專利名稱：幾丁質(zhì)珠、聚氨基葡糖珠、這些珠的制造方法和這些珠制得的載體以及微孢子蟲孢子的制 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從主要細(xì)胞壁物質(zhì)為幾丁質(zhì)的微孢子蟲孢子制得的均勻微細(xì)粒徑的幾丁質(zhì)珠、該幾丁質(zhì)N-脫乙?；玫木鶆蛭⒓?xì)粒徑的聚氨基葡糖珠、這些珠的制造方法和這些珠制得的載體以及微孢子蟲孢子的制造方法。
背景技術(shù)：
聚氨基葡糖因?yàn)榫哂辛己玫奈锢砘瘜W(xué)吸附性、生物體適應(yīng)性和微生物分解性，作為醫(yī)藥·醫(yī)療用、香料用、化妝品用、粘合材料·涂料用和復(fù)印·記錄表示用的材料等，是能夠在廣泛產(chǎn)業(yè)范圍內(nèi)應(yīng)用的生物高分子。一方面，粒徑波動(dòng)小的多孔性珠(beads)作為酶等的固定化用載體，廣泛地應(yīng)用于化學(xué)、醫(yī)療、食品和工業(yè)過程等各種產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域。所以，如果能夠提供聚氨基葡糖的具有均勻粒徑的多孔性珠，可望能在多方面進(jìn)行應(yīng)用。
以前，聚氨基葡糖珠例如按以下的復(fù)雜方法制造。首先，從形成甲殼類外骨骼的成分中除去無機(jī)物，得到聚氨基葡糖，將其充分溶于有機(jī)酸作成均勻的原液。將此原液滴入堿性凝固液中或在其中放出，使之凝固，制造得到聚氨基葡糖珠(Knorr,D.,M.Daly聚氨基葡糖/藻酸多層凝聚層膠囊觀察到力學(xué)與擴(kuò)散變化Mechanics and diffusional changes observedin multi-layer chitosan/alginate coacervate capsules，工藝生物化學(xué)Process Biochemistry,4,48-50(1988))。
發(fā)明的公開在上述以前的方法中，聚氨基葡糖珠的粒徑和多孔狀態(tài)會(huì)因脫溶劑的速度和凝固液向生成的珠中的滲透、擴(kuò)散速度等的不同而發(fā)生大幅度變化。正因?yàn)槿绱耍筒蝗菀资怪榈牧揭恢?，要制造粒徑均勻的聚氨基葡糖珠，就必需有?fù)雜的制備操作并有熟練的技術(shù)，從而使大量生產(chǎn)很困難。所以，人們希望開發(fā)出根據(jù)在收率、效率、經(jīng)濟(jì)等方面優(yōu)秀且處理容易的制造工藝進(jìn)行的制造均勻微細(xì)粒徑聚氨基葡糖珠的方法。
在本發(fā)明中，利用了主要細(xì)胞壁物質(zhì)為幾丁質(zhì)構(gòu)成的均勻微細(xì)粒徑的微孢子蟲類的孢子在昆蟲體內(nèi)或培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)能夠效率良好地生產(chǎn)得到這個(gè)特性，解決了上述問題。也就是說，本發(fā)明的目的在于，利用粒狀微孢子蟲孢子細(xì)胞壁物質(zhì)的主要成分為幾丁質(zhì)這一點(diǎn)，提供高效且經(jīng)濟(jì)地制造均勻微細(xì)粒徑的幾丁質(zhì)珠、聚氨基葡糖珠和微孢子蟲孢子的方法，同時(shí)提供如此所得的均勻微細(xì)粒徑的珠和這些均勻粒徑的珠制成的載體。
本發(fā)明者們就昆蟲來源的生物高分子的新應(yīng)用技術(shù)的開發(fā)進(jìn)行了深入的研究。結(jié)果首先發(fā)現(xiàn)，微孢子蟲孢子能在昆蟲體內(nèi)或培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)高效地生產(chǎn)，而且微孢子蟲孢子呈均勻粒徑的球狀、橢球狀，因微孢子蟲孢子的主要細(xì)胞壁物質(zhì)為幾丁質(zhì)，如果在粒徑均勻的幾丁質(zhì)珠或聚氨基葡糖珠上固定抗生素及生理活性物質(zhì)，就可用作緩釋載體，從而完成了本發(fā)明。
如果在家蠶、野蠶或其它多種昆蟲或者培養(yǎng)細(xì)胞中接種微孢子蟲孢子，則主要細(xì)胞壁物質(zhì)為幾丁質(zhì)、數(shù)微米大小的微孢子蟲孢子大量增殖。本發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)了精制、分離增殖的微孢子蟲孢子、得到一定粒徑的幾丁質(zhì)珠、聚氨基葡糖珠和微孢子蟲孢子的方法，以及將這些珠制成抗生素和生理活性物質(zhì)等的固定化用載體的簡易方法。
本發(fā)明者們首先揭示了往昆蟲或培養(yǎng)細(xì)胞中接種微孢子蟲孢子的時(shí)間、接種量、接種方法和在昆蟲體內(nèi)等增殖后的微孢子蟲孢子的精制、分離方法，以及高效生產(chǎn)微孢子蟲孢子所需的最適條件。
對于微孢子蟲孢子往昆蟲或培養(yǎng)細(xì)胞中的接種，現(xiàn)有例如有①往昆蟲飼料中加入目的的微孢子蟲孢子的經(jīng)口接種方法、②對飼養(yǎng)過程中的昆蟲經(jīng)皮直接接種微孢子蟲孢子的方法等。
微孢子蟲孢子的形狀很多樣，但各個(gè)種類會(huì)有一定的形狀，其主要的細(xì)胞壁物質(zhì)為幾丁質(zhì)和蛋白質(zhì)的復(fù)合物。所以孢子可以①作為增殖后的微孢子蟲孢子的幾丁質(zhì)珠，還有②作為微孢子蟲孢子的幾丁質(zhì)N-脫乙酰化的聚氨基葡糖珠來使用。此外，將微孢子蟲孢子表面的幾丁質(zhì)進(jìn)行N-脫乙?；幚?，可以制造出微粒子表面為聚氨基葡糖的聚氨基葡糖珠。還有，活化細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)，使其從孢子的細(xì)胞壁中出來，也可以制造出微孢子蟲孢子細(xì)胞壁上有小孔的中空珠。
如上所述，本發(fā)明的幾丁質(zhì)珠是由在昆蟲或培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)增殖的微孢子蟲孢子制成的、以幾丁質(zhì)為主要細(xì)胞壁物質(zhì)的均勻微細(xì)粒徑的珠；此外，聚氨基葡糖珠為該細(xì)胞壁物質(zhì)幾丁質(zhì)N-脫乙?；漠a(chǎn)物。此幾丁質(zhì)珠和聚氨基葡糖珠也可以是除去蛋白質(zhì)的非抗原性物質(zhì)。蛋白質(zhì)的除去可按通常的水解處理進(jìn)行。此外，根據(jù)需要，上述增殖的微孢子蟲孢子也可以是細(xì)胞壁上有孔的，上述幾丁質(zhì)珠和聚氨基葡糖珠可以是中空的。這些孔可以通過過氧化氫處理或堿處理得到。
本發(fā)明的載體從如上述的增殖的微孢子蟲孢子制得，它是以幾丁質(zhì)為主要細(xì)胞壁物質(zhì)得到的均勻微細(xì)粒徑的幾丁質(zhì)珠或該細(xì)胞壁物質(zhì)幾丁質(zhì)N-脫乙?；木郯被咸侵橹瞥傻摹４藥锥≠|(zhì)珠和聚氨基葡糖珠也可以是除去蛋白質(zhì)的非抗原性物質(zhì)。蛋白質(zhì)的除去可按通常的水解處理進(jìn)行。如上所述，根據(jù)需要，這些增殖的微孢子蟲孢子可以是細(xì)胞壁上有孔的，這些幾丁質(zhì)珠和聚氨基葡糖珠也可以是中空的。這些孔可以通過過氧化氫處理或堿處理得到。
本發(fā)明的載體是用于固定或引入生理活性物質(zhì)、抗生素、生物體細(xì)胞、細(xì)菌等微生物、無色和有色的染料、藥物、農(nóng)藥、香料、飼料原料及食品原料等的物質(zhì)。
