專利名稱：脊椎動物端粒酶基因和蛋白質及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明通常涉及端粒酶，特別涉及人的端粒酶基因和蛋白質及其在診斷和治療中的用途。
背景技術：
非環(huán)狀的染色體需要一種特化機制，用于在每次細胞分裂后維持染色體的末端，因為負責染色體DNA復制的聚合酶不能完全復制線性DNA分子，因而產生“末端復制問題”。為了解決這一問題，真核細胞依賴于一種酶，即端粒酶，將短的、特別是富含G的、相對保守的重復序列增加到染色體的末端。這些重復結構被稱為端粒。
端粒的存在是細胞生存所必需的。即使缺少了一個端粒也會導致酵母(一種真核細胞)中的細胞循環(huán)停滯(Sandell和Zakian，細胞(Cell)75729，1993)。端粒在復制中縮短；端粒酶修復端粒。因此，如預料的那樣，端粒酶的活性首先在活躍分裂的細胞中被檢測到。象這樣，端粒酶的活性在單細胞生物中是組成型存在，而在更復雜的生物中是被調節(jié)的，在胚系、胚胎組織和細胞以及腫瘤細胞中相對豐富。與此相反，在正常的人類體細胞中很難檢測到端粒酶的活性。而且，不僅復制的終止會造成端粒酶減少，最新的數據顯示端粒酶抑制可能是這個過渡期的一個關鍵事件。端粒酶與復制活性之間似乎直接的關系促使人們猜想端粒酶抑制劑可能是一種“通用的”癌癥治療物，基本上對所有的腫瘤類型都有效，而端粒酶的刺激物則可能克服所觀察到的正常細胞的自然衰老。
受這些模型的激勵，在分離與克隆端粒酶的過程中已經對端粒酶進行了大量的描述。已表明端粒延長的機制主要在于端粒重復序列的富含G的鏈。這條向染色體的3’端延伸的富含G的鏈是由端粒酶延伸的，其是來自RNA組分的一種核糖核蛋白質，在此作為模板。已經分離并克隆了這種復合體的不同組分。復合體的RNA組分已被從許多不同的生物中分離并克隆，包括人(Feng等人，科學(Science)2691236，1995)、小鼠和其他哺乳動物、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、四膜蟲(Tetrahymena)、Euplotes、以及Oxytricha(參考Singer和Gottschling，科學，266404，1994；Lingner等人，基因與發(fā)育(Genes & Develop.)81984，1994；以及Romero和Blackburn，細胞，67343，1994)。蛋白質組分相對難分離。最近，已經測定了幾種蛋白質組分的核苷酸序列(從四膜蟲中分離的一個80kD/95kD二聚體蛋白質，WO96/19580；和從人體分離的一個67kD蛋白質，WO97/08314)。
本發(fā)明公開了端粒酶的核苷酸和氨基酸序列、這些序列在診斷和治療中的用途，并提供其它相關的優(yōu)點。
發(fā)明概述一方面，本發(fā)明通常提供分離的編碼脊椎動物端粒酶(及其變體)的核酸分子。脊椎動物的代表性例子包括哺乳動物如人、古老的猴子(例如獼猴、黑猩猩和狒狒)、狗、大鼠和小鼠，以及非哺乳動物類生物如鳥類。在一個優(yōu)選實施方案中，提供了編碼脊椎動物端粒酶的核酸分子，該核酸分子含有

圖1中所示的序列，或者在嚴謹條件下可與圖1中所示序列的互補序列雜交，前提是該核酸分子不是EST AA281296。
在另一個優(yōu)選實施方案中，核酸分子含有圖11中所示的任何序列或編碼圖11中所示的任何氨基酸序列，或者在正常嚴謹條件下可與其序列的互補序列雜交，前提是該核酸分子不是EST AA281296。在其它實施方案中，核酸分子含有圖10中所示的任何序列，或在正常嚴謹條件下可與其序列的互補序列雜交。
另一方面，本發(fā)明提供了含有圖1所示的序列的10至100個連續(xù)核苷酸的寡核苷酸或其互補序列，以及圖10所示序列的10至100個連續(xù)核苷酸的寡核苷酸或其互補序列。寡核苷酸可用可檢測的標記物進行標記。
而在另一方面，本發(fā)明提供了一種表達載體，它含有一個與人端粒酶核酸分子有效相連的異源啟動子。該載體可選自細菌載體、逆轉錄病毒載體、腺病毒載體和酵母載體。還提供了含有這些載體的宿主細胞。
另一方面，本發(fā)明提供一種分離的含有人端粒酶蛋白質的蛋白質。該蛋白質可含有圖1所示的氨基酸序列或其變體，或含有圖11所示的任一氨基酸序列或其變體。在一個相關方面，該蛋白質是人端粒酶蛋白質的一部分，它可衍生自圖1或11所示的序列。在優(yōu)選實施方案中，該蛋白質長度為10至100個氨基酸。
在其它方面，本發(fā)明提供了可與人端粒酶蛋白質或其部分蛋白質特異結合的抗體。
在一個優(yōu)選方面，本發(fā)明提供了能夠在正常嚴謹條件下與編碼人端粒酶的核酸分子特異雜交的寡核苷酸(例如核酸探針或引物)。在某些實施方案中，核酸分子具有可檢測的標記。在某些實施方案中，核酸分子是根據不能與圖1所示的1624-2012位核苷酸雜交而選擇的。在本發(fā)明的某些實施方案中，核酸探針或引物可能與野生型端粒酶序列有一個或多個核苷酸的差別。
在一個相關方面，本發(fā)明提供了能夠特異擴增編碼人端粒酶的核酸分子的全部或部分的一對寡核苷酸引物。在特定實施方案中，核酸分子含有圖1、圖11中所示的序列或其互補序列。在優(yōu)選實施方案中，這對引物能夠特異擴增含有1區(qū)、α區(qū)、β區(qū)、2區(qū)、3區(qū)、X區(qū)或Y區(qū)的全部或部分的序列。在一個相關方面，本發(fā)明提供可與1區(qū)、α區(qū)、β區(qū)、2區(qū)、3區(qū)、X區(qū)或Y區(qū)中的核酸序列特異雜交的寡核苷酸。
本發(fā)明還提供了在患者身上診斷癌癥的方法。這些方法包括制備腫瘤cDNA，并利用特異擴增人端粒酶核酸序列的引物擴增腫瘤cDNA，其中端粒酶核酸序列的檢測是癌癥診斷的一個指征。可以比較檢測序列的數量同正常對照細胞中擴增的端粒酶序列的數量，其中與對照相比端粒酶核酸序列的增加是癌癥診斷的指征。
而在另一方面，本發(fā)明提供了一種測定細胞中端粒酶RNA表達模式的方法，包括從由細胞中分離的mRNA中制備cDNA，利用權利要求35的引物擴增cDNA，由此測定端粒酶RNA表達的模式。在優(yōu)選實施方案中，本方法還包括通過與具有1區(qū)、α區(qū)、β區(qū)、2區(qū)、3區(qū)、X區(qū)或Y區(qū)的所有或部分序列的寡核苷酸雜交而檢測擴增產物。這些方法可用于診斷患者的癌癥，其中RNA的表達模式是癌癥診斷的指示。
本發(fā)明還提供非人類轉基因動物，其細胞中含有人端粒酶基因，該基因與能夠使其表達的啟動子有效地相連。在優(yōu)選實施方案中，該動物是小鼠而啟動子是組織特異性的。在一個相關方面，本發(fā)明提供一種小鼠，其細胞中的內源性端粒酶基因通過與無功能的端粒酶基因進行同源重組而被破壞，其中該小鼠不能表達內源性端粒酶。
本發(fā)明還提供人端粒酶活性的抑制劑，以及鑒定端粒酶活性抑制劑的方法，其中該抑制劑與端粒酶結合而且不是核苷類似物。抑制劑可能是一種與人端粒酶mRNA互補的反義核酸、核酶等等。該抑制劑可用于治療癌癥。
本發(fā)明還提供了鑒定端粒酶活性效應物的方法，包括一般步驟(a)向端粒酶蛋白質、RNA組分和模板的混合物中加入候選效應物，其中端粒酶蛋白質是由按上述分離的核酸分子編碼的；(b)檢測端粒酶的活性，以及(c)比較步驟(b)的活性與沒有候選效應物的對照混合物的活性，由此鑒定效應物。在其它實施方案中，效應物是一種抑制劑。而在其它實施方案中核酸分子編碼人端粒酶。
參考下列詳述和附圖，本發(fā)明的這些方面和其它方面將顯而易見。另外，下面列出了各種參考，它們詳細描述了某些方法或組合物(例如質粒，等等)，并且因此被完整地引入本文作為參考。
附圖簡述圖1A-E表示人端粒酶的DNA序列(SEQ ID NO)及預測的氨基酸序列(SEQ ID NO)。
圖2表示Euplotes aediculatus p123(SEQ ID NO)、酵母(EST2)(SEQ ID NO)和人(HT1)端粒酶蛋白質(氨基酸29-1132)序列的對比。圖中指出了逆轉錄酶基元。三種蛋白質的高度同源區(qū)定義為端粒酶區(qū)。這些序列是用ClustalW對比的。
圖3是Northern分析的掃描圖象，表示端粒酶催化亞單位在LIM1215結腸癌細胞中表達，而在CCD原代成纖維細胞中不表達。一個大約3.8kb的mRNA與hT1探針雜交。另外一個高分子量的交叉雜交的mRNA在上面加箭頭表示。指出了與polyA+RNA制備物中核糖體(RNA)的交叉雜交。相同的印跡還與來自GAPDH作為上樣對照(下面一組)的探針雜交。分子量標記的大小以kb表示。
圖4是Southern分析的掃描圖象，表示端粒酶催化亞單位是由單基因編碼的，并且不能在LIM 1215細胞中擴增。用hT1基因探針探測從人周圍血細胞和LIM 1215細胞系中分離的基因組DNA。印跡還含有稀釋的探針質粒作為檢測敏感性的對照。質粒大約被稀釋為10、5和1個基因組當量。H，HindIII；E，EcoRI；P，Pst I；X，XbaI；B，BamHI。
圖5表示從不同組織中合成的cDNA的擴增結果。擴增是利用來自hT1 cDNA序列的引物進行的，hT1 cDNA序列橫跨hT1基因中的內含子，將擴增產物印跡并用來自hT1序列的放射性標記寡核苷酸探測。還在同樣的樣品上用來自作為上樣對照的β-肌動蛋白基因的一對引物進行擴增。ahT1 cDNA對照；b人基因組DNA對照；c無模板對照；d正常結腸RNA；e正常睪丸RNA；f.正常淋巴細胞RNA；g黑素瘤RNA(腦轉移)；h黑素瘤RNA(皮下踝轉移)；i黑素瘤RNA(肝轉移)；j黑素瘤RNA(肺轉移)；k黑素瘤RNA(腋淋巴結轉移)；l黑素瘤RNA(皮膚轉移)；m乳腺癌RNA；n乳腺癌RNA；o乳腺癌RNA；p乳腺癌RNA。
圖6表示的結果說明hT1在轉捩期前(pre-crisis)細胞和轉捩期后(post-crisis)細胞系中的表達。上圖利用初始EST內的引物進行的嵌套擴增。下圖利用β-肌動蛋白 引物進行的對照RT-PCR。aBET-3K第7代細胞(p7)(轉捩期前)；bBET-3K第32代細胞(轉捩期后)；cBFT-3K第14代細胞(轉捩期前)；dBFT-3K第22代細胞(轉捩期后)；3BFT-3B第15代細胞(轉捩期前)；fBFT-3B第29代細胞(轉捩期后)；gGM897(ALT)；hIIICF/c(ALT)；iIIICF-T/B1(ALT)；j無模板對照。
圖7A-C表示hT1轉錄物的幾種不同的剪接模式。A，六種剪接變體的示意圖。B，幾個鑒定的RNA變體的組合。C，RNA變體的推測的外顯子/內含子接點的序列。在A部分標出了變體。給出了變體3的完整DNA序列(及所翻譯的蛋白質)(SEQ ID NO)。標出了相應于一個可能的c-Abl/SH3結合位點的氨基酸。推測的外顯子/內含子用標出，序列坐標(coordinate)如圖1。推測的剪接外顯子為小寫字母而推測的未剪接的內含子為大寫字母。
圖8表示在不同的腫瘤樣品中hT1轉錄物的各種剪接模式。利用HT2026F和HT2482R引物，在由HT1875F和HT2781R引物產生的原代RT-PCR產物上進行嵌套擴增(14個循環(huán))。a肺癌；b淋巴瘤；c肺癌；d成神經管細胞瘤；e淋巴瘤；f.淋巴瘤；gT47D；h嗜鉻細胞瘤；i淋巴瘤；j神經膠質瘤；k淋巴瘤；l無模板對照。
圖9表示從LIM 1215cDNA合成的cDNA的擴增結果。如圖中所示，逆轉錄基元A被從含有序列α的剪接變體中刪除掉。引物組合有a，HTM2028F+HT2356R；b，HT2026F+HT2482R；c，HTM2028F+HT2482R；d，HT2026F+HT2482R。
圖10A-B表示端粒酶變體區(qū)域的DNA序列。
圖11A-W表示作為示范的變體端粒酶蛋白質的DNA和氨基酸序列。
圖12是端粒酶活性分析的掃描圖象。
圖13A-D表示質粒pAK128.4的示意圖及該質粒的DNA序列。
圖14A-E表示質粒pAK128.7的示意圖及該質粒的DNA序列。
圖15A-D表示質粒pAK128.14的示意圖及該質粒的DNA序列。
發(fā)明詳述在開始闡述本發(fā)明之前，對此處用到的某些術語加以定義會有助于理解本發(fā)明。
如此處所用的，“野生型端粒酶”通常指一種多肽，它向染色體的末端酶促合成含有簡單重復序列(例如CCCTAA，參考Zakian，科學2701601，1995)的核酸序列。已推測出一個代表性的人野生型端粒酶的氨基酸序列，并示于圖1(SEQ ID NO.)。在本發(fā)明中，應當理解本發(fā)明的端粒酶不僅包括野生型蛋白質，還包括野生型蛋白質序列的變體(包括等位基因)。這些變體不必表現出酶促功能。簡單地說，這些變體可以是由天然多態(tài)性造成的，包括RNA剪接變體，通過遺傳重組形成，或是通過重組方法學合成的，而且，這種變體與野生型蛋白質的區(qū)別可以是一個或多個氨基酸的替換、插入、缺失、重排等等。典型地，當變體是合成的時，氨基酸替換是保守的，就是說，氨基酸替換在極性、非極性、芳香的、帶電荷的等等相同組中的氨基酸。在逆轉錄酶基元區(qū)與野生型序列同源的區(qū)域內，變體與野生型具有至少90％的氨基酸序列同一性，在某些實施方案中，具有大于92％、95％，或97％的同一性。在逆轉錄酶基元區(qū)以外，變體優(yōu)選地具有75％的氨基酸同一性，在某些實施方案中，具有至少80％、85％、90％、92％、95％或97％的同一性。
本領域的技術人員將知曉，一個編碼端粒酶的核苷酸序列可以不同于附圖中的野生型序列；這是由于密碼子的簡并性、核苷酸多態(tài)性，或氨基酸的差異造成的。在其它實施方案中，變體應在正常嚴謹的條件下優(yōu)先與野生型核苷酸序列雜交，雜交條件大約是比天然雙鏈的Tm值低25-30℃(例如1M Na+，65℃；5X SSPE，0.5％SDS，5X Denhardt氏溶液，65℃或同等條件；通常參考Sambrook等人，《分子克隆實驗手冊》(Molecular CloningA laboratory Manual)，第二版，冷泉港出版，1987；Ausubel等人，《現代分子生物學技術》(Current Protocols in MolecularBiology)，Greene出版公司，1987)。其它短寡核苷酸的Tm值可通過下面的公式計算出Tm＝81.5+0.41％(G+C)-log(Na+)。低嚴謹雜交是在大約低于Tm值40℃的條件下進行的，而高嚴謹雜交是在大約低于Tm值10℃的條件下進行的。在逆轉錄酶基元區(qū)變體優(yōu)選地與野生型序列具有至少75％的同一性，優(yōu)選地至少80％、85％同一性，而最優(yōu)選地具有至少90％的核苷酸同一性。
如此處所用的，“啟動子”指含有指導與其相連基因轉錄的元件的一種核苷酸序列。最低條件是，啟動子含有RNA聚合酶結合位點。更為典型的是，在真核生物中，啟動子序列含有控制基因表達的速度和時間的其它轉錄因子的結合位點。這種位點包括TATA盒、CAAT盒、POU盒、AP1結合位點等等。啟動子區(qū)還可以含有增強子元件。當一啟動子與一基因相連以使該基因得以轉錄時，就稱為“有效連接”。
