhì)水解物20毫升/升 50毫升/升生物素 0.5毫克/升 2毫克/升鹽酸硫胺素 2毫克/升 3毫克/升表26菌株 谷氨酸天冬氨酸 丙氨酸 GDH 相對值(克/100(毫克/ (毫克/比活性毫升) 100毫升)100毫升)AJ 13029 8.3 49 607.71.0GA01 9.0 145 152 22.3 2.9GA02 8.9 153 155 27.0 3.5AJ 13029/pGDH8.8 201 190 82.7 10.7AJ 13029/pAJ220G 7.5 290 590 120.12 15.6
序列表<110>Ajinomoto Co.Inc.<120>構(gòu)建產(chǎn)生氨基酸的細(xì)菌的方法，及通過發(fā)酵該經(jīng)構(gòu)建的產(chǎn)生氨基酸的細(xì)菌以制備氨基酸的方法<130>YIG-0426<160>＞6<210>1<211>46<212>核酸<400>1ttaattcttt gtggtcatat ctgcgacact gccataattt gaacgt<210>2<211>46<212>核酸<400>2ttaattcttt gcggtcatat ctgcgacact gccataattt gaacgt<210>3<211>46<212>核酸<400>3ttaattcttt gtggtcatat ctgcgacact gctataattt gaacgt<210>4<211>46<212>核酸<400>4ttaattcttt gttgacatat ctgcgacact gctataattt gaacgt<210>5<211>46<212>核酸<400>5ttaattcttt gttgccatat ctgcgacact gctataattt gaacgt<210>6<211>46<212>核酸<400>6ttaattcttt gttgtcatat ctgcgacact gctataattt gaacgt<210>7<211>30<212>核酸<220>用于克隆乳酸發(fā)酵短桿菌的gltA的引物A<400>7gtcgacaata gcctgaatct gttctggtcg<210>8<211>30<212>核酸<220>用于克隆乳酸發(fā)酵短桿菌的gltA的引物B<400>8aagcttatcg acgctcccct ccccaccgtt<210>9<211>20<212>核酸<220>用于導(dǎo)入突變到gltA啟動子的引物1<400>9atcgtataa cgtgttaacc<210>10<211>20<212>核酸<220>用于導(dǎo)入突變到gltA啟動子的引物2<400>10atcggtataa tgtgttaacc<210>11<211>40<212>核酸<220>用于導(dǎo)入突變到gltA啟動子的引物4<400>11gatttgacaa aaccgcattt atcggtataa tgtgttaacc<210>12<211>28<212>核酸<220>gltA啟動子序列引物<440>12agggatccgt ccagtctcag acagcatc<210>13<211>17<212>核酸<220>通用引物M13RV<400>13caggaaacag ctatgac<210>14<211>20<212>核酸<220>用于克隆ICDH的引物A<400>14gaattcgctc ccggtgcagc<210>15<211>20<212>核酸<220>用于克隆ICDH的引物B<400>15gatgcagaat tccttgtcgg<210>16<211>28<212>核酸<220>用于導(dǎo)入突變到ICDH的引物1<400>16tggattgctg gctataatgg tgtcgtga<210>17<211>53<212>核酸<220>用于導(dǎo)入突變到ICDH啟動子的引物2<400>17caacccacgt tcagttgaca actactggat tgctggctat aatggtgtcg tga<210>18<211>53<212>核酸<220>用于導(dǎo)入突變到ICDH啟動子的引物3<400>18caacccacgt tcagttgact actactggat tgctggctaa agtggtgtcg tga<210>19<211>28<212>核酸<220>用于導(dǎo)入突變到ICDH啟動子的引物4<400>19ggctgaaact gctataatag gcgccagc<210>20<211>51<212>核酸<220>用于導(dǎo)入突變到ICDH啟動子的引物5<400>20ggaaacacgg cgttgccatg cggggctaa actgctataa taggcgccag c<210>21<211>51<212>核酸<220>用于導(dǎo)入突變到ICDH啟動子的引物6<400>21ggaaaca cgg cgttgacatg cggggctgaa actgctataa taggcgccag c<210>22<211>22<212>核酸<220>ICDH啟動子序列引物<400>22