還有，本發(fā)明的幾丁質(zhì)珠和聚氨基葡糖珠包埋入人等的體內(nèi)時(shí)，希望具有非抗原性。
本發(fā)明的均勻微細(xì)粒子(幾丁質(zhì)珠和聚氨基葡糖珠)的制造方法如下所述，以5×102～5×108個(gè)/毫升、優(yōu)選5×102～5×107個(gè)/毫升的濃度經(jīng)口或經(jīng)皮往昆蟲體內(nèi)接種微孢子蟲孢子，增殖以后，取出在生育昆蟲體內(nèi)增殖的孢子，精制得到均勻微細(xì)粒子(幾丁質(zhì)珠)，接著按照要求將幾丁質(zhì)珠的幾丁質(zhì)N-脫乙?；?，得到均勻微細(xì)粒子的聚氨基葡糖珠。孢子濃度不足5×102個(gè)/毫升時(shí)，對昆蟲的感染效率低，或因感染率產(chǎn)生變動(dòng)而無效；此外，不足濃度超過5×108時(shí)，在昆蟲體內(nèi)完全形成孢子前昆蟲就要死亡對經(jīng)濟(jì)方面不利。微孢子蟲的接種時(shí)間優(yōu)選該昆蟲為2齡起蠶的時(shí)候，孢子的采集優(yōu)選從昆蟲的5齡期開始。該昆蟲優(yōu)選家蠶的幼蟲。
本發(fā)明的微孢子蟲孢子的制造方法優(yōu)選如下述過程進(jìn)行，往以細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)基重量為基準(zhǔn)，含家蠶幼蟲體液的上清5～50％重量、優(yōu)選10～40％重量的細(xì)胞培養(yǎng)基中加入昆蟲來源的培養(yǎng)細(xì)胞，再往其中接種微孢子蟲孢子使之增殖后，從增殖的細(xì)胞中取出微孢子蟲孢子。在家蠶幼蟲體液的上清的添加量不足5％重量和超過50％重量的情況時(shí)，孢子都不能增殖。此外，在優(yōu)選范圍內(nèi)孢子能更高效地增殖。
圖的簡單說明

圖1表示下述實(shí)施例2所得的干燥粉末(幾丁質(zhì)珠)和標(biāo)準(zhǔn)樣品的幾丁質(zhì)相比較的紅外吸收光譜。
實(shí)施發(fā)明的最佳形式作為本發(fā)明中所用的微孢子蟲，沒有特殊的限定，只要是具有形狀能保持一定的珠形狀而且主要的細(xì)胞壁物質(zhì)為幾丁質(zhì)的孢子的微孢子蟲就可以。例如可以使用家蠶微粒子蟲(Nosema bombycis)、家蠶微粒子蟲(No.402)、家蠶微粒子蟲(No.408)、家蠶微粒子蟲(No.520)、家蠶微粒子蟲(No.611)、微粒子蟲屬(M 11)和微粒子蟲屬(M 14)等的微粒子蟲屬微孢子蟲，多形孢蟲屬(Vairimorpha)(M12)，擬微孢子蟲屬(Plestophola)(M25)，擬微孢子蟲屬(M27)和消泡微孢子蟲屬(Thelophania)等。
在本發(fā)明中，可以利用家蠶、大菜粉蝶Pieris brassicae、美國白蛾Hyphantria cunea、絹粉蝶Aporia crataegi、人紋污燈蛾Spilosomasubcarnea Walker、蓖麻蠶Philosamia cynthia arrinda和樗蠶Philosamiacynthia等廣大范圍的昆蟲作為微孢子蟲孢子的宿主。在昆蟲當(dāng)中，特別符合要求的是已確立了飼養(yǎng)方法、飼養(yǎng)技術(shù)的，在遺傳、育種、生理、生態(tài)等方面已進(jìn)行了全方位研究的家蠶。采用家蠶的幼蟲可以生產(chǎn)出大量的微孢子蟲孢子。以家蠶為對象制造微孢子蟲孢子時(shí)，以每只家蠶5×102～5×107個(gè)/毫升微孢子蟲孢子的接種量對2齡起的蠶進(jìn)行經(jīng)口或經(jīng)皮接種，在5齡期時(shí)可望精制、分離大量增殖的微孢子蟲孢子。如果將微孢子蟲孢子經(jīng)口接種入1齡起的蠶，則在微孢子蟲孢子形成前蠶就病死了。將家蠶微粒子蟲的原蟲給予家蠶時(shí)，優(yōu)選每只2齡起的蠶大約接種5×102～3×103個(gè)孢子，在幼蟲開始死亡的接種的第12天采集幼蟲體內(nèi)的孢子能最高效地得到微孢子蟲孢子。
在本發(fā)明中，如上所述，能在昆蟲體內(nèi)或培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)得到大量的目的物微孢子蟲孢子，所以除了可以使用家蠶等昆蟲外，還可以使用哺乳動(dòng)物和廣大脊椎動(dòng)物、無脊椎動(dòng)物來源的培養(yǎng)細(xì)胞。接種后的昆蟲可以在15～32℃下按通常方法進(jìn)行飼養(yǎng)，優(yōu)選的飼養(yǎng)溫度為25～28℃。另一方面，接種后的培養(yǎng)細(xì)胞可以在20～30℃下，優(yōu)選25～28℃下進(jìn)行培養(yǎng)。
作為本發(fā)明所用的培養(yǎng)細(xì)胞，可如下述例子所示。
作為家蠶來源的培養(yǎng)細(xì)胞，例如有家蠶(Bombyx mori)S.P.C.Bm36、家蠶Bm N-4、家蠶SES-BoMo-15A等；作為柞蠶來源的培養(yǎng)細(xì)胞，例如有中國柞蠶(Antheraea pernyi)NIS ES-AnPe-428；作為長角天蠶來源的培養(yǎng)細(xì)胞，例如有蓖麻蠶(Philosamia cynthiapernyi)NIS ES-SaCy-12。此外，作為桑斑污燈蛾來源的，例如有桑斑污燈蛾(Spilosoma imparilis)FRI-SpIm-1229；作為甘藍(lán)夜蛾來源的培養(yǎng)細(xì)胞，例如有甘藍(lán)夜蛾(Mamestra brassicae)SES-MaBr-4。
在上述培養(yǎng)細(xì)胞中，對中國柞蠶(Antheraea pernyi)NIS ES～AnPe-428來說，如果使用含家蠶幼蟲體液的上清5～50％的Grace培養(yǎng)液時(shí)，在培養(yǎng)溫度為20～30℃、優(yōu)選25～28℃下，微孢子蟲孢子能夠在培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)高效地增殖。對于中國柞蠶(Antheraea pernyi)NIS ES-AnPe-428以外的培養(yǎng)細(xì)胞，可以使用通常一般所用的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)(橫田等，九州蠶絲，34(1995))。
用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，往培養(yǎng)基中加入一定濃度的家蠶體液上清可使微孢子蟲孢子在培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)容易增殖，形成大量的孢子。為了經(jīng)濟(jì)、高效地生產(chǎn)微孢子蟲孢子，家蠶體液上清的添加量優(yōu)選培養(yǎng)液的10～40％重量。培養(yǎng)條件可以和未添加上清時(shí)一樣。對于體液的調(diào)制，用剪刀把5齡家蠶幼蟲的足剪斷，用冰冷卻的玻璃制試管收集體液的方法既簡便又有效。將這樣收集的體液在水浴60℃下加熱15分鐘，沉淀體液中所含的蛋白質(zhì)，以傾潷的方法除去它，就可以使用這樣所得的體液上清。
使用昆蟲來源的培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，不受昆蟲的飼養(yǎng)、采集等、昆蟲的得到的制約，能夠以箱式培養(yǎng)簡單而高效地生產(chǎn)微孢子蟲孢子。
