專利名稱：一種新的用于微生物液體培養(yǎng)的生物反應(yīng)器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵工藝設(shè)備領(lǐng)域，具體地說本發(fā)明涉及一種新的具有低回流區(qū)的氣升式反應(yīng)器。具有以下的特點反應(yīng)器內(nèi)的液流下降段Ad和上升段Ar比，即Ad/Ar值為1.00-2.00范圍內(nèi)，防止菌絲體纖維破損，形成菌絮團結(jié)壁。改變“內(nèi)導(dǎo)流筒高度與反應(yīng)器高度h/H之比”為≤0.50，有利于菌絲體的正常生長。該氣升反應(yīng)器包含有一層或多層脈沖流清壁器，和雙點式接種系統(tǒng)。
絲狀真菌及大型絲狀真菌中許多都是工業(yè)微生物或藥用菌，其細胞及其代謝產(chǎn)物的制備與生產(chǎn)具有明顯的社會效益和可觀的經(jīng)濟效益。特別是近年來國內(nèi)外專家對藥用大型絲狀真菌細胞及其產(chǎn)物進行的生理生化、藥理與臨床研究結(jié)果表明了工業(yè)規(guī)模開發(fā)這類藥用菌的必要性，從而在子實體栽培基礎(chǔ)上正逐步形成可實施規(guī)模化生產(chǎn)的液體深層培養(yǎng)工藝。絲狀真菌液體培養(yǎng)(特別是大型絲狀真菌培養(yǎng))工藝中的生物反應(yīng)器(包括種液培養(yǎng)反應(yīng)器與液體發(fā)酵反應(yīng)器)目前多沿用非絲狀微生物(例如細菌，放線菌等)培養(yǎng)的傳統(tǒng)機械攪拌發(fā)酵罐。由于攪拌器產(chǎn)生的(特別是在較高轉(zhuǎn)速時)液體內(nèi)湍流剪切場、以及因流體表層旋渦的尾渦氣穴與嚴重的氣泡夾帶產(chǎn)生的氣泡在漿葉區(qū)發(fā)生劇烈而頻繁的分散、聚并與破裂等過程，產(chǎn)生流體剪切使纖細的菌絲破損而影響生長，從而嚴重降低細胞培養(yǎng)效率。
氣升式環(huán)流反應(yīng)器是靠氣體噴射形成流體循環(huán)而達到物質(zhì)傳遞、氧傳遞與熱量傳遞。由于其混合性能良好，供氧能力強，流場剪切力較低，而避免對細胞生長的不良影響(這些優(yōu)點也是簡單鼓泡式反應(yīng)器無法比擬的)。
本發(fā)明為解決微生物液體培養(yǎng)，特別是大型絲狀真菌(MacroFilamentous Fungi)在攪拌反應(yīng)器中液體培養(yǎng)時菌絲易破損、菌團結(jié)壁而不利生長的難題，針對絲狀真菌的生長特點，首創(chuàng)性地專門設(shè)計了與現(xiàn)有氣升反應(yīng)器不同的具有低回流區(qū)等特定結(jié)構(gòu)參數(shù)及其他針對性結(jié)構(gòu)的專用氣升環(huán)流反應(yīng)器(Air Lift Reactor for Filamentous fungi Cultivation，簡稱ALR/ff)。ALR/ff主要結(jié)構(gòu)特征為1)用于明顯好氧性、非絲狀微生物(例如，許多細菌、放線菌)的氣升環(huán)流反應(yīng)器，主要考慮加強主體湍流、獲取較高的氧傳遞效率kLa值。其關(guān)鍵參數(shù)之一的“液流下降段與上升段面積比Ad/Ar值常為0.80-0.90，有時甚至為0.10-0.40。而許多絲狀真菌特別是大型絲狀真菌具有不強烈的氧要求、多細胞菌絲體纖長易破損、易呈菌絮團結(jié)壁生長的生長特點。ALR/ff專用生物反應(yīng)器的Ad/Ar參數(shù)設(shè)計值為1.00-2.00(圖1)，種液菌絲培養(yǎng)反應(yīng)器可取較高值。該設(shè)計以避免較強主體湍流場下造成過小的湍流旋渦尺度而多向剪切于細胞表面，以及防止狹窄的下降段截面增加菌絲團的結(jié)壁率。