“分離的核酸分子”指一種多核苷酸分子，其形式為獨立的片段或一個較大的核酸構件的一個成分，是從其來源細胞中分離的(包括它正常所在的染色體)至少曾經為基本上純的形式。核酸分子可以包括各種核苷酸，包括DNA、RNA、核苷酸類似物，或其組合。I.端粒酶、端粒酶基因和基因產物如上所述，本發(fā)明提供了涉及脊椎動物端粒酶基因和基因產物的組合物，以及利用這些基因和基因產物的方法。根據此處提供的公開內容，端粒酶基因可從表達端粒酶的各種細胞類型中分離到，包括無限增殖化細胞或轉化細胞。如此處所例舉的，來自人細胞的編碼端粒酶的cDNA和變體被鑒定、分離，并表征。通過用編碼端粒酶的表達載體轉化的宿主細胞可以很容易地生產端粒酶蛋白質。A.端粒酶基因的分離如此處所述，本發(fā)明提供編碼端粒酶的基因。在本發(fā)明的一個實施方案中，一個編碼人端粒酶的基因可以利用從EST序列中設計的引物對通過cDNA文庫擴增而鑒定。EST序列GenBank Accession No.AA281296，是通過與Euplotes aediculatus端粒酶基因(GenBankAccession No.U95964；Lingner等人，科學276561，1997)的序列同一性和相似性鑒定的。Euplotes端粒酶基因和EST的序列對比顯示大約38％的氨基酸同一性和59％的氨基酸相似性。
端粒酶基因可從基因組DNA或cDNA中分離到。當需要啟動子區(qū)或其它側翼區(qū)時，優(yōu)選基因組DNA。在染色體載體如YAC(酵母人工染色體)、細菌載體如λEMBL3、λgt10、粘?；蛸|粒中構建的基因組DNA文庫，和在細菌載體(例如λZAPII)、質?；蚱渌d體中構建的cDNA文庫都是適合篩選的。這種文庫可以利用本領域的方法和技術進行構建(參考Sambrook等人，《分子克隆實驗手冊》，冷泉港出版，1989)和從商業(yè)渠道購買(例如，Clontech公司，Palo Alto，CA)。DNA可以從脊椎動物細胞中分離，如人細胞、小鼠細胞，其它嚙齒類動物或靈長類動物細胞、鳥類細胞等等。
在一個實施方案中，端粒酶基因是利用cDNA文庫的DNA為模板通過擴增分離的。利用報道的EST序列，可以分離人端粒酶。簡單地說，就是根據EST核苷酸序列設計幾套擴增引物。這種引物的例子列于表2(還可參考實施例1)。從具有高端粒酶活性的細胞中制備的cDNA文庫的擴增是優(yōu)選的。此處描述的引物擴增了一個片段，該片段具有從來自LIM1215 cDNA文庫的EST序列預測的長度。LIM1215是一人結腸癌細胞系。通過DNA序列分析證實該片段的性質。
利用于一個可與EST引物之一相連的載體序列雜交的引物，在反應中擴增了含有附加序列的DNA片段。通過利用克隆位點任意一側的載體引物，與EST引物結合使用，分離了一個衍生自h-TEL(人端粒酶)的3’區(qū)的1.6kb片段和一個衍生自5’區(qū)的0.7kb片段。利用一對EST序列內部引物，通過擴增證實了這些片段含有端粒酶編碼序列。將這兩個片段克隆到pBluescript并進行DNA序列分析。附加的DNA序列是通過C-RACE和擴增技術得到cDNA的5’端，以及通過從cDNA文庫中雜交并分離克隆獲得的。
一個對照人端粒酶的編譯DNA序列和預測的氨基酸序列示于圖1。如圖中所示，對照端粒酶的編碼區(qū)為3396個堿基長并有一段大約620個堿基長的3’非翻譯區(qū)。預測的氨基酸序列為1132個氨基酸長并被描繪為四個主要結構域N-端、基本、逆轉錄酶(RT)和C-端。而且，人端粒酶含有與其它端粒酶(例如來自Euplotes和S.pombe的端粒酶)和逆轉錄酶同源的區(qū)域。這些基元在本文和在Kilian等人(人類分子遺傳學(Human Molecular Genetics)，122011-2019，1997)中被鑒定為結構域1、2、A、B、C和D，在Nakamura等人(科學，277955-959)中為結構域1、2、A、B′、C、D和E，而在Meyerson等人(細胞，90785-795，1997)中為基元1-6。不管采用的名稱如何，這些基元都含有氨基酸621-626(基元1)和631-634(基元2)、708-720(基元A)、827-839(基元B)、863-871(基元C)，以及895-902(基元D)。因為這些基元的邊界是根據與其它端粒酶的相似性和同一性確定的，所以各個基元的功能性邊界可能不同。
另外，對照端粒酶序列的變體是通過擴增獲得的，這在本文中有描述。其DNA和預測的氨基酸序列示于圖11中，并在下面有更詳細的討論。簡單地說，這些變體中的一些變體編碼被截短的蛋白質，而其它變體具有不同的C-端序列。這些變體似乎是由于不同的RNA剪接造成的，因為端粒酶似乎是人類中的一個單拷貝基因(見實施例2)。
或者，其它方法也可用于獲得編碼端粒酶的核酸分子。例如，通過利用抗體或可與端粒酶反應的抗體進行篩選，從表達文庫中獲得編碼端粒酶的核酸分子(參考Sambrook等人，《分子克隆實驗手冊》，第二版，冷泉港出版，NY，1987；Ausubel等人，《現代分子生物學技術》，Greene出版公司和Wiley-Interscience公司，NY，1995)。在另一個實施方案中，編碼端粒酶的核酸分子可以通過雜交篩選cDNA文庫或基因組文庫獲得。用于雜交篩選的寡核苷酸可以根據此處提供的人端粒酶的DNA序列進行設計。用于篩選的寡核苷酸通常至少11個堿基長，更常用的是至少20或25個堿基長。在一個實施方案中，寡核苷酸為20-30個堿基長。這樣的寡核苷酸可以通過自動化方式合成。為了便于檢測，寡核苷酸可以方便地加以標記，通常是在5’端用一個報告分子，如一種放射性核素(如32p)、酶標記、蛋白質標記、熒光標記或生物素標記。根據載體的不同，文庫通常為菌落或噬菌體，并將重組DNA轉移到尼龍膜或硝酸纖維素膜上。雜交條件根據寡核苷酸的長度和GC含量加以調整。經過變性、中和，和將DNA固定到膜上，使膜與標記探針雜交。合適的雜交條件可以在Sambrook等人，同上，Ausubel等人，同上中找到，而且雜交溶液中可以含有添加劑如四甲基氯化銨或其它離液劑或親水劑以增加雜交的特異性(參考PCT/US97/17413)。雜交后，利用合適的檢測方法顯示出雜交菌落或噬菌體，并且隨后將其分離并增殖。候選菌落或擴增片段可以通過任何一種方法來證實其含有端粒酶DNA。例如，候選菌落可以與第二個非重疊探針雜交或進行DNA序列分析。通過這些方法，適用于本發(fā)明的含有端粒酶基因或基因片段的菌落就被分離出來。
端粒酶DNA還可以通過cDNA或基因組DNA擴增獲得。用于擴增全長cDNA的寡核苷酸引物優(yōu)選地衍生自位于編碼區(qū)的5’或3’端的序列?；蚪M序列的擴增將利用跨越內含子序列的引物，并且采用適于長擴增產物的條件(參考Promega目錄)。簡單地說，用作擴增引物的寡核苷酸優(yōu)選地不能具有自我互補序列，其3’端也不能有互補序列(以防止引物二聚體的形成)。優(yōu)選地，引物具有約50％的GC含量并且具有限制性位點以便于克隆。通常，引物為15至50個核苷酸長，更優(yōu)選地20至35個核苷酸長。引物與cDNA或基因組DNA退火并進行足夠的擴增循環(huán)以產生可檢測的產物，優(yōu)選地是一種可以容易地通過凝膠電泳和染色觀察到的產物。擴增片段被純化并插入到載體(例如，病毒、噬菌?；蛸|粒載體，例如λgt10或pBS(m13+))中并增殖。
來自許多品種的端粒酶基因可以利用此處提供的組合物進行分離。對于密切相關的品種，人的序列或其部分序列可用作探針篩選基因組或cDNA文庫。例如，含有催化位點(大約相應于圖1的605-915位氨基酸)的端粒酶基因的一個片段可被標記，并用作探針篩選從小鼠、靈長類動物、大鼠、狗、或其它脊椎動物、溫血動物、或哺乳動物類構建的文庫。在正常嚴謹條件下進行一個初始雜交可以得到編碼端粒酶的克隆或片段。如果沒有觀察到雜交，可以進行松(低)嚴謹條件雜交。改變雜交嚴謹度的指導方法可以從Sambrook等人，同上，以及其它眾所周知的途徑中獲得。這樣的探針還可以用于進化上具有多樣性的品種如果蠅，盡管雜交條件通常更為松弛。
其它方法也可以用于從非人品種中分離端粒酶基因。這些方法包括，但不限于，利用來自保守區(qū)(如逆轉錄酶基元)的引物進行擴增，利用來自端粒酶的不同區(qū)域(包括逆轉錄酶區(qū))的簡并引物進行擴增，利用抗體探測表達文庫，利用端粒酶RNA探測表達文庫等等。通過氨基酸相似性和/或核酸同一性鑒定一基因序列為端粒酶基因。通常，氨基酸相似性，是鑒定端粒酶所優(yōu)選的，它允許有保守性的差別。對于不同的品種，氨基酸相似性通常至少為30％，優(yōu)選地至少40％或至少50％。核酸同一性可能較低所以難以評價。幾種方便易得的計算機分析程序，如BLASTN和BLASTP，有助于確定基因和基因產物的相關性。候選的端粒酶基因的檢測是利用此處描述的一種功能分析方法或其它相當的方法檢測其酶活性。B.變體端粒酶基因此處提供的端粒酶核酸或氨基酸序列的變體(包括等位基因)，可以很容易地從天然變體(如多態(tài)性，剪接變體，突變體)中分離、合成、或構建。根據用途不同，突變體可以構建成表現不同的或有缺陷的端粒酶功能。特別有用的端粒酶基因編碼一種缺少酶活性但具有顯性失活表型的蛋白質。而且端粒酶變體缺失一種或多種已知的端粒酶活性，包括逆轉錄酶活性、溶核活性、端粒結合活性、dNTP結合活性，以及端粒酶RNA(hTR)結合活性。
本領域的技術人員知道現在已經建立了許多形成突變體的方法(通常參考，Sambrook等人，同上；Ausubel等人，同上)。簡單地說，形成少量核苷酸替換突變體的優(yōu)選方法是利用跨越待突變的堿基并含有突變的堿基的寡核苷酸。寡核苷酸可與互補單鏈核酸雜交，而第二條鏈從寡核苷酸處延伸合成。相似地，缺失和/或插入突變體可以通過各種任何已知的一種方法進行構建。例如，將基因用限制性酶消化并重新連接，這樣一些序列被刪除，或者與分離的具有粘性末端的片段相連，這樣就產生了具有插入或大的替換的突變體。在另一個實施方案中，變體是通過“外顯子重排(exon shuffling)”形成的(參考美國專利No.5,605,793)。變體序列還可以通過“分子進化(Molecular Evolution)”技術形成(參考美國專利No.5,723,323)。其它形成變體序列的方法可以在如Sambrook等人(同上)和Ausubel等人(同上)中找到。變體序列的驗證通常是通過限制性酶作圖、序列分析、或探針雜交進行的，盡管其它方法也可以采用。將雙鏈核酸轉化宿主細胞，通常是大腸桿菌，但是其它原核生物、酵母、或大型真核生物也可以采用。標準的篩選技術，例如核酸雜交、擴增、以及DNA序列分析，將鑒定突變體序列。
在優(yōu)選實施方案中，變體端粒酶的酶活性失活并賦予宿主細胞以顯性失活的表型。不管實際機制如何，當顯性失活的端粒酶在宿主細胞中表達時，天然有活性的端粒酶就被失活。在催化結構域中，逆轉錄酶基元具有保守的天冬氨酸殘基。人端粒酶還含有這些重要的殘基Asp712，Asp718，Asp868，和Asp869。這些天冬氨酸殘基的一個或多個突變?yōu)榉潜Ｊ匦缘陌被?例如丙氨酸)將可能破壞酶促活性或影響端粒的縮短。對于每個這樣的突變體，檢測其顯性失活現象。在某些實施方案中，優(yōu)選的突變體是顯性失活的并引起老化的表型。其它顯性失活變體可以通過刪除一個或多個逆轉錄酶基元或改變某些區(qū)域而形成，這些區(qū)域與DNA引發(fā)(priming)(如基元E)、RNA組分結合位點、模板結合位點、金屬離子結合位點(如基元C)等等有關。
在其它實施方案中，編碼端粒酶的核酸分子可以與另一個核酸分子融合在一起。我們將會看到，融合伴侶基因在某些實施方案中會貢獻出一個編碼區(qū)。于是，可能需要僅僅利用端粒酶的催化位點(例如氨基酸609-915)、單個逆轉錄酶基元(上述的)、此處描述的任何剪接變體端粒酶、端粒酶RNA結合位點等等。融合伴侶選擇部分取決于應用的目的。融合伴侶可被用于改變端粒酶的特異性、提供一個報告基因功能、提供一個用于鑒定或純化技術的標簽序列，等等。報告序列或標簽序列可以是任何一種蛋白質，它使得可以方便地并敏感地測量或分離基因產物，而不干擾端粒酶的功能。對于報告基因功能，β-葡糖醛酸糖苷酶(美國專利No5,268,463)、綠色熒光蛋白質和β-半乳糖苷酶都是很容易得到的DNA序列。肽標簽是一個短的序列，通常衍生自天然蛋白質，可以被抗體或其它分子所識別。肽標簽包括FLAG、Glu-Glu標簽(Chiron公司，Emeryville，CA)KT3標簽(Chiron公司)、T7基因10標簽(Invitrogen，La Jolla，CA)、T7主要衣殼蛋白質標簽(Novagen，Madison，WI)、His6(六組氨酸)、以及HSV標簽(Novagen)。除了標簽以外，其他類的蛋白質或肽，例如谷胱甘肽-S-轉移酶也可以采用。C.由端粒酶基因衍生的片段和寡核苷酸另外，可以分離或構建部分端粒酶基因或基因片段以用于本發(fā)明。例如，通過眾所周知的方法可以從模板DNA，如質粒DNA中分離到限制性片段，而DNA片段，包括限制性片段可以通過擴增產生。而且，寡核苷酸可以經合成或從重組DNA分子中分離到。本領域的技術人員知道，還有其它方法也可用于獲得具有至少部分端粒酶序列的DNA或RNA分子。而且，對于特殊的應用，這些核酸可以通過本領域已知的技術，利用放射性標記(例如，32P、33P、35S、125I、131I、3H、14C)、熒光標記(例如，FITC、Cy5、RITC、Texas紅)、化學發(fā)光標記、酶、生物素等等進行標記。
獲得這些片段的方法在本領域是眾所周知的。特別適用于本發(fā)明的端粒酶部分含有催化位點、單個逆轉錄酶基元、推測的內含子序列(參考圖10)等等。寡核苷酸通常是通過自動化方式合成的；合成的方法和儀器是很容易得到的(例如應用生物系統(tǒng)公司，CA)。寡核苷酸可以含有非天然形成的核苷酸，例如核苷酸類似物、被修飾的骨架(如肽骨架)、核苷酸衍生物(如生物素化的核苷酸)，等等。如此處所用的，寡核苷酸是指至少約7個核苷酸并通常不超過約100個核苷酸的核酸序列。通常，寡核苷酸大約為10至50個堿基之間，更常用的是大約18至35個堿基之間。寡核苷酸可以是單鏈的，或在某些情況下是雙鏈的。如此處所用的，部分核酸是指含有比完整的母核酸序列少的多核苷酸。例如，端粒酶編碼序列的一部分含有少于全長的端粒酶序列。一個“部分”通常至少是約7個核苷酸，也可以多至10、20、25或更多的核苷酸。一個片段是指具有任意長度的多核苷酸分子，并可以包括寡核苷酸，盡管常用但并不限于，術語寡核苷酸用于指短的多核苷酸，而術語片段用于指長的多核苷酸。
被用作擴增引物和雜交篩選探針的寡核苷酸可以根據此處給出的人端粒酶的DNA序列進行設計。用于擴增全長cDNA的寡核苷酸引物優(yōu)選地衍生自5’和3’端的序列。選擇擴增特定區(qū)域的引物用于形成大小容易檢測的產物。在優(yōu)選實施方案中，選擇位于要進行其它RNA剪接的序列側翼的引物。在優(yōu)選實施方案中，選擇了一套引物，使得跨越被剪接進(spliced-in)的序列的產物和跨越被剪接出(spliced-out)的序列的產物都具有合適的大小，在相同的條件下可被檢出。在其它實施方案中，用兩套引物檢測其它剪接的RNA。例如一套引物位于剪接結合部側翼以檢測被剪接出的產物。第二套引物非?？拷Y合部(這樣被剪接出的擴增產物與引物二聚體具有相同的大小或比引物二聚體略長)或一套或多套引物來自被剪接進序列(這樣被剪接出的RNA不會產生任何產物)。
