專(zhuān)利名稱(chēng)：交感神經(jīng)系統(tǒng)功能的診斷方法和評(píng)價(jià)試劑盒的制作方法
背景技術(shù)：
(a)發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及交感神經(jīng)系統(tǒng)功能的診斷方法和評(píng)價(jià)試劑盒，這是基于通過(guò)光度測(cè)定從酪胺形成的酚乙醇胺來(lái)檢測(cè)多巴胺-β-羥化酶的比活性實(shí)現(xiàn)的。(b)在先技術(shù)的描述多巴胺-β-羥化酶[DBH3，4-二羥基苯乙胺，抗壞血酸根氧氧化還原酶(β-羥基化)EC 1.14.17.1]作為一混合的銅-依賴(lài)酶催化從多巴胺到去甲腎上腺素的羥基化，其在人與動(dòng)物血液中的存在是由其在含有兒茶酚胺的小泡中的定位引起的，小泡位于中樞與交感神經(jīng)系統(tǒng)中和腎上腺髓質(zhì)的嗜鉻顆粒中(Stewart LC等，Ann Rev Bioch，1988，57551-592)。
在人和大鼠中血清純化酶的性質(zhì)與特征已被很好描述(Ikeno T等，Mol Cell Biochem，1977，18(23)117-123)。血清DBH活性在生物化學(xué)上和免疫化學(xué)上都與其他組織中的相似，而不管所用的物種是什么。DBH解離二聚體形式的存在已被詳細(xì)描述為作為糖蛋白和銅-依賴(lài)酶的從純化的人胞漿或嗜鉻細(xì)胞瘤中來(lái)的酶。在對(duì)交感神經(jīng)系統(tǒng)的刺激中，DBH與去甲腎上腺素一起被釋放到血液中。DBH、去甲腎上腺素和腎上腺素的分泌也在免疫抑制過(guò)程中被抑制。多巴胺-腎上腺素途徑在神經(jīng)變性、神經(jīng)內(nèi)分泌、精神易感性和心血管疾病的情況下，和在燒傷、慢性疲勞和緊張的情形如恐慌綜合癥下受到影響。
在人血液中發(fā)現(xiàn)DBH導(dǎo)致一種提議，即血清活性可能提供人交感神經(jīng)系統(tǒng)功能的一個(gè)指示(Geffen LB，生命科學(xué)(Life Sci)，1974，14(9)1593-1604)。然而，并不存在診斷性測(cè)定方法來(lái)直接確定DBH以作為評(píng)價(jià)交感神經(jīng)系統(tǒng)功能或下丘腦-垂體-腎上腺軸的工具。下丘腦-垂體-腎上腺軸在人體對(duì)付如感染、低血壓、免疫缺陷、手術(shù)、精神易感性和神經(jīng)變性紊亂的緊張情況下有著重要的作用。下丘腦-垂體二者是大腦的“外門(mén)”。下丘腦自己也受到大腦其他部分特別是mesolimbic系統(tǒng)的調(diào)節(jié)影響。下丘腦激素促皮質(zhì)素釋放激素和精氨酸后葉加壓素都是前垂體分泌促皮質(zhì)激素的重要刺激物。
當(dāng)前，臨床測(cè)定下丘腦-垂體-腎上腺-交感神經(jīng)(HPAS)軸和下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸都是基于刺激垂體釋放促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)或腎上腺釋放ACTH-依賴(lài)的類(lèi)固醇來(lái)評(píng)價(jià)可疑的腎上腺機(jī)能減退。基本上，迄今尚沒(méi)有可用的檢測(cè)來(lái)評(píng)價(jià)HPA軸。最常應(yīng)用的檢測(cè)HPA軸的檢驗(yàn)都是侵害性的，并應(yīng)用短期ACTH注射實(shí)驗(yàn)(SAT)、胰島素低血糖實(shí)驗(yàn)(IHT)、短期甲基雙吡啶丙酮實(shí)驗(yàn)(SMT)和釋放腎上腺皮質(zhì)激素激素(CRH)實(shí)驗(yàn)。當(dāng)今，在臨床實(shí)踐中的這些實(shí)驗(yàn)的可靠性在正?；颊呋蛟谂懦怂性谄べ|(zhì)素和去甲腎上腺素與腎上腺素(包含在其自身的所有HPA和HPAS軸中的)之間的關(guān)系的患者中的血漿ACTH和皮質(zhì)醇之間的劑量-反應(yīng)關(guān)系方面仍有疑問(wèn)。臨床常用的測(cè)定HPA軸的方法有不少缺點(diǎn)，例如缺乏與間接檢測(cè)方法相關(guān)的敏感性、花費(fèi)高、費(fèi)時(shí)、循環(huán)抗體、不能敏感地測(cè)到中等程度的次級(jí)腎上腺機(jī)能減退、不適合于腎上腺萎縮。還不存在臨床上可靠的實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)涉及多巴胺-腎上腺素途徑的酶活性。
這些先前在特別臨床情形下應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)的可靠性在以下幾個(gè)方面受到懷疑，例如劑量-反應(yīng)關(guān)系、對(duì)任何形式的腎上腺機(jī)能不全的特異性，如敏感性、并發(fā)癥和副作用等。直到最近，臨床兒茶酚胺神經(jīng)化學(xué)主要用來(lái)檢測(cè)作為效應(yīng)化合物的兒茶酚胺的釋放，以指示外周神經(jīng)系統(tǒng)的活性。但是基于兒茶酚胺表型改變臨床顯著性理解的新進(jìn)展，如在本發(fā)明中描述的血清DBH比活性，將要被更多地需求以給診斷、治療和神經(jīng)遺傳疾病的病生理提供可能重要的線索。在此方面，有必要開(kāi)發(fā)出臨床工具，它是基于蛋白參與在兒茶酚胺和所有相關(guān)物以及它們的動(dòng)態(tài)平衡或生化平衡涉及的所有相關(guān)代謝化合物的合成、貯存、釋放、代謝和循環(huán)中。
將特別希望能提供診斷交感神經(jīng)系統(tǒng)功能的臨床工具。
將特別希望能提供診斷神經(jīng)變性、神經(jīng)內(nèi)分泌、精神易感性和心血管疾病、燒傷、慢性疲勞和恐慌綜合癥的臨床工具。發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供診斷交感神經(jīng)系統(tǒng)功能和緊張的臨床工具。
本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供診斷神經(jīng)變性、神經(jīng)內(nèi)分泌、精神易感性和心血管疾病、燒傷、慢性疲勞和恐慌綜合癥的臨床工具。
依據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，它提供了一種基于通過(guò)分光光度檢測(cè)從酪胺形成的酚乙醇胺來(lái)檢測(cè)多巴胺-β-羥化酶比活性以評(píng)價(jià)交感神經(jīng)系統(tǒng)功能的診斷方法。
依據(jù)本發(fā)明，“患者”包括但不限于人和動(dòng)物如家養(yǎng)與群牧動(dòng)物。
