專利名稱：微生物活菌組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用已知的酪酸梭菌、雙歧桿菌活菌作為有效成份，調(diào)節(jié)腸道功能及增強(qiáng)體液免疫力的組合物及其制備方法。
在正常人的腸道中生存著大量微生物，細(xì)菌總數(shù)約100萬億個(gè)，微生物間相互作用形成腸道菌群并保持著微生態(tài)平衡。在受到飲食、藥物、微生物、氣候及宿主本身生理狀況發(fā)生劇烈變動(dòng)的情況下，腸道菌群平衡遭到破壞，致病菌大量繁殖，產(chǎn)生大量的有害物質(zhì)，有益菌的生長(zhǎng)受到抑制，從而導(dǎo)致腸道功能紊亂。尤其是自五十年代使用抗生素以來，雖然抗生素在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中起了很大的作用，然而隨著時(shí)間的推移，抗生素帶來的憂慮也越來越明顯，長(zhǎng)期應(yīng)用抗生素所引起抗藥菌株的產(chǎn)生、腸道菌群失調(diào)、抗生素相關(guān)性腹瀉、二重感染已成為目前臨床上難以解決的一大問題。
微生態(tài)制劑是一種口服非致病性活菌制劑，它能改進(jìn)腸道細(xì)菌的平衡，對(duì)人或動(dòng)物產(chǎn)生有益的作用，國(guó)外早在30年前就已進(jìn)入實(shí)際應(yīng)用階段，至今這門科學(xué)發(fā)展迅速，日本、德國(guó)、美國(guó)、法國(guó)、意大利、荷蘭和丹麥等國(guó)已都有產(chǎn)品投放市場(chǎng)。我國(guó)近年來也陸續(xù)出現(xiàn)了一些產(chǎn)品。
目前用于研制生態(tài)制劑的細(xì)菌，主要有雙歧桿菌、乳桿菌、枯草桿菌、腸球菌、大腸桿菌、酵母菌、臘樣芽孢桿菌、地衣芽胞桿菌、棒狀桿菌、類桿菌及表皮葡萄球菌等。其中以雙歧桿菌應(yīng)用最廣，這與雙歧桿菌是人體內(nèi)微生物主要成員有關(guān)，它是人類大腸中的優(yōu)勢(shì)菌，對(duì)人體有營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)作用，對(duì)腸內(nèi)腐敗菌、食物中毒菌、病原菌等有抑制作用，菌群失調(diào)的恢復(fù)主要是雙歧桿菌的恢復(fù)，雙歧桿菌制劑可調(diào)整腸道菌群微生態(tài)平衡。雙歧桿菌是Orla-Jensen1924年發(fā)現(xiàn)，并記載于Peter H.A Sneath主編1986年出版的《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》(Berger’s Manual of Systematic Bacteriology)第二卷第1418頁。本菌存在于土壤和糞便中，其菌種分離方法是將糞便按1∶9(重量、體積比)加入無菌生理鹽水，振蕩混勻后接種于SSCM培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)48小時(shí)，然后用接種環(huán)劃線接種于雙歧桿菌選擇性培養(yǎng)基表面，37℃厭氧培養(yǎng)72小時(shí)；生長(zhǎng)培養(yǎng)特性厭氧條件下生長(zhǎng)良好，菌落灰白色，呈露珠樣，針帽大小，邊緣整齊，突起，表面光滑，為厭氧性細(xì)菌，鏡檢革蘭氏染色陽性，呈直形或彎曲狀，兩端著色較深，可出現(xiàn)“Y”、“V”型的排列形態(tài)，不形成芽胞。據(jù)報(bào)導(dǎo)日本至今雙歧桿菌制劑就有70余種。這些生態(tài)制劑在目前主要用于治療腹瀉、調(diào)整腸道菌群。國(guó)內(nèi)已有用枯草桿菌活菌制劑預(yù)防和控制燒傷創(chuàng)面的感染；用乳桿菌、腸球菌制劑降低膽固醇等。另還有幾種雙歧桿菌活菌制劑，如口服雙歧桿菌活菌制劑商品名為回春生或麗珠腸樂，是由青春型雙歧桿菌制備而成的活菌制劑；如商品名為培菲康，由兩歧雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌和糞鏈球菌組成的活菌制劑等。