2)以上提到的一般的氣升環(huán)流反應(yīng)器結(jié)構(gòu)中，其關(guān)鍵參數(shù)之二，“內(nèi)導(dǎo)流筒高度與反應(yīng)器高度之比h/H”參數(shù)值通常＞0.60。ALR/ff專用生物反應(yīng)器設(shè)計為低回流區(qū)/高分離區(qū)，即h/H參數(shù)值≤0.50(0.30-0.50)，種液菌絲培養(yǎng)反應(yīng)器可取較低值。該設(shè)計的高分離區(qū)有利于減低待分離氣泡(即氣泡上升至液流主體與反應(yīng)器頂部氣流空間交界面處崩裂離析)的流速，以及增大氣泡尺度、以減小氣泡崩裂時菌絲的破損(氣泡液膜吸附較多的菌絲體)。低回流區(qū)/高分離區(qū)使培養(yǎng)結(jié)果表現(xiàn)為菌絲生長均勻齊整。另外，較高的分離區(qū)可以允許對部份絲狀真菌，特別是大型絲狀真菌進行漸增體積的補料分批培養(yǎng)過程。因為可以保證補料過程中自始至終保持導(dǎo)流筒內(nèi)外液體循環(huán)(設(shè)補料過程始、終體積時料液高度分別為h1、h2，令h1＞h2，補入體積高度差為(h2-h1))。
3)絲狀真菌特別是大型絲狀真菌生長過程菌絮團結(jié)壁不僅降低培養(yǎng)效率(Productivity)，而且阻礙傳質(zhì)、傳熱過程，以及影響菌絲形態(tài)控制，特別對種液菌絲培養(yǎng)的關(guān)系更為密切。進一步還對實施微機進行過程自控工作增加了麻煩。這是一個長期來困擾工藝的問題。菌團結(jié)壁主要發(fā)生在液面位置。本發(fā)明ALR/ff生物反應(yīng)器設(shè)計有一層或多層脈沖流清壁器(圖2)。使反應(yīng)器消除結(jié)壁現(xiàn)象，還可以輔助解決氣升反應(yīng)器中經(jīng)常發(fā)生的料液失水濃縮問題。該裝置構(gòu)思新穎、結(jié)構(gòu)簡單、投資低廉、清壁效果明顯。
4)常用生物反應(yīng)器的搖瓶種液接種操作常用壓差法或火焰口傾倒法。后者難于操作又不能確保過程無菌。前者對于絲狀真菌特別是大型絲狀真菌的絮團狀種液，不能通暢接種，而不得不加大壓差或增加壓差次數(shù)，操作繁瑣不安全。ALR/ff生物反應(yīng)器對接種法進行了改進，該反應(yīng)器頂部設(shè)計有“雙點式接種系統(tǒng)”。菌絮狀接種液可以在平衡壓下由液位差驅(qū)動而自然流入反應(yīng)器內(nèi)。整個接種過程簡單、方便、安全、有效。
5)ALR/ff生物反應(yīng)器結(jié)構(gòu)適用于絲狀真菌特別是大型絲狀真菌的種液菌絲培養(yǎng)過程與液體發(fā)酵過程。附圖1,ALR/ff生物反應(yīng)器主要結(jié)構(gòu)圖；圖2,ALR/ff生物反應(yīng)器的脈沖流清壁器結(jié)構(gòu)圖。
實現(xiàn)本發(fā)明的具體步驟如下ALR/ff生物反應(yīng)器，可用耐壓材質(zhì)制成，最高工作溫度130℃，最高工作壓力1.5kg/cm2。主要結(jié)構(gòu)請見圖1。其中Ad/Ar參數(shù)設(shè)計值為1.00-2.00，種液菌絲培養(yǎng)反應(yīng)器可取較高值；h/H參數(shù)值≤0.50(0.30-0.50)，種液菌絲培養(yǎng)反應(yīng)器應(yīng)取較低值。反應(yīng)器的徑高比D/H值取1∶4.0-5.0。以上參數(shù)值可用于實驗室小型反應(yīng)器設(shè)計及其放大到生產(chǎn)規(guī)模的反應(yīng)器。另外，如用不銹鋼材質(zhì)，反應(yīng)器加工時，焊縫必須雙面焊并打光。反應(yīng)器內(nèi)壁有光潔度要求。
ALR/ff生物反應(yīng)器的環(huán)狀管式脈沖流清壁器的結(jié)構(gòu)見圖2。其結(jié)構(gòu)特征在于環(huán)管相對于反應(yīng)器壁的一側(cè)，具有均勻分布的φ3mm孔，分布在環(huán)管上，孔的朝向，面向反應(yīng)器內(nèi)壁朝下形成45°角，由不銹鋼制成。一層或多層。采用可調(diào)式定時閥據(jù)生長與結(jié)壁情況，按設(shè)定的脈沖波周期向易結(jié)壁位置噴射一定壓力的無菌氣流或無菌水流。當使用無菌水流時又可輔助解決氣升反應(yīng)器中經(jīng)常發(fā)生的料液失水濃縮問題。
ALR/ff生物反應(yīng)器裝有“雙點式接種系統(tǒng)”，結(jié)構(gòu)見圖3。裝有待接種液的不銹鋼材質(zhì)專用接種器的上端與下端分別連有耐壓軟管及插入針(特制，針孔Φ6mm)，接種時通過無菌操作，分別插入反應(yīng)器內(nèi)。接種口由可替換的、嚴密緊壓的、耐壓耐高溫彈性橡膠墊所封閉。接種液在平衡壓下由液位差驅(qū)動下自然、平穩(wěn)地流入反應(yīng)器內(nèi)。上述專用接種器由不銹鋼制成，耐壓不小于2kg/cm2，為圓柱形結(jié)構(gòu)，柱壁一側(cè)有耐壓玻璃視鏡，用于計量與觀察內(nèi)部種液情況。圓柱體頂端與下端分別連有上述耐壓軟管及插入針，它的頂端口與種液上方空氣相通，下端口接有可控夾子或閥門與種液相接。