依據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，它提供了一種從血清樣品中通過(guò)檢測(cè)多巴胺-β-羥化酶比活性來(lái)評(píng)價(jià)患者交感神經(jīng)系統(tǒng)功能的體外診斷方法。它包括以下步驟a)過(guò)濾血清樣品以基本除去藥物和多巴胺-β-羥化酶的內(nèi)源抑制劑；
b)把由步驟a)得到的過(guò)濾樣品和多巴胺-β-羥化酶底物溫育，以轉(zhuǎn)化為可檢測(cè)化合物；c)測(cè)定可檢測(cè)化合物的量以評(píng)價(jià)多巴胺-β-羥化酶活性并與正常樣品比較；其中，比正常值低則指示交感神經(jīng)系統(tǒng)功能降低，比正常值高則指示交感神經(jīng)系統(tǒng)功能升高。
依據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例，它提供了一種從血清樣品中通過(guò)檢測(cè)多巴胺-β-羥化酶比活性來(lái)評(píng)價(jià)患者交感神經(jīng)系統(tǒng)功能的體外診斷方法。它包括以下步驟a)在含有干粉酚乙醇胺的小瓶中，過(guò)濾血清樣品以基本除去藥物和多巴胺-β-羥化酶的內(nèi)源抑制劑，得到樣品溶液；b)將樣品溶液和多巴胺-β-羥化酶底物溫育，以轉(zhuǎn)化為可檢測(cè)化合物；c)通過(guò)帶正電荷樹(shù)脂測(cè)定可檢測(cè)化合物的量以評(píng)價(jià)多巴胺-β-羥化酶活性并與正常樣品比較；其中，比正常值低則指示交感神經(jīng)系統(tǒng)功能降低，比正常值高則指示交感神經(jīng)系統(tǒng)功能升高。
優(yōu)選地，小瓶有開(kāi)口，含有可移動(dòng)濾網(wǎng)，濾網(wǎng)緊緊地放在與酚乙醇胺干粉相隔一段距離的地方。更優(yōu)選地，濾網(wǎng)放在小瓶的上邊沿或在上邊沿與酚乙醇胺溶液之間的地方。優(yōu)選地，濾網(wǎng)的孔徑為100μ。
依據(jù)本發(fā)明的方法，底物優(yōu)選為酪胺，可檢測(cè)化合物優(yōu)選為酚乙醇胺衍生物。更優(yōu)選地，底物也包括用來(lái)結(jié)合酚乙醇胺衍生物的正電樹(shù)脂，以節(jié)省操作和時(shí)間。
方法進(jìn)一步優(yōu)選地包括在b)和c)之間的一個(gè)步驟，該步驟為將過(guò)氧化氫酶加入以降解過(guò)氧化物，它可以抑制酶活或多巴胺-β-羥化酶的酶活。
優(yōu)選地，通過(guò)在溫育培養(yǎng)基中進(jìn)一步加入NaIO4并用分光光度檢測(cè)對(duì)羥基苯甲醛來(lái)測(cè)定酚乙醇胺衍生物的量。
依據(jù)本發(fā)明的方法，交感神經(jīng)系統(tǒng)功能降低就指示著神經(jīng)變性、神經(jīng)內(nèi)分泌、精神易感性和心血管疾病、燒傷、慢性疲勞和恐慌綜合癥。
依據(jù)本發(fā)明的方法，交感神經(jīng)系統(tǒng)功能升高就指示著緊張的效果。
更精確地，以下的病理與交感神經(jīng)系統(tǒng)功能降低有關(guān)·精神分裂癥；·精神易感性紊亂；·月經(jīng)性偏頭痛；·低血壓；·心力衰竭；和·心肌梗死更精確地，以下的病理與交感神經(jīng)系統(tǒng)功能升高有關(guān)·急性腦血管；·由饑餓、食物限制、工作壓力或寒冷帶來(lái)的緊張；·高血壓；·交感性活性過(guò)高。
依據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例，它提供了體外測(cè)定多巴胺-β-羥化酶比活性的試劑盒，該試劑盒包括下列組分a)含有酚乙醇胺溶液的小瓶，有緊緊地安放在離溶液有一段距離的可移動(dòng)的濾網(wǎng)；b)為轉(zhuǎn)化為可檢測(cè)化合物的多巴胺-β-羥化酶底物；和
c)過(guò)氧化氫酶溶液。
優(yōu)選地，組分a)也包括醋酸鈉緩沖液和N-乙基馬來(lái)酰亞胺。優(yōu)選地，組分b)含有酪胺和抗壞血酸根。更優(yōu)選地，組分b)也包括富馬酸根二鈉和鹽酸帕吉林。附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1表示在人血清中DBH比活性對(duì)pH的依賴(lài)；圖2表示酶濃度對(duì)人DBH比活性的作用；圖3表示酪胺濃度對(duì)人血清中DBH比活性的作用；圖4表示抗壞血酸根濃度對(duì)人血清中DBH比活性的作用；圖5表示N-乙基馬來(lái)酰亞胺(NEM)濃度對(duì)人血清中DBH比活性的作用；圖6表示銅濃度對(duì)人血清中DBH比活性的作用。每個(gè)方塊代表對(duì)25個(gè)患者至少六次測(cè)定；圖7表示在EDTA-處理的人血液中測(cè)定的DBH活性的生化特性和動(dòng)力學(xué)參數(shù)；圖8表示在針對(duì)不同年齡組的224名正常健康受驗(yàn)者中測(cè)定的血清DBH酶活性的分布(％)；和圖9表示依據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的小瓶，該小瓶具有一個(gè)緊緊地放在離溶液有一段距離的可移動(dòng)濾網(wǎng)。發(fā)明的詳細(xì)描述多巴胺-β-羥化酶活性的生化特性和動(dòng)力學(xué)參數(shù)在未純化的正常人血清中已被測(cè)定。酶活性1)抗壞血酸根-依賴(lài)性被外源10mM抗壞血酸根飽和；2)獨(dú)立于加入的外源銅，當(dāng)濃度高于4μM時(shí)，導(dǎo)致顯著性地降低；3)被20mM酪胺飽和；4)在少到1到20μL血清中測(cè)定；5)發(fā)現(xiàn)對(duì)抗壞血酸根的親合力大于對(duì)酪胺的親合力其Km值是比酪胺的低10倍；6)在溫育培養(yǎng)基中被15mM N-乙基馬來(lái)酰亞胺顯著增強(qiáng)；7)在年齡為15到85歲的男女受驗(yàn)者之間分布相似，沒(méi)有顯著的性別和年齡差異。
本發(fā)明的診斷試劑盒快速、敏感、簡(jiǎn)單和可重復(fù)生產(chǎn)，其臨床值的分布范圍比文獻(xiàn)中報(bào)道的要窄，這是因?yàn)檠罕贿^(guò)濾以避免抑制劑和藥物的相互作用，因而預(yù)示本技術(shù)在臨床調(diào)查中是一有用工具。并且，本發(fā)明的試劑盒可用少量血液樣品進(jìn)行定量的DBH比活性測(cè)定，而沒(méi)有由患者通常服用的藥物如β-阻斷劑、鈣離子阻斷劑等的干擾。材料酚乙醇胺、L-酪胺、抗壞血酸、富馬酸根二鈉、鹽酸帕吉林、高碘酸-m-鈉、N-乙基馬來(lái)酰亞胺(NEM)和牛血清白蛋白從SigmaCo.(St-Louis，Mo，U.S.A.)購(gòu)得。亞硫酸氫鈉和亞硫酸鈉從FisherScientific(Ste-Foy，Quebec)購(gòu)得，牛肝臟過(guò)氧化氫酶從BDH(Ville St-Laurent，Quebec)購(gòu)得，DOWEXTM50×4-400從Aldrich ChemicalsCo.(Milwaukee，WI)購(gòu)得，DIAFLOTM超濾膜，YM100型從AmiconCanada Ltd(Oakville，Ontario)購(gòu)得，它可被安裝到如圖9所示的小瓶上。