專利名稱：：抗病型增效菌及其培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種微生物及其培養(yǎng)方法，具體涉及一種抗病型增效菌及其培養(yǎng)方法。防治水稻紋枯病的生物抗菌素——井崗霉素延用至今，在我國已有二十多年，由于藥劑的單一性使藥效有所下降，甚至加大用量效果仍不理想。如何提高井崗霉素對水稻紋枯病的防治效果已成為科研的熱點(diǎn)，開發(fā)新型制劑，使之達(dá)到比井崗霉素更好的防治和增產(chǎn)效果，已成為本領(lǐng)域中技術(shù)人員的攻關(guān)方向。目前市場上出售的增產(chǎn)菌，是根據(jù)微生態(tài)學(xué)理論選育出的一種對作物生長有增產(chǎn)作用的微生物菌，增產(chǎn)菌對作物有明顯的增產(chǎn)作用，但在防治水稻紋枯病的試驗(yàn)中，增產(chǎn)菌并未顯示出防治效果。本發(fā)明的目的在于提供一種抗病型增效菌SD23及其培養(yǎng)方法。作為本發(fā)明的抗病型增產(chǎn)菌SD23，根據(jù)動(dòng)植物細(xì)菌命名法為蠟狀芽孢桿菌(BacillusCereus)，該菌株已于1997年6月25日送交北京，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCCNo.0310。本發(fā)明的上述目的是通過以下方式實(shí)現(xiàn)的一種抗病型增效菌SD23的培養(yǎng)方法，包括從起始菌株DM423經(jīng)分離、提純、復(fù)壯、篩選、抗藥性培養(yǎng)、抗病性培養(yǎng)、適應(yīng)性培養(yǎng)、穩(wěn)定培養(yǎng)、誘變育種和優(yōu)選步驟。本發(fā)明的抗病型增效菌SD23為蠟狀芽孢桿菌(BacillusCereus)，已經(jīng)在北京，中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCCNO.0310。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是明顯的a.菌種安全性高由于該產(chǎn)品的應(yīng)用對象是農(nóng)作物，對菌種的安全性理應(yīng)有較高的要求，為確保本發(fā)明產(chǎn)品的高安全性，本發(fā)明選用了作為治療嬰幼兒腹瀉的DM423菌株(芽孢桿菌)該菌株已通過動(dòng)物安全試驗(yàn)、毒性試驗(yàn)、臨床應(yīng)用等，安全可靠性高。b.對稻麥有增產(chǎn)作用以DM423菌株作為出發(fā)菌株。通過對單子葉作物的親和性選擇試驗(yàn)和應(yīng)用試驗(yàn)，優(yōu)選出對水稻、麥子等單子葉作物增產(chǎn)作用明顯的菌株作為本發(fā)明的生產(chǎn)用菌株。c.兼有抗生素和抗病菌的雙重效果本發(fā)明的菌株與生物抗生素井崗霉素配成復(fù)合制劑，既提高了防治效果。又增加了產(chǎn)量，使井崗霉素這個(gè)老產(chǎn)品煥發(fā)青春，為我國水稻生產(chǎn)發(fā)展、開發(fā)綠色食品和無公害農(nóng)業(yè)以及替代化學(xué)農(nóng)藥或少用化學(xué)農(nóng)藥開辟了具有重要意義的途徑。本發(fā)明抗病型增產(chǎn)菌的培養(yǎng)方法，其優(yōu)選的培養(yǎng)方案如下一、(參見附圖)二、適應(yīng)性菌株的培養(yǎng)1.選配了不同程度的耐藥性培養(yǎng)基，以井崗霉素濃度不同分別為1號井崗霉素含量為10000ppm2號井崗霉素含量為20000pm3號井崗霉素含量為30000ppm4號井崗霉素含量為40000ppm5號井崗霉素含量為5000ppm2.找出菌株在井崗霉素不同濃度中的生長關(guān)系以相同含量的菌株稀釋液同劑量置于以上培養(yǎng)基中培養(yǎng)觀察分析生長情況，生長情況定量考查如下表注平板培養(yǎng)菌落數(shù)為每次三只平板，三次重復(fù)后的單只平板菌落數(shù)。3.采用階梯濃度法篩選適應(yīng)性菌種應(yīng)用微機(jī)分析技術(shù)將增產(chǎn)菌置于不同濃度的井崗霉素中，定向培養(yǎng)經(jīng)過多世代強(qiáng)制性適應(yīng)，采用理化誘變方法，終于獲得適應(yīng)性較強(qiáng)的抗病型增效菌變異菌種。經(jīng)過階梯培養(yǎng)法篩選出的適應(yīng)性菌株，在生產(chǎn)中顯示了良好的效果。菌種在不同井崗霉素濃度培養(yǎng)基中的試驗(yàn)結(jié)果如下表<tablesid="table2"num="002"><tablewidth="492">培養(yǎng)基類號平板培養(yǎng)菌落數(shù)12622332141358</table></tables>以下將結(jié)合最佳具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。實(shí)施例1.