對野蠶來源的培養(yǎng)細(xì)胞桉大蠶蛾Antheraea eucalypti細(xì)胞給予微孢子蟲孢子時(shí)，可以往家蠶幼蟲體液的上清最大加到40％的市售細(xì)胞培養(yǎng)液(例如Grace培養(yǎng)液，Gibco公司制造)中的細(xì)胞直接接種微孢子蟲孢子從而在培養(yǎng)細(xì)胞中高效地生產(chǎn)微孢子蟲孢子。
因?yàn)橥ハx或昆蟲來源的培養(yǎng)細(xì)胞中接種微孢子蟲孢子而生產(chǎn)的孢子對家蠶具有強(qiáng)大的傳染性，從防止對家蠶的污染的角度出發(fā)，所取出的孢子應(yīng)該進(jìn)行福爾馬林、醇處理或熱處理等，使之無毒化。無毒化后的微孢子蟲孢子如果就這樣使用可以作為不溶于水的幾丁質(zhì)微粒(幾丁質(zhì)珠)應(yīng)用。
制造本發(fā)明的均勻微細(xì)粒徑的幾丁質(zhì)珠時(shí)的增殖微孢子蟲孢子的精制按以下步驟進(jìn)行。即，例如將體內(nèi)增殖了微孢子蟲孢子的昆蟲幼蟲在0.85％氯化鈉水溶液中磨碎后，用脫脂棉濾過，收集孢子，用離心分離器進(jìn)行2次離心操作。接著，移至Percoll層(商品名，瑞典法瑪西亞公司制造)上，以3000rpm進(jìn)行30分鐘的離心分離，可以精制微孢子蟲孢子。
將幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)換成聚氨基葡糖的N-脫乙?；幚砜砂赐ǔ５姆椒ㄟM(jìn)行，例如將微孢子蟲孢子的幾丁質(zhì)珠在30～50％氫氧化鈉溶液中、80～120℃下處理數(shù)小時(shí)，使細(xì)胞壁物質(zhì)幾丁質(zhì)N-脫乙?；兂删郯被咸侵?。還有，作為N-脫乙?；玫乃幤?、pH等操作條件已知的方法可以適用(Brine等，比較生物化學(xué)與生理學(xué)Comp.Biochem.Physiol.69B、283(1983))。
本發(fā)明的幾丁質(zhì)珠、聚氨基葡糖珠的細(xì)胞壁物質(zhì)是由無抗原性的幾丁質(zhì)、聚氨基葡糖及葡聚糖和抗原性的蛋白質(zhì)構(gòu)成的。蛋白質(zhì)可以經(jīng)酸和/或堿水解處理溶出除去，此時(shí)珠的形態(tài)沒有變化。這種水解，使用0.1～3N、優(yōu)選0.5～2N、更優(yōu)選0.9～1.3N的氫氧化鈉、鹽酸，在溫度5～35℃下進(jìn)行1～25小時(shí)，優(yōu)選在20～25℃下進(jìn)行8～15小時(shí)，更優(yōu)選在室溫下進(jìn)行10～12小時(shí)，由此得到無抗原性的珠。水解處理可以開始時(shí)在酸性水溶液中、而隨后的過程在堿性水溶液中進(jìn)行，也可以開始時(shí)在堿性水溶液中、而隨后的過程在酸性水溶液中進(jìn)行。酸處理和堿處理合起來為1個(gè)循環(huán)，重復(fù)此操作，應(yīng)該合計(jì)處理5個(gè)循環(huán)以上。最后用水洗凈后，為了進(jìn)行殺菌、脫水，用95％以上的乙醇按預(yù)定時(shí)間進(jìn)行清洗處理。這樣，就可以完全除去為微孢子蟲孢子細(xì)胞壁物質(zhì)的蛋白質(zhì)。
在微孢子蟲孢子中把抗生素、細(xì)菌、生理活性物質(zhì)、藥物和生物體細(xì)胞，或固定，或引入其內(nèi)部時(shí)，在微孢子蟲孢子的細(xì)胞壁上打開微細(xì)的小孔是較為有效的。作為在微孢子蟲孢子上開微細(xì)小孔的方法，沒有特殊的限定，例如優(yōu)選下述兩種方法。
①1～6％重量H2O2和孢子懸浮液等量混合的方法。
②將微孢子蟲孢子用25℃的0.2N KOH進(jìn)行30分鐘的浸漬處理后，分批少量加入pH7.2的磷酸緩沖液，調(diào)節(jié)浸漬溶液pH至中性的方法。
將微孢子蟲孢子用堿性水溶液處理后，孢子內(nèi)的細(xì)胞物質(zhì)被活性化，根據(jù)孢子大小的不同，細(xì)胞物質(zhì)在細(xì)胞壁上打開例如約0.1～0.3μm的微細(xì)小孔，釋放出孢子外，所以可以利用此時(shí)生成的微孢子蟲孢子壁的微細(xì)小孔。具體地說，先用0.2N的氫氧化鉀水溶液在15～20℃下處理微孢子蟲孢子30分鐘，在這之后，進(jìn)一步用pH7.2的磷酸緩沖液進(jìn)行中和處理，活性化孢子內(nèi)的細(xì)胞物質(zhì)，往培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞用培養(yǎng)基中放出孢子內(nèi)細(xì)胞物質(zhì)時(shí)形成了微細(xì)小孔。
增殖后的微孢子蟲孢子本身為抗原，當(dāng)如上述用酸、堿進(jìn)行水解除去細(xì)胞壁物質(zhì)的蛋白質(zhì)后的幾丁質(zhì)珠和聚氨基葡糖珠就不是抗原了。
如上所述，根據(jù)本發(fā)明，應(yīng)用昆蟲或培養(yǎng)細(xì)胞中極大量增殖的微孢子蟲孢子，可以得到呈球形或橢球形的、數(shù)微米大小的且均勻微細(xì)粒徑的幾丁質(zhì)珠；此外，將幾丁質(zhì)珠N-脫乙?；艿玫骄郯被咸侵?。根據(jù)本發(fā)明，能夠制造以前的制造方法極難得到的均勻微細(xì)粒徑的珠，特別是粒徑約1～6微米的無粒徑不均的珠，此外，也能制造中空的聚氨基葡糖珠。按此方法制造的均勻微細(xì)粒徑的幾丁質(zhì)珠和聚氨基葡糖珠可以作為藥物釋放系統(tǒng)的載體、以及化妝品粉底原料來使用。對于根據(jù)本發(fā)明的幾丁質(zhì)珠和聚氨基葡糖珠，因微孢子蟲的種類不同，可以生產(chǎn)出各種大小的珠。此外，在聚氨基葡糖珠上吸附、固定酶或生物體細(xì)胞，就可作為生物反應(yīng)器用于食品工業(yè)及其它廣泛的產(chǎn)業(yè)之中。
本發(fā)明的幾丁質(zhì)珠和聚氨基葡糖珠具有富于反應(yīng)性的化學(xué)組成成分，其表面能夠與酶或免疫抗體形成化學(xué)或物理的結(jié)合。例如，將免疫球蛋白等抗原、抗體在粒子表面和/或內(nèi)部固定化可以作為免疫載體使用。此外，幾丁質(zhì)用化學(xué)反應(yīng)改造成乙二醇幾丁質(zhì)和羧甲基幾丁質(zhì)等的改性幾丁質(zhì)具有優(yōu)良的保溫性，可以作為化妝品材料使用。還有，將微孢子蟲孢子或幾丁質(zhì)珠用乙烯化合物進(jìn)行接枝加工后，在其上固定α-淀粉酶等酶，不僅能提高酶活性的穩(wěn)定性，又因?yàn)橛行П砻娣e增大，更能高效地發(fā)揮酶的功能。
將昆蟲來源的幾丁質(zhì)珠和聚氨基葡糖珠水解后得到的細(xì)胞壁物質(zhì)為如上所述的幾丁質(zhì)、聚氨基葡糖和葡聚糖等構(gòu)成，它們中的任一個(gè)都是不容易成為抗原的物質(zhì)。所以，將幾丁質(zhì)珠和聚氨基葡糖珠作為緩釋載體包埋于人等動(dòng)物體內(nèi)時(shí)也不發(fā)生抗原抗體反應(yīng)。除去蛋白質(zhì)的微孢子蟲孢子的細(xì)胞壁物質(zhì)的抗原性已經(jīng)消失。此外，因?yàn)閹锥≠|(zhì)珠和聚氨基葡糖珠在一定的時(shí)間后能被體內(nèi)的酶完全分解，所以可以作為能在生物體內(nèi)分解的安全材料使用。