擴增引物優(yōu)選地沒有自我互補序列，其3’端也沒有互補序列(以防止形成引物二聚體)。優(yōu)選地，引物具有大約50％的GC含量并含有限制性位點以便于克隆。擴增引物通常至少15個堿基并且通常不長于50個堿基，盡管在一些情況和條件下可使用更短的或更長的引物。更為常用的引物為17至40個堿基長、17至35個堿基長、或20至30個堿基長。引物與cDNA或基因組DNA退火并進行足夠的擴增循環(huán)，通常是20至40個循環(huán)，以產生通過凝膠電泳和染色或通過雜交容易檢測的產物。擴增片段被純化并插入載體如λgt10或pBS(M13+)中，增殖、分離并進行DNA序列分析，進行雜交等等。
適用于篩選基因組、cDNA或其它類型(如突變體端粒酶序列)文庫，探測Southern、Northern、或Northwestern印跡、擴增產物等等的寡核苷酸雜交探針可以根據此處提供的序列進行設計。用于雜交的寡核苷酸通常至少11個堿基長，一般長度少于100個堿基，優(yōu)選至少15個堿基長，至少20個堿基長，至少25個堿基長，而優(yōu)選地為20-70、25-50、或30-40個堿基長。為了便于檢測，寡核苷酸可以被方便地予以標記，通常在5’端用報告分子，如放射性核素(如32P)、酶標記、蛋白質標記、熒光標記、或生物素進行標記(參考Ausubel等人，和Sambrook等人，同上)。根據載體的不同，文庫通常為菌落或噬菌體，而重組DNA被轉移到尼龍膜或硝酸纖維素膜上。經過變性、中和、并將DNA固定到膜上，使膜與標記探針雜交，并洗膜。利用合適的檢測方法會顯示出雜交菌落或噬菌體，然后將其分離并增殖。將核酸轉移至膜上并進行雜交的方法是眾所周知的。在某些實施方案中，加入雜交溶液的添加劑，例如離液劑(如四甲基氯化銨)或親水劑(如三氯乙酸銨；參考PCT/US97/17413)以增加雜交的敏感性和特異性。如果在經過了與雜交條件相當的條件下(此處表示為低于Tm值的度數)的洗膜后，探針仍然保持在可檢測的退火狀態(tài)下，該探針就特異地與核酸雜交。D.人端粒酶的剪接變體除了圖1的對照端粒酶DNA和蛋白質序列以外，還觀察到幾種RNA剪接變體。盡管一些變體反映了不完全加工的mRNA，值得注意的是這種變體在預先選擇的多腺嘌呤化mRNA的RNA樣品(LIM1215)中非常豐富。這些發(fā)現，以及它們在RT結構域中的成簇情況，說明插入變體似乎更反映了hT1蛋白質表達的調節(jié)情況。例如，外顯子被刪除的變體(參考α，β，圖7)似乎是編碼變體蛋白質的不同成熟類型。支持不同蛋白質的其它證據來自LIM1215 cDNA文庫中的cDNA克隆的序列分析，與對照序列相比該文庫含有缺失和插入。
至少有七種推測的內含子保留在mRNA中(參考圖7，它列出了7個內含子中的6個)。內含子是獨立保留的，因此，一個特定的mRNA可以沒有、有任何1個、兩個、等等直至7個內含子。由7個獨立剪接形成的不同mRNA的最大數目是27，或128個不同的mRNA。這些內含子的DNA序列示于圖10中。最靠近5’端的內含子，稱為序列“X”，其長度未知，并且只列出了部分序列。
對照端粒酶序列(圖1)包括內含子α和內含子β。在下面的討論中，各個內含子的存在與否及其位置所起的作用均基于這是唯一的改變。我們將會看到，一個特定的內含子可以改變翻譯產物的序列，而不管其它內含子是被剪接進還是剪接出。例如，內含子1的存在產生一個移碼和截短的蛋白質，而不管內含子α、β、2或3是被剪接進還是被剪接出。
內含子“X”的存在產生一個截短的蛋白質，它含有大約600個N-端氨基酸，缺少所有的逆轉錄酶基元。在222位堿基上內含子“Y”的存在產生一個終止在內含子外三個密碼子內的移碼的蛋白質。因為Y內含子富含GC(大約為78％)，測序很困難，所以內含子Y引起大約35個氨基酸的插入而不是移碼。
位于1950位核苷酸的內含子1為38bp長，它在mRNA上的存在引起移碼，并最終翻譯出一個截短的蛋白質(終止密碼子在1973位核苷酸)。這個截短的蛋白質僅含逆轉錄酶結構域1和2。
內含子α位于2131-2166堿基之間，常常觀察到它從端粒酶mRNA中被剪接出去。從這樣一個RNA翻譯的蛋白質缺失了12個氨基酸，即失去了逆轉錄酶基元A。這個基元似乎是逆轉錄酶功能所必須的；在酵母EST2蛋白質中這個結構域內的單個氨基酸的突變產生具有顯性失活功能的蛋白質，并且導致細胞老化和端粒縮短。
在2286-2468位刪除β-外顯子的另一個變體序列編碼一個截短的蛋白質，這是由于在與2269位堿基相連的2287位堿基處發(fā)生了閱讀移碼，因此在2605位堿基處形成終止密碼子。這個變體蛋白質具有逆轉錄酶的結構域1、2、A、B和部分C，但缺少另一個基元；除了逆轉錄酶結構域基元，在hT1的β插入序列中鑒定的另一個序列基元(AVRIRGKS)與P-環(huán)基元共有序列AXXXXGK(S)相匹配(Saraste等人，生化科學進展(Trends Biochem.Sci.)15430-434，1990)。該基元見于大量的蛋白質家族中，包括許多激酶、細菌dnaA、recA、recF、mutS和結合ATP的解旋酶(Devereaux等人，核酸研究(Nucl.Acids Res.)，12387-395，1984)。因此P-環(huán)僅僅存在于大多數所分析的RNA樣品中h-TEL的一個亞群中，而在幾種腫瘤樣品中完全不存在(圖8)。
2843堿基處的內含子2含有一個框內終止密碼，產生一個具有完整的逆轉錄酶結構域區(qū)但失去了C-末端的截短的蛋白質。因為C-末端可能起調控作用，所以該蛋白質的活性可能會受到影響。當保留內含子3時，也產生一個較小的蛋白質，因為此內含子含有一個框內終止密碼子。所以，此蛋白質的C-末端序列被改變了。此種蛋白質可能具有的活性現在還不知道。HIV-1逆轉錄酶的晶體結構顯示，缺少RNAase結構域的較短的蛋白質(p51)受到了C-末端向催化裂隙的“結合”折疊的抑制。如果假設hT1采取與HIV-RT相似的結構，那么C-末端hT1蛋白質變體將反映出相似的調控機制。
除了缺少對照C-末端結構域的變體外，在2157堿基處具有內含子3的變體表達一個不同的C-末端結構域。而且，由內含子3提供的編碼區(qū)具有潛在的SH3結合位點，SGQPEMEPPRRPSGCVG，這個序列與在如共濟失調毛細血管擴張突變的(ATM)蛋白質中發(fā)現的共有序列c-AblSH3結合肽(PXXXXPXXP)相匹配。另一個這種基元的例子見于hT1蛋白質的N-末端內，該肽序列為HAGPPSTSRPPRPWDTP。在端粒酶cDNA中發(fā)現了其它不同的C-末端結構域；EST12462(GenBankAccession No.AA299878)直至2157位堿基具有大約50個堿基的相同序列，然后開始與對照端粒酶序列以及內含子不同。這個新序列在50個堿基內具有一個內部終止密碼子，這將產生一個截短的C-末端。
在一個ALT細胞系中檢測到的變體(圖6，泳道i)說明了hT1的堿性結構域可能至少在某些ALT細胞系中對于ALT機制有所貢獻。有趣的是，這個ALT細胞系表達hTR基因。ALT的一個可能的機制似乎涉及在TRAP分析中失活的調節(jié)失常的端粒酶組分。
下表概括了剪接變體和所形成的蛋白質。為了簡便起見，對于每個形成的蛋白質僅列出了一種變體。而且如上所述，Y內含子的存在似乎引起移碼，從而形成截短的蛋白質，但是不引起插入。因此，Y內含子的每個閱讀框都存在，而此表的構建似乎插入不造成截短的蛋白質。這些內含子的一個獨立的組合會產生128種不同的mRNA序列。表1中的變體的DNA和氨基酸序列示于圖11。
表1

E.載體、宿主細胞和表達與產生蛋白質的方法端粒酶蛋白質可在多種宿主生物體中表達。在一個實施方案中，端粒酶是在細菌，如大腸桿菌中表達的，已經構建了許多大腸桿菌表達載體，這些載體都是容易獲得的。其它合適的宿主生物體包括其它細菌種類，以及真核生物，如酵母(例如釀酒酵母)、哺乳動物細胞(如CHO和COS-7)、和昆蟲細胞(例如Sf9)。
將編碼端粒酶、端粒酶的一部分、一個變體、其融合蛋白質等等的DNA序列引入到適合于宿主的表達載體中。在某些實施方案中，將端粒酶插入到一種載體中以便產生一種融合蛋白質。端粒酶序列衍生自一個現存的片段、cDNA克隆、或是經合成的序列。合成的一個優(yōu)選方法是利用一套位于該編碼區(qū)或其所需部分側翼的引物，從cDNA中擴增該基因。如上面所討論，端粒酶序列可以含有具有多密碼子的各氨基酸的不同的密碼子。選擇最適合宿主種類的不同的密碼子。通常還在引物序列中插入限制位點，這些位點是根據載體上的克隆位點加以選擇的。如果需要的話，可以將翻譯起始密碼子和終止密碼子設計到引物序列中。
最低要求是，載體必須含有啟動子序列。載體中可以含有其它調控序列。這些序列包括轉錄終止信號序列、分泌信號序列、復制起點、選擇性標記等等。這些調控序列彼此有效地結合在一起以進行轉錄或翻譯。
此處用于端粒酶表達的質粒含有為了在宿主細胞(如細菌)中表達該蛋白質而設計的啟動子。合適的啟動子來源廣泛而且在本領域眾所周知。誘導型或組成型啟動子是優(yōu)選的。用于在細菌中表達的這些啟動子包括T7噬菌體和其它噬菌體的啟動子，例如T3、T5和SP6，以及trp、lpp，和lac操縱子。還可以采用雜合啟動子(參考美國專利No.4,551,433)，例如tac和trc。用于在真核細胞中表達的啟動子包括P10或桿狀病毒/昆蟲細胞表達系統(tǒng)的多角體基因啟動子(參考美國專利Nos.5,243,041，5,266,317，4,745,051，及5,169,784)、MMTV LTR、CMV IE啟動子、RSVLTR、SV40、金屬硫蛋白質啟動子(參考美國專利No.4,870,009)以及其它誘導型啟動子。為了表達該蛋白質，將啟動子與端粒酶蛋白質的編碼區(qū)有效地連接起來。
控制端粒酶轉錄的啟動子本身可以受到阻遏子的控制。在一些系統(tǒng)中，通過改變細胞的生理條件可以使啟動子去阻遏，例如，通過加入一個能夠競爭性結合阻遏子的分子、或者通過改變生長培養(yǎng)基的溫度。優(yōu)選的阻遏子蛋白質包括，但不限于，負責IPTG誘導的大腸桿菌lacI阻遏子、溫度敏感型λcI857阻遏子等等。大腸桿菌阻遏子是優(yōu)選的。
在其它優(yōu)選實施方案中，載體還含有轉錄終止序列，終止序列中有一段序列，它提供一種信號，通過聚合酶識別所選啟動子而終止轉錄，以及/或者提供聚腺苷酸化的信號序列。
優(yōu)選，載體能夠在宿主細胞中復制。因此，當宿主細胞是一種細菌時，載體優(yōu)選地含有細菌的復制起始區(qū)。優(yōu)選的細菌復制起始區(qū)包括fl-ori和col E1復制起始區(qū)，特別是衍生自pUC質粒的復制起始區(qū)。在酵母中，ARS或GEN序列可用于保證復制的進行。哺乳動物細胞中最常用的系統(tǒng)是SV40的復制起始區(qū)。
質粒也優(yōu)選地含有至少一個在宿主中起作用的選擇性標記。選擇性標記基因包括任何賦予宿主一種表型的基因，該表型使得轉化細胞能夠被鑒定出來并選擇性地生長。細菌宿主的合適的選擇性標記基因包括氨芐青霉素抗性基因(Ampr)、四環(huán)素抗性基因(Tcr)和卡那霉素抗性基因(Kanr)。在本發(fā)明中卡那霉素抗性基因是優(yōu)選的。真核生物的合適的標記基因通常需要宿主中的互補缺陷型(例如，tk-宿主中的胸苷激酶)。但是，也可用藥物標記(例如，G418抗性和潮霉素抗性)。
編碼端粒酶的核苷酸序列還可以含有分泌信號，通過這個信號使蛋白質被合成為前體蛋白質，隨后被加工并分泌出去。形成的經過加工的蛋白質可以從壁膜間隙或發(fā)酵培養(yǎng)基中回收。合適的分泌信號來源廣泛并且在本領域是眾所周知的(von Heijne，分子生物學雜志(J.Mol.Biol.)18499-105，1985)。在大腸桿菌(或其它宿主)中起作用的原核的和真核的分泌信號都可以采用。在本發(fā)明中優(yōu)選的分泌信號包括，但不限于，這些由下列大腸桿菌基因編碼的分泌信號pelB(Lei等人，細菌學雜志(J.Bacteriol.)1694379，1987)、phoA、ompA、ompT、ompF、ompC、β-內酰胺酶和堿性磷酸酶。
本領域的技術人員知曉，有大量的適于在細菌細胞中表達的載體并且這些載體都是很容易得到的。例如pET系列(Novagen，Madison，MI)、tac和trc系列(Pharmacia，Uppsala，瑞典)、pTTQ18(AmershamInternational plc，英國)、pACYC177、pGEX系列等載體都適合于端粒酶的表達。桿狀病毒載體，如pBlueBac(參考，美國專利Nos.5,278,050、5,244,805、5,243,041、5,242,687、5,266,317、4,745,051、以及5,169,784；可從Invitrogen公司得到，San Diego)可用于在昆蟲細胞中表達端粒酶，例如在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)sf9細胞中(參考美國專利No.4,745,051)。用于端粒酶表達的宿主的選擇部分是由載體所決定的。商業(yè)上可得的載體是與適當的宿主成對提供的。
大量用于在真核細胞中表達的合適的載體是可以得到的。這些載體包括pCMVLacI、pXT1(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA)；pCDNA系列、pREP系列、pEBVHis(Invitrogen，Carlsbad，CA)。在某些實施方案中，端粒酶基因被克隆到基因導向載體中，例如pMClneo、pOG系列載體(Stragene)。
端粒酶蛋白質通過標準方法分離，例如親和層析、分子排阻層析、金屬離子層析、離子交換層析、HPLC，以及其它已知的蛋白質分離方法。(通常參考Ausubel等人，同上；Sambrook等人，同上)。一個被分離純化的蛋白質用考馬斯蘭染色后在SDS-PAGE上為一條帶。
在一個實施方案中，端粒酶蛋白質是以六組氨酸融合蛋白質的形式表達的，并通過含金屬離子的層析法，如鎳偶聯(lián)珠層析進行分離。簡單地說，編碼His6的序列與編碼端粒酶的DNA序列連在一起。盡管His6序列可以定位在分子中的任何地方，它優(yōu)選地連接在3’端緊靠終止密碼子之前的位置。His-hT1融合蛋白質可以通過這多種方法的任何一種進行構建。一個方便的方法是利用含有His6密碼子的下游引物擴增TEL基因。F.端粒酶的肽和蛋白質在本發(fā)明的一個方面中，提供了具有端粒酶序列的肽。在此處和其它地方描述的分析中，這些肽可被用作免疫原制備抗體、用作端粒酶功能的抑制劑或增強劑。這些肽一般為5至100個氨基酸長，更常采用10至50個氨基酸。這些肽很容易以自動化方式經化學合成(PerkinElmerABI肽合成儀)或由商業(yè)途徑獲得。這些肽可以進一步通過各種方法加以純化，包括高效液相層析。而且，這些肽和蛋白質可以含有這20種天然形成的氨基酸以外的氨基酸，或含有這些氨基酸的衍生物和修飾物。