按照發(fā)明說明書內(nèi)容及參照附圖1、2、3的結(jié)構(gòu)圖可實現(xiàn)本發(fā)明不同規(guī)格(體積)的生物反應(yīng)器的制作。
實施例一實驗室用2000ml的ALR/ff生物反應(yīng)器。用耐壓玻璃燒制成筒體及隔套(水浴控溫用)，用不銹鋼材質(zhì)構(gòu)成內(nèi)導(dǎo)流筒、空氣分布管及環(huán)管式脈沖流清壁器及反應(yīng)器頂部具有雙點式接種孔。設(shè)計參數(shù)采用Ad/Ar=1.158,h/H=0.420。用于培養(yǎng)藥用絲狀真菌A.blazei，罐壓＜0.1kg/cm2，低通風量1∶1.0v.v.m.條件下，培養(yǎng)6天，菌絲干重可達13.01g/L。至今國內(nèi)外報道采用其它反應(yīng)器的該菌培養(yǎng)結(jié)果菌絲干重最高僅為3.20g/L。
實施例二實驗室中用作種液培養(yǎng)的1200ml ALR/ff生物反應(yīng)器。制作方法及要求同實施例一。而設(shè)計參數(shù)則采用Ad/Ar=1.980,h/H=0.380。用作藥用絲狀真菌G.sinence的菌絲態(tài)種液培養(yǎng)。通風量1∶2.5v.v.m.，罐壓＜0.1kg/cm2。不用在培養(yǎng)基內(nèi)加入文獻報道常用的促使菌絲分散均勻的增稠劑(如瓊脂，纖維素等)。培養(yǎng)20小時，即可獲得符合發(fā)酵用要求的均勻齊整的短絲狀種液。文獻報道常采用添加增稠劑方法使菌絲生長均勻齊整，但增稠劑的加入往往影響發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)量要求。
實施例三生產(chǎn)用200立升ALR/ff生物反應(yīng)器。該反應(yīng)器全由不銹鋼制成，包括環(huán)管狀脈沖流清壁器以及雙點式接種系統(tǒng)(見圖1,2,3)?？諝夥植脊芗胺帕瞎茉O(shè)置在罐體底部。設(shè)計參數(shù)Ad/Ar=1.08,h/H=0.46。按發(fā)酵工程規(guī)范方法進行反應(yīng)器相應(yīng)的閥件、管件連接。用常規(guī)方法進行反應(yīng)器空消與培養(yǎng)基實消，注意控制空氣分布管進入的蒸氣流量以保證料液在滅菌過程中的有效攪拌。用于生產(chǎn)藥用絲狀真菌靈芝發(fā)酵液。反應(yīng)器的脈沖流清壁器用無菌空氣以0.5小時周期連續(xù)工作，效果滿意。用雙點式接種系統(tǒng)正常接種10％接種量的絲狀種液。周期五天，菌絲干重達到“企業(yè)標準”要求，并且獲得的菌絲球外觀齊整均勻，幾無菌團結(jié)塊物(該產(chǎn)品“企業(yè)標準”的主要指標之一)。與有關(guān)文獻報道比較，使用其他反應(yīng)器還未達到上述效果(例如，菌團結(jié)塊呈大小不等的不定形物，常需進行二次分散性加工處理)。
為更好的理解本發(fā)明，做如下


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圖1 ALR/ff生物反應(yīng)器主要結(jié)構(gòu)圖Twi 雙點式接種系統(tǒng)Cle 脈沖流清壁器H反應(yīng)器筒體高度h內(nèi)導(dǎo)流筒高度D反應(yīng)器內(nèi)徑d內(nèi)導(dǎo)流筒內(nèi)徑Ad 反應(yīng)器內(nèi)液流下降段面積Ar 反應(yīng)器內(nèi)液流上升段面積A-A A-A剖面俯視圖Air 空氣進入口圖2脈沖流清壁器Cle 脈沖流清壁器A由可控閥脈沖式噴射高壓無菌空氣或無菌水的入口RΦ3mm孔分布全圓周，每孔均勻間隔10mmII剖面的局部放大3雙點式接種系統(tǒng)Twi 雙點式接種系統(tǒng)A接種器的兩個插入針分別插入雙孔R擰開A蓋后插入針由膠塞插入II剖面的局部放大圖參考文獻1)D.J.Pollard,et