酪酸梭菌是1933年由日本千葉醫(yī)科大學(xué)宮入近治首先發(fā)現(xiàn)報(bào)告，并記載于Peter H.A Sneath主編1986年出版的《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》(Berger’s Manual of Systematic Bacteriology)第二卷第1160頁。本菌存在于土壤、動(dòng)物和人的腸道中，可從土壤、動(dòng)物和人的糞便中分離；其分離方法是取糞便，按1∶9(重量、體積比)比例加入無菌生理鹽水，振蕩混勻后接種于SSCM培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)24小時(shí)，然后用接種環(huán)劃線接種于酪酸梭菌選擇性培養(yǎng)基表面，37℃厭氧培養(yǎng)48小時(shí)；培養(yǎng)特征及菌體形態(tài)，生長(zhǎng)培養(yǎng)特性厭氧條件下生長(zhǎng)良好，菌落為灰白色，大小約1-6mm，邊緣不整齊，呈油煎蛋樣，中心有突起，表面不光滑，為厭氧性細(xì)菌，鏡檢革蘭氏染色呈陽性，菌體呈直桿形，兩端較圓，大多數(shù)菌體中央有芽胞。酪酸梭菌是人體腸道內(nèi)暫住非定植性正常菌群，除能調(diào)整和補(bǔ)充正常菌群外，能與雙歧桿菌、乳酸菌等腸內(nèi)的有益菌共生，并促使其增殖和發(fā)育，抑制有害菌和腐敗菌的生長(zhǎng)和繁殖。它能減少胺、吲哚待物質(zhì)的產(chǎn)生；產(chǎn)生B組維生素、維生素K、淀粉酶、酪酸醋酸和乳酸待代謝產(chǎn)物；代謝產(chǎn)物酪酸為人體腸上皮細(xì)胞新陳代謝的主要能量來源，可促進(jìn)腸上皮組織的再生和修復(fù)；酪酸梭菌為梭狀芽胞桿菌，在胃腸內(nèi)不受胃酸、膽汁等的影響，對(duì)多種抗生素有較強(qiáng)的耐受性，可與抗生素共用。
近半個(gè)世紀(jì)以來，酪酸梭菌制劑在日本、韓國(guó)、臺(tái)灣等亞洲國(guó)家和地區(qū)被廣泛應(yīng)用?？烧{(diào)整腸道菌群微生態(tài)平衡、具有增殖雙歧桿菌的作用。
但將酪酸梭菌和雙歧桿菌活菌混合的制劑，利用酪酸梭菌對(duì)雙歧桿菌的增殖作用共同發(fā)揮其有益作用的制劑尚未見文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)。
本發(fā)明的目的是為了提供一種將酪酸梭菌和雙歧桿菌聯(lián)合起來制成一種新的微生態(tài)制劑，利用酪酸梭菌增殖雙歧桿菌的作用，更為有效地發(fā)揮復(fù)合菌制劑調(diào)節(jié)人體腸道菌群及提高人體體液免疫力的作用，可防治胃腸疾病，改善胃腸功能，且無毒無副作用的微生物活菌組合物。
本發(fā)明的目的可通過如下措施來實(shí)現(xiàn)一種微生物活菌組合物它包括酪酸梭菌活菌菌粉、雙歧桿菌活菌菌粉和載體；其中以重量計(jì)每克組合物中含酪酸梭菌數(shù)為105-1010個(gè)，含雙歧桿菌活菌數(shù)為105-1010個(gè)。
本發(fā)明的目的還可通過如下措施來實(shí)現(xiàn)一種微生物活菌組合物的制備方法先培養(yǎng)酪酸梭菌和雙歧桿菌，再從培養(yǎng)物中分離菌體，將菌體按體積比1∶(0.8-1.5)加入乳品，將乳品菌液在低溫真空下凍干得到菌粉；再按每克組合物中分別含酪酸梭菌和雙歧桿菌活菌數(shù)105-1010個(gè)稱取菌粉，然后按常規(guī)制劑比例加入載體至1克，并按常規(guī)制劑方法制劑即可。