本發(fā)明中特別感興趣的肽具有內含子序列(圖10)、逆轉錄酶基元等等。在某些實施方案中，端粒酶蛋白質具有圖1或11中的氨基酸序列，或其至少8個氨基酸長的一部分(可以為10、15、20個氨基酸或更長)。在其它實施方案中，該蛋白質有一個或多個氨基酸被替換、插入、缺失。而在其它實施方案中，該蛋白質具有由一個核酸序列決定的氨基酸序列，該核酸序列在正常嚴謹條件下可與圖11中任何一個序列雜交。如上面所指出，端粒酶的變體包括等位基因變體。II.端粒酶分析有多種方法可用于測定端粒酶的活性及表達。這些方法包括測量端粒酶延伸端粒DNA底物能力、溶核活性、引物(端粒)結合活性、dNTP結合活性、端粒酶RNA(hTR)結合活性的體外分析，體內功能獲得(gain-of-function)分析，體內功能失去(loss-of function)分析，原位雜交，RNA酶探針保護、Northern分析，cDNA擴增，抗體染色等等。A.催化活性分析多種催化活性的分析方法在美國專利Nos 5,629,154；5,639,613；5,645,986等等中有描述。在一個傳統(tǒng)的端粒酶活性分析方法中，使用具有宿主端粒序列的單鏈DNA引物(例如[TTAGGG]n)和端粒酶(參考Shay等人，分子遺傳學方法(Methods in Molecular Genetics)5263，1994；Greider和Blackburn，細胞43405，1985；Morin，細胞59521，1989；美國專利No.5,629,154)。一個優(yōu)選分析方法將基于去污劑的提取法與基于擴增的分析法結合起來。這種被稱為TRAP(端粒重復擴增技術)的方法具有更高的敏感性(Kim等人，科學2662011，1994)。簡單地說，在TRAP方法中，端粒酶合成延伸引物，延伸引物再作為擴增的模板。端粒酶產物是用衍生自寡核苷酸的非端粒區(qū)的引物和衍生自端粒區(qū)的引物擴增的。當例如通過凝膠電泳分析擴增產物，如果有端粒酶活性時可以觀察到產物梯(ladder of products)。這種方法的排列已被描述(Krupp等人，核酸研究，25919，1997；Savoysky等人，核酸研究241175，1996)。而且，還有其它的端粒酶分析方法可以采用(Faraoni等人，化學療法雜志(J.Chemother)8394，1996，描述了一種體外化學敏感性分析方法；Tatematsu等人，癌基因(Oncogene)132265，1996，描述一種“延伸PCR分析法”；Lin和Zakian，細胞811127，1995，描述一種酵母的體外分析方法)。
另外，催化活性或其它活性可以通過體外重建系統(tǒng)進行測定(參考實施例)。簡單地說，分析方法，例如此處描述的那些方法，是利用由重組產生的純端粒酶蛋白質和其它必須組分，例如端粒酶RNA組分、如WO/98/14593中描述的其它蛋白質進行的。B.其它活性分析溶核活性可以通過如Collins和Grieder，基因與發(fā)育(Genes andDevelopment)71364，1993)描述的技術進行評價。溶核活性是從位于DNA模板5’邊界的一段核苷酸序列的3’端切除一個核苷酸(從端粒重復序列TTAGG切除G)。簡單地說，此活性可以通過一個反應進行測定，該反應利用一個具有被封閉的3’核苷酸的核酸模板，即它不能作為聚合酶的引物，除非它經過溶核活性被除去。
端粒結合活性及分析在如Harrington等人，生物化學雜志(J.Biol.Chem)2708893，1995中有描述。一般地，可以采用任何檢測蛋白質與核酸相互作用的方法，如凝膠移位分析。DNTP和RNA結合活性分析方法在如Morin，歐洲癌癥雜志(Eur.J.Cancer)33750中有描述。C.功能獲得與丟失體內功能獲得分析可以通過將編碼端粒酶的表達載體轉染沒有或幾乎不可檢測的內源活性的細胞而進行。然后通過如此處描述的那些體外分析方法測定活性。另一種功能獲得分析方法可以在腫瘤細胞或其它表達端粒酶或逆轉錄酶的細胞中進行。端粒酶基因被轉染到細胞中，并以高水平表達，將這些細胞用逆轉錄酶的抑制劑處理。然后觀察到端粒酶活性對這些抑制劑的敏感性降低。而且，在酵母端粒酶突變體EST2中可以測定功能恢復情況。
功能丟失可以在表達高水平的端粒酶活性的細胞中測定，例如LIM1215細胞或其它腫瘤細胞。在這種分析中，將通常構建在表達載體中的反義寡核苷酸分子導入細胞中。端粒酶基因通過消除端粒酶活性得到證實。在另一種分析中，抑制端粒酶功能的抗體被用于展示功能性分子。D.端粒酶的表達端粒酶在各種細胞中的表達可以通過標準方法利用此處提供的序列進行分析。例如，用放射性或熒光標記探針(片段或寡核苷酸)的原位雜交可用于組織切片或固定化細胞。或者，可以將RNA從細胞中分離出來并用于Northern分析、Rnase探針保護分析等等。特定區(qū)域的探針和變體特異的探針將形成各種端粒酶轉錄物的表達分布曲線。
在一個優(yōu)選實施方案中，通過擴增分析端粒酶的表達。用于擴增端粒酶的引物對(包括擴增特殊變體的引物對)，被用于擴增從細胞RNA合成的cDNA。cDNA可以由總RNA或poly(A)+RNA合成。用于RNA分離的方法和技術是眾所周知的。cDNA的合成可以由寡聚(dT)引物、隨機引物(如dN6)、端粒酶特異引物等等起始。引物的選擇至少部分取決于RNA的量和分析的目的。擴增引物是設計用于擴增脊椎動物細胞中存在的任何一種變體、幾種特定變體的組合或所有變體的。選擇與引物的長度、堿基含量、擴增產物的長度等等相稱的擴增條件。有各種擴增系統(tǒng)可以采用(參考Lee等人，《核酸擴增技術》，生物技術叢書，Eaton出版，Natick，MA，1997；Larrick，《PCR技術定量PCR》，生物技術叢書，Eaton出版，Natick，MA，1997)。
其它用于定性和定量測定基因表達的分析方法都是眾所周知的。當端粒酶mRNA的量很充足時，Rnase探針保護和Northern分析法是可行的。當只有極少的細胞時，需要進行單細胞分析，或者當樣品中端粒酶RNA所占的比例極低時，采用擴增技術則是優(yōu)選的。Rnase探針保護分析特別適用于檢測剪接變體、突變體、以及定量這些RNA。
如上所討論的，在優(yōu)選實施方案中，各種RNA種類的表達是受到監(jiān)測的。不同種類的分析可以采用任何能夠將某一種類與其它種類區(qū)分開來的方法。于是，通過Northern確定長度、Rnase探針保護、克隆和擴增是一些可行的方法。在優(yōu)選實施方案中，采用Rnase探針保護和擴增的方法。對于Rnase探針保護，該探針一般是衍生自對照序列和內含子連接處的一個片段，或者是衍生自內含子插入序列位點周圍的序列的一個片段。例如，對照端粒酶上的一個跨越1950-1951位核苷酸的片段(如1910-1980位核苷酸)將保護對照序列上71個堿基的片段，它將保護具有內含子1的端粒酶上的41個堿基和30個堿基長的兩個片段。相反，含有1910-1950位核苷酸和內含子1的30個堿基的一個片段將保護內含子1變體的71個堿基的片段和對照端粒酶的41個堿基的片段。用于Rnase探針保護的片段通常是選擇30至400個堿基范圍的長度，并且將片段進行定位以產生容易區(qū)分的保護產物。
另一種可用于區(qū)分變體的方法是擴增。擴增引物的設計和擴增的策略在上面有所描述。簡單地說，優(yōu)選那些能夠將每個被剪接進或剪接出的變體單獨擴增的引物。可以進行多重反應以鑒別那些發(fā)生過不止一次剪接進或剪接出事件的變體。
測定端粒酶蛋白質的方法在本發(fā)明中同樣有用。例如，端粒酶抗體可用于使組織切片或透化細胞染色?？贵w還可用于通過免疫沉淀、Westernblot等方法檢測蛋白質。而且，使用此處描述的抗體可以確定端粒酶或端粒酶變體的亞細胞定位情況。E.端粒酶抗體此處所討論的端粒酶蛋白質、片段或肽的抗體的制備很容易。這種抗體可以特異地識別野生型端粒酶蛋白質而不能識別突變體(或變體)蛋白質，或者能識別突變體(或變體)端粒酶蛋白質而不能識別野生型蛋白質，或者同時識別突變體(或變體)及野生型蛋白質。抗體可用于分離蛋白質、抑制(拮抗物)蛋白質的活性，或增強(激動劑)蛋白質的活性。同時，抗體的發(fā)展對與端粒酶作用的小分子的分析將有所幫助。
在本發(fā)明中，抗體被理解為包括單克隆抗體、多克隆抗體、抗特應抗體、抗體片段(如Fab，和F(ab′)2)，Fv可變區(qū)，或互補決定區(qū))。如果抗體與端粒酶蛋白質的結合Kd值大于或等于10-7M，優(yōu)選地大于或等于10-8M，這種抗體一般被認為是特異性的。單克隆抗體或其結合對方的親和性通過本領域普通技術人員可以很容易地測定(參考Scatchard，紐約科學院年報(Ann.N.Y.Acad.Sci.)51660-672，1949)。
簡單地說，多克隆抗體的制品可以容易地從大量溫血動物如兔子、小鼠或大鼠中產生。將動物用端粒酶蛋白質或其肽進行免疫，優(yōu)選地將它們連接到一個載體蛋白質如匙孔血藍蛋白質上。給藥途徑包括腹膜內、肌內、眼內、或皮下注射，通常是在佐劑中(如弗氏完全或不完全佐劑)進行。特別優(yōu)選的多克隆抗血清在分析中表現出至少比背景高三倍的結合活性。
單克隆抗體還可以容易地利用傳統(tǒng)技術從雜交瘤細胞系中產生(參考美國專利Nos.RE32,011，4,902,614，4,543,439和4,411,993；還參考《抗體實驗手冊》(AntibodiesA laboratory Manual)，Harlow和Lane主編，冷泉港實驗室出版，1988)。簡單地說，在一個實施方案中，受試動物如大鼠或小鼠被用端粒酶或其一部分注射。該蛋白質以在一種佐劑如弗氏完全或不完全佐劑中的乳劑形式給藥，以增加免疫反應。在最初免疫后的一至三周，動物一般被加強免疫，并用熟知的方法測試其對蛋白質的反應性。收獲脾和/或淋巴結并使其無限增殖化?？梢圆捎酶鞣N無限增殖化技術，如由Epstein-Barr病毒介導或融合以產生雜交瘤的技術。在一個優(yōu)選實施方案中，無限增殖化的發(fā)生是通過與合適的骨髓瘤細胞系融合形成分泌單克隆抗體的雜交瘤。合適的骨髓瘤細胞系包括，例如，NS-1(ATCC NO.TIB 18)，和P3X63-Ag8.653(ATCC NO.CRL 1580)。優(yōu)選的融合伴侶不表達內源抗體基因。融合后，將細胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基中含有使融合的脾和骨髓瘤細胞選擇性生長的試劑，如HAT(次黃嘌呤、氨基蝶呤、和胸苷)。大約七天后，篩選存在能夠與端粒酶蛋白質作用的抗體的雜交瘤。大量分析方法可以采用，包括如對流免疫電泳、放射免疫分析、放射免疫沉淀、酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)、點雜交分析、Western雜交、免疫沉淀、抑制或競爭分析，以及夾心法技術(參考美國專利Nos.4,376,110和4,486,530；還參考《抗體實驗手冊》，Harlow和Lane主編，冷泉港實驗室出版，1988)。
也可以利用其他技術來構建單克隆抗體(參考Huse等人，科學2461275-1281，1989；Sastry等人，美國國家科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)865728-5732，1989；Alting-Mees等人，分子生物學策略(Strategiesin Molecular Biology)31-9，1990；描述重組技術)。簡單地說，從B細胞群體中分離mRNA，并用于在合適的載體如λImmunoZap(H)和λImmunoZap(L)中構建重鏈和輕鏈免疫球蛋白質cDNA表達文庫。這些載體可以被單獨篩選或共表達以形成Fab片段或抗體(參考Huse等人，同上；Sastry等人，同上)。陽性噬菌斑可以隨后被轉變?yōu)槟軌蚋咚奖磉_大腸桿菌單克隆抗體片段的非裂解質粒。
相似地，抗體的部分或片段，例如Fab和Fv片段，可以利用傳統(tǒng)的酶解或重組DNA技術進行構建，以形成分離的抗體可變區(qū)。在一個實施方案中，來自產生目的單克隆抗體的雜交瘤編碼可變區(qū)的基因是利用可變區(qū)的核苷酸引物擴增的。這些引物可以通過本領域普通技術人員進行合成，或者從商業(yè)渠道購買(如Stratacyte公司，La Jolla，CA)。擴增產物插入到載體如ImmunoZApTMH或ImmunoZApTML(Stratacyte)中，然后再導入大腸桿菌、酵母、或基于哺乳動物的系統(tǒng)中進行表達。利用這些技術，可以產生大量的含有VH和VL結構域融合的單鏈蛋白質(參考Bird等人，科學242423-426，1988)。另外，可利用技術將“鼠源”抗體變?yōu)椤叭嗽础笨贵w，而不改變該抗體的結合特異性。
一旦獲得了合適的抗體，可以通過許多本領域普通技術人員熟知的那些方法進行分離或純化(參考《抗體實驗手冊》，Harlow和Lane主編，冷泉港實驗室出版，1988)。合適的技術包括肽或蛋白質親和柱層析、HPLC或RP-HPLC、在蛋白質A或蛋白質G柱上純化，或這些技術的任何組合。F.與端粒酶作用的蛋白質可以通過一種方法如酵母雙雜交結合系統(tǒng)檢測直接與端粒酶作用的蛋白質。簡單地說，在雙雜交系統(tǒng)中，構建DNA-結合結構域-端粒酶蛋白質融合體(如GAL4-端粒酶融合體)并轉染到含有與選擇性標記基因連接的GAL4結合位點的細胞中。可以使用完整的端粒酶蛋白質或端粒酶的亞區(qū)。還構建了融合到GAL4激活結構域的cDNA文庫并共轉染。當cDNA-GAL4激活結構域融合體中的cDNA編碼與端粒酶作用的蛋白質時，選擇性標記就會表達。培養(yǎng)含有cDNA的細胞，分離并鑒定該構件。還可以采用其它分析方法鑒定與端粒酶作用的蛋白質。這些方法包括ELISA、Western雜交、共免疫沉淀等等。III.端粒酶活性的抑制劑和增強劑候選的抑制劑和增強劑(統(tǒng)稱為“效應物”)可從多種渠道分離到或獲得，例如細菌、真菌、植物、寄生蟲、化合物文庫(如組合化學文庫)、隨機肽等等。效應物還可以是端粒酶的肽或變體肽、端粒酶變體、反義核酸、端粒酶抗體、端粒酶啟動子活性的抑制劑等等。抑制劑和增強劑還可以根據從X-射線晶體學確定的蛋白質結構進行合理設計(參考，Livnah等人，科學273464，1996)。在某些優(yōu)選實施方案中，抑制劑作用于特異的端粒酶，例如一種變體。
抑制劑的作用是通過阻止端粒酶與核蛋白質復合體的其他組分或端粒的結合，通過引起結合蛋白質的解離，或者通過其它機制。抑制劑的作用可以是直接的或者是間接的。在優(yōu)選實施方案中，抑制劑干擾端粒酶蛋白質與端粒酶RNA或端粒的結合。在其它優(yōu)選實施方案中，抑制劑是小分子。在一個最優(yōu)選實施方案中，抑制劑使得細胞停止復制。抑制劑應當具有最低的副作用并且優(yōu)選地是無毒的。能夠透過細胞的抑制劑是優(yōu)選的。