本發(fā)明的幾丁質(zhì)和聚氨基葡糖的任一個(gè)都可以是內(nèi)部具有空隙的中空珠，它在細(xì)胞壁組織上打開了微細(xì)的小孔。所以在負(fù)壓環(huán)境下能夠?qū)⑸矬w細(xì)胞、細(xì)菌、抗生素、生理活性物質(zhì)等引入微細(xì)的空隙。因?yàn)閷⒓?xì)菌等微生物封入該珠時(shí)，被封入的微生物不容易受外界紫外線等的蛋白質(zhì)變性因素影響，所以該珠可以作為天敵微生物保護(hù)材料使用。
本發(fā)明的幾丁質(zhì)和聚氨基葡糖例如可以作為親和層析用載體、細(xì)胞培養(yǎng)用載體和醫(yī)藥輔助材料使用，作為藥物、生理活性物質(zhì)、激素和疫苗等的微囊化基質(zhì)也能發(fā)揮優(yōu)良的特性。將農(nóng)藥或肥料等封入微孢子蟲孢子、幾丁質(zhì)珠或聚氨基葡糖珠中膠囊化的物質(zhì)可以作為土壤改造材料使用；此外，將微量的有效飼料成分和食品材料封入幾丁質(zhì)珠或聚氨基葡糖珠中膠囊化的物質(zhì)可以作為家畜飼料和養(yǎng)魚飼料使用。還有，封入、固定化了細(xì)菌的微孢子蟲孢子、幾丁質(zhì)和聚氨基葡糖對紫外線照射具有保護(hù)作用，可以作為生物防護(hù)材料用的原料使用。特別地，如果使幾丁質(zhì)珠和聚氨基葡糖珠的粒徑一致，則能夠在精細(xì)化工等領(lǐng)域有特殊的應(yīng)用。此外，將以根據(jù)本發(fā)明的幾丁質(zhì)、聚氨基葡糖為成分的微囊作為壓敏復(fù)印紙使用時(shí)，可以提高涂抹過程時(shí)的干燥性，此外還可大幅度改善顯色打印性。
如上所述，幾丁質(zhì)、聚氨基葡糖微粒子能夠有效地應(yīng)用于農(nóng)藥、工業(yè)、醫(yī)學(xué)、食品等廣泛的領(lǐng)域。
如前述，微孢子蟲孢子、幾丁質(zhì)珠或聚氨基葡糖珠中封入細(xì)菌等的微生物或生理活性物質(zhì)等形成的物質(zhì)在紫外線照射的情況下，因?yàn)榧?xì)胞壁物質(zhì)幾丁質(zhì)、聚氨基葡糖吸收了紫外線，阻斷了紫外線的能量，所以能夠長期保持微孢子蟲孢子、幾丁質(zhì)珠和聚氨基葡糖珠中封入的細(xì)菌等微生物和生理活性物質(zhì)等的生物和生理活性。這樣，微孢子蟲孢子、幾丁質(zhì)珠和聚氨基葡糖珠能夠有效地防止封入的生理活性物質(zhì)、細(xì)菌等微生物的活性降低。
本發(fā)明中除去蛋白質(zhì)的幾丁質(zhì)和聚氨基葡糖如上所述即使進(jìn)入生物體內(nèi)也難于成為抗原，對生物體沒有不良的影響，所以它固定化具有生理作用的藥物后，即使將其包埋入人等的體內(nèi)也不引起基于抗原抗體反應(yīng)的問題。因此，特別地，封入具有抗癌作用的藥物的幾丁質(zhì)珠、聚氨基葡糖珠能夠作為用于治療特定患部的靶向載體應(yīng)用在尖端的醫(yī)療領(lǐng)域。
此外，根據(jù)水解處理程度的不同，或者在活性化了微孢子蟲孢子的細(xì)胞物質(zhì)、放出內(nèi)容物的微孢子蟲孢子上打開微細(xì)小孔的程度的不同，能夠簡單地控制被負(fù)載或封入的藥物、生理活性物質(zhì)、抗生素等的緩釋速度、緩釋量甚至生物分解性的程度。
實(shí)施例接著就實(shí)施例和比較例對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明，但本發(fā)明并不僅限于此這些例子。還有，微孢子蟲有很多種類，如果沒有特別限定就使用家蠶幼蟲來源的家蠶微粒子蟲。
實(shí)施例中細(xì)菌活性和抗原性的評價(jià)按下述方法進(jìn)行。A．細(xì)菌活性的評價(jià)加熱溶解后，將15毫升保持在55℃的半合成脅本培養(yǎng)基或King B培養(yǎng)基和2毫升檢定菌的孢子液(濃度109-10個(gè)/毫升)混合，將此混合物倒入培養(yǎng)皿中固定成平板狀。往此菌液混合平板培養(yǎng)基上滴入10微升被檢樣品，在20～25℃下保持2天后，按下述判定標(biāo)準(zhǔn)分四級評價(jià)被檢樣品下的培養(yǎng)基的細(xì)菌增殖抑制程度。
+++強(qiáng)(細(xì)菌幾乎不增殖，培養(yǎng)基透明度高如透明的玻璃)++較強(qiáng)+弱(細(xì)菌稍微增殖，培養(yǎng)基透明度處于透明玻璃和半透明玻璃之間)±輕微(細(xì)菌的增殖有1/5的程度，培養(yǎng)基透明度為半透明玻璃程度)-細(xì)菌增殖良好，培養(yǎng)基不透明B．對放線菌(霉菌)的抗菌活性的評價(jià)方法加熱溶解后，將保持在55℃的PSA培養(yǎng)基和2毫升檢定菌的孢子液(濃度105-6個(gè)/毫升)混合，將此混合物倒入培養(yǎng)皿中固定成平板狀，按上述細(xì)菌活性的評價(jià)進(jìn)行同樣的處理、觀察。C．抗原性的評價(jià)微孢子蟲孢子的抗血清按以下方法調(diào)制。將家蠶幼蟲傳代的孢子以Percoll密度梯度管法進(jìn)行精制，以2000rpm進(jìn)行10分鐘的離心分離，將沉淀的孢子懸浮于0.85％NaCl溶液中，如此所得的孢子懸浮液(2×108個(gè)/毫升)作為抗原，將它和弗氏完全佐劑(Freund’s Complete adjuvant)等量混合，用2毫升所得的混合物對兔子進(jìn)行1次肌肉注射。在這之后，每次用1毫升孢子懸浮液每隔1周靜脈注射4次，從最后的注射起7天后采血。血清在56℃下去活化30分鐘，然后在-20℃下保存。
對于凝集反應(yīng)用的抗原，將精制的微孢子蟲孢子用1％的甲醛溶液處理后，以蒸餾水離心洗凈，再將此孢子用0.85％NaCl溶液懸浮(4×107個(gè)/毫升)調(diào)制而成。
將上述抗血清用0.85％NaCl溶液以2倍分級稀釋后，在載玻片上與孢子懸浮液等量混合，在37℃下反應(yīng)1小時(shí)后，用倒置顯微鏡觀察，評價(jià)凝集反應(yīng)(效價(jià)，滴度)?？贵w(抗血清)的稀釋倍數(shù)分別為16、32、64、128、256、512、1024、2040，按下述判定標(biāo)準(zhǔn)分2級進(jìn)行評價(jià)。
+確認(rèn)有抗原抗體反應(yīng)-完全不能確認(rèn)有抗原抗體反應(yīng)實(shí)施例1將各種微孢子蟲孢子接種于家蠶幼蟲，進(jìn)行培養(yǎng)，考查能夠從家蠶幼蟲中分離出的各種微孢子蟲孢子的種名、孢子的大小和抗原性。作為微孢子蟲，如表1所示，有家蠶微粒子蟲*(Nosema bombycis)(作為比較其它微孢子蟲特性的標(biāo)準(zhǔn)種Nosema bombycis Nageli)、家蠶微粒子蟲(No.402)、家蠶微粒子蟲(No.408)、家蠶微粒子蟲(No.520)、家蠶微粒子蟲(No.611)、微粒子蟲屬(M 11)、多形孢蟲屬(Vairimorpha)(M 12)、微粒子蟲屬(M 14)、擬微孢子蟲屬(Plestophola)(M 25)、擬微孢子蟲屬(M 27)、和消泡微孢子蟲屬(Thelophania)等。研究結(jié)果如表1所示。
所用的微孢子蟲孢子的形狀大致為橢球形，長徑和短徑分別為3～5微米和1～3微米，其形狀和大小對一定種類的微孢子蟲來說是一定的。也就是說，使用一定種類的微孢子蟲，能夠自由地制造均勻形狀的幾丁質(zhì)珠、聚氨基葡糖珠。各種微孢子蟲孢子的長徑最大為5微米，可以將符合所望用途的微孢子蟲作為對象使用。還有，它們對蠶的寄生部位如表1所示。
表