酪酸梭菌和雙歧桿菌的培養(yǎng)方式可采用液體培養(yǎng)；上述兩種菌體的培養(yǎng)對(duì)培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)源并無特殊的規(guī)定，可使培養(yǎng)基中含有常用于微生物培養(yǎng)的碳源、氮源及其它營(yíng)養(yǎng)源。其中碳源可為淀粉、糊精、甘油、葡萄糖、蔗糖、肌醇、甘露醇等。氮源可為胨、大豆粉、肉膏、米糖、麥皮、尿素、玉米漿、銨鹽、硝酸鹽，以及其它有機(jī)或無機(jī)含氮化合物。至于其它營(yíng)養(yǎng)源則可適當(dāng)添加一些無機(jī)鹽類。對(duì)溫度、時(shí)間等培養(yǎng)條件并無嚴(yán)格限制，以適于使用菌的生長(zhǎng)為準(zhǔn)，并以選擇酪酸梭菌、雙歧桿菌產(chǎn)量最高的條件為好。例如，培養(yǎng)基的PH范圍可為4-9，尤以接近中性為好。
本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有如下優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明首次將酪酸梭菌和雙歧桿菌聯(lián)合制成新的微生態(tài)制劑，利用酪酸梭菌除能調(diào)整和補(bǔ)充正常菌群外，還能與雙歧桿菌、乳酸菌等腸內(nèi)的有益菌共生，并促使其增殖和發(fā)育功能，來增殖雙歧桿菌，使這一雙菌制劑更能有效地發(fā)揮其調(diào)節(jié)人體腸道群及提高人體體液免疫力的作用。本發(fā)明的防治胃腸功能失調(diào)及改善胃腸功能、提高人體體液免疫力的效果經(jīng)衛(wèi)生部食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗(yàn)所對(duì)小白鼠進(jìn)行的試驗(yàn)證實(shí)。
2、本發(fā)明的組合物急性毒性，經(jīng)小白鼠口服大于10000mg/kg，無任何中毒癥狀及死亡情況。
3、本發(fā)明組合物的穩(wěn)定性在常溫下留樣考察一年，穩(wěn)定性良好。
本發(fā)明還將結(jié)合實(shí)施例作進(jìn)一步詳述實(shí)施例一一種微生物活菌組合物的制備方法包括下述步驟(1)將從成人糞便和嬰兒糞便中分離出的酪酸梭菌和嬰兒型雙歧桿菌菌種接種于庖肉培養(yǎng)基，在38℃下，將酪酸梭菌和嬰兒型雙歧桿菌分別培養(yǎng)10小時(shí)和30小時(shí)；(2)將(1)接種培養(yǎng)后的菌種進(jìn)行傳種；其中酪酸梭菌傳種用GAM(GAM Broth“Nissui”日水制藥株式會(huì)社)；雙歧桿菌傳種用Bf液體培養(yǎng)基；均在38℃下厭氧培養(yǎng)，酪酸梭菌培養(yǎng)12小時(shí)，雙歧桿菌培養(yǎng)36小時(shí)；(3)按2.0％的接種比例，酪酸梭菌和雙歧桿菌分別用LDS培養(yǎng)基和Bf液體培養(yǎng)基，在36℃下厭氧增菌培養(yǎng)24小時(shí)；(4)將(3)增菌培養(yǎng)的菌體培養(yǎng)液(應(yīng)留樣計(jì)數(shù))進(jìn)行14000rpm離心分離得到菌體沉淀，將菌體按體積比1∶1.1加入脫脂牛奶并混勻；牛奶菌液留樣計(jì)數(shù)，測(cè)定總量，然后將牛奶菌液放入-70℃低溫冰箱預(yù)凍14小時(shí)；(5)將預(yù)凍的牛奶菌液在低溫真空下凍干得到菌粉；(6)在酪酸梭菌菌粉和嬰兒型雙歧桿菌菌粉中按常規(guī)制劑比例加入淀粉、蔗糖，并按常規(guī)制劑方法制成片劑，每克片劑中含酪酸梭菌活菌數(shù)為107個(gè)，嬰兒型雙歧桿菌活菌數(shù)為10個(gè)，將活菌數(shù)計(jì)數(shù)后得到的菌粉重量稱重后再按每克片劑的余量加入淀粉和蔗糖即可得到成品。