在其它優(yōu)選實施方案中，效應物是以顯性失活方式起作用的端粒酶蛋白質或肽(參考，Ball等人，現代生物學(Current Biology)771，1997；現代生物學684，1996)。例如，能夠競爭性抑制端粒酶與端粒結合的端粒酶的肽將破壞端粒的延長。一般地，這些肽具有天然的序列，但是變體可以具有更強的活性(參考，Ball等人，同上)。變體可通過此處描述的方法進行構建。其它的肽可能結合端粒酶并抑制其一種或多種活性，但是不具有端粒酶的氨基酸序列。這種肽可以通過此處描述的方法加以鑒別。這些蛋白質或肽還可以增強端粒酶的活性。為了有效的抑制，肽類抑制劑優(yōu)選地是由被轉染或感染到宿主細胞中的載體表達的，但是載體也可以是通過其它方法導入的，例如脂質體介導的融合等等。真核生物載體為大家所熟知并且很容易得到。載體包括質粒、基于病毒的載體等等。
在另一個優(yōu)選實施方案中，抑制劑是核酶?！昂嗣浮笔侵敢环N能夠切割端粒酶核酸序列的核酸分子。核酶由DNA、RNA、核酸類似物、或這些分子的任何組合形式(例如DNA/RNA雜合體)構成?！昂嗣富颉敝敢环N核酸分子，當它被轉錄為RNA時能夠產生核酶，而“核酶載體”指一種能夠轉錄目的核酶基因的部件，由DNA或RNA構成。在本發(fā)明的某些實施方案中，載體可以含有一個或多個限制性位點和選擇性標記。此外，根據所選擇的載體和宿主細胞，此處描述的載體中可以含有另外的元件如復制起點、聚腺苷酸化位點、和增強子。
如上所述，本發(fā)明還提供能夠抑制端粒酶基因表達的核酶。簡單地說，可以產生大量的核酶用于本發(fā)明中，例如包括發(fā)夾核酶(參考如，Hampel等人，核酸研究18299-304，1990，EPO360，257，和美國專利No.5,254,678)，錘頭核酶(參考如，Rossi，J.J.等人，藥物療法(Pharmac.Ther.)50245-254，1991；Forster和Symons，細胞48211-220，1987；Haseloff和Gerlach，自然(Nature)328596-600，1988；Walbot和Bruening，自然334196，1988；Haseloff和Gerlach，自然334585，1988；Haseloff等人，U.S.Patent No.5,254,678)，丁型肝炎病毒核酶(參考如，Perrotta和Been，生物化學(Biochem.)3116，1992)，I組內含子核酶例如那些基于四膜蟲核糖體RNA的核酶(參考如，Cech等人，美國專利No.4,987,071)，RNase P核酶(參考如，Takada等人，細胞35849，1983)；以及大量的能夠切割目的或所選靶序列的其它核酸結構(參考如，WO95/29241，和WO95/31551)。在本發(fā)明的某些實施方案中，核酶的天然結構可以被改變以包含能夠增加穩(wěn)定性的四環(huán)或其它結構(參考如，Anderson等人，核酸研究221096-1100，1994；Cheong等人，自然346680-682，1990)，或使核酶抵抗RNase或內切酶活性的結構(參考如，Rossi等人，藥物療法50245-254，1991)。
在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了能夠切割端粒酶核酸序列的發(fā)夾核酶和錘頭核酶。簡單地說，產生發(fā)夾核酶以使他們能夠識別靶序列N3XN*GUC(N＞6)，其中N是G、U、C、或A，X是G、C、或U，而*是切割位點。相似地，產生錘頭核酶以使他們能夠識別序列NUX，其中N是G、U、C、或A。錘頭或發(fā)夾核酶的其它核苷酸是根據靶序列周圍的核苷酸和錘頭共有序列確定的(參考Ruffner等人，生物化學(Biochemistry.)2910695-10702，1990)。特定核酶的制備和應用在Cech等人(美國專利No.4,987,071)中被描述。核酶優(yōu)選地是由導入宿主細胞中的載體表達的。
本發(fā)明的核酶，以及編碼這些核酶的DNA可以利用已發(fā)表的技術很容易地產生(例如，Promega，Madison Wis.，Heidenreich等人，J.FASEB7090-6，1993；Sproat，生物技術現代觀點(Curr.Opin.Biotechnol.)420-28，1993)?；蛘撸嗣缚梢杂删幋a核酶并與RNA聚合酶啟動子(例如，SP6或T7)有效連接的DNA或cDNA分子產生。RNA核酶是由DNA或cDNA分子轉錄產生的。
在其它優(yōu)選實施方案中，抑制劑消除了端粒酶的啟動子活性。真核啟動子含有被RNA聚合酶結合的序列和其它參與轉錄單位調控的蛋白質。端粒酶的轉錄似乎是被高度調控的；該蛋白質主要在干細胞、胚胎細胞和癌細胞中表達，而在大多數體細胞中以低水平表達或根本就不表達。于是，啟動子是抑制劑潛在的靶點。抑制劑破壞或阻止一個或多個控制端粒酶轉錄的因子的結合，引起轉錄減少或停止。轉錄水平僅僅需要低到使得至少一種端粒酶消失的足夠低的水平。
本發(fā)明的另一個抑制劑是端粒酶編碼或非編碼序列的反義RNA或DNA。針對特定mRNA分子的反義核酸已經表現出抑制所編碼蛋白質表達的活性。根據此處的端粒酶序列，設計反義序列并優(yōu)選地插入適于轉染宿主細胞的載體中，并表達反義序列。反義序列可以結合hT1 RNA的任何部分。在某些實施方案中，設計了與一個或多個變體特異結合的反義序列。特異結合的意思是在生理條件下，反義序列與具有互補序列的RNA結合，而不與其它RNA結合。因為含有任何特定內含子序列的端粒酶RNA可以是一組由于剪接變體獨立排列組合造成的異源變體，所以不只一種RNA被結合并被鈍化。此處的反義多聚核苷酸至少7個核苷酸長，一般不長于100至200個堿基，更典型的至少10至50個堿基長。關于反義分子的設計和導入細胞的方法方面的考慮可在美國專利Nos.5,681,747；5,734,033；5,767,102；5,756,476；5,749,847；5,747,470；5,744,362；5,716,846)中找到。
另外，在某些情況下需要端粒酶活性或表達的增強劑。有時，提高細胞的繁殖潛力將具有治療作用。例如，在受傷或生病之后器官的再生或分化，受傷后神經細胞或腦細胞的生長，在骨髓移植中用到的造血干細胞或其它器官干細胞的繁殖等十分有限，并因此得益于端粒酶的增強劑。增強劑穩(wěn)定內源蛋白質、增加轉錄或翻譯、或通過其它機制起作用。正如本領域的技術人員所清楚的，上面提供的許多指導同樣適用于增強劑的設計。
抑制劑和增強劑的篩選分析方法將隨抑制劑的類型和受抑制的活性的性質不同而改變。分析方法包括TRAP分析或方差分析、不基于擴增的聚合酶分析、酵母雙雜交法、用脊椎動物端粒酶轉染的酵母中阻遏的釋放等等。為了篩選與端粒酶啟動子相互作用的化合物，通過報告基因進行的分析是很方便的。IV.端粒酶的應用端粒酶的核苷酸序列和端粒酶蛋白質被用于本發(fā)明的許多地方。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的組合物被用作診斷劑或治療劑。A.診斷劑編碼端粒酶和/或蛋白質的mRNA的表達可用于正在分裂的細胞的檢測，特別是腫瘤細胞和干細胞。檢測方法包括抗體染色或用于檢測蛋白質的標記端粒酶結合化合物，mRNA的核酸原位雜交，在DNA“芯片”上的雜交，Northern分析，Rnase探針保護，通過PCR或其它方法的擴增，連接酶介導的擴增等等。而且，RNA剪接變體的表達可以方便地通過擴增、RNase探針保護、其它公開的方法等分析。特別地，圍繞頻繁剪接變體位點的寡核苷酸引物例如此處描述的引物(例如，Htel內含子T和HT2482R)可用于檢測不同細胞類型中的剪接變體。如實施方案中所示，不同的腫瘤細胞類型表現出不同的RNA剪接變化?？梢源_定剪接變體的類型與腫瘤所處的時期、轉移潛力等的關系。這樣，對特定變體的分析可用作一種診斷劑。具有增強的端粒酶活性的細胞，例如腫瘤細胞或過量增生性細胞可通過此處描述的任何一種方法進行定性或定量分析來鑒別。典型地，比較目的細胞和其來自相同個體或不同個體的正常對等細胞之間的端粒酶活性或表達。腫瘤或過量增殖造成活性增強這一指征是通過直接比較或通過檢測其它細胞中的活性建立的，在這些細胞中已知缺失了端粒酶活性或表達。另外，可利用此處描述的分析方法監(jiān)視腫瘤的發(fā)展或對治療的反應，并比較一段時間內的活性或表達。
在一個ALT細胞系中檢測到的表達端粒酶的變體提示，hT1這一基本結構域至少在一些ALT細胞系中促進了ALT機制。ALT的一個可能的機制涉及在TRAP分析中被鈍化的調節(jié)異常的端粒酶組分。于是，變體的鑒別對隨后的腫瘤發(fā)生有所幫助。
不同的mRNA剪接是在高等真核生物中調節(jié)基因表達的一種常見機制，并且有許多組織特異的、發(fā)育特異的和性別特異的剪接發(fā)生改變的例子。重要的是，15％與哺乳動物疾病狀態(tài)有關的突變影響剪接類型(Horowitz和Krainer，遺傳學進展(Trends Genet.)10100-106，1994)。細胞生理狀態(tài)的改變也能引起剪接類型改變。實際上，腫瘤發(fā)生本身已經提示可以通過適應不同的剪接機制而提高mRNA剪接變體的表達。盡管其它新的、細微不同的剪接hT1變體在腫瘤發(fā)展中可能起作用，但是在與正常細胞相比的各種腫瘤細胞中，以及在與生命周期有限的轉捩前細胞相比的轉捩后細胞系中發(fā)現的主要轉錄物不同的相對表達水平，似乎是在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起主要作用。另外，在睪丸和結腸隱窩以及腫瘤細胞系中發(fā)現的hT1的不同剪接變體的存在，顯示出該基因在正常發(fā)育中受到復雜的調節(jié)。
在大多數腫瘤和所有端粒酶呈陽性的無限增殖化細胞系中都觀察到了主要hT1產物的表達。所以hT1的轉錄調控是端粒酶活性及其它功能調節(jié)的一個主要方面。例如，除了維持種系中端粒的長度以外，端粒酶還在愈合染色體斷裂中起作用。端粒酶的組成可以根據這些功能角色的不同而改變。
因此，內含子序列在診斷實踐中特別有用。例如，疾病，例如癌、衰老、傷口的愈合、神經元再生、再生性細胞(如干細胞)的檢測與鑒別是確定有效療法的重要前奏。鑒于這一考慮，對傷口愈合的檢測有助于開發(fā)并鑒別改良的化合物。當前，傷口愈合分析昂貴并耗時，而擴增或基于雜交的分析快速而費用低。在這些實踐中，檢測可以是定量的或是定性的。在定性分析中，一種變體序列(例如以不同方式剪接的內含子)的特定擴增引物對或雜交探針可被用于檢測變體序列的存在與否。
在本發(fā)明中有用的探針包括可與圖10中列出的序列或其互補序列雜交的核酸分子。雜交探針一般至少24個堿基，但其變化范圍可以從12個堿基至全長序列。探針可以包含不與hT1 DNA或RNA雜交的其它序列。探針一般是DNA，但也可以是RNA、PNA、或其衍生物。選擇對于探針長度和雜交方法合適的雜交條件(例如，在尼龍支持物上，在硅片上)。雜交條件在本領域是眾所周知的。圖10中的一個序列是基因組序列，在端粒酶mRNA中找不到。由這個序列衍生的探針可被用于在RNA樣品和擴增反應中檢測基因組DNA。雜交探針可用放射性標記物、化學發(fā)光標記物、或任何大量其它已知的標記物加以標記。
雜交可以在mRNA樣品、cDNA樣品上進行，可固定到固體支持物上、在溶液中、或在組織中原位進行等等。一種雜交分析是與固定在固體底物如經功能化處理的玻璃片或硅片上的寡核苷酸進行退火。這種芯片可從商業(yè)途徑獲得，或根據下面文獻中提供的方法和步驟進行制備如PCT/US94/12282；美國專利No.5,405,783；美國專利No.5,412,087；美國專利No.5,424,186；美國專利No.5,436,327；美國專利No.5,429,807；美國專利No.5,510,270；WO 95/35505；美國專利No.5,474,796。寡核苷酸一般是以陣列的方式排列的，這樣就能夠確定每個寡核苷酸序列的位置。
對于擴增分析，需要用于擴增的引物對或者是位于內含子附近，或者是需要內含子存在。此處公開了許多這樣的引物對。其它的引物對可以根據此處給出的序列進行設計。一般地，引物對的設計是使其僅僅能夠擴增單個內含子，但是，在一些情況下在同一個RNA樣品中檢測多個內含子則是優(yōu)選的。
其它診斷方法，例如原位雜交、RNase保護等方法可以單獨使用或與上面討論的方法聯(lián)合使用。本發(fā)明提供了指導這些分析方法的原則，盡管這些技術是眾所周知的。
可以構建轉基因小鼠和無效突變體小鼠(如“敲除小鼠”)以促進候選抑制劑的測試。端粒酶基因優(yōu)選地處于一個轉基因小鼠載體構件的組織特異性啟動子的控制下。過量表達端粒酶的小鼠可被用作測試抑制劑的模式系統(tǒng)。在這些小鼠中，過量表達端粒酶的細胞可望連續(xù)地繁殖。根據對細胞生長的觀察和測量決定候選抑制劑的給藥方式。能夠減緩細胞生長或使細胞生長停止的抑制劑是候選的治療劑。
端粒酶還可被轉染到細胞中使各種細胞類型無限增殖化。暫時的無限增殖化可通過含有端粒酶的表達載體的不穩(wěn)定轉染獲得。相反，通過添加或不加誘導物，可以使處于可誘導啟動子控制下的端粒酶基因穩(wěn)定轉化子進行或不進行繁殖。相似地，端粒酶活性的抑制劑的存在與否可用于選擇性地無限增殖化細胞。酵母中全部蛋白質的一部分的表達可以作為一種顯性失活，因為許多的人類蛋白質與酵母中蛋白質復合體的一些組分相互作用，但是這種作用非常不完美因此是沒有價值的。所以，這些基因作為顯性失活。于是，酵母將最終老化。這種細胞可被用于篩選抑制劑藥物，這種藥物將使得酵母的生長度過老化期。
純化的端粒酶蛋白質、對照變體蛋白質、或片段可被用于篩選抑制劑藥物的分析中。這些分析將典型地在體外進行，并利用任何一種上述的方法或本領域已知的方法。該蛋白質還可以制成晶體并進行X-射線分析以確定其三維結構。B.治療劑此處公開的組合物和方法還可在疾病和紊亂的治療中用作治療劑以影響細胞中的任何一種端粒酶活性。治療是指任何對疾病或紊亂的改善，例如減輕疾病或紊亂的癥狀、減小腫瘤細胞的體積等等。例如，酶活性的抑制劑可用于限制細胞的繁殖。
許多疾病和紊亂與細胞的繁殖和繁殖潛力密切相關。與不希望的繁殖相關的一種最明顯的疾病是癌癥。此處描述的方法和組合物可用于治療癌癥，例如黑素瘤、其它皮膚癌、成神經細胞瘤、乳腺癌、結腸癌、白血病、淋巴瘤、骨肉瘤、等等。在本發(fā)明中適于治療的其它疾病和紊亂包括細胞過度繁殖(與相同或不同個體的正常對等細胞相比其繁殖速率增加)如平滑肌細胞增生、皮膚生長等等。而其它的疾病和紊亂將受益于端粒酶活性的提高。端粒酶的增強劑可用于刺激干細胞繁殖和可能的分化。所以，造血干細胞的擴增可用于骨髓移植中。同時許多組織具有干細胞。這些細胞的繁殖有助于傷口愈合、毛發(fā)生長、疾病如Wilm′s腫瘤的治療等等。
某些抑制劑或增強劑可以通過表達載體的方式給藥。許多將核酸導入細胞的技術是已知的。這種方法包括逆轉錄病毒載體和隨后的逆轉錄病毒感染、腺病毒或腺結合病毒載體和隨后的感染、核酸與凝聚劑(如多聚賴氨酸)的復合體，這些復合體或病毒載體通過結合配體的方式導入特定的細胞類型。許多腫瘤細胞和其它細胞特異的配體在本領域是眾所周知的。