實(shí)驗(yàn)過(guò)程從224名顯然健康沒(méi)有特別疾病、酗酒和藥物濫用歷史的男性(78)和女性(146)受驗(yàn)者中得到血清樣品。在8點(diǎn)到10點(diǎn)間采集他們的血清樣品用于通常的常規(guī)臨床血液評(píng)價(jià)。所有血液樣品都通過(guò)在左臂靜脈穿刺得到，然后放置到冰上并在10000克、4℃下離心10分鐘。移去血清并貯存在-80℃下，直到進(jìn)行多巴胺-β-羥化酶(DBH)的活性的測(cè)定。酶的制備在25名隨機(jī)分布的男性和女性受驗(yàn)者組中測(cè)定動(dòng)力學(xué)參數(shù)和生化特性。在預(yù)溫育之前，取合適的血清量作為酶源，在去離子的冰冷的水中稀釋到終體積400μL。為測(cè)定單個(gè)DBH酶活性，通常用20μL人血清。對(duì)于超過(guò)濾方法，把血清樣品通過(guò)YM100型DIAFLOTM超濾膜，用40μL超濾液來(lái)測(cè)定酶活(圖9)。酶測(cè)定用Roberge和Charbonneau(Roberge AG等，Nutr Res，1985，557-63)描述的方法測(cè)定DBH的比活性。預(yù)溫育混合物含有0.2M醋酸鈉緩沖液(pH5)、15mM N-乙基馬來(lái)酰亞胺(NEM)和酶源(來(lái)自血清樣品)，在25℃空氣的代謝搖床(Dubnoff)中溫育10分鐘。在預(yù)溫育酶源中加入如下物質(zhì)至終體積1mL10mM富馬酸、10M抗壞血酸，2500單位過(guò)氧化氫酶和作為單氨氧化酶抑制劑的1mM帕吉林。以同樣的方式建立空白和內(nèi)標(biāo)，但用20mM酚乙醇胺代替酶源。溫育開(kāi)始，用20mM酪胺，在37℃空氣的代謝搖床(Dubnoff)中溫育30分鐘。在冰上，在每個(gè)試管中加入300μL 3M三氯乙酸以終止反應(yīng)，然后立即在4℃、2500克下離心10分鐘。把上清液移注到DOWEXTM50×4-400樹(shù)脂柱上，該酸用3M NH4OH洗脫。形成的酚乙醇胺用高碘酸鹽分解轉(zhuǎn)化為對(duì)羥基苯甲醛，該對(duì)羥基苯甲醛用醚和氨水進(jìn)行連續(xù)的溶劑抽提而分離出來(lái)。最后的水相用雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)(333-360nm)測(cè)量。比活性用每毫升每分鐘形成的納摩爾(nmol)酚乙醇胺表示。加到空白溫育混合物中的酚乙醇胺的回收率為90±2％。L-酪胺被用作底物，等分的未被純化的血清作為酶源，通常為20μL。酶動(dòng)力學(xué)表觀米氏常數(shù)(Km)和表觀最大速度(Vmax)用Woolf圖表法和通常的Lineweaver和Burk方法測(cè)定。依據(jù)Wilkinson的方法來(lái)做與酶動(dòng)力學(xué)相關(guān)的統(tǒng)計(jì)學(xué)估計(jì)。蛋白質(zhì)測(cè)定用牛血清白蛋白做標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定蛋白濃度。統(tǒng)計(jì)分析通過(guò)Duncan實(shí)驗(yàn)計(jì)算平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差、平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)、Chi方檢驗(yàn)、配對(duì)-t-檢驗(yàn)和單向ANOVA。當(dāng)p＜0.05時(shí)認(rèn)為平均值之間的差別是顯著的。本方法偏差的內(nèi)部-測(cè)定系數(shù)(intra-assaycoefficient of variation)小于1％。在4個(gè)月的時(shí)間內(nèi)對(duì)于相同的受驗(yàn)者，數(shù)據(jù)的重復(fù)性是高度相關(guān)的(p＜0.01)。結(jié)果從10個(gè)不同的貯藏血清中得到的蛋白濃度是72±8mg/mL，通過(guò)超過(guò)濾得到的為16.5±2mg/mL。保留這些數(shù)據(jù)以估計(jì)用每毫克蛋白形成的酚乙醇胺納摩爾數(shù)來(lái)表示的酶活性。對(duì)pH的依賴(lài)性在圖1中，用濃度恒定的抗壞血酸根(10mM)和酪胺(20mM)得到的從4到8的pH范圍確定人血清中DBH的比活性。每個(gè)方塊代表對(duì)25個(gè)受驗(yàn)者的血清樣品至少六次的測(cè)定。結(jié)果用每毫升每分鐘形成的酚乙醇胺nmol數(shù)表示(平均值±SEM)。在pH為4.8和5.0附近酶活達(dá)到最大活性(p＜0.05)，而在pH大于5.2時(shí)有持續(xù)的和顯著的降低(p＜0.01；p＜0.001)。在pH為5時(shí)，酶比活性(平均值±SEM)為每毫升每分鐘形成55.5±5nmol酚乙醇胺。此pH被選擇用來(lái)做進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。溫育時(shí)間實(shí)驗(yàn)溫育時(shí)間直到60分鐘的長(zhǎng)度，溫育在pH5下進(jìn)行。溫育混合物含有在以上部分中描述的所有組分。當(dāng)結(jié)果用每毫升血清形成的酚乙醇胺nmol數(shù)表達(dá)時(shí)，在至少60分鐘內(nèi)，DBH比活性與溫育時(shí)間是成比例的。為所有實(shí)驗(yàn)選擇的溫育時(shí)間為在37℃下30分鐘。
分別在25℃和37℃下實(shí)驗(yàn)預(yù)溫育的時(shí)間。因?yàn)闆](méi)有觀察到被測(cè)定的酶活性有顯著的差異，為預(yù)溫育時(shí)間選擇的溫度為25℃。酶濃度把不同體積的正常人血清1-200μL在400μL冰冷的水中稀釋以測(cè)量DBH酶比活性。在圖2中顯示，應(yīng)用的血清在50μL之內(nèi)酶活是線性的，窗口顯示血清為少到1-20μL時(shí)測(cè)定的酶活。每個(gè)方塊代表對(duì)25個(gè)受驗(yàn)者的血清樣品的至少六次的測(cè)定。結(jié)果用每30分鐘形成的酚乙醇胺nmol數(shù)表示(平均值±SEM)。對(duì)于一個(gè)線性反應(yīng)，血清對(duì)冰水的稀釋比例的變化幅度為1∶400到1∶8。圖上每個(gè)點(diǎn)代表對(duì)正常血清至少六次的測(cè)定。結(jié)果用每30分鐘形成的酚乙醇胺nmol數(shù)表示(平均值±SEM)。