>注)*標(biāo)準(zhǔn)種上述家蠶微粒子蟲*(作為標(biāo)準(zhǔn)種的Nosema bombycis Nageli)、微粒子蟲屬(M 11)和Vairimorpha(M 12)已在農(nóng)林水產(chǎn)省蠶絲·昆蟲農(nóng)業(yè)技術(shù)研究所中分別以登記號第860001、860004和860005號保藏，在本申請的優(yōu)先權(quán)日的時(shí)間，是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠得到的菌種。此外，這些微孢子蟲，基于布達(dá)佩斯條約，在美利堅(jiān)合眾國、馬里蘭州20852、羅克維爾、Parklawn大道12301號的美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)中，于1998年3月23日交付國際保藏，其保藏編號分別為ATCC第209694、209693和209692號。這些保藏于ATCC的微孢子蟲按ATCC的規(guī)定可從第三方獲得。實(shí)施例2使用上述表1記載的家蠶微粒子蟲*、微粒子蟲屬(M 11)和擬微孢子蟲屬(M 27)的微孢子蟲原蟲，對2齡起蠶的家蠶幼蟲(日135號×支135號)按每只3×103個(gè)的量分別經(jīng)口接種入各種微孢子蟲孢子，微孢子蟲孢子在蠶體內(nèi)增殖后，取出所得的孢子，首先將其在-30℃下冷凍干燥，接著用東西通商株式會(huì)社制造的冷凍干燥機(jī)進(jìn)行干燥，得到干燥粉末。為了簡單地定性孢子溶液得到的干燥粉末的化學(xué)成分，將干燥樣品粉末和溴化鋰混合，制片，用日本分光工業(yè)公司制造的紅外分光光度計(jì)測定900～1200cm-1波數(shù)范圍的紅外吸收光譜。還有，作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，使用和光純藥工業(yè)株式會(huì)社制造的市售標(biāo)準(zhǔn)樣品的幾丁質(zhì)。其結(jié)果如圖1所示。在圖1中，紅外吸收光譜曲線a表示市售的幾丁質(zhì)，此外，曲線b、c和d分別表示家蠶微粒子蟲、微粒子蟲屬和擬微孢子蟲屬的結(jié)果。所得的標(biāo)準(zhǔn)樣品幾丁質(zhì)的紅外吸收光譜在985、1025、1065、1100、1145cm-1處出現(xiàn)吸收。即使微孢子蟲孢子的種類不同，也和標(biāo)準(zhǔn)幾丁質(zhì)樣品的紅外吸收光譜大致在同一波數(shù)范圍(1000～1200cm-1)內(nèi)有相同的吸收，因此可以確定構(gòu)成各種微孢子蟲孢子細(xì)胞壁的主要成分為幾丁質(zhì)。
此外，以經(jīng)皮接種代替經(jīng)口接種時(shí)，得到與上述相同的結(jié)果。
此外，大菜粉蝶用Pieris brassicae、美國白蛾Hyphantria cunea、絹粉蝶Aporia crataegi、人紋污燈蛾Spilosoma subcarnea Walker、蓖麻蠶Philosamia cynthis arrinda和樗蠶Philosamia cynthia等代替家蠶幼蟲作為微孢子蟲孢子的宿主時(shí)，也和上面一樣得到構(gòu)成細(xì)胞壁的主要成分為幾丁質(zhì)的微孢子蟲孢子。實(shí)施例3與實(shí)施例2相同，為了定性地闡明從微孢子蟲原蟲得到的干燥孢子粉末的結(jié)晶形態(tài)，使用X射線衍射裝置(理學(xué)電機(jī)株式會(huì)社制造)攝錄X射線衍射照片。所得各樣品面間距離的測定值和標(biāo)準(zhǔn)品幾丁質(zhì)一起如表2所示。即使微孢子蟲原蟲的種類不同，在樣品的X射線衍射照片中，也都能見到有對應(yīng)于8.53、6.70、4.64、3.31埃晶面間距的衍射，它們同時(shí)都伴隨著寬的暈光。在幾丁質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的X射線衍射圖中，可見對應(yīng)9.30、6.90、4.64、3.36、3.00、2.80埃晶面間距的衍射，和孢子的X射線衍射圖類似。構(gòu)成微孢子蟲孢子細(xì)胞壁的主要物質(zhì)為幾丁質(zhì)，X射線衍射照片也能確認(rèn)這一點(diǎn)。
表2

實(shí)施例4蠶絲·昆蟲農(nóng)業(yè)技術(shù)研究所保存的微孢子蟲、家蠶微粒子蟲*(相當(dāng)于ATCC第209694號)的孢子用于實(shí)驗(yàn)，對每只2齡起蠶的家蠶幼蟲(日135號×支135號)經(jīng)口接種入3×103個(gè)/毫升的家蠶微粒子蟲孢子。因?yàn)樵诩倚Q幼蟲體內(nèi)微孢子蟲孢子極大量地增殖，發(fā)生孢子的形成，家蠶幼蟲在5齡期時(shí)就皆因微粒子病而死亡。將死亡幼蟲在0.85％氯化鈉水溶液中磨碎后，用脫脂棉濾過，收集孢子。孢子的精制是將2份0.85％氯化鈉水溶液的孢子懸浮液用8份Percoll(商品名瑞典法瑪西亞公司制造)提取分層，以3000rpm在25℃下進(jìn)行30分鐘的離心分離。
從1只家蠶幼蟲所得的家蠶微粒子蟲孢子數(shù)總數(shù)約為1×1010個(gè)。將孢子的水溶液干燥，得到100毫克粉末狀的孢子。實(shí)施例5對桉大蠶蛾Antheraea eucalypti培養(yǎng)細(xì)胞的微孢子蟲家蠶微粒子蟲*的孢子形成狀態(tài)按下述方法進(jìn)行研究。往加了不同量家蠶血清(家蠶體液上清)的市售細(xì)胞培養(yǎng)基(Grace培養(yǎng)液，Gibco公司制造)中接種桉大蠶蛾Antheraea eucalypti培養(yǎng)細(xì)胞后，加入一定量的微孢子蟲家蠶微粒子蟲的孢子，培養(yǎng)給定的時(shí)間，用血細(xì)胞密度計(jì)數(shù)板在顯微鏡觀察下測定每毫升所含的孢子數(shù)。將5齡家蠶幼蟲的足用剪刀剪斷，用冰冷卻的玻璃制試管收集體液，所收集的體液在60℃水浴下加熱15分鐘，除去所含的蛋白質(zhì)，使用如此所得的體液的上清。測定結(jié)果如表3所示。
從此結(jié)果可以明顯地看出，在培養(yǎng)細(xì)胞增殖時(shí)，如果往培養(yǎng)液中加入一定濃度家蠶體液的上清，微孢子蟲孢子就容易在培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)大量增殖，形成孢子。作為經(jīng)濟(jì)且高效生產(chǎn)微孢子蟲孢子的家蠶體液上清的添加量，一般在對應(yīng)培養(yǎng)液約5～50％重量的范圍，優(yōu)選在10～40％重量范圍。
表3

實(shí)施例6與實(shí)施例5不同，使用其它昆蟲來源的培養(yǎng)細(xì)胞，討論培養(yǎng)細(xì)胞中微孢子蟲孢子的增殖狀態(tài)。將家蠶微粒子蟲*和微粒子蟲屬(M 11)兩種原蟲接種于不同種類的昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞，觀察昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞中增加的微孢子蟲孢子的數(shù)量。培養(yǎng)細(xì)胞的增殖方法和實(shí)施例5一樣，評價(jià)培養(yǎng)液中所加體液量分別為細(xì)胞培養(yǎng)基重量的0％和20％兩種情況。所得結(jié)果如表4所示。
表4