如上所述，在本發(fā)明的某些方面，編碼核酶、反義序列、顯性失活端粒酶、端粒酶的部分等等的核酸可以通過向目的細胞引入一種功能性的基因，而被用于抑制端粒酶的活性。這可以通過向細胞傳遞一種合成的基因或者通過傳遞能夠在體內轉錄基因產物的DNA或cDNA來實現。更特別的是，為了在體內產生該產物，編碼該產物的核酸序列被置于一個真核啟動子的控制之下(如pol III啟動子、CMV或SV40啟動子)。當需要更特異地控制轉錄時，該基因可被置于一個組織或細胞特異的啟動子(如將細胞導入肝中)，或一個可誘導啟動子的控制之下。
大量的載體可用于本發(fā)明中，包括如質粒、病毒、逆轉錄轉座子和粘粒。代表性例子包括腺病毒載體(如WO94/26914，WO93/9191；Yei等人，基因療法(Gene Therapy)1192200，1994；Koll等人，美國國家科學院院報91(1)215-219，1994；Kass-Eisler等人，美國國家科學院院報90(24)11498-502，1993；Guzman等人，循環(huán)88(6)2838-48，1993；Guzman等人，循環(huán)研究(Cir.Res.)73(6)1202-1207，1993；Zabner等人，細胞75(2)207-216，1993；Li等人，人基因療法(HumGene Ther.)4(4)403-409，1993；Cailaud等人，歐洲神經科學雜志(Eur.J.Neurosci.)5(10)1287-1291，1993)，腺伴隨1型病毒(“AAV-1”)或腺伴隨1型病毒(“AAV-2”)載體(參考WO95/13365；Flotte等人，美國國家科學院院報90(22)10613-10617，1993)，活體、或弱化的丁型肝炎病毒載體和皰疹病毒載體(如美國專利No.5,228,641)，以及在美國專利No.5,166,320中公開的載體。其它代表性的載體包括逆轉錄病毒載體(如EP 0 415 731；WO90/07936；WO91/02805；WO94/03622；WO93/25698；WO93/25234；美國專利No.5,219,740；WO93/11230；WO93/11230；WO93/10218。方法和其它組合物參考美國專利No.5,756,264；5,741,486；5,733,761；5,707,618；5,702,384；5,656,465；5,547,932；5,529,774；5,672,510；5,399,346，和5,712,378)。
在本發(fā)明的某些方面中，利用載體或通過各種物理方法可將核酸分子導入宿主細胞中。這些方法的代表性例子包括用磷酸鈣沉淀進行轉化(Dubensky等人，美國國家科學院院報817529-7533，1984)，直接顯微注射核酸分子到完整的靶細胞中(Acsadi等人，自然352815-818，1991)，和電穿孔法。在電穿孔法中，懸浮在導電溶液中的細胞被置于強電場中使細胞膜被瞬時極化，從而使核酸分子進入細胞。其它方法包括利用連接在失活腺病毒上的核酸分子(Cotton等人，美國國家科學院院報896094，1990)，脂質轉染法(Felgner等人，美國國家科學院院報847412-7417，1989)，微粒轟擊法(Willianms等人，美國國家科學院院報882726-2730，1991)，聚陽離子化合物如聚賴氨酸、受體特異性配體、包裹核酸分子的脂質體，含有核酸分子的大腸桿菌被除去外層細胞壁并通過聚乙二醇融合到動物細胞中形成的球形融合體，病毒轉導(Cline等人，藥物療法2969，1985；和Friedmann等人，科學2441275，1989)，和DNA配體(Wu等人，生物化學雜志26416985-16987，1989)，以及被補骨脂素失活的病毒如仙臺病毒或腺病毒。在一個實施方案中，利用脂質體法將核酸分子導入宿主細胞中。
效應物的給藥方法一般按照現有方案進行。本發(fā)明的化合物可單獨給藥，或是作為藥物組合物給藥。簡單地說，本發(fā)明的藥物組合物可含有此處描述的一種或多種抑制劑或增強劑，并與一種或多種藥學或生理學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑結合使用。這些組合物可以含有緩沖液如中性緩沖鹽水、磷酸緩沖鹽水等等，碳水化合物如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇，蛋白質、多肽或氨基酸如甘氨酸，抗氧化劑、螯合劑如EDTA或谷胱甘肽，佐劑(例如氫氧化鋁)和防腐劑。另外，本發(fā)明的藥物組合物還可以含有一種或多種另外的活性成分。效應物可以進一步結合一個導向基團，它可與繁殖細胞特異的細胞表面受體結合。
本發(fā)明的組合物可以根據指定的給藥方式進行配制，包括如經口、經鼻、經靜脈、顱內、腹膜內、皮下、或肌內給藥。在本發(fā)明的其它實施方案中，此處描述的組合物可以作為緩釋植入物的一部分。而在其它實施方案中，本發(fā)明的組合物可制成凍干粉，利用合適的賦形劑提高凍干粉和隨后的再水化的穩(wěn)定性。
如上所述，本發(fā)明還提供了藥物組合物。這些組合物含有任何一種上述核酶、DNA分子、蛋白質、化學藥品、載體、或宿主細胞，以及藥學或生理學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。一般地，這些載體在所用的劑量和濃度內對受體應是無毒的。通常，這些組合物的制備包括使治療劑與緩沖液、抗氧化劑如抗壞血酸、低分子量(低于約10個殘基)多肽、蛋白質、氨基酸、碳水化合物包括葡萄糖、蔗糖或糊精、螯合劑如EDTA、谷胱甘肽和其它穩(wěn)定劑和賦形劑混合。中性緩沖鹽水或與非特異性血清白蛋白質混合的鹽水是合適的稀釋劑的范例。
另外，本發(fā)明的藥物組合物可制成不同藥劑以便通過多種不同的途徑給藥，包括如關節(jié)內、顱內、皮內、肝內、肌內、眼內、腹膜內、鞘內、靜脈內、皮下注射或者甚至直接注射到腫瘤中。另外，本發(fā)明的藥物組合物可置于容器內，并有提供該藥物組合物使用指導的包裝材料。一般地，這些指導將包括描述藥劑濃度的明確說明，以及在某些實施方案中還包括賦形劑成分或稀釋劑(如水、鹽水或PBS)的相對含量，這些成分是重構藥物組合物所必需的。藥物組合物對于診斷或治療都是有用的。
本發(fā)明的藥物組合物可以針對所治療(或預防)的疾病采取適當的給藥方式。給藥的量和頻率將根據這些因素確定，例如患者的條件、以及患者病情的類型和嚴重程度等。在臨床實驗中最精確地確定給藥的劑量。通過適當的技術檢測患者的治療效果，這些技術包括臨床惡化的觀察、成像等等。
下面的實施方案是通過說明的方式提供的，而不是意在限制。實施例實施例1人端粒酶基因的鑒定與分離一個人端粒酶基因是在從癌細胞系構建的cDNA文庫中鑒定的。將該cDNA進行DNA序列分析(Kilian等人，同上)。
通過BLAST與GenBank登錄號U95964(p＝3.2×10-6)的Euplotes端粒酶序列比較，GenBank登錄號AA281296的EST序列被鑒定為一個部分端粒酶基因序列。兩個序列之間的氨基酸序列的同一性大約為38％而氨基酸序列的相似性大約60％。
為了獲得更長的hT1克隆，利用EST序列內部引物，通過擴增的方法篩選從腫瘤細胞制備的cDNA文庫?；贓ST序列的引物HT1553F和HT1920R用于在不同cDNA文庫中擴增大約350bp的片段。擴增反應是在“熱啟動”條件下進行的。擴增循環(huán)為95℃4分鐘；80℃1分鐘；94℃30秒、55℃30秒、72℃1分鐘30次循環(huán)；以及72℃5分鐘。在12個所篩選的文庫中，僅從3個文庫中檢測到了預期大小(～350bp)的擴增產物。在睪丸cDNA文庫、體細胞文庫、和不同癌細胞cDNA文庫中未檢測到片段。然而，從結腸癌細胞系LIM1215細胞中檢測到了高豐度的350bp片段。在這個文庫以及其它幾個文庫中，擴增了大約170bp的另外一個片段。
從LIM1215文庫中獲得更長克隆的方法有兩個用32P標記的EST探針篩選噬菌斑和在文庫DNA上擴增。通過用EST探針進行文庫雜交獲得了一個具有1.9kb插入片段的陽性噬菌斑，命名為53.2。此克隆的DNA序列分析表明它從EST序列的5’和3’延伸，但是并不含有一個開放閱讀框(ORF)。從文庫的擴增分析獲得的一個片段在序列上與53.2片段相似，但是還含有36bp和＞300bp的另外兩個序列。這兩個插入片段表示出了在相對于53.2序列邊界處剪接受體和供體序列的特征，可能代表了未剪接的內含子。用T7引物和HT1553F引物擴增，產生一個大約1.6kb的片段；而用T3引物和HT1893R引物擴增，產生了一個大約0.7bp的片段。每個片段都支持用HTEL1553F引物和HT1893R引物擴增，得到320bp的片段。
更長的克隆還可以通過mRNA樣品的擴增獲得。在LIM1215 mRNA上進行逆轉錄PCR(RT-PCR)鑒定出另外一個PCR產物，包括一個相對于53.2片段的具有182bp插入片段的產物，它形成一個開放閱讀框(ORF)。cDNA是從分離自正常組織和腫瘤組織的RNA合成的。在進行嵌套擴增前用Titan RT-PCR系統(tǒng)(Boehringer-Mannheim)進行RT-PCR。擴增條件如下95℃2分鐘，94℃30秒兩個循環(huán)，65℃30秒和68℃3分鐘，94℃30秒，63℃30秒，68℃3分鐘兩個循環(huán)，94℃30秒，60℃30秒和68℃3分鐘34個循環(huán)。RT-PCR產物稀釋100倍，將其中1微升用Taq聚合酶和緩沖液Q(Qiagen)進行嵌套擴增。擴增條件如上，除了最后一步為14個循環(huán)。對于正常組織和腫瘤組織，將擴增產物在1.5％瓊脂糖凝膠上電泳分離，轉移至Zetaprobe膜上并用放射性標記的寡核苷酸HT1691F探測。
分別用cRACE和3’RACE的組合，在LIM1215mRNA上將該DNA序列的5’和3’延伸，得到了命名為hT1(圖1)的3871bp的片段。進行兩輪cRACE以延伸hT1序列并確定轉錄的起始位點。用500納克LIM1215 polyA+RNA作為模板。cDNA第一條鏈的合成是用HT1576R引物引發(fā)的。在連接產物(利用XL-PCR系統(tǒng))上進行的第一輪擴增采用HT1157R和HT1262F引物。擴增產物用Qiagen柱純化，并進一步用HT1114R和HT1553F引物擴增。產生的1.4kb譜帶進行DNA序列分析，并根據該序列設計了一套新的引物。在第二輪cRACE中，cDNA第一條鏈用HT220R引物引發(fā)。第一輪擴增采用HT0142R和HT0141F引物。產物按上述純化并用HT0093和HT0163F擴增。觀察到一個100bp的產物，并在兩個獨立的實驗中將其進行序列分析以確定hT1轉錄物的5’末端。轉錄物的5’末端還可以通過用引物HtelFulcodT 5′-AGGAGATCTCGCGATGCCGCGCGCTC-3′和HtelFulcodB 5′-TCCACGCGTCCTGCCCGGGTG-3′對LIM1215 RNA擴增得到。產生的擴增產物用MluI和BglII消化并連接到剩余的端粒酶cDNA序列上。
轉錄物的3’遠端序列是通過進行兩輪擴增(XL-PCR系統(tǒng))得到的，在兩輪擴增中都采用EBHT18作為反向引物，而在第一和第二輪擴增中分別采用HT2761F和HT3114F作為正向引物。
hT1的大小與從LIM1215 RNA中豐度最高的RNA的Northern雜交(見下面)中估計的大小非常吻合。在圖1中列出了大約3.9kb的DNA序列。在EST中發(fā)現的序列位于1624-2012位核苷酸。最大開放閱讀框的預測的氨基酸序列也在圖1中列出。如圖中所示，該蛋白質為1132個氨基酸。
表2名稱寡核苷酸序列HT0028F 5′-GCTGGTGCAGCGCGGGGACCHT5′Met5′-CACAAGCTTGAATTCACATCTCACCATGAAGGAGCTGGTGGCCCGAGTHT0093R 5′-GGCACGCACACCAGGCACTGHT0141F 5′-CCTGCCTGAAGGAGCTGGTGHT0142R 5′-GGACACCTGGCGGAAGGAGHT0163F 5′-CCGAGTGCTGCAGAGGCTGTHT0220R 5′-GAAGCCGAAGGCCAGCACGTTCTTHT1262F 5′-GTGCAGCTGCTCCGCCAGCACAHT1114R 5′-GTTCCCAAGCAGCTCCAGAAACAGHT1157R 5′-GGCAGTGCGTCTTGAGGAGCAHT1553F 5′-CACTGGCTGATGAGTGTGTACHT1576R 5′-GACGTACACACTCATCAGCCAGHT1590F 5′-GGTCTTTCTTTTATGTCACGGAGHT1691F 5′-CACTTGAAGAGGGTGCAGCTHT1875F 5′-GTCTCACCTCGAGGGTGAAGHT1893R 5′-TTCACCCTCGAGGTGAGACGCTHT1920R 5′-TCGTAGTTGAGCACGCTGAACHT2026F 5′-GCCTGAGCTGTACTTTGTCAAHTM2028F 5′-CTGAGCTGTACTTTGTCAAGGACAHT2230F 5′-GTACATGCGACAGTTCGTGGCTCAHT2356R 5′-CATGAAGCGTAGGAAGACGTCGAAGAHT2482R 5′-CGCAAACAGCTTGTTCTCCATGTCHT2761F 5′-CTATGCCCGGACCTCCATCAGAHT2781R 5′-CTGATGGAGGTCCGGGCATAGHT3114F 5′-CCTCCGAGGCCGTGCAGTHT3292B 5′-CACCTCAAGCTTTCTAGATCAGTCCAGGATGGTCTTGAAGTCAHT3689R 5′-GGAAGGCAAAGGAGGGCAGGGCGAEBHT185′-CACGAATTCGGATCCAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTHT-RNA-F 5′-GGGTTGCGGAGGGTGGGCHT-RNA451R5′-GCAGTGGTGAGCCGAGTCCTGHT-RNA598F5′-CGACTTTGGAGGTGCCTTCAHTel5′T 5′-GCTGGTGCAGCGCGGGGACCHTel979T 5′-GAGGTGCAGAGCGACTACTCCAHTel1335T 5′-GTCTCACCTCGAGGGTGAAGHTel71T 5′-GGCTGCTCCTGCGTTTGGTGGAHTel21B(Top) 5′-GCCAGAGATGGAGCCACCCHTel21TBot) 5′-GGGTGGCTCCATCTCTGGCHTel-7B 5′-CCGCACGCTCATCTTCCACGTHTel+256B 5′-GCTTGGGGATGAAGCGGTCHtelIntronT 5′-CGCCTGAGCTGTACTTTGTCAHtel 3′CODB5′-CACCTCAAGCTTTCTAGATCAGCTAGCGGCCCAGCCCAACTCCCCTHtel 1210B 5′-GCAGCACACATGCGTGAAACCTGTHtel 1274B 5′-GTGTCAGAGATGACGCGCAGGAAHtel 1624b 5′-ACCCACACTTGCCTGTCCTGAGThTR TAC 5′-ACTGGATCCTTGACAATTAATGCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAGGGTTGCGGAGGGTGGGChTR 5′T7 5′-CTGTAATACGACTCACTATAGGGTTGCGGAGGGTGGGChTR 3′PstI 5′-CACCTGCAGACATGCGTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGGCCAGCTGGCGACGCATGTGTGAGCCGAGTCCTGBT-177 5′-GGATCCGCCGCAGAGCACCGTCTGBT-178 5′-CGAAGCTTTCAGTGGGCCGGCATCTGAACBT-179 5′-CGAAGCTTTCACAGGCCCAGCCCAACTCCBT-182 5′-GCGGATCCAGAGCCACGTCCTACGTCBT-183 5′-GCGGATCCGTTCAGATGCCGGCCCAC實施例2HT1序列及與其它端粒酶的序列比較多重序列比較顯示推測的hT1蛋白質與Euplotes和釀酒酵母端粒酶催化亞單位在全長范圍內共線性(co-linear)(圖2)。盡管三種蛋白質之間的整體同源性相對較低(在所有的成對組合中大約為40％的相似性)，但是蛋白質的整體結構似乎非常保守。四個主要的結構域N-末端、堿性的、逆轉錄酶(RT)和C-末端結構域存在于所有三種蛋白質中。序列相似性最高的區(qū)域是在RT結構域中。顯然，Euplotes逆轉錄酶結構域的所有基元的特征都存在于hT1序列中，并且與逆轉錄酶催化有關的所有氨基酸殘基也都保留在hT1序列中(Lingner等人，科學276561-567，1997)。