把大體積血清(從50到100μL)稀釋到400μL冰冷的水中所做的實(shí)驗(yàn)顯示，在溫育培養(yǎng)基中NEM從15增加到30mM時(shí)，仍能維持線性反應(yīng)。在100到200μL血清之間，無(wú)論培養(yǎng)基中NEM為多少，反應(yīng)都不是線性的。在任何時(shí)間，在培養(yǎng)基中加入銅都能恢復(fù)反應(yīng)的線性或促進(jìn)酶活。所有進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)都如上述通過(guò)把20μL血清稀釋到400μL冰冷的水中以在終體積為1毫升的溫育混合物中得到1∶20的比率。酪胺濃度在圖3中顯示當(dāng)抗壞血酸根恒定為10mM時(shí)，酪胺的濃度高達(dá)30mM時(shí)表現(xiàn)出的對(duì)DBH酶比活性的影響。每個(gè)方塊代表對(duì)25個(gè)受驗(yàn)者至少六次的測(cè)定。結(jié)果用每毫升每分鐘形成的酚乙醇胺nmol數(shù)表示(平均值±SEM)。在人血清中DBH對(duì)酪胺的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，作為底物，依據(jù)Woolf圖表法從各點(diǎn)的的底物濃度計(jì)算Km和Vmax值。
在酚乙醇胺的形成中，顯示與應(yīng)用的酪胺量(高達(dá)15mM)相關(guān)的持續(xù)升高，之后是一個(gè)平臺(tái)(p＜0.05)。圖中的每個(gè)點(diǎn)代表對(duì)正常血清至少六次的測(cè)定。結(jié)果用每毫升每分鐘形成的酚乙醇胺nmol數(shù)表示(平均值±SEM)。在酪胺20mM下觀察到的飽和點(diǎn)在所有進(jìn)一步應(yīng)用20μL血清作為酶源的反應(yīng)中都得到保持。對(duì)抗壞血酸根的依賴(lài)性在圖4中，顯示當(dāng)酪胺在溫育混合物中恒定為20mM時(shí)，抗壞血酸根濃度(0到30mM)的作用。酶活被高達(dá)10mM的抗壞血酸根所促進(jìn)(p＜0.01)，接著是一個(gè)平臺(tái)(p＜0.05；p＜0.01)。每個(gè)方塊代表對(duì)25個(gè)受驗(yàn)者至少六次的測(cè)定。結(jié)果用每毫升每分鐘形成的酚乙醇胺nmol數(shù)表示(平均值±SEM)。在人血清中DBH對(duì)抗壞血酸根的動(dòng)力學(xué)參數(shù)作為輔助因子。依據(jù)Woolf圖表法從各點(diǎn)的抗壞血酸根濃度計(jì)算Km和Vmax值。在10mM抗壞血酸根下得到的飽和點(diǎn)在所有進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中都得到保持。表I顯示在去掉通常在溫育培養(yǎng)基中含有的不同組分時(shí)測(cè)定的酶活，表明在培養(yǎng)基中沒(méi)有抗壞血酸根就會(huì)導(dǎo)致酶活的顯著降低(96％，p＜0.001)。
表I 血清多巴胺-β-羥化酶活性輔助因子的作用去掉的因子＝活性++％對(duì)照無(wú)(對(duì)照) 53.7±0.18 100抗壞血酸根 2.2±0.194過(guò)氧化氫酶 5.6±0.4510富馬酸根 47.5±1.00 88N-乙基馬來(lái)酰亞胺(NEM)35.6±0.39 66NEM和富馬酸根36.2±0.79 67＝在方法部分描述的在通常情況下(對(duì)照)和在反應(yīng)混合物中某些組分缺失的情況下，25個(gè)正常人血清被用來(lái)測(cè)量DBH酶活。
++結(jié)果用37℃下每分鐘每毫升形成的酚乙醇胺nmol數(shù)表示，每個(gè)結(jié)果都是至少10個(gè)測(cè)量的平均值±SEM。過(guò)氧化氫酶濃度用不同過(guò)氧化氫酶濃度來(lái)獲得最大酶活性。在溫育培養(yǎng)基中過(guò)氧化氫酶到達(dá)2000單位之前，觀察到酶活的持續(xù)增加(p＜0.01)，然后是一個(gè)平臺(tái)直到4000單位。在表I中，溫育培養(yǎng)基中過(guò)氧化氫酶的缺失使酶活降低到10％(p＜0.001)。在所有進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中過(guò)氧化氫酶都是2500單位。富馬酸根濃度無(wú)論用任何濃度，直到40mM，在溫育培養(yǎng)基中加入富馬酸根都導(dǎo)致酶活輕微但卻顯著的增加(12％，p＜0.05；表I)。在溫育培養(yǎng)基中同時(shí)缺失富馬酸根和NEM能顯著地增加酶活達(dá)33％(p＜0.05，表I)。對(duì)于所有進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)，都保持10mM的富馬酸根。NEM濃度圖5描述了不同濃度的NEM(直到60mM)的作用。每個(gè)方塊代表對(duì)25個(gè)受驗(yàn)者至少六次的測(cè)定。結(jié)果用每毫升每分鐘形成的酚乙醇胺nmol數(shù)表示(平均值±SEM)。NEM的存在，直到15mM，都能顯著增加酶活(p＜0.01)，然后是一個(gè)平臺(tái)直到60mM。表I顯示，溫育培養(yǎng)基中缺失NEM能使酶活顯著降低36％(p＜0.01)。在所有進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的溫育培養(yǎng)基中都有15mM的NEM。外源銅與NEM的相互作用在溫育培養(yǎng)基中有、無(wú)15mM NEM的情況下，分別描述不同銅濃度，從0到20μL，對(duì)DBH酶比活性的作用(圖6)。結(jié)果用每毫升每分鐘形成的酚乙醇胺nmol數(shù)表示(平均值±SEM)。
結(jié)果顯示，在培養(yǎng)基中沒(méi)有NEM的情況下(圖6，黑色方塊)，與有NEM的情況相比(圖6，白色方塊)，酶活有顯著降低(66％；p＜0.01)。當(dāng)培養(yǎng)基中有NEM時(shí)測(cè)量的酶活，在有直到2μM的外源銅濃度時(shí)和在銅不存在時(shí)并沒(méi)有顯著差別(圖6，白色方塊)。然而，當(dāng)外源銅含量高于2μM時(shí)則可觀察到酶活持續(xù)與顯著地降低(p＜0.05)，在20μM時(shí)觀察到最大量的下降(90％，p＜0.001)。
當(dāng)溫育培養(yǎng)基中沒(méi)有NEM時(shí)，與培養(yǎng)基中沒(méi)有銅時(shí)測(cè)得的數(shù)據(jù)相比，加入直到4μM的不同銅濃度并不能顯著地改變酶活(圖6，黑色方塊)。然而，當(dāng)外源銅含量高于4μM直到20μM時(shí)，則可觀察到酶活持續(xù)與顯著的降低(p＜0.001)。當(dāng)兩條曲線相比較時(shí)(圖6，白色與黑色方塊)，在外源銅濃度分別到2和4μM時(shí)，可觀察到酶活性的顯著差別(p＜0.001；p＜0.05)，但在更高銅濃度時(shí)卻沒(méi)有任何顯著差異。圖中每個(gè)點(diǎn)都代表對(duì)正常血清至少六次的測(cè)定。結(jié)果用每毫升每分鐘形成的酚乙醇胺nmol數(shù)表示(平均值±SEM)。在所有進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的溫育培養(yǎng)基中都有15mM的NEM但卻沒(méi)有銅。