gtgcgggtcc agatgatctt ag<210>23<211>20<212>核酸<220>用于擴(kuò)增nptⅡ的引物A<400>23gggatcccgg atgaatgtca<210>24<211>23<212>核酸<220>用于擴(kuò)增nptⅡ的引物B<400>24gcccggggtg ggcgaagaac tcc<210>25<211>23<212>核酸<220>用于擴(kuò)增乳酸發(fā)酵短桿菌pdhA基因LA的引物<440>25aci gti tci atg ggi cti ggi cc<210>26<211>23<212>核酸<220>用于擴(kuò)增乳酸發(fā)酵短桿菌pdhA基因LA的引物<400>26cct tct ccg tti agi gti gti cg<210>27<211>30<212>核酸<220>用于體外克隆乳酸發(fā)酵短桿菌pdhA基因LA的引物<400>27ttg cag tta acc acg aag gtc agg ttg tcc<210>28<211>30<2l2>核酸<220>用于體外克隆乳酸發(fā)酵短桿菌pdhA基因LA的引物<400>28tgg atg aga cca cgt gat tct ggc tcg tcc<210>29<211>30<212>核酸<220>用于體外克隆乳酸發(fā)酵短桿菌pdhA基因LA的引物<400>29aca gat cct gca cga agg cat caa cga ggc<210>30<211>30<212>核酸<220>用于體外克隆乳酸發(fā)酵短桿菌pdhA基因LA的引物<400>30tca tcg ctg cgg gta cct cct acg cca ccc<210>31<211>2766<212>核酸<213>乳酸發(fā)酵短桿菌ATCC 13869<220>乳酸發(fā)酵短桿菌ATCC 13869的pdhA基因LA<400>31atg gcc gat caa gca aaa ctt ggt ggt aag ccc tcg gat gac tct aac 48Met Ala Asp Gln Ala Lys Leu Gly Gly Lys Pro Ser Asp Asp ser Asa1 5 10 15ttc gcg atg atc cgc gat ggc gtg gca tct tat ttg aac gac tca gat 96Phe Ala Met Ile Arg Asp Gly Val Ala Ser Tyr Leu Asn Asp Ser Asp20 25 30ccg gag gag acc aac gag tgg atg gat tca ctc gac gga tta ctc cag 144gro Glu Glu Thr Asn Glu Trp Met Asp Ser Leu Asp G1y Leu Leu Gln35 40 45gag tct tct cca gaa cgt gct cgt tac ctc atg ctt cgt ttg ctt gag 192Glu Ser Ser Pro Glu Arg Ala Arg Tyr Leu Met Leu Arg Leu Lau Glu50 55 50cgt gca tct gca aag cgc gta tct ctt ccc cca atg acg tca acc gac 240Arg Ala Ser Ala Lys Arg Val ser Leu Pro Pro Met Thr Ser Thr Asp65 70 75 80tac gtc aac acc att cca acc tct atg gaa cct gaa ttc cca ggc gat 288Tyr Val Asn Thr Ile Pro Thr Ser Met Glu Pro Glu Phe Pro Gly Asp85 90 95gag gaa atg gag aag cgt tac cgt cgt tgg att cgc tgg aac gca gcc 336Glu Glu Met Glu Lys Arg Tyr Arg Arg Trp Ile Arg Trp Asn Ala Ala100 105 110atc atg gtt cac cgc gct cag cga cca ggc atc ggc gtc ggc gga cac 384Ile Met Val His Arg Ala Gla Arg Pro Gly Ile Gly Val Gly Gly His115 120 125att tcc act tac gca ggc gca gcc cct 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權(quán)利要求
1．氨基酸或核酸生產(chǎn)力增強(qiáng)的棒狀菌的制備方法，其特征在于，該方法包括在一棒狀菌染色體上的氨基酸或核酸生物合成基因的啟動子序列中發(fā)生突變而使其接近共有序列，或以基因重組作用在一棒狀菌染色體上的氨基酸或核酸生物合成基因的啟動子序列中導(dǎo)入一個變化而使其接近共有序列，進(jìn)而取得此產(chǎn)生氨基酸或核苷酸的棒狀菌的突變株，培養(yǎng)這些突變株并篩選能大量產(chǎn)生氨基酸或核苷酸的突變株。