實(shí)施例7按以下方法將上述實(shí)施例4制得的微孢子蟲、家蠶微粒子蟲*孢子的細(xì)胞壁物質(zhì)調(diào)制成聚氨基葡糖孢子。首先，將此微孢子蟲孢子在40％氫氧化鈉溶液中80℃下處理4小時(shí)后，加入水洗凈。其結(jié)果是微孢子細(xì)胞壁的主要成分幾丁質(zhì)N-脫乙?；?。光學(xué)顯微鏡和掃描式電子顯微鏡觀察顯示，各微孢子蟲孢子即使進(jìn)行N-脫乙?；幚恚㈡咦酉x孢子也不溶解，仍然保持微孢子形狀。實(shí)施例8將2毫克和實(shí)施例4作同樣處理的家蠶微粒子蟲孢子水解除去孢子內(nèi)容物所得的粉末狀幾丁質(zhì)孢子的細(xì)胞壁組織按以下方法吸附抗生素。水解時(shí)，用室溫的1N NaOH處理12小時(shí)后，用1N HCl在處理12小時(shí)。將分別用NaOH和HCl處理1次作為1個(gè)循環(huán)，合計(jì)反復(fù)操作5個(gè)循環(huán)后，為了使孢子脫水最后用95％乙醇處理2小時(shí)。這樣就能夠?qū)⒆鳛槲㈡咦酉x孢子細(xì)胞壁物質(zhì)的蛋白質(zhì)完全除去。此外，對于抗生素的吸附來說，將10毫克利福平或四環(huán)素用3毫升蒸餾水溶解所得的溶液和該幾丁質(zhì)孢子裝入管中，用水流唧筒(水泵)反復(fù)進(jìn)行3次減壓、抽氣，進(jìn)一步用超聲波進(jìn)行10分鐘處理使抗生素滲透入細(xì)胞壁組織。接著，用離心機(jī)以2500rmp離心分離20分鐘，使含有抗生素的幾丁質(zhì)孢子沉淀下來。進(jìn)一步加入10毫升蒸餾水，再次離心分離，用傾潷的方法除去上清，分離得到含有利福平或四環(huán)素的幾丁質(zhì)孢子。
家蠶微粒子蟲孢子中是否負(fù)載有利福平或四環(huán)素按以下方法確定。將家蠶微粒子蟲孢子小心地用水洗3次后，以3000rpm離心分離20分鐘回收孢子，評價(jià)對番茄潰瘍病細(xì)菌(密執(zhí)安棍狀桿菌密執(zhí)安變種Clavibactermichiganensis pv.michiganensis)增殖的抑制程度。其結(jié)果表明，即使是反復(fù)用水洗的家蠶微粒子蟲孢子也能完全抑制番茄潰瘍病細(xì)菌的增殖，因此判定孢子上負(fù)載有抗生素。實(shí)施例9應(yīng)用實(shí)施例2所示的紅外吸收光譜測定用試樣片的制作方法，如下述過程制造完全不用溴化鋰只用家蠶微粒子蟲孢子作成的圓形板狀片。
將200毫克實(shí)施例4所得的粉末狀家蠶微粒子蟲孢子裝入日本分光工學(xué)工業(yè)公司制造的直徑10mmφ的紅外吸收光譜片劑成形器中，用真空泵抽氣20分鐘后，用油壓式加壓裝置往片劑成形器上施加150kg/cm2的壓力，在此狀態(tài)保持10分鐘的壓力，制得厚度約0.3毫米的強(qiáng)韌的圓形板狀盤。象這樣，能夠?qū)⒈景l(fā)明所得的微孢子蟲孢子作為塊狀材料使用。實(shí)施例10將200毫克實(shí)施例4所得粉末狀家蠶微粒子蟲孢子加入裝有冷凝器的50毫升梨形瓶中，再加入30毫升40％重量的氫氧化鈉水溶液，用油浴在100℃下處理3小時(shí)，得到脫乙酰化度93.6％的均勻微細(xì)粒徑的聚氨基葡糖珠。實(shí)施例11天敵微生物的保護(hù)效果(利用微孢子蟲孢子的對紫外線的細(xì)菌保護(hù)作用)如下述將細(xì)菌封入微孢子蟲孢子中。在和實(shí)施例8相同的條件下進(jìn)行水解處理除去孢子的內(nèi)容物，將2毫克與實(shí)施例4作同樣處理所得的粉末狀家蠶微粒子蟲孢子裝入細(xì)胞培養(yǎng)用的離心管，往其中加入2.0毫升109個(gè)/毫升濃度的地耳腐(褐斑)病細(xì)菌托拉氏假單胞菌Pseudomonas tolaasii或番茄潰瘍病細(xì)菌(密執(zhí)安棍狀桿菌密執(zhí)安變種Clavibacter michiganensispv.michiganensis)的懸濁液，用水流唧筒減壓10分鐘后，解除減壓，引入空氣。減壓和空氣引入反復(fù)操作3次。接著，用離心機(jī)以1000rpm離心分離10分鐘，孢子在離心管底部聚集。取0.2毫升沉淀的孢子(下面稱為有孢子區(qū))，在直徑9厘米的玻璃制培養(yǎng)皿內(nèi)的瓊脂培養(yǎng)基上用L字棒均勻地展開。風(fēng)干孢子液直至在培養(yǎng)基上不呈水狀后，將培養(yǎng)基置于距離紫外燈20厘米處，分別照射10秒、30秒、1分鐘、2分鐘、5分鐘。還有，UV照射實(shí)驗(yàn)在凈化臺內(nèi)進(jìn)行，光源用national GL-15(15瓦)的殺菌燈。紫外線照射3天后統(tǒng)計(jì)1/6培養(yǎng)皿面積上出現(xiàn)的菌落數(shù)，評價(jià)微孢子蟲孢子對紫外線照射的保護(hù)作用。所得結(jié)果如表5所示。還有，在完全不含有微孢子蟲孢子的系統(tǒng)中，將和上述一樣在離心管沉淀所得的細(xì)菌液作為對照區(qū)(下面稱為無孢子區(qū))使用。
表5殺菌燈照射時(shí)間和封入進(jìn)行的微孢子蟲孢子的保護(hù)作用

在上述表5中，1/6培養(yǎng)皿面積中出現(xiàn)的菌落(colony)數(shù)太多以致于不能測定時(shí)，以“多”表示；此外，對于集落數(shù)較多但可以在量上區(qū)別時(shí)，用+++～-(無)四個(gè)級別表示。
在紫外線照射下孢子對細(xì)菌的保護(hù)作用按下述方法定量化。使用半對數(shù)方格紙，將1/6培養(yǎng)皿面積上出現(xiàn)的菌落數(shù)的對數(shù)作為縱軸，將照射時(shí)間以分鐘為單位作為橫軸。從此圖中求出使培養(yǎng)皿中出現(xiàn)的菌落數(shù)減少到大約20個(gè)所需的照射時(shí)間，無孢子區(qū)為30秒，有孢子區(qū)為5分鐘。
從此結(jié)果可見，將地耳腐病細(xì)菌托拉氏假單胞菌Pseudomonas tolaasii封入家蠶微粒子蟲孢子中時(shí)，即使受到紫外線照射，封入內(nèi)部的細(xì)菌的死亡率也比無孢子區(qū)的低，大約有10倍的保護(hù)作用。此外，對番茄潰瘍病細(xì)菌也可見保護(hù)作用。因?yàn)榭梢源_認(rèn)封入所帶來的保護(hù)作用，所以封入了細(xì)菌、酶、生理活性物質(zhì)等的本發(fā)明的微孢子蟲孢子作為天敵微生物用的保護(hù)載體等很有用。實(shí)施例12幾丁質(zhì)孢子的抗生素吸附實(shí)驗(yàn)按下述方法，用濃堿溶液處理幾丁質(zhì)珠，將其改性成聚氨基葡糖珠。將100毫克幾丁質(zhì)珠加入裝有回流冷凝器的梨形瓶中，加入50毫升30％重量的NaOH水溶液，用油浴在100℃下處理2小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，用充足的蒸餾水洗凈，用離心機(jī)以3000rpm離心10分鐘，制備聚氨基葡糖珠。接著，往0.2毫升10毫克利福平溶于3毫升水調(diào)制而成的抗生素水溶液中加入0.5毫克上述聚氨基葡糖珠后，用水流唧筒反復(fù)抽氣5次，制成一個(gè)部分。按實(shí)施例8相同的方法研究對番茄潰瘍病細(xì)菌增殖的抑制作用，結(jié)果表明利福平反復(fù)抽氣5次部分的聚氨基葡糖珠確實(shí)吸附了抗生素。為了研究吸附了利福平的微孢子蟲孢子的聚氨基葡糖作為緩釋載體是否有效，用番茄潰瘍病細(xì)菌評價(jià)其緩釋效果。