用通過(guò)YM100型DIAFLOTM超濾膜的血清樣品研究培養(yǎng)基中銅與NEM的關(guān)系，測(cè)量超濾液中的酶活性。結(jié)果顯示酶活性并不被培養(yǎng)基中15mM NEM的存在而增強(qiáng)，在有和沒(méi)有NEM存在時(shí)的活性結(jié)果每毫克蛋白每小時(shí)形成的酚乙醇胺分別為52±0.7和50±0.6nmol。并且，在培養(yǎng)基中加入銅直到4μM時(shí)并不影響酶活性，但高濃度時(shí)卻導(dǎo)致活性降低，這與圖6中顯示的結(jié)果吻合。在培養(yǎng)基中有和沒(méi)有銅存在時(shí)，酶活性每毫克蛋白每小時(shí)形成的酚乙醇胺為51±0.56nmol。動(dòng)力學(xué)參數(shù)在圖3和圖4中，分別用Woolf圖表法計(jì)算動(dòng)力學(xué)參數(shù)，在溫育培養(yǎng)基中應(yīng)用不同濃度的酪胺(底物)和抗壞血酸根(輔助因子)。在人血清中，在pH5.0下，對(duì)酪胺的表觀米氏常數(shù)(Km)是8mM，表觀Vmax值是每毫升每分鐘形成酚乙醇胺72nmol(圖3)，在此計(jì)算的對(duì)抗壞血酸根的Km值為0.77mM，最大速度為每毫升每分鐘形成酚乙醇胺56nmol。銅螯合物在圖7中，用一種銅螯合劑EDTA處理人血液，測(cè)定DBH酶比活性，分別針對(duì)pH依賴(lài)性、加到溫育培養(yǎng)基中的銅濃度和動(dòng)力學(xué)參數(shù)。對(duì)pH的依賴(lài)性、銅濃度的作用和依據(jù)Lineweaver和Burk方法計(jì)算得出的Km和Vmax值都分別標(biāo)出。結(jié)果用每分鐘每毫升形成的酚乙醇胺nmol數(shù)表示(平均值±SEM)。
EDTA抑制被在培養(yǎng)基中加入的0到100μM外源銅持續(xù)地逆轉(zhuǎn)，隨后當(dāng)銅濃度高于140μM時(shí)有酶活性降低(圖7，白色方塊)。根據(jù)其pH依賴(lài)性，對(duì)于用EDTA處理的血液，觀察到最適酶活是在pH5.8而不是在pH5.0(圖7，黑色方塊)。在pH5.8處測(cè)量的對(duì)于底物酪胺的Km和Vmax值分別是2.4mM和38.5nmol每毫升每分鐘形成的酚乙醇胺(圖7)，與觀察到的正常人血清(圖3)對(duì)底物酪胺的值有顯著不同(p＜0.01)。在健康男性和女性受驗(yàn)者中的血清DBH圖8針對(duì)不同年齡組(在15和85之間)描述了在224個(gè)顯然健康的男女受驗(yàn)者中測(cè)量的人血清DBH酶活。結(jié)果用每分鐘每毫升形成的酚乙醇胺nmol數(shù)表示(平均值±SEM)。對(duì)于每一個(gè)年齡組，受驗(yàn)者數(shù)都在括號(hào)中標(biāo)出。依據(jù)用每分鐘每毫升形成的酚乙醇胺nmol數(shù)(平均值±SEM)表示的酶活(＜20；21-40；41-60；61-80；81-100；＞100)將受驗(yàn)者分組。
酶活通常在20μl血清中測(cè)定，方法如方法部分所述。每個(gè)樣品測(cè)三次，偏差的內(nèi)部-測(cè)定系數(shù)小于1％。在4個(gè)月的時(shí)間內(nèi)對(duì)于同一受驗(yàn)者測(cè)定的酶活高度相關(guān)(p＜0.01)。結(jié)果表明對(duì)于年齡組有同樣的分布，但在組內(nèi)卻沒(méi)有任何顯著性差異。
表II分別描述了在女性(146)和男性(78)受驗(yàn)者中對(duì)于不同年齡組血清DBH酶活性的臨床值(平均值±SEM；分布范圍)。對(duì)于整組來(lái)說(shuō)，觀察酶活對(duì)于性別與年齡的任何顯著性差異，數(shù)據(jù)顯示分布范圍的變化每毫升每分鐘形成的酚乙醇胺nmol數(shù)為從2到138。在男性和女性組中，觀察任何針對(duì)分布范圍的顯著差異。用來(lái)比較男性和女性受驗(yàn)者對(duì)于他們相關(guān)年齡組的所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析都顯示是不顯著的(p＜0.05)。
表II 不同年齡和性別的男女受驗(yàn)者的血清DBH活性臨床值*年齡組 女性 男性15-20歲 (35)44.6±2.0 (5)47.4±10.9范圍27-7611-7921-30歲 (20)53.4±6.0 (4)64.6±6.1范圍13-10852-8131-40歲 (23)51.0±5.6 (12)51.8±6.4范圍12-11121-8741-50歲 (22)60.7±5.1 (16)46.3±4.4范圍24-11316-7751-60歲 (21)61.9±7.1 (22)56.6±5.7范圍17-12215-11460-80歲 (26)65.9±8.6 (19)55.4±6.2范圍3-138 19-133*結(jié)果用每毫升每分鐘形成的酚乙醇胺nmol數(shù)(平均值±SEM)表示，分布范圍顯示在平均值之下。括號(hào)中代表的是應(yīng)用的受驗(yàn)者數(shù)。討論根據(jù)本發(fā)明，DBH酶活性的生化特點(diǎn)和動(dòng)力學(xué)參數(shù)是在未純化的正常人血清中測(cè)得的，血清DBH酶活的臨床值是從針對(duì)年齡與性別的一組顯然健康的男女受驗(yàn)者中測(cè)得的，因而能用來(lái)定義一個(gè)敏感的和可重復(fù)的臨床檢測(cè)方法。生化研究從人血清中測(cè)得的DBH酶活的生化特點(diǎn)和動(dòng)力學(xué)參數(shù)可使我們展示1)DBH活性所依賴(lài)的最適pH為5.0；2)對(duì)酪胺的飽和點(diǎn)為20mM；3)培養(yǎng)基中有或無(wú)NEM，酶都獨(dú)立于外源銅；4)培養(yǎng)基中有NEM能促進(jìn)酶活性和穩(wěn)定反應(yīng)；5)酶是抗壞血酸根依賴(lài)的；6)酶活可用少到1-20μl血清測(cè)定，直到血清為50μl反應(yīng)都呈線性；7)對(duì)酪胺和抗壞血酸根的動(dòng)力學(xué)參數(shù)不同，顯示對(duì)抗壞血酸根比對(duì)酪胺有更大親合性。這些結(jié)果為此提供了良好的證據(jù)，即用未純化的人血清作為酶源，在作為酶促反應(yīng)的外源輔助因子的抗壞血酸根和銅之間的關(guān)系是不同的，酶是抗壞血酸根-依賴(lài)的。并且，正如EDTA螯合反應(yīng)所顯示的，NEM在溫育培養(yǎng)基中的存在足能控制所有可溶的內(nèi)源巰基抑制因子，因而能保證結(jié)合在酶活性位點(diǎn)上的作為內(nèi)源輔助因子的銅在人血清中的角色。動(dòng)力學(xué)研究人血清多巴胺-β-羥化酶(DBH)的結(jié)構(gòu)和功能已被Frigon和Stone廣泛研究(Frigon RP等，J.Biol Chem，1978，253(19)6780-6786)，純酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)和生化特點(diǎn)也如此(Ikeno T等，Mol Cell Biochem，1977，18(23)117-123)。