出發(fā)菌株原始菌株DM423(B.Cereus)培養(yǎng)基斜面、平板培養(yǎng)基牛肉膏0.5％蛋白胨1％氯化鈉0.5％瓊脂1.5-2.0％pH7.0-7.50.105Mpa高壓滅菌30分鐘搖瓶培養(yǎng)基豆粉4％玉米粉2％魚粉0.4％蛋白胨0.2％酵母粉0.4％磷酸二氫鉀0.02％硫酸鎂0.02％碳酸鈣0.05％pH7.2-7.5發(fā)酵溫度32℃搖床振蕩式2.菌種選育流程(參見附圖2)3.選育方法(1)自然分離a.菌種單孢子懸浮液制備將天冬門葡萄糖斜面于28℃培養(yǎng)6-7天的菌種，用0.85％生理鹽水，洗下孢子加玻璃珠，振蕩數(shù)分鐘，使孢子團(tuán)打成單孢子，經(jīng)過滅菌漏斗(內(nèi)有棉花或紗布)過濾去除菌絲即成為單孢子懸浮液。b.將上述懸浮液用生理鹽水稀釋成不同倍數(shù)，一般為102-108倍即可，以每一種稀釋度取數(shù)滴于含有培養(yǎng)基(天冬素葡萄糖瓊脂)的培養(yǎng)皿中，用無菌推棒涂抹置溫箱中28℃或37℃培養(yǎng)、一般28℃約6天，37℃約3天左右即可挑選菌種再經(jīng)以下(2)、(3)、(4)、(5)和/或(7)物理化學(xué)誘變后進(jìn)行篩選。(2)紫外線處理步驟取上述5ml單孢子懸浮液于直徑9cm的培養(yǎng)皿中在10-50瓦紫外燈下距離5-50cm避光照射0.5-5分鐘稀釋涂皿。(3)紫外線氯化鋰復(fù)合處理步驟經(jīng)紫外線處理后的孢子懸浮液稀釋在0.1-1％(重量)氯化鋰的天冬素-葡萄糖培養(yǎng)基中25°-35℃培養(yǎng)5-10天。(4)快中子處理步驟將上述制備好的單孢子懸浮液，放在靜電加速器產(chǎn)生快中子的減速劑鈹旁，處理劑量為20krad-6krad的處理0.1-2分鐘，稀釋涂皿。(5)X光處理步驟將上述制備好的單孢子懸浮液置于X光照射機(jī)旁以2千、5千、1萬-5萬倫琴處理0.5-50秒鐘后稀釋涂皿。(6)Co60處理每支試管取上述單孢子懸浮液2ml分別放于γ射線中照射，分別用0.5-10萬倫琴處理0.5-2秒鐘，照射后稀釋涂皿。(7)高濃度井崗霉素培養(yǎng)基培養(yǎng)后自然分離步驟將上述篩選出的菌株制成孢子懸浮液在天冬素-葡萄糖培養(yǎng)基中加入井崗霉素，使井崗霉素濃度分別達(dá)2000-100000ppm(每隔1000ppm計(jì)50個(gè)處理)，在上述培養(yǎng)基中，于20-45℃溫箱中培養(yǎng)3-10天后挑選出SD23菌株測定活性和耐藥性。經(jīng)過上述培養(yǎng)方法得到的SD23菌株具有如下特性應(yīng)用效果將井崗霉素5.0×104μg/ml和本發(fā)明的抗病型增效菌SD2320×104μg/ml以下述比例混配，每畝施用200ml，試驗(yàn)對水稻紋枯病的防治效果比例對水稻紋枯病的防治效果(％)崗霉素SD231∶192.291∶284.541∶382.541∶479.222∶181.462∶387.323∶178.543∶286.583∶490.144∶175.674∶389.585∶173.45從應(yīng)用效果可以看出，井崗霉素中加入本發(fā)明的SD23菌后，使用正常劑量防治效果對水稻紋枯病的防效增加了11.1-20％，另外，經(jīng)大田試驗(yàn)結(jié)果證明，增產(chǎn)效果提高了6-10個(gè)百分點(diǎn)。上述實(shí)施例僅為了說明的目的，本發(fā)明的保護(hù)范圍將在權(quán)利要求書中體現(xiàn)。權(quán)利要求1.一種抗病型增產(chǎn)菌，其特征是一種SD23菌株為蠟狀芽孢桿菌(BacillusCereus)，其保藏號為CGMCCNo.0310。2.一種抗病型增產(chǎn)菌的培養(yǎng)方法，其特征在于包括從起始菌株DM423(B.Cereus)出發(fā)，經(jīng)分離、提純、復(fù)壯、篩選以及紫外線處理、紫外線氯化鋰復(fù)合處理、快中子處理、X射線處理、和/或Co60處理，最后經(jīng)高濃度井崗霉素培養(yǎng)后自然分離得到，所述的紫外線處理?xiàng)l件為在10-50瓦紫外燈下，于距離5-50cm避光照射0.5-5分鐘；所述的紫外線氯化鋰復(fù)合處理?xiàng)l件為在0.1-1％(重量)氯化鋰的天冬素-葡萄糖培養(yǎng)基中于25°-35℃培養(yǎng)5-10天；所述的快中子處理?xiàng)l件是在靜電加速器產(chǎn)生快中子的減速劑鈹旁，處理劑量為20krad-6krad；所述的X光處理?xiàng)l件為在2000、5000、10000-50000倫琴劑量下處理后稀釋涂皿；所述的鈷60處理?xiàng)l件為0.5-10萬倫琴的γ射線下處理后稀釋涂皿以及高濃度井崗霉素培養(yǎng)條件為分別在2000-100000ppm的井崗霉素中，在20-45℃培養(yǎng)3-10天分離得到。全文摘要本發(fā)明揭示一種抗病型增產(chǎn)菌及其培養(yǎng)方法,其特征在于SD文檔編號C12N13/00GK1177635SQ9710654公開日1998年4月1日申請日期1997年8月1日優(yōu)先權(quán)日1997年8月1日發(fā)明者馮鎮(zhèn)泰申請人:上海農(nóng)樂生物制品廠