最近，用蛋白質磷酸酶2A處理人乳腺癌細胞提取物，顯示能夠抑制端粒酶的活性(Li等人，生物化學雜志27216729-16732，1997)。盡管還不知道這種作用是不是直接的，但是它提高了蛋白質磷酸化對端粒酶活性調節(jié)的可能性。推測的hT1蛋白質不含有大量潛在的磷酸化位點，包括11SP或TP二肽，這些是細胞周期依賴性激酶的潛在位點。實施例3端粒酶基因的表征進行Northern分析和Southern分析以確定端粒酶轉錄物的大小以及端粒酶基因是否是在腫瘤細胞中擴增的。
對于Northern分析，polyA mRNA是從LIM1215細胞和CCD成纖維細胞中分離的。CCD是一個原代人成纖維細胞系。在含有去污劑(0.1％SDS)和200μg/ml蛋白質酶K的緩沖液(0.1M NaCl，10mM Tris，pH 7.4，1mM EDTA)中通過勻漿簡單地將細胞裂解。將SDS加到裂解液中至終濃度為0.5％，并將裂解液在60℃保溫1小時和37℃下保溫20分鐘。將裂解液與Oligo dT-纖維素再保溫1小時，Oligo dT-纖維素事先經在0.1M NaOH中預循環(huán)并經在0.5M NaCl，10mM Tris pH 7.4，1mMEDTA，和0.1％SDS中平衡。離心收集樹脂，在平衡緩沖液中分批洗滌，并裝柱。mRNA用溫緩沖液(38℃)(10mM Tris pH 7.4，0.1mM EDTA)洗脫下來并用乙醇沉淀。
大約3微克聚腺苷酸化的RNA在0.85％的甲醛-瓊脂糖凝膠上電泳(參考Sambrook等人，同上)，過夜轉移至Genescreen plus膜(Bio-Rad，CA)上。將膜用32P標記的端粒酶特異探針(相應于EST序列的390bp插入片段)雜交。經高嚴謹度洗膜后，在來自LIM1215的mRNA中觀察到一條很明顯的～3.8kb的譜帶，而在來自CCD成纖維細胞的mRNA中沒有(圖3)。隨后，同一張膜用甘油醛6-磷酸脫氫酶探針進行的雜交顯示兩種mRNA的譜帶強度相同，說明各泳道中含有相似數量的高質量的RNA。僅在LIM1215RNA中還觀察到更大的轉錄物(特別是～8kb非均一的譜帶)的存在(圖10，上道)。這些結果證明了其它hT1-特異的mRNA的存在，以及hT1可以優(yōu)選地在腫瘤細胞而非正常細胞中表達。
為了Southern分析，DNA從人的外周血液單核細胞和LIM1215細胞中分離。大約10微克DNA用HindIII、XbaI、EcoRI、BamHI和PstI消化，在1％瓊脂糖凝膠中電泳，并轉移至尼龍膜上。作為對照，將含有人端粒酶的質粒DNA滴定至每10微克基因組DNA大約10個拷貝、5個拷貝和1個拷貝，并在相同凝膠中電泳。一個390bp的端粒酶基因片段(含有EST序列)被用32p標記并在正常嚴謹度條件下雜交。在2×SSC，0.1％SDS中55℃下洗膜。圖4中給出了一個掃描磷圖象。如圖所示，端粒酶基因似乎沒有在LIM1215細胞中被擴增或重排，因為LIM1215與PBMC DNA相比其雜交帶型與強度沒有明顯的不同。而且，端粒酶似乎是一個單拷貝基因，因為除了PstI以外，所有的酶消化都產生單一譜帶。實施例4HT1的表達模式盡管已經將端粒酶活性與腫瘤細胞和種系廣泛地聯(lián)系在一起，但是直到最近才認識到某些正常的哺乳動物組織表達低水平的端粒酶活性。在原代成纖維細胞RNA中沒有檢測到hT1的表達，并且用EST區(qū)的引物擴增幾種從商業(yè)途徑得到的肺、心臟、肝、胰、海馬區(qū)、胎兒腦以及睪丸的cDNA文庫也沒有得到任何產物。
然而，在前面已表明具有端粒酶活性的正常組織(結腸，睪丸和外周血液淋巴細胞)以及許多黑素瘤和乳腺癌樣品中檢測了hT1的表達。從正常的人結腸、睪丸和循環(huán)淋巴細胞和腫瘤樣品的組織切片中分離RNA，并進行RT-PCR分析。cDNA的擴增產物很容易與因污染了基因組DNA而形成的產物區(qū)別開，因為利用cDNA為模板得到～300bp的產物，而利用基因組DNA為模板得到2.7kb的產物。在結腸、睪丸和大多數腫瘤樣品中都檢測出hT1轉錄物，在淋巴RNA中轉錄物非常弱(圖5，上道)。有趣的是，兩個乳腺癌樣品的hT1表達呈陰性，盡管以β-肌動蛋白的擴增作為陽性對照判斷它含有與其它樣品數量相當的RNA(圖5，下道)。
端粒酶活性的獲得似乎是無限增殖化過程的一個重要的方面。在許多區(qū)配的成對轉捩前細胞培養(yǎng)物和轉捩后細胞系中hT1的表達利用RT-PCR進行測定，隨后進行嵌套引物擴增(圖6，上道)。根據TRAP分析(Bryan等人，EMBO J.144240-4248，1995)，這些細胞系分別是端粒酶陰性(轉捩前細胞系)和陽性(轉捩后細胞系)的。在兩個匹配的成對細胞系BFT-3B和BET-3K中，hT1僅在轉捩后細胞系中檢測到(比較a泳道和b泳道、e泳道和f泳道)。盡管BFT-3K的轉捩后細胞系(d、f泳道)顯示出豐富的hT1譜帶，但是相同大小的片段在轉捩前培養(yǎng)樣品(c、e泳道)中仍然很弱。另外，三個轉捩后細胞系中的兩個顯示存在另外一個320bp的意料之外的片段，并且當在高分辯率膠上分析結腸和睪丸mRNA時也觀察到了這個產物。
對三個無限增殖化的端粒酶陰性(ALT)細胞系也進行hT1表達分析(圖6，g，h，i泳道)。兩個細胞系顯示hT1表達陰性，但是在另一個細胞系(IIICF-T/B1)中，又擴增到了一個大約320bp的產物，這與轉捩后的結腸和睪丸樣品相似。來自IIICF-T/B1(ALT)細胞系的320bp產物的DNA序列分析顯示，與期望的產物相比存在一個38bp的插入片段。利用相同的引物但是用基因組DNA為模板進行的擴增排除了這是一個基因組DNA擴增而不是mRNA擴增的可能性。在這些條件下，擴增到一個2.7kb的片段，通過部分序列分析得到確證。實施例5端粒酶mRNA其它剪接類型的鑒定LIM1215cDNA文庫中克隆的DNA序列分析和上述轉捩前和轉捩后培養(yǎng)物的RT-PCR數據表明，在hT1轉錄物中有大量不同的序列變體。為了系統(tǒng)地測定變體，利用包含整個序列的引物對進行RT-PCR。在N-末端和堿性結構域中沒有發(fā)現變體，而在逆轉錄酶結構域中發(fā)現了幾個變體，以及在C-末端結構域發(fā)現了更少的變體。最明顯的是，在逆轉錄酶基元A和逆轉錄酶基元B之間有幾個RNA變體(圖7A)。
mRNA樣品是利用傳統(tǒng)方法從幾種不同的腫瘤中制備的。這些腫瘤是(1)SLL肺癌，(2)淋巴瘤C，(3)肺癌，(4)成神經管細胞瘤，(5)淋巴瘤B，(6)淋巴瘤E，(7)腫瘤樣品47D，(8)嗜鉻細胞瘤，(9)淋巴瘤F，(10)神經膠質瘤，和(11)淋巴瘤G。這些樣品的mRNA首先被逆轉錄為cDNA，再用引物HT1875F和HT2781R擴增，最后用嵌套引物HT2026F和HT2482R擴增。在圖8中發(fā)現了四個不同的擴增產物220bp(譜帶1)、250bp(譜帶2)、400bp(譜帶3)和430bp(譜帶4)。令人驚訝的是，所測試的腫瘤樣品在擴增產物的總數和這些產物的定量分布上都有很大的差異。
這些產物中的三個從一些腫瘤組織中分離，并進行DNA序列分析。其中之一，一個220bp的片段與LIM1215文庫的53.2cDNA相等。大約250bp的片段(譜帶2)含有36bp的框內插入片段，與從LIM1215cDNA文庫的擴增產物中鑒定的插入片段相同。因為RT-PCR產物與cDNA文庫的產物具有相同的序列，很明顯36bp插入片段不是在文庫構建時人工形成的。最大的產物(譜帶4)與250bp復制子相比含有182bp的插入片段(與前面從LIM1215 RNA擴增的較大產物相同)。400bp譜帶(譜帶3)的確切的序列還沒有得到。根據它的大小，它可能含有182bp的插入片段，但是失去了譜帶2和譜帶4中存在而譜帶1中沒有的36bp插入片段。
為了檢驗該轉錄物存在的假設，設計了一個引物HTM2028F，使得只有當36bp片段丟失時才能進行擴增。利用HTM2028F和HT2026F引物與HT2356R結合的擴增證明，含有182bp片段但是丟失了36bp片段的轉錄物存在于LIM1215 RNA中(圖9，a和b泳道)。相同的上鏈引物(HTM2028F和HT2026F)與HT2482R引物結合從LIM1215 RNA中擴增了許多產物(圖9，c和d泳道)，根據PCR產物的直接序列分析其中大部分代表譜帶1-4。用HTM2028F和HT2482R引物擴增的一個650bp的片段代表另一個尚未完全表征的、逆轉錄酶-基元A/逆轉錄酶基元B區(qū)的以其它方式剪接的端粒酶變體。為了表示得更清楚，與Euplotes和釀酒酵母蛋白質匹配最好的蛋白質序列列于圖1中作為對照序列。
特別地，至少有7個插入片段或內含子可以在端粒酶RNA中存在或從端粒酶RNA中消失。(1)5’-最遠端序列(Y)位于堿基222和223之間。(2)插入序列(X)位于堿基1766-1767之間。測定了一個部分序列并示于圖10中。終止密碼子存在于所有三個閱讀框中。因此，將產生一個沒有任何逆轉錄酶基元的截短的蛋白質。(2)一個序列，在圖7中以“1”表示，位于堿基1950-1951之間。這個內含子為38bp(圖10)，并且似乎存在于ALT和大部分腫瘤系中。該序列的存在增加了13個氨基酸并使閱讀框移碼，使得終止密碼子(TGA)位于閱讀框中1973位堿基處。(3)一個序列，在圖7中以“α”表示，位于堿基2130和2167之間。該插入序列為36堿基(圖10)，它的丟失移去了逆轉錄酶基元“A”但是沒有改變閱讀框。(4)一個序列，在圖7中以“β”表示，位于堿基2286和2469之間。該插入序列為182堿基(圖10)，并且它的丟失引起閱讀框移碼并且在逆轉錄酶基元5中2604位核苷酸出現終止密碼子。(5)圖7中的序列“2”存在于堿基2823和2824之間。其長度未定；其部分序列列于圖10中。該插入片段的存在造成一個截短的端粒酶蛋白質，因為該插入片段的第一個密碼子是終止密碼子。(6)序列“3”是一個位于堿基3157和3158之間159bp的插入片段(圖10)。它的存在形成一個改變了羧基端的端粒酶蛋白質。該插入片段含有一個終止密碼子。而且，序列“3”具有一個推測的c-abl的SH3結構域的結合位點(PXXXXPXXP；PEMEPPRRP)。
與Euplotes和酵母的氨基酸相似性最接近的轉錄物含有序列A和B，而不含有序列C。由mRNA形成包括序列A、B和C的各種組合的八個變體的核苷酸和氨基酸序列列于圖8。實施例6人端粒酶的的重組表達人端粒酶被克隆到細菌表達載體中。從兩個品種的LIM1215 mRNA中擴增到圖1所示的序列，并且將其連接起來。
擴增時，合成cDNA的第一條鏈并用于含有DNA聚合酶混合物的擴增反應中(Titan系統(tǒng)，Boehringer，IN)，這樣一個校讀熱穩(wěn)定的酶(如rTth)與Taq DNA聚合酶一起使用。因為LIM1215中的許多mRNA缺少序列B(圖9)，設計擴增引物，使得每對引物的一個引物位于序列B中，位于2271位核苷酸的SacI位點的任何一側(圖1)。用HT2356R和HT0028F首先從cDNA中擴增了5’部分(循環(huán)條件70℃2分鐘；然后添加平衡至50℃的引物序列；50℃30分鐘；95℃2分鐘；94℃30秒；65℃30秒2個循環(huán)；94℃30秒；63℃30秒；68℃3分鐘3個循環(huán)；94℃30秒；60℃30秒；68℃3分鐘32個循環(huán))。然后端粒酶基因的最遠端5’部分連接在用EcoRI/SacI消化的pTTQ18(Amersham Internationalplc，Buckinghamshire，英國)和pBluescriptII KS+上，并且驗證了該序列。
為了獲得3’端，用HT2230F和HT3292B引物擴增LIM1215cDNA，該cDNA與編碼端粒酶最C-端的序列互補。擴增產物用HindIII和SacI消化，插入到pTTQ18和pBluescript II KS+上。5’端和3’端還被一起克隆在pTTQ18的天然SacI位點上作為六組氨酸融合體和非融合體蛋白質。
質粒pTTQ18-Htel被轉染到細菌細胞中(如BL21(DE3))。用IPTG誘導可以過量表達蛋白質。離心收集細菌并在裂解緩沖液中裂解(20mMNaPO4，pH7.0，5mM EDTA，5mM EGTA，1mM DTT，0.5μg/ml亮抑蛋白酶肽，1μg/ml抑蛋白酶肽，0.7μg/ml胃蛋白酶抑制劑)。用Polytron勻漿器均勻地懸浮此混合物，經過玻璃珠攪拌或通過微量流體器(microfluidizer)將細胞破碎。將裂解液50,000轉/分離心45分鐘。用20mMNaPO4，1mM EDTA，pH7.0(緩沖液A)稀釋上清液。將稀釋后的裂解液上清液上樣于SP-瓊脂糖柱或與之相當的柱子，使用總計6倍柱體積的緩沖液A和以0至30％線性梯度加入緩沖液A中的緩沖液B(1M NaCl，20mM NaPO4，1mM EDTA，pH7.0)?；旌虾卸肆Ｃ傅募壏??？梢赃M行進一步的純化。