對(duì)于pH依賴(lài)和對(duì)酪胺的飽和點(diǎn)，本結(jié)果與先前在人血清、大鼠血清、貓和大鼠腎上腺中(Fortin D等，Comp Biochem Physiol，1993，104B(3)567-575)和在牛嗜鉻顆粒中(Stewart LC等，Ann RevBioch，1988，57551-592)觀察到的數(shù)據(jù)是相當(dāng)一致的。根據(jù)抗壞血酸根濃度，其Km值比酪胺濃度低10倍，因而提示酶對(duì)作為輔助因子的抗壞血酸根在人血清中有更高的親合力(Ikeno T等，Mol Cell Biochem，1977，18(23)117-123；Frigon RP等，J.Biol Chem，1978，253(19)6780-6786)，在貓和大鼠腎上腺中(Fortin D等，Comp Biochem Physiol，1993，104B(3)567-575)和牛腎上腺髓質(zhì)中(Stewart LC等，Ann RevBioch，1988，57551-592)也被觀察到。并且，對(duì)酪胺和抗壞血酸根的Vmax值是處于同一數(shù)量級(jí)的，與報(bào)道的人血清活性相似但卻比報(bào)道的在其他物種血清中的值要顯著地高(Geffen LB，Life Sci，1974，14(9)1593-1604)。根據(jù)本結(jié)果，顯然可以指出，觀察到的DBH酶對(duì)抗壞血酸根的動(dòng)力學(xué)參數(shù)不能被歸因于銅的不足，因?yàn)橥庠淬~并不能激起酶活性，不管使用的濃度是多少和培養(yǎng)基中是否有NEM。對(duì)外源抗壞血酸根的依賴(lài)性本研究顯示在溫育培養(yǎng)基中缺失抗壞血酸根使酶活在人血清中只為文獻(xiàn)報(bào)道的和在其他不同組織中的4％(Fortin D等，Comp BiochemPhysiol，1993，00(0)305-491)。并且，對(duì)于過(guò)氧化氫酶的存在來(lái)說(shuō)，必須存在酶-抗壞血酸根復(fù)合物以阻止過(guò)氧化物在培養(yǎng)基中的形成(Frigon RP等，J.Biol Chem，1978，253(19)6780-6786)與維持最適酶活性。在牛腎上腺中，有報(bào)道說(shuō)外源抗壞血酸根能在羥基化的環(huán)境中阻止內(nèi)在還原的抗壞血酸根的缺失，因而提示在DBH活性水平上抗壞血酸根的調(diào)節(jié)角色(Menniti F等，J Biol Chem，1986，261(36)16901-16908)。先前的發(fā)現(xiàn)也顯示富馬酸根可作為一調(diào)節(jié)因素，且與富馬酸根無(wú)關(guān)的陰離子結(jié)構(gòu)如醋酸與氯化物能作為對(duì)DBH酶的重要生理角色。在此方面，本研究表明富馬酸根輕微但卻顯著地增加了酶活性，這因而與研究陰離子在反應(yīng)中的生理角色的文獻(xiàn)是一致的，并強(qiáng)調(diào)在所有溫育培養(yǎng)基中都已存在的陰離子如氯化物能與富馬酸根一起促進(jìn)酶的活性。在NEM和銅之間的聯(lián)系在人血清中DBH酶抑制劑的自然存在導(dǎo)致系統(tǒng)地添加一種巰基反應(yīng)試劑NEM到溫育培養(yǎng)基中(Geffen LB，Life Sci，1974，14(9)1593-1604)，在其他幾個(gè)組織中也是一樣。依據(jù)本數(shù)據(jù)，巰基化合物不與底物酪胺或輔助因子抗壞血酸根競(jìng)爭(zhēng)，但卻通過(guò)與可能是調(diào)節(jié)酶活性的蛋白-結(jié)合銅的配基的半胱氨酸基團(tuán)競(jìng)爭(zhēng)來(lái)抑制酶活性。在這方面，在溫育培養(yǎng)基中有效的NEM濃度是相對(duì)高的(15mM)，因而顯示配基并不參與化學(xué)修飾。并且，在人血清中觀察到的本數(shù)據(jù)與下列通常說(shuō)法是相當(dāng)一致的，即內(nèi)源銅微弱地結(jié)合在酶活性位點(diǎn)上，在純化過(guò)程中發(fā)生改變、丟失與被螯合劑除去，因而有必要加入外源銅。在此方面，用EDTA處理的血液作為酶源所作的實(shí)驗(yàn)清楚地表明銅在酶位點(diǎn)上的活躍角色，因?yàn)楫?dāng)在培養(yǎng)基中有過(guò)量銅(100μM)時(shí)才能觀察到逆轉(zhuǎn)的抑制，這因而暗示EDTA在螯合結(jié)合酶位點(diǎn)的內(nèi)源銅時(shí)，已誘發(fā)了一種只有外源銅才可抵抗的可逆機(jī)制。這些結(jié)果激起了興趣，因?yàn)楫?dāng)用純化的或半純化的酶源時(shí)，加外源銅到培養(yǎng)基中對(duì)于恢復(fù)由純化步驟導(dǎo)致的丟失是必需的(Ikeno T等，Mol Cell Biochem，1977，18(23)117-123；Frigon RP等，J.Biol Chem，1978，253(19)6780-6786)，并因而常常這樣做。并且，為研究在培養(yǎng)基中的外源銅和NEM之間的反應(yīng)和藥物間的反應(yīng)，用超濾方法去除酶源中分子量小于100,000的可溶分子，揭示出外源銅并不刺激去除其可溶性抑制劑的酶活，如在正常人血清中觀察到的那樣，這強(qiáng)調(diào)了它通過(guò)酶活性位點(diǎn)的作用，消除了在生理?xiàng)l件下對(duì)外源添加的需求。穩(wěn)定劑NEM在作為酶源的未純化的人血清的酶反應(yīng)中的NEM與銅的關(guān)系很少被研究。從臨床觀點(diǎn)來(lái)看，本工作與以前在人血清中得到的數(shù)據(jù)是一致的，這些數(shù)據(jù)表明反應(yīng)的真正最大速度是在培養(yǎng)基中沒(méi)有銅的情況下得到的，但這些觀察分別不適用于大鼠和豚鼠血清，因而分離了酶活性與物種之間的關(guān)系。文獻(xiàn)中DBH酶活性臨床值的差別與不同的因素相聯(lián)系，如應(yīng)用的血清體積、培養(yǎng)基中的NEM濃度、培養(yǎng)基中有無(wú)外源銅。這些因素導(dǎo)致臨床數(shù)據(jù)的差異和它們的重復(fù)性。在這方面，在沒(méi)有酶的可溶性?xún)?nèi)源抑制劑時(shí)用來(lái)測(cè)定酶活性的超濾方法使NEM對(duì)酶活性的活化作用無(wú)效，因此強(qiáng)調(diào)了它對(duì)正常人血清中存在的可溶性巰基化合物的重要作用。在NEM和在用冰水稀釋步驟之前應(yīng)用的人血清體積之間的關(guān)系被認(rèn)為對(duì)于數(shù)據(jù)的重復(fù)性和方法的再現(xiàn)性都是重要的。并且，如果用多于50μL的血清來(lái)測(cè)量DBH酶活性，就不得不針對(duì)培養(yǎng)基中的NEM量或新的最適動(dòng)力學(xué)條件對(duì)反應(yīng)的線性做再定義。