2．權(quán)利要求1的方法，其中的氨基酸選自谷氨酸，賴氨酸，精氨酸，絲氨酸，苯丙氨酸，核酸是選肌苷，鳥苷，腺苷和核苷酸。
3．權(quán)利要求1的方法，其中的氨基酸是谷氨酸，其啟動子選自谷氨酸脫氫酶(GDH)，檸檬酸合成酶(CS)，異檸檬酸合成酶(ICDH)，丙酮酸脫氫酶(PDH)和烏頭酸酶(ACO)產(chǎn)生基因的啟動子。
4．權(quán)利要求3的方法，其中谷氨酸脫氫酶(GDH)基因的啟動子是選自位于-35區(qū)域的CGGTCA，TTGTCA,TTGACA和TTGCCA的至少一種DNA序列和/或-10區(qū)域TATAAT序列或ATAAT已被其它堿基取代且不會抑制啟動子的序列。
5．權(quán)利要求4的方法，其中GDH的啟動子具有位于-35區(qū)域的TGGTCA，和位于-10區(qū)域的TATAAT；或位于-35區(qū)域的TTGTCA，和位于-10區(qū)域的TATAAT。
6．權(quán)利要求3的方法，其中CS的啟動子具有位于-35區(qū)域的TTGTCA序列和/或位于-10區(qū)域的TATAAT序列，且此序列不會抑制啟動子功能。
7．權(quán)利要求3的方法，其中ICDH啟動子具有-35區(qū)域的第一或第二啟動子(位點(diǎn))的TTGCCA序列及TTGACA序列中的任意一個和/或-10區(qū)域第一或第二啟動子(位點(diǎn))的TATAAT，且此序列不會抑制啟動子功能。
8．權(quán)利要求3的方法，其中PDH的啟動子具有位于-35區(qū)域的TTGCCA序列和/或位于-10區(qū)域的TATAAT，且此序列不會抑制啟動子功能。
9．權(quán)利要求1的方法，其中的氨基酸是精氨酸，其啟動子是精氨酸琥珀酸合成酶的啟動子。
10．權(quán)利要求9的方法，其中精氨酸琥珀酸合成酶的啟動子具有選自位于-35區(qū)域的TTGCCA,TTGCTA和TTGTCA中至少一種的DNA序列和/或-10區(qū)域TATAAT序列或ATAAC已被其它堿基取代的序列，且此序列不抑制啟動子功能。
11．權(quán)利要求10的方法，其中精氨酸琥珀酸合成酶的啟動子具有位于-35區(qū)域的TTGTCA序列和/或位于-10區(qū)域的TATAAT序列。
12．一種谷氨酸合成基因，它具有權(quán)利要求第4項(xiàng)到第8項(xiàng)中所敘述的啟動子。
13．一種精氨酸合成基因，它具有權(quán)利要求第10項(xiàng)中所敘述的啟動子。
14．一種產(chǎn)生谷氨酸的棒狀菌，它具有權(quán)利要求第12項(xiàng)中所陳述的谷氨酸合成基因。
15．一種產(chǎn)生精氨酸的棒狀菌，它具有權(quán)利要求第13項(xiàng)中所陳述的精氨酸合成基因。
16．經(jīng)由發(fā)酵作用產(chǎn)生氨基酸或核酸的方法，其特征在于，該方法包括培養(yǎng)一具有增強(qiáng)的氨基酸或核苷酸生產(chǎn)力的棒狀菌，而該棒狀菌是通過權(quán)利要求第1項(xiàng)到第11項(xiàng)中所陳述的方法所構(gòu)建的，或在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求第14項(xiàng)或第15項(xiàng)的棒狀菌，于培養(yǎng)基中形成并累積指定的氨基酸或核苷酸，并從培養(yǎng)基中收集之。
17．一種經(jīng)由發(fā)酵作用產(chǎn)生L-谷氨酸的方法，其特征在于，該方法包括在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)對4-氟谷氨酸具抗性的產(chǎn)生L-谷氨酸的棒狀菌，在培養(yǎng)液中形成并累積L-谷氨酸，并從培養(yǎng)基中收集之。
全文摘要
一種制備具有增強(qiáng)的氨基酸或核酸生產(chǎn)能力的棒狀桿菌的方法,包括在一棒狀菌染色體上的氨基酸或核酸生物合成基因的啟動子序列中發(fā)生突變而使其接近共有序列,或以基因重組作用在一棒狀菌染色體上的氨基酸和核酸生物合成基因的啟動于序列中導(dǎo)入一個變化而使其接近共有序列,進(jìn)而取得此產(chǎn)生氨基酸或核苷酸的棒狀桿菌的突變株,培養(yǎng)這些突變株并篩選能大量產(chǎn)生氨基酸或核酸的突變株。這些方法可構(gòu)建一突變株,不需要利用質(zhì)粒就能適當(dāng)加強(qiáng)或控制目的基因的表達(dá);且能經(jīng)由重組作用或突變作用產(chǎn)生高產(chǎn)量的氨基酸。
文檔編號C12N1/21GK1289368SQ99802380
公開日2001年3月28日 申請日期1999年9月22日 優(yōu)先權(quán)日1998年9月25日
發(fā)明者朝倉陽子, 中村純, 菅野壯平, 菅美喜子, 木村英一郎, 伊藤久生, 松井和彥, 中松亙, 倉橋修, 大住剛 申請人:味之素株式會社