對于六組氨酸融合體蛋白質，離心澄清裂解液，分批吸附到Ni-IDA-瓊脂糖柱上。將基質加入柱中并用緩沖液洗柱，一般緩沖液或是50mM TrispH 7.6，1mM DTT；50mM MES pH 7.0，或是IMAC緩沖液(對于六組氨酸融合體)。結合到基質上的端粒酶蛋白質在含NaCl的緩沖液中被洗脫。實施例7人端粒酶RNA組分的重組表達人端粒酶RNA組分首先通過擴增從基因組DNA中分離。擴增引物是telRNA T和telRNA 598B(圖5)。擴增條件是95℃3分鐘；加聚合酶；80℃2分鐘；94℃30秒；68℃2分鐘35個循環(huán)。
用hTR TAC(具有tac啟動子序列)和hTR 3′Pst(具有順式作用核酶序列)引物進行另一個擴增后，將擴增產物插入到pBluescript中。然后分離pBluescript插入片段并連接到pACYC177。實施例8人端粒酶亞區(qū)的表達人端粒酶的逆轉錄酶結構域是通過與莫洛尼鼠類白血病病毒(Moloney MuLV)逆轉錄酶進行序列比較確定的。莫洛尼鼠類白血病病毒的手指/手掌區(qū)形成一個結晶穩(wěn)定單元(Georgiadis等人，結構(Structure)3879，1995)。許多殘基和基元保留在兩個蛋白質的活性位點上。設計引物擴增逆轉錄酶結構域和手指/手掌結構域，插入到表達載體中并分離蛋白質。
片段號 引物 氨基酸I BT-177/BT-178AAEH...→...VQMPAHII BT-177/BT-179AAEH...→...VGLGLIIIBT-182/BT-179RATS...→...VGLGLIV BT-183/BT-179VQMPAH...→...VGLGL片段I編碼相應于莫洛尼鼠類白血病病毒的“手指和手掌”結構域。C-末端的“拇指”區(qū)和“連接”區(qū)(參考Kohlstaedt等人，科學2561783，1992)被刪除了。片段II編碼端粒酶的逆轉錄酶結構域，以及C-末端的“連接”區(qū)結構域。N-末端是通過與莫洛尼鼠類白血病病毒逆轉錄酶結構比較大小而選出的。片段III編碼蛋白質的C-末端。RATS序列位于蛋白質的逆轉錄酶結構域(手掌區(qū))內。片段IV編碼含有“拇指”和“連接”結構域的C-末端區(qū)并且可能起調節(jié)元件的作用。HIV-1中的連接結構域在沒有RNase結構域時能夠填塞HIV逆轉錄酶的催化裂縫(Kohlstaedt等人，同上)。C-末端區(qū)可能以一種類似的方式起調節(jié)(抑制)片段的作用。而且序列C具有一個推測的SH3結構域結合位點c-abl(PXXXXPXXP；PEMEPPRRP，參考圖8的變體2序列)。c-abl蛋白質直接與ATM(共濟失調毛細血管擴張)蛋白質相互作用(Shafman等人，自然389520，1997)，ATM蛋白質是一種明顯參與細胞周期調控、減數分裂重組、端粒長度監(jiān)測和DNA損傷應答的蛋白質。c-abl蛋白質的結合可以通過標準的蛋白質-蛋白質相互作用方法加以測定。這樣，端粒酶與c-abl或其它含有SH3結構域的蛋白質(如erb2)的相互作用，以及通過端粒酶C-末端在催化裂縫內或裂縫外的運動進行的調節(jié)是可以用此處描述的構件和產物進行控制的。在一種情況下，這種調節(jié)可以是通過磷酸化/去磷酸化反應介導的。
所有的引物都具有HinIII或BamHI位點。擴增反應是在1×Pfu緩沖液、250μM dNTP、100ng各種引物、克隆53.2模板DNA中進行的，循環(huán)條件如下94℃2分鐘；55℃、60℃或65℃2分鐘、72℃2分鐘、94℃1分鐘25個循環(huán)；然后72℃10分鐘。獲得了預期長度的產物(BT-177/BT-178 966bp；BT-177/BT-179 1479bp；BT-182/BT-179 824bp；BT-183/BT-179 529bp)。用酚氯仿抽提擴增產物并用乙醇沉淀。重懸擴增產物并用在引物序列內有切點的合適的酶消化。
被消化的產物連接到經酶消化產生合適末端的pBluescript上，將插入片段用HindIII消化并用BamHI部分消化以連接到pGEX上。質粒轉染BL21(DE3)細胞并在氨芐青霉素平板上選擇。挑取克隆并在液體培養(yǎng)液中生長過夜。取一份培養(yǎng)液在加100μg/ml氨芐青霉素的Terrific液中稀釋。細胞在37℃下生長并用0.5mM IPTG誘導至O.D值約為0.8。繼續(xù)生長5個小時。離心收集細胞并立即處理或冷凍在-70℃?zhèn)溆谩?br> 從裂解細胞中純化蛋白質。細胞菌體在50mM Tris pH 8.0，10mM 2-ME，1mg/ml溶菌酶，0.5％Triton X-100，1μg/ml胃蛋白酶抑制劑，10μg/ml亮抑蛋白酶肽，10μg/ml抑蛋白酶肽，0.5mM PMSE，和2mMEDTA中振蕩混合，凍融一次使之裂解。將裂解液離心澄清。將上清液加入到50％GSH-瓊脂糖漿液中，在4℃下攪拌2小時。將基質用裂解緩沖液和50mM Tris pH8.0，10mM 2-ME洗兩次。為了通過SDS-PAGE凝膠電泳進行分析，加入含150mM 2-ME的樣品緩沖液并將樣品煮沸。實施例9鼠端粒酶基因的分離鼠端粒酶基因是從基因組文庫或cDNA文庫中分離的。鼠基因組文庫是用細胞株129 DNA在λFIX II載體上構建的。將文庫涂平板，把噬菌斑挑到尼龍膜上。尼龍膜用克隆53.1(1.9kb)的插入片段在正常嚴謹條件下進行雜交。選出六個雜交斑點以作進一步的分析。實施例10用HT-1和端粒酶變體說明端粒酶的活性將全長的hT-1序列克隆至一表達載體，分析產生的蛋白質的端粒酶活性。載體pRc/CMV2(Invitrogen，Carlsbad，CA)是一個真核表達載體，在啟動子RSV LTR之間具有多克隆位點，以及聚腺苷酸化信號和來自牛生長激素基因的轉錄終止序列。將亮氨酸49密碼子轉變成甲硫氨酸密碼子的端粒酶序列插入到pRc/CMV2中。從中選擇一個克隆phTC51進行進一步研究。測定了5’連接處的DNA序列并確定了插入片段的方向。隨后，測定了3’連接處的序列并且顯示缺失了polyA信號，但是沒有缺失端粒酶編碼序列。
將該克隆轉染至第44代和第68代HeLa GM847細胞，第18代SUSM-1細胞，和第40代RKF-T/A6細胞。通過此處描述的TRAP分析法分析細胞提取物的端粒酶活性。如圖12中所示，以1∶100稀釋的SUSM-1細胞的提取物中，可以看到指示端粒酶活性的產物梯，而在對照細胞中沒有看到。在高濃度的提取物中不容易檢測到產物帶，可能是由于提取物中的核酸酶活性的緣故。
構建了三個端粒酶變體pAKI.4是β區(qū)被剪接出的端粒酶(圖13)；pAKI.7是C-端插入片段3被改變的端粒酶(圖14)；而pAKI.14是α區(qū)被剪接出的端粒酶(圖15)。端粒酶基因的5’端分別插入至這三個載體中并將插入片段轉移至pCIneo表達載體中。這些變體，以及pCIneo中的對照端粒酶被瞬時轉染至GM847細胞中，GM847細胞中沒有可檢測到的端粒酶活性但是表達RNA亞單位。用TRAP法檢測細胞提取物。對照端粒酶表現出活性，具有插入片段3(pAKI.7插入)的端粒酶也有活性，而其它的變體不表達活性。
從前面可以看出，盡管為了進行說明已經在此描述了本發(fā)明的幾個特殊的實施例，但是可以在不背離本發(fā)明的精神和范圍的前提下進行各種修正。因此，除了附加的權利要求以外，本發(fā)明沒有加以限制。
權利要求
1.一種分離的編碼脊椎動物端粒酶的核酸分子。
2.權利要求1的分離的核酸分子，其中所說的脊椎動物是人。
3.權利要求1的核酸分子，其中的核酸分子包含圖1中所示的序列，或者在正常嚴謹條件下可與圖1中所示序列的互補序列雜交的序列，前提是該核酸分子不是EST AA281296。
4.權利要求1的核酸分子，其中的核酸分子編碼圖1或11中所示的氨基酸序列或其變體。
5.一種分離的編碼圖11中所示的任何一個氨基酸序列的核酸分子，或者在正常嚴謹條件下可與編碼圖11所示氨基酸序列的互補序列雜交的核酸分子，前提是該核酸分子不是EST AA281296。
6.一種分離的含有圖10中所示的任何一個序列的核酸分子，或者在正常嚴謹條件下可與圖10所示序列的互補序列雜交的核酸分子。
7.一種寡核苷酸，它含有圖1中所示序列的10至100個連續(xù)核苷酸或其互補序列。
8.一種寡核苷酸，它含有圖10中所示序列的10至100個連續(xù)核苷酸或其互補序列。
9.權利要求7或8的寡核苷酸，其中的寡核苷酸被標記。
10.權利要求9的寡核苷酸，其中的標記是一種放射性標記、化學發(fā)光標記或生物素標記。
11.一種表達載體，它含有一個與權利要求1-6的任一核酸分子有效連接的異源啟動子。
12.權利要求11的表達載體，其中的載體選自細菌載體、逆轉錄病毒載體、腺病毒載體和酵母載體。
13.一種含有權利要求11或12的載體的宿主細胞。
14.權利要求13的宿主細胞，其中的細胞選自人細胞、猴子細胞、小鼠細胞、大鼠細胞、酵母細胞和細菌細胞。
15.權利要求13的宿主細胞，其中的細胞是人細胞。
16.一種分離的含有脊椎動物端粒酶蛋白質的蛋白質。
17.權利要求16的蛋白質，其中的脊椎動物是人。
18.權利要求16的蛋白質，其中的蛋白質含有圖1或11中所示的氨基酸序列或其變體。
19.脊椎動物端粒酶蛋白質的一部分。
20.權利要求19的部分蛋白質，其中該部分蛋白質的氨基酸序列示于圖1中。
21.權利要求19的部分蛋白質，其中該部分蛋白質的氨基酸序列示于圖11中。
22.權利要求19的部分蛋白質，其中該部分蛋白質為10至100個氨基酸長。
23.一種可與權利要求16或19的蛋白質特異結合的抗體。
24.一種可與由選自1區(qū)、α區(qū)、β區(qū)、2區(qū)和3區(qū)的序列編碼的多肽特異結合的抗體。
25.權利要求24的抗體，其中的抗體為單克隆抗體。
26.一種產生權利要求14的抗體的雜交瘤。
27.一種在正常嚴謹條件下能夠與編碼脊椎動物端粒酶特異性雜交的核酸探針，前提是該探針不與圖1中所示的1624-2012位核苷酸雜交。
28.權利要求27的探針，其中的探針為12至200個核苷酸長。
29.權利要求27的探針，其中的探針為20至50個核苷酸長。
30.權利要求17的探針，其中的核酸分子具有圖1中所示的序列或其互補序列。
31.權利要求17的探針，其中的核酸分子被標記。
32.一對能夠特異擴增編碼人端粒酶的核酸分子的全部或部分的寡核苷酸引物。
33.權利要求32的引物，其中的核酸分子含有圖1中所示的序列或其互補序列。
34.權利要求32的引物，其中的核酸分子含有圖11中所示的任何一個序列或其互補序列。
35.權利要求32的引物，其中的引物對能夠特異地擴增包括1區(qū)、α區(qū)、β區(qū)、2區(qū)、3區(qū)、X區(qū)或Y區(qū)的全部或部分的序列。
36.權利要求35的引物，其中的引物位于圖1中所示的222、1950、2131-2166、2287-2468、2843、或3157位核苷酸的側翼。
37.權利要求36的引物，其中引物對中只有一個引物位于圖1中所示的222、1950、2131-2166、2287-2468、2843、或3157位核苷酸的側翼，而引物對中的另一個引物具有相應于圖10中所示的序列之一的序列或其互補序列。
38.一對能夠特異擴增圖10中所示的基因組序列的寡核苷酸引物，其中的引物擴增至少1至38位核苷酸。
39.一種可與1區(qū)、α區(qū)、β區(qū)、2區(qū)、3區(qū)、X區(qū)或Y區(qū)的核酸序列特異雜交的寡核苷酸。
40.權利要求39的寡核苷酸，其中的寡核苷酸為15至36個堿基。
41.一種診斷患者癌癥的方法，包括制備腫瘤cDNA，利用特異擴增人端粒酶核酸序列的引物擴增腫瘤cDNA，其中端粒酶核酸序列的檢測是癌癥診斷的指征。
42.權利要求41的方法，進一步包括比較端粒酶序列與對照的擴增量，其中端粒酶核酸序列比對照量的增加是癌癥診斷的指征。
43.權利要求41的方法，其中的引物跨越1區(qū)、α區(qū)、β區(qū)、2區(qū)、3區(qū)、X區(qū)或Y區(qū)，其中擴增的模式是癌癥診斷的指征。
44.權利要求43的方法，其中的引物為Htel內含子T和Htel 723B。
45.權利要求44的方法，其中的引物為Htel335T和Htel1022B。
46.一種確定細胞中端粒酶RNA表達模式的方法，包括從分離自細胞中的mRNA制備cDNA，利用權利要求35的引物擴增cDNA，由此確定端粒酶RNA表達的模式。
47.權利要求46的方法，進一步包括通過與具有1區(qū)、α區(qū)、β區(qū)、2區(qū)、3區(qū)、X區(qū)或Y區(qū)序列的全部或部分的寡核苷酸雜交，檢測擴增產物。
48.一種診斷患者癌癥的方法，包括確定端粒酶RNA表達的模式，包括從由腫瘤RNA合成的cDNA擴增端粒酶，并通過與具有1區(qū)、α區(qū)、β區(qū)、2區(qū)、3區(qū)、X區(qū)或Y區(qū)序列的全部或部分的寡核苷酸雜交檢測擴增產物，由此確定端粒酶RNA表達的模式，其中表達模式是癌癥診斷的指征。
49.權利要求48的方法，進一步包括將表達模式與從對照癌癥所得的表達模式相比較。
50.一種非人類轉基因動物，其細胞中含有脊椎動物端粒酶基因，該基因與能夠使該基因表達的啟動子有效地連接。
51.權利要求50的動物，其中的動物是小鼠。
52.權利要求50的動物，其中的啟動子是組織特異性的。
53.權利要求50的動物，其中的端粒酶基因是圖11中所示的任何一個核酸序列。
54.一種小鼠，其細胞中具有通過與非功能性端粒酶基因進行同源重組而被破壞的內源性端粒酶基因，其中的小鼠不能表達內源性端粒酶。
55.一種脊椎動物端粒酶活性抑制劑，其中的抑制劑可與端粒酶結合但不是核苷類似物。
56.權利要求55的抑制劑，其中的脊椎動物是人。
57.權利要求55的抑制劑，其中的抑制劑是與人端粒酶mRNA互補的反義核酸。
58.權利要求57的抑制劑，其中的反義核酸與α區(qū)、β區(qū)、2區(qū)、3區(qū)、或X區(qū)互補。
59.權利要求55的抑制劑，其中的抑制劑是核酶。
60.一種治療癌癥的方法，包括給患者施用治療有效量的權利要求55的抑制劑。
61.一種核酸分子，其含有由選自圖10中所示的1區(qū)、α區(qū)、β區(qū)、2區(qū)或3區(qū)的序列構成的序列及其變體。
62.一種鑒定端粒酶活性效應物的方法，包括(a)向端粒酶蛋白質、RNA組分和模板混合物中加入候選效應物，其中的端粒酶蛋白質由分離的權利要求1的核酸分子編碼；(b)檢測端粒酶活性；和(c)比較步驟(b)的活性與沒有候選效應物的對照混合物的活性，由此鑒定效應物。
63.權利要求62的方法，其中的效應物是抑制劑。
64.權利要求62的方法，其中的核酸分子編碼人端粒酶。
全文摘要
本發(fā)明提供了編碼脊椎動物端粒酶的核酸分子。還提供了基因產物、表達載體和適于表達端粒酶的宿主細胞。公開了鑒定端粒酶活性抑制劑的方法和抑制劑組合物。
文檔編號C12N15/54GK1270634SQ98808383
公開日2000年10月18日 申請日期1998年7月1日 優(yōu)先權日1997年7月1日
發(fā)明者A·奇利安, D·鮑泰爾 申請人:卡姆比亞生物系統(tǒng)有限責任公司