可以顯明地指出，血清的冰水稀釋步驟的比例應(yīng)至少為1∶8，以考慮反應(yīng)的線性和已經(jīng)描述的動(dòng)力學(xué)參數(shù)和生化特點(diǎn)。在這些最適條件下，對(duì)人血清來(lái)說(shuō)，本方法用少至1-20μL的人血清就可清楚地顯示Vmax值比文獻(xiàn)中報(bào)道的要高出至少20％。臨床研究本研究表明在224個(gè)顯然健康的男女受驗(yàn)者中測(cè)量的血清DBH酶活性是1)在男性與女性組中有相似的分布，呈狹窄的分布；2)對(duì)于年齡與性別沒(méi)有顯著差異；3)在任何年齡組都沒(méi)有男性與女性間的顯著差異；4)對(duì)于單個(gè)受驗(yàn)者來(lái)講，數(shù)據(jù)的重復(fù)性是高度相關(guān)的。健康的男性和女性受驗(yàn)者開(kāi)展本臨床工作是為了把人血清DBH酶活性定義為一種診斷調(diào)查的臨床工具，這是基于特別的和有價(jià)值的生化研究和統(tǒng)計(jì)學(xué)可重復(fù)的臨床數(shù)據(jù)的文獻(xiàn)中的建議(Geffen LB，Life Sci，1974，14(9)1593-1604；Ogihara T等，J Lab Clin Med，1975，85(4)566-575)。已經(jīng)做了幾個(gè)臨床實(shí)驗(yàn)以闡明酶在不同生理狀態(tài)下的機(jī)制，并調(diào)查它在不同病理狀態(tài)下的活性。然而，多數(shù)這些臨床調(diào)查都不得不做得很廣泛以便能得出結(jié)論和避免臨床值的偏差，這些差別與不同的測(cè)定方法(LaduronP，Biochem Pharmacol，1975，24(5)557-562)、持續(xù)時(shí)間、取樣程序、受驗(yàn)者的選擇、受驗(yàn)者內(nèi)和受驗(yàn)者間的DBH活性差異相關(guān)，其中受驗(yàn)者的差異是由于缺乏有價(jià)值的動(dòng)力學(xué)研究而導(dǎo)致要對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行廣泛解釋而造成的(Geffen LB，Life Sci，1974，14(9)1593-1604；Ogihara T等，JLab Clin Med，1975，85(4)566-575)。
對(duì)顯然健康的受驗(yàn)者的人血清DBH酶活性的測(cè)量與已經(jīng)公布的調(diào)查的測(cè)量是相似的，用未純化的血清作為酶源、在培養(yǎng)基中消除外源銅、在飽和點(diǎn)加入NEM和酪胺。預(yù)溫育步驟與文獻(xiàn)中報(bào)道的相比可增強(qiáng)20％的酶比活性。其次，本臨床實(shí)驗(yàn)值比那些公布的在培養(yǎng)基中有過(guò)量銅、用處理過(guò)的胞漿或大體積血清(100μL和更多)的數(shù)據(jù)顯著地高。在此方面，值得提起的是，用偶聯(lián)酶苯基-N-甲基-轉(zhuǎn)移酶(PNMT)方法測(cè)定人DBH酶活性以評(píng)價(jià)形成的腎上腺素得到了不同的結(jié)果。事實(shí)上，此方法涉及兩個(gè)不同的動(dòng)力學(xué)測(cè)量，它們?cè)谙嗤瑮l件下沒(méi)有必要都是最適的，因?yàn)檫@些原因，偶聯(lián)酶方法就受到嚴(yán)重地懷疑。
本臨床實(shí)驗(yàn)值顯示DBH酶活性在男性與女性受驗(yàn)者間是相似的，在不同年齡組之間也沒(méi)有顯著差別，這在文獻(xiàn)中也有報(bào)道。事實(shí)上，在對(duì)正常人群不同年齡組最廣泛的研究中(Ogihara T等，J Lab clinMed，1975，85(4)566-575；Weishilboum RM等，科學(xué)(Science)，1973，181(4103)943-945；Sapru MK等，Acta Psychiatr Scand，1989，80474-478；Fujita F等，J Neurochem，1978，301569-1572)，顯示DBH酶活性在成年中并沒(méi)有顯著的不同，但在生命的第一年與站立姿勢(shì)發(fā)育相應(yīng)的階段中卻有隨年齡的持續(xù)升高(Fujita F等，J Neurochem，1978，301569-1572)。在任何年齡組的男女性別之間都沒(méi)有顯著差別(OgiharaT等，J Lab clin Med，1975，85(4)566-575)。然而，本實(shí)驗(yàn)中的分布范圍卻不象在文獻(xiàn)中報(bào)道的(從13到1043U/ml)那么寬對(duì)于78個(gè)男性受驗(yàn)者是從11到130，對(duì)于146個(gè)女性受驗(yàn)者是從2到138。文獻(xiàn)中認(rèn)為DBH酶活性在受驗(yàn)者間寬泛的差異是遺傳控制的(Geffen LB，LifeSci，1974，14(9)1593-1604；Weishilboum RM等，Science，1973，181(4103)943-945；Galvin M等，Psychiatry Res，1991，391-11)，但其任何受驗(yàn)者內(nèi)的變化也都在本研究中被觀察到。可以明顯地指出，在小鼠、大鼠、豚鼠、貓、牛和不同靈長(zhǎng)類(lèi)中測(cè)出的血清DBH酶比活性都在每毫升每分鐘pmol范圍間，顯著地低于在人血清中觀察到的值。并且，針對(duì)年齡測(cè)定的酶活顯示，在靈長(zhǎng)類(lèi)中從出生到生命周期的生長(zhǎng)有一持續(xù)的增長(zhǎng)，然而在貓中，在雌性中的酶活就顯著地高于在雄性中的酶活，結(jié)果顯示，在出生后開(kāi)始的幾天里酶活很低，但在40天時(shí)則達(dá)到持續(xù)的升高，并維持于終生。
在本研究中，樣品收集得到技術(shù)上的控制，操作也較好地考慮到通常的臨床程序，因而保證了數(shù)據(jù)對(duì)時(shí)間的可重復(fù)性，避免了內(nèi)部技術(shù)誤差。改善的本方法簡(jiǎn)單、快速、特異、可重復(fù)、比先前的技術(shù)更加敏感，可以被方便地介紹到工作臺(tái)上用于臨床檢驗(yàn)。在此方面，本技術(shù)可以被認(rèn)為是可用于不同診斷的臨床工具和交感神經(jīng)系統(tǒng)活性的指示。