如上所述，將0.5毫克微孢子蟲孢子的聚氨基葡糖粉末分散于0.2毫升上述的利福平水溶液中，將此分散液裝入離心管中。接著，以5000rpm離心分離3分鐘，將微孢子蟲孢子沉淀物和上清分離。將0.1毫升沉淀物裝入其它離心管，往其中重新加入1毫升蒸餾水，再次離心分離，以同樣方法分離上清和微孢子蟲孢子沉淀物。每隔一定時(shí)間，就如此所得的沉淀物和上清部分，研究它們對番茄潰瘍細(xì)菌增殖抑制的抗菌作用。這樣得到的結(jié)果如表6所示。
表6

含有微孢子蟲孢子的沉淀物顯示出比上清恒定更高的抗菌活性，因?yàn)榧词乖?天后它也具有抗菌活性，所以可以判定吸附有抗生素的微孢子蟲孢子作為抗生素的緩釋載體是有效的。作為對照所用的上清稀釋液在所經(jīng)過時(shí)間0天時(shí)使用對應(yīng)上清的原液，所經(jīng)過時(shí)間為2、4、6、8天時(shí)分別為依次稀釋10倍的原液(對應(yīng)經(jīng)過時(shí)間2、4、6、8天分別稀釋為10、100、1000、10000倍)。稀釋1000倍時(shí)對照稀釋上清液的抗菌作用消失，而相同樣品所對應(yīng)上清的抗菌活性依然存在。由此可見，微孢子蟲孢子作為抗生素用緩釋載體有效。實(shí)施例13使用培養(yǎng)細(xì)胞的微孢子蟲孢子的生產(chǎn)作為昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞，使用天蠶蛾科的一個(gè)種桉大蠶蛾Antheraeaeucalypti的培養(yǎng)細(xì)胞系、鱗翅目昆蟲來源的Bm36培養(yǎng)細(xì)胞系。使用分別添加了5％在60℃下加熱處理15分鐘的家蠶幼蟲體液上清和胎牛血清的培養(yǎng)液，將桉大蠶蛾Antheraea eucalypti的培養(yǎng)細(xì)胞系、鱗翅目昆蟲來源的Bm36培養(yǎng)細(xì)胞系分別在Grace培養(yǎng)基上、26℃下進(jìn)行培養(yǎng)。微孢子蟲孢子往培養(yǎng)細(xì)胞的接種按下述方法進(jìn)行。即，用Percoll精制已部分精制的微孢子蟲孢子，以0.2N-KOH在25℃下處理30分鐘后，將所得的精制孢子和培養(yǎng)細(xì)胞混合，以進(jìn)行接種。
接種10天后收集這些培養(yǎng)細(xì)胞，將用超聲波清洗器處理破壞的培養(yǎng)細(xì)胞的懸浮液用Percoll分層，進(jìn)行離心分離操作，大量制造微孢子蟲孢子。實(shí)施例14按下述方法除去和實(shí)施例1所用的相同的微孢子蟲孢子(家蠶微粒子蟲)的細(xì)胞壁物質(zhì)蛋白質(zhì)，制造無抗原性的幾丁質(zhì)珠。
首先進(jìn)行水解，在室溫下用1N NaOH處理12小時(shí)后，再用1NHCl處理12小時(shí)。NaOH和HCl處理合計(jì)反復(fù)操作5次后，最后用95％乙醇處理2小時(shí)，將孢子脫水。接著，以2000rpm離心分離20分鐘，沉淀孢子，往此沉淀物中加入水，離心分離操作重復(fù)7次，制得完全除去孢子細(xì)胞壁物質(zhì)蛋白質(zhì)的幾丁質(zhì)珠。為了以血清反應(yīng)檢測如此所得的幾丁質(zhì)珠的抗原抗體反應(yīng)，將從使用了無處理的微孢子蟲孢子的家兔制得的抗血清用于實(shí)驗(yàn)，使用此抗血清的稀釋液，比較對于無處理孢子(對照部分樣品)和處理孢子(水解處理樣品)，稀釋到何種程度的稀釋液與其發(fā)生血清反應(yīng)。其結(jié)果如表7所示。
表7

注)+有血清反應(yīng)-沒有血清反應(yīng)對于無處理孢子(對照部分樣品)，抗血清即使稀釋1024倍也仍然可見血清反應(yīng)，而對于處理孢子(水解處理樣品)稀釋到16倍時(shí)就完全沒有血清反應(yīng)。這樣可以判定，經(jīng)過水解處理，作為孢子細(xì)胞壁成分中抗原的蛋白質(zhì)已被完全除去，所得的幾丁質(zhì)珠是無抗原性的。
用酸或堿除去微孢子蟲孢子的細(xì)胞壁物質(zhì)蛋白質(zhì)后，主要成分幾丁質(zhì)的量相對增加，測定X射線衍射強(qiáng)度確認(rèn)這一點(diǎn)。將微孢子蟲孢子用火棉膠固定，測定X射線衍射，如上述表2所見，可以觀察到R1、R2、R3、R4的衍射環(huán)(干涉環(huán))，但任一個(gè)都顯示出散亂的衍射環(huán)。然而如果用酸或堿只是除去細(xì)胞壁物質(zhì)中的蛋白質(zhì)，那么經(jīng)過此處理的微孢子蟲孢子的幾丁質(zhì)顯示的R1～R2的衍射強(qiáng)度變尖銳，證實(shí)幾丁質(zhì)含量增加。
此外，即使將經(jīng)水解處理的樣品在25℃下與1％的水合茚三酮反應(yīng)20小時(shí)，也完全不見顯色反應(yīng)，可以確定樣品中完全不存在氨基酸。實(shí)施例15具有微細(xì)小孔的幾丁質(zhì)珠和聚氨基葡糖珠將和實(shí)施例1中所用的相同的微孢子蟲孢子(擬微孢子蟲屬M(fèi)27)的懸浮液加入0.2N的氫氧化鉀水溶液中，在25℃下放置30分鐘。1小時(shí)后用和光純藥工業(yè)制造的生物化學(xué)用pH7.2磷酸緩沖液中和樣品。經(jīng)過此簡單的處理，微孢子蟲孢子內(nèi)的細(xì)胞物質(zhì)被活化，細(xì)胞內(nèi)容物從孢子中放出，用掃描式電子顯微鏡觀察確定此時(shí)生成每個(gè)約0.3μm的孔。這種放出細(xì)胞物質(zhì)后的微孢子蟲孢子的大小為長徑1.7μm×短徑0.9μm，細(xì)胞膜厚約0.13μm，呈細(xì)胞壁內(nèi)全空的橢圓球狀，放出細(xì)胞物質(zhì)所形成的孔在橢圓球體長徑方向的一端。因?yàn)榇丝椎拇嬖?，通過對此微孢子蟲孢子環(huán)境壓力的減壓或解除減壓，能夠很容易地將酶、抗生素、金屬離子、藥物、病毒、生理活性物質(zhì)等封入微孢子的空隙中，所以本發(fā)明的幾丁質(zhì)珠和聚氨基葡糖珠，作為大小一致、呈微粒狀態(tài)的上述藥效成分的緩釋載體很有用。實(shí)施例16具有微細(xì)小孔的幾丁質(zhì)珠和聚氨基葡糖珠將實(shí)施例15中所用的微孢子蟲孢子用家蠶微粒子蟲No.520代替，其它和實(shí)施例15作相同處理。如此所得的放出細(xì)胞物質(zhì)后的微孢子蟲孢子的大小為長徑2.6μm×短徑1.4μm，細(xì)胞膜厚約0.13μm，呈細(xì)胞壁內(nèi)全空的橢圓球狀，透射式電子顯微鏡觀察確定，放出細(xì)胞物質(zhì)所形成的孔在橢圓球體長徑方向的一端，孔的直徑為0.1μm。因?yàn)榇丝椎拇嬖?，和?shí)施例5一樣作為藥效成分的緩釋載體有效。實(shí)施例17只除去微孢子蟲孢子的細(xì)胞壁物質(zhì)蛋白質(zhì)的物質(zhì)的安全性實(shí)驗(yàn)如下述方法進(jìn)行。
用實(shí)施例1中制造的微孢子蟲孢子用酸水解處理所得的孢子懸浮液(4×108孢子/毫升)每隔一周給家兔靜脈注射，觀察家兔的發(fā)育過程。接種6個(gè)月后，和沒有注射的對照組兔子相比，注射了的處理組兔子在體重變化和外觀上都完全沒有異常。
產(chǎn)業(yè)上的利用可能性根據(jù)本發(fā)明，均勻微細(xì)粒徑的幾丁質(zhì)珠和聚氨基葡糖珠可以作為藥物輸送系統(tǒng)用載體、甚至化妝品粉底原料使用。在聚氨基葡糖珠上吸附、固定酶或生物體細(xì)胞，能夠作為生物反應(yīng)器應(yīng)用于食品工業(yè)及其它廣泛的領(lǐng)域。