al.:Bioprocess Engineering.16:273-281(1997)2)Dehua hiu,et al.:Applied Biochemistry andBiotechrology,vol.57/58.pp.593-589.1996.3)K.J.Ganzeveld,et al.:Bioprocess Engineering,12:239-247(1995)4)莫海濤 等化學反應(yīng)工程與工藝，vol.14.No.1pp.92-96(1998).5)“第七屆全國生物化工學術(shù)會議”論文集，pp.55-58,pp.521-524,pp.525-528(1996).6)[美]Leon hapidus,Neal R.Amundson.《Chemical Reactor Theory》，周佩正等譯，石油工業(yè)出版社，1984。
權(quán)利要求
1.一種用于微生物液體培養(yǎng)的生物反應(yīng)器，其特征在于，該生物反應(yīng)器是一種具有低回流區(qū)的氣升式反應(yīng)器，包含有一層或多層脈沖流清壁器和雙點式接種系統(tǒng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有低回流區(qū)的氣升式生物反應(yīng)器，其特征在于反應(yīng)器的液流下降段(Ad)與上升段(Ar)面積比，即Ad/Ar參數(shù)設(shè)計值的比值為1.00-2.00的范圍內(nèi)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有低回流區(qū)的氣升式生物反應(yīng)器，其特征在于反應(yīng)器中內(nèi)導(dǎo)流筒高度h與反應(yīng)器高度H之比，即h/H的參數(shù)設(shè)計值≤0.50。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的低回流區(qū)的氣升式生物反應(yīng)器，其特征在于反應(yīng)器設(shè)有一個或多個環(huán)狀管式脈沖流清壁裝置。
5.根據(jù)權(quán)利要4所述的環(huán)狀管式脈沖流清壁裝置，其特征在于環(huán)狀管式脈沖清壁裝置的環(huán)管相對反應(yīng)器壁的一側(cè)具有均勻分布的Φ3mm孔，分布于全環(huán)管上，孔的朝向，面向反應(yīng)器內(nèi)壁向下，最佳角度為45°。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，雙點式接種系統(tǒng)，其特征在于反應(yīng)器設(shè)有二個接種孔，可分別與專用接種器的二端接種針相連。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的反應(yīng)器頂部有二個接種孔，其特征在于接種孔由可替換的、嚴密緊壓的、耐高壓、耐高溫、有彈性的橡膠墊所封閉，接種液可在平衡壓下自然、平穩(wěn)的流入反應(yīng)器內(nèi)，與此相配套的輔助裝置，即專用接種器為由不銹鋼材質(zhì)制成的耐壓圓柱形筒體，一側(cè)有耐壓玻璃液位視鏡，筒體上、下端分別有軟管及接種針相連。
全文摘要
本發(fā)明為解決絲狀真菌特別是大型絲狀真菌在傳統(tǒng)機械攪拌反應(yīng)器中液體培養(yǎng)時菌絲易破損、菌團結(jié)壁而不利于生長的難題,針對絲狀真菌的生長特點專門設(shè)計發(fā)明了與現(xiàn)有氣升反應(yīng)器不同的、具有低回流區(qū)以及涉及升降循環(huán)比等其他特定參數(shù)的氣升反應(yīng)器(ALR/ff),包括種液菌絲培養(yǎng)反應(yīng)器與液體發(fā)酵反應(yīng)器。本發(fā)明中還有新穎有效的脈沖流清壁器,以及適用于絮團狀種液接種的雙點式接種系統(tǒng)。該生物反應(yīng)器還可用于部份絲狀真菌在一般氣升反應(yīng)器中無法進行的變體積補料液體培養(yǎng)過程。
文檔編號C12M1/04GK1302862SQ9912189
公開日2001年7月11日 申請日期1999年10月22日 優(yōu)先權(quán)日1999年10月22日
發(fā)明者龔建華, 王義軍, 杜遵義 申請人:中國科學院微生物研究所