盡管本發(fā)明與其特別的實(shí)施例被相聯(lián)系地描述，但應(yīng)該理解為它可以進(jìn)行進(jìn)一步的修正。本申請(qǐng)希望覆蓋本發(fā)明的任何變化、應(yīng)用或適應(yīng)，一般地，覆蓋本發(fā)明的原理和包括從本發(fā)明公開(kāi)得到的外延，例如與本發(fā)明相關(guān)聯(lián)的技術(shù)領(lǐng)域中已知的和習(xí)慣的做法，和在此之前公開(kāi)的必要特點(diǎn)的應(yīng)用和在所附的權(quán)利要求書(shū)的范圍之內(nèi)的應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種體外診斷方法，該方法能從血清樣品中測(cè)出多巴胺-β-羥化酶活性以評(píng)價(jià)患者的交感神經(jīng)系統(tǒng)功能；該方法包括以下步驟a)過(guò)濾血清樣品以基本除去藥物和多巴胺-β-羥化酶的內(nèi)源抑制劑；b)把由步驟a)得到的過(guò)濾樣品和多巴胺-β-羥化酶的底物溫育以轉(zhuǎn)化為可檢測(cè)化合物；c)測(cè)定可檢測(cè)化合物的量以評(píng)價(jià)多巴胺-β-羥化酶活性并與正常樣品比較；其中比正常樣品值低則指示交感神經(jīng)系統(tǒng)功能降低，比正常樣品值高則指示交感神經(jīng)系統(tǒng)功能升高。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所說(shuō)的底物是酪胺，所說(shuō)的可檢測(cè)化合物是酚乙醇胺衍生物。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所說(shuō)的底物也包括結(jié)合酚乙醇胺衍生物的帶正電荷的樹(shù)脂。
4.權(quán)利要求3的方法，該方法也包括步驟b)和c)之間的步驟，該步驟為將過(guò)氧化氫酶加入以進(jìn)行過(guò)氧化物的降解。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所說(shuō)的酚乙醇胺衍生物的量通過(guò)進(jìn)一步與NaIO4溫育和分光光度測(cè)定對(duì)羥基苯甲醛而確定。
6.權(quán)利要求5的方法，其中當(dāng)交感神經(jīng)系統(tǒng)功能降低時(shí)指示神經(jīng)變性、神經(jīng)內(nèi)分泌、精神易感性和心血管疾病、燒傷、慢性疲勞、緊張和恐慌綜合癥。
7.權(quán)利要求5的方法，其中當(dāng)交感神經(jīng)系統(tǒng)功能升高時(shí)指示緊張的效果。
8.一種體外診斷方法，該方法能從血清樣品中測(cè)出多巴胺-β-羥化酶比活性以評(píng)價(jià)患者的交感神經(jīng)系統(tǒng)功能；該方法包括以下步驟a)在含有干粉酚乙醇胺的小瓶中，過(guò)濾血清樣品以基本除去藥物和多巴胺-β-羥化酶的內(nèi)源抑制劑，得到樣品溶液；b)將樣品溶液和多巴胺-β-羥化酶底物溫育，以轉(zhuǎn)化為可檢測(cè)化合物；c)通過(guò)正電荷樹(shù)脂測(cè)定可檢測(cè)化合物的量以評(píng)價(jià)多巴胺-β-羥化酶活性并與正常樣品比較；其中，比正常樣品值低則指示交感神經(jīng)系統(tǒng)功能降低，比正常樣品值高則指示交感神經(jīng)系統(tǒng)功能升高。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所說(shuō)的小瓶有開(kāi)口并含有緊緊地放在與所說(shuō)的酚乙醇胺溶液相隔一段距離的可移動(dòng)濾網(wǎng)。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所說(shuō)的濾網(wǎng)放在所說(shuō)小瓶的上邊沿或在上邊沿與酚乙醇胺干粉之間的地方。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所說(shuō)的濾網(wǎng)是YM100TM膜或有可以讓分子量低于100000的分子通過(guò)的膜孔。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所說(shuō)的底物是酪胺，所說(shuō)的可檢測(cè)化合物是酚乙醇胺衍生物。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所說(shuō)的底物也包括結(jié)合酚乙醇胺衍生物的帶正電荷的樹(shù)脂。
14.權(quán)利要求13的方法，該方法也包括步驟b)和c)之間的步驟，該步驟為將過(guò)氧化氫酶加入以進(jìn)行過(guò)氧化物的降解。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所說(shuō)的酚乙醇胺衍生物的量通過(guò)進(jìn)一步與NaIO4溫育和分光光度測(cè)定對(duì)羥基苯甲醛而確定。
16.權(quán)利要求15的方法，其中當(dāng)交感神經(jīng)系統(tǒng)功能降低時(shí)指示神經(jīng)變性、神經(jīng)內(nèi)分泌、精神易感性和心血管疾病、燒傷、慢性疲勞、緊張和恐慌綜合癥。
17.權(quán)利要求15的方法，其中當(dāng)交感神經(jīng)系統(tǒng)功能升高時(shí)指示緊張的效果。
18.依據(jù)權(quán)利要求8在體外測(cè)定多巴胺-β-羥化酶比活性的試劑盒，該試劑盒包括以下組分a)含有酚乙醇胺溶液的小瓶，該小瓶有緊緊地安放在離所說(shuō)的溶液有一段距離的可移動(dòng)濾網(wǎng)；b)為轉(zhuǎn)化為可檢測(cè)化合物的多巴胺-β-羥化酶底物；和c)過(guò)氧化氫酶溶液。
19.權(quán)利要求18的試劑盒，其中組分a)也包括醋酸鈉緩沖液。
20.權(quán)利要求18的試劑盒，其中組分b)也包括酪胺和抗壞血酸根。
21.權(quán)利要求19的試劑盒，其中組分b)也包括富馬酸二鈉和鹽酸帕吉林。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種在體外通過(guò)測(cè)定血清樣品的多巴胺－β－羥化酶比活性以評(píng)價(jià)患者的交感神經(jīng)系統(tǒng)功能的診斷方法;該方法包括以下步驟:a)過(guò)濾血清樣品以基本除去藥物和多巴胺－β－羥化酶的內(nèi)源抑制劑;b)把由步驟a)得到的過(guò)濾樣品和多巴胺－β－羥化酶的底物溫育以轉(zhuǎn)化為可檢測(cè)化合物;c)測(cè)定可檢測(cè)化合物的量以評(píng)價(jià)多巴胺－β－羥化酶活性并與正常樣品比較;其中,比正常樣品值低則指示交感神經(jīng)系統(tǒng)功能降低,比正常樣品值高則指示交感神經(jīng)系統(tǒng)功能升高。交感神經(jīng)系統(tǒng)功能的降低是神經(jīng)變性、神經(jīng)內(nèi)分泌、精神易感性和心血管疾病、燒傷、慢性疲勞、緊張和恐慌綜合癥的表示。交感神經(jīng)系統(tǒng)功能升高時(shí)指示緊張的效果。
文檔編號(hào)C12Q1/26GK1267335SQ98808195
公開(kāi)日2000年9月20日 申請(qǐng)日期1998年5月28日 優(yōu)先權(quán)日1997年6月16日
發(fā)明者安德烈·G·勒貝格, 米歇爾·沙瑞斯特 申請(qǐng)人:神經(jīng)－生物技術(shù)公司