此外，在這些珠的表明和/或內(nèi)部結(jié)合酶或免疫抗體等，可以作為免疫載體使用。此外，將幾丁質(zhì)改良成乙二醇幾丁質(zhì)、羧甲基幾丁質(zhì)的改良幾丁質(zhì)具有優(yōu)良的保溫性，能夠作為化妝品材料使用。還有，將微孢子蟲孢子或幾丁質(zhì)珠用乙烯化合物等進(jìn)行接枝加工后，如往其中固定酶，不僅能提高酶活性的穩(wěn)定性，還因?yàn)槲⒘Ｗ泳哂袕V大有效表面積的特征，能更高效地發(fā)揮酶的功能。
將本發(fā)明的進(jìn)行蛋白質(zhì)除去處理了的幾丁質(zhì)珠、聚氨基葡糖珠即使包埋于包括人在內(nèi)的動(dòng)物體內(nèi)，也不發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，因此它可作為緩釋載體使用。此外，幾丁質(zhì)珠、聚氨基葡糖珠在經(jīng)過一定時(shí)間后，能被體內(nèi)的酶分解，可以作為能在生物體內(nèi)分解的安全材料。幾丁質(zhì)珠、聚氨基葡糖珠即使進(jìn)入生物組織內(nèi)也難于成為抗原，所以可以在其上固定具有生理作用的藥物，然后埋入體內(nèi)使用；特別地，封入具抗癌作用藥物的幾丁質(zhì)珠、聚氨基葡糖珠作為靶向載體能夠利用于尖端的醫(yī)療領(lǐng)域。
此外，本發(fā)明的幾丁質(zhì)珠、聚氨基葡糖珠可以制成內(nèi)部有空隙的中空珠，因?yàn)榧?xì)胞壁組織上開有微細(xì)小孔，所以能夠?qū)⑸矬w細(xì)胞、細(xì)菌、抗生素、生理活性物質(zhì)等通過微細(xì)小孔封入空隙中。封入的物質(zhì)因不易受外界的蛋白質(zhì)變性因素(紫外線等)的影響，其生物活性能夠長期保持。所以這些珠例如能夠作為天敵微生物保護(hù)材料的新原料。
本發(fā)明的微孢子蟲孢子作為藥物、生理活性物質(zhì)、激素、疫苗等的微囊基質(zhì)材料也很優(yōu)秀，將農(nóng)藥、肥料等封入微孢子蟲孢子中再膠囊化的物質(zhì)可以作為土壤改良材料使用。此外，封入飼料成分在膠囊化的物質(zhì)可以作為家畜飼料和養(yǎng)魚飼料使用。
根據(jù)本發(fā)明，通過增減水解處理的程度、或者微孢子蟲孢子的細(xì)胞壁上微細(xì)小孔打開的程度，就能很簡單地控制藥物、生理活性物質(zhì)、抗生素等的緩釋速度、緩釋量、生物分解性的程度。更進(jìn)一步，因?yàn)閹锥≠|(zhì)珠、聚氨基葡糖珠能被生物體內(nèi)的酶逐漸分解，所以能夠作為生物降解性材料使用。
權(quán)利要求
1．昆蟲或培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)增殖的微孢子蟲孢子制得的、以幾丁質(zhì)為主要細(xì)胞壁物質(zhì)的均勻微細(xì)粒徑的幾丁質(zhì)珠和該細(xì)胞壁物質(zhì)幾丁質(zhì)N-脫乙?；纬傻木郯被咸侵椤?br> 2．根據(jù)權(quán)利要求1記載的幾丁質(zhì)珠和聚氨基葡糖珠，其中幾丁質(zhì)珠和聚氨基葡糖珠為除去了蛋白質(zhì)的無抗原性的物質(zhì)。
3．根據(jù)權(quán)利要求1或2記載的幾丁質(zhì)珠和聚氨基葡糖珠，其中增殖微孢子蟲孢子為其細(xì)胞壁上有孔的物質(zhì)，而且?guī)锥≠|(zhì)珠和聚氨基葡糖珠為中空的。
4．載體，是由昆蟲或培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)增殖的微孢子蟲孢子制得的、以幾丁質(zhì)為主要細(xì)胞壁物質(zhì)的均勻微細(xì)粒徑的幾丁質(zhì)珠和該細(xì)胞壁物質(zhì)幾丁質(zhì)N-脫乙酰化形成的聚氨基葡糖珠制成的。
5．根據(jù)權(quán)利要求4記載的載體，其中幾丁質(zhì)珠和聚氨基葡糖珠為除去蛋白質(zhì)的無抗原性的物質(zhì)。
6．根據(jù)權(quán)利要求4或5記載的載體，其中增殖微孢子蟲孢子為其細(xì)胞壁上有孔的物質(zhì)，而且?guī)锥≠|(zhì)珠和聚氨基葡糖珠為中空的。
7．根據(jù)權(quán)利要求4～6任一項(xiàng)記載的載體，其中的載體是用于固定或?qū)肷砘钚晕镔|(zhì)、抗生素、生物體細(xì)胞、微生物、染料、藥物、農(nóng)藥、香料、飼料原料、或食品原料等的物質(zhì)。
8．一種均勻微細(xì)粒徑幾丁質(zhì)珠的制造方法，其特征在于，將濃度為5×102～5×108個(gè)/毫升的微孢子蟲孢子經(jīng)口或經(jīng)皮接種于昆蟲使之增殖后，取出在生育后的昆蟲體內(nèi)增殖的該微孢子蟲孢子，進(jìn)行精制，得到均勻微細(xì)粒子的幾丁質(zhì)珠。
9．根據(jù)權(quán)利要求8記載的均勻微細(xì)粒徑的幾丁質(zhì)珠的制造方法，其特征在于，其中的昆蟲為2齡起的蠶，上述生育后的昆蟲為5齡期。
10．根據(jù)權(quán)利要求8或9記載的均勻微細(xì)粒徑的幾丁質(zhì)珠的制造方法，其特征在于，其中的昆蟲為家蠶幼蟲。
11．一種均勻微細(xì)粒徑聚氨基葡糖珠的制造方法，其特征在于，將濃度為5×102～5×108個(gè)/毫升的微孢子蟲孢子經(jīng)口或經(jīng)皮接種于昆蟲使之增殖后，取出在生育后的昆蟲體內(nèi)增殖的該微孢子蟲孢子，進(jìn)行精制，得到均勻微細(xì)粒子的幾丁質(zhì)珠，接著將幾丁質(zhì)珠的幾丁質(zhì)進(jìn)行N-脫乙?；玫骄郯被咸侵?。
12．根據(jù)權(quán)利要求11記載的均勻微細(xì)粒徑的聚氨基葡糖珠的制造方法，其特征在于，其中的昆蟲為2齡起的蠶，生育后的昆蟲為5齡期。
13．根據(jù)權(quán)利要求11或12記載的均勻微細(xì)粒徑的聚氨基葡糖珠的制造方法，其特征在于，其中的昆蟲為家蠶幼蟲。
14．一種微孢子蟲孢子的制造方法，其特征在于，往含有5～50％重量家蠶幼蟲體液上清的細(xì)胞培養(yǎng)基中加入昆蟲來源的培養(yǎng)細(xì)胞，往此細(xì)胞中接種微孢子蟲孢子使之增殖后，從增殖的細(xì)胞中取出微孢子蟲孢子。
全文摘要
本發(fā)明涉及從主要細(xì)胞壁物質(zhì)為幾丁質(zhì)的微孢子蟲孢子制得的均勻微細(xì)粒徑的幾丁質(zhì)珠、該幾丁質(zhì)N－脫乙?；玫降木鶆蛭⒓?xì)粒徑聚氨基葡糖珠、這些珠的制造方法和這些珠制得的載體以及微孢子蟲孢子的制造方法。使微孢子蟲孢子在昆蟲或培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)增殖,得到以幾丁質(zhì)為主要細(xì)胞壁物質(zhì)的均勻微細(xì)粒徑幾丁質(zhì)珠。使細(xì)胞壁物質(zhì)的幾丁質(zhì)N－脫乙酰化得到聚氨基葡糖珠。昆蟲為家蠶幼蟲時(shí),將濃度為5×10
文檔編號A23L1/22GK1226900SQ98800631
公開日1999年8月25日 申請日期1998年5月13日 優(yōu)先權(quán)日1997年5月14日
發(fā)明者冢田益裕, 白田昭, 早坂昭二 申請人:農(nóng)林水產(chǎn)省蠶絲、昆蟲農(nóng)業(yè)技術(shù)研究所長代表的日本國 被以下專利引用 (1),