所述的皰肉培養(yǎng)基的制備方法是以重量份計(jì)將牛肉水500份、酪素水解液500份混合過濾后，煮沸10分鐘，并調(diào)節(jié)其PH值為7.8，然后再加入明膠5份、瓊脂份1.1份、葡萄糖6份，溶解、調(diào)節(jié)PH值為8，并滅菌即可制成。
所述的Bf液體培養(yǎng)基的制備方法是按重量份計(jì)在1000份西紅柿汁中加入0.5份淀粉、14份蛋白胨、5份酵母粉、25份葡萄糖、5份氯化鈉、0.8份吐溫-80，依次加熱溶解，并調(diào)節(jié)PH值為6，滅菌即制成。
所述的LDS培養(yǎng)基的制備方法是按重量份在1000份蒸鎦水中加入17份胨、4份酵母粉、4份淀粉、12份磷酸氫二鈉、12份硫代乙醇酸鈉，依次加熱溶解后，調(diào)節(jié)其PH值為8，滅菌即可制成。
實(shí)施例二一種微生物活菌組合物的制備方法與例一同；但存在下述不同將酪酸梭菌活菌和青春型雙歧桿菌活菌數(shù)均確定為每克制劑含1010個(gè)而得到菌粉的重量，然后再加入硬脂酸鎂和抗壞血酸鈉至1克制劑，硬脂酸鎂與抗壞血酸鈉的重量比按常規(guī)制劑比例，將制劑制成膠囊。
實(shí)施例三一種微生物活菌組合物的制備方法與例一同；但存在下述不同將酪酸梭菌活菌和雙歧雙歧桿菌活菌數(shù)均確定為每克制劑含9×105個(gè)而得到菌粉的重量，然后再加入淀粉和維生素B、D至1克制劑，淀粉和維生素B、D的重量比按常規(guī)制劑比例，將制劑制成微膠囊。
實(shí)施例四一種微生物活菌組合物的制備方法與例一同；但存在下述不同將酪酸棱菌活菌和長(zhǎng)雙歧桿菌活菌數(shù)均確定為每克制劑含6×106個(gè)而得到菌粉的重量，然后再加入乳糖、乳酸鈣和酪蛋白酸鈉至1克制劑，乳糖、乳酸鈣和酪蛋白酸鈉的重量比按常規(guī)制劑比例，將制劑制成粉劑。
權(quán)利要求
1.一種微生物活菌組合物，其特征在于它包括酪酸梭菌活菌菌粉、雙歧桿菌活菌菌粉和載體；其中以重量計(jì)每克組合物中含酪酸梭菌數(shù)為105-1010個(gè)，含雙歧桿菌活菌數(shù)為105-1010個(gè)。
2.如權(quán)利要求1所述的微生物活菌組合物，其特征在于在該組合物中還可添加維生素和/或微量元素和/或甜味劑。
3.一種權(quán)利要求1所述的微生物活菌組合物的制備方法，其特征在于先培養(yǎng)酪酸梭菌和雙歧桿菌，再從培養(yǎng)物中分離菌體，將菌體按體積比1∶(0.8-1.5)加入乳品，將乳品菌液在低溫真空下凍干得到菌粉；再按每克組合物中分別含酪酸梭菌和雙歧桿菌活菌數(shù)105-1010個(gè)稱取菌粉，然后按常規(guī)制劑比例加入載體至1克，并按常規(guī)制劑方法制劑即可。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種微生物活菌組合物,該組合物是先培養(yǎng)酪酸梭菌和雙歧桿菌,再從培養(yǎng)物中分離菌體,將菌體按體積比加入乳品,將乳品菌液在低溫真空下凍干得到菌粉;再按每克組合物中分別含酪酸梭菌和雙歧桿菌活菌數(shù)稱取菌粉,然后按常規(guī)制劑比例加入載體至1克,并按常規(guī)制劑方法制劑即可;本發(fā)明將酪酸梭菌和雙歧桿菌聯(lián)合起來制成一種新的微生態(tài)制劑,利用酪酸梭菌增殖雙歧桿菌的作用,更為有效地發(fā)揮復(fù)合菌制劑調(diào)節(jié)人體腸道菌群及提高人體體液免疫力的作用,可防治胃腸疾病,改善胃腸功能,且無毒無副作用。
文檔編號(hào)C12N1/20GK1252439SQ9812376
公開日2000年5月10日 申請(qǐng)日期1998年10月27日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月27日
發(fā)明者傅思武, 王棣, 孟筱琦 申請(qǐng)人:衛(wèi)生部蘭州生物制品研究所