專利名稱：膽鹽刺激的脂酶變異體、編碼其之dna分子和轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及作為膽鹽刺激的脂酶(BSSL；EC 3.1.1.1.)變異體的新的多肽。也涉及編碼所述多肽的DNA分子，涉及含所述DNA分子的亞產(chǎn)品。此外本發(fā)明涉及生產(chǎn)所述BSSL變異體和生產(chǎn)能表達(dá)BSSL變異體的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物的方法。而且本發(fā)明涉及所述的轉(zhuǎn)基因動物及含此轉(zhuǎn)基因動物乳的嬰兒膳食配方。本發(fā)明還涉及含所述多肽的藥物組合物，所述多肽及制造藥物的DNA分子的用途。
背景技術(shù)：
膳食脂類的水解膳食脂類是一種重要的能量來源。富含能量的三脂酰甘油占這些脂類的95％以上。一些脂類，如某些脂肪酸和脂溶性維生素，是必需的膳食成分。在胃腸吸收之前，三脂酰甘油和微量成分，如酯化的脂溶性維生素、膽固醇及二脂酰磷脂酰甘油，需要酯鍵水解以得到疏水性弱、可吸收的產(chǎn)物。通過稱為脂酶的特異性酶類催化這些反應(yīng)。
在人類中，相關(guān)的必需脂酶有，胃脂酶、共脂酶依賴的胰脂酶(水解三-和二脂酰甘油)、胰磷脂酶A2(水解二脂酰磷脂酰甘油)和羧基酯水解酶(CEH)(水解固醇酯和脂溶性維生素酯及三、二和單脂酰甘油)。對哺乳的新生兒，膽鹽刺激的脂酶(BSSL)在水解上述提到的幾種脂類過程中發(fā)揮著重要的作用。脂類消化產(chǎn)物和膽鹽一起形成混合的吸收微團(tuán)或單層吸收囊泡(Hernell et al.，1990)。膽鹽刺激的脂酶膽鹽刺激的脂酶(BSSL)在有限幾個(gè)種類，如人類、大猩猩、貓和狗中是乳中成分(Hernell et al.，1989，Hamosh et al.，1986)。在上部小腸內(nèi)容物中與膽汁混合后，BSSL被初級膽鹽(Hernell，1975)特異地激活。約占總?cè)榈鞍?％的BSSL，和乳一起經(jīng)過胃時(shí)不降解，在十二指腸內(nèi)容物中膽鹽保護(hù)其不被如胰蛋白酶和糜蛋白酶的胰蛋白酶類失活。
加熱處理人乳(巴斯德消毒法62.5℃，30分鐘)，使BSSL完全失活(Bjrksten et al.，1980)，使早產(chǎn)兒的脂肪吸收系數(shù)降低約1/3(Williamson et al.，1978，Atkinson et al.，1981)，因此由于BSSL和同樣脂肪成分的嬰兒膳食配方比，新鮮人乳中三脂酰甘油較好利用(Hernell et al.，1991，Chapell et al.，1986)。
BSSL是一種非特異性脂酶(EC 3.1.1.1)，它不但大量水解三脂酰甘油，而且水解二和單脂酰甘油，膽固醇酯類及脂溶性維生素酯類(Blckberg & Hernell，1983)。因此，活化后，BSSL本身有能力水解人乳中的大部分脂類，縱使人乳三脂酰甘油的最有效利用需要胃脂酶(EC 3.1.1.3)，共脂酶依賴的胰脂酶(EC 3.1.1.3)和BSSL(Bernbck et al.，1990)的協(xié)同作用。
最近研究表明，乳酶對于新生兒利用長鏈多不飽和脂肪酸是特別重要的(Hernell et al.，1992)。這些脂肪酸是eicosanoids的重要前體并有助于神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育。新生兒，尤其早產(chǎn)兒，從前體合成這些脂肪酸的能力有限。因此，認(rèn)為出生后在一段還未確定的時(shí)期內(nèi)仍然需要它們。
最近從幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室研究中已描述了乳脂酶和胰羧基酯水解酶(CEH)(E.C.3.1.1.1)兩者cDNA結(jié)構(gòu)的特征(Baba et al.，1991；Hui et al.，1991；Nilsson et al.，1990；Reue etal.，1991)，結(jié)論為，乳酶和胰酶是同一基因的產(chǎn)物。BSSL或CEH基因的cDNA序列及推導(dǎo)出的氨基酸序列(SEQ ID NO1)也公開在WO91/15234(Oklahoma Medical Research Foundation)和WO 91/18923(Aktiebolaget Astra)中。
BSSL是一種單鏈糖蛋白。推導(dǎo)出的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO3)含722個(gè)氨基酸殘基，而且高度糖基化(Abouakil et al.，1989)。這種蛋白質(zhì)N-端部分的一半同乙酰膽堿脂酶及其它一些脂酶有顯著同源性(Nilsson et al.，1990)。
一個(gè)暫定的絲氨基殘基活性位點(diǎn)定位在第194位絲氨酸；這個(gè)絲氨酸兩側(cè)的序列同絲氨酸水解酶的共有活性位點(diǎn)序列是一致的。一個(gè)暫定的N-糖基化位點(diǎn)、在活性位點(diǎn)絲氨酸N-端的僅7個(gè)殘基處(Nilsson et al.，1990)。
BSSL在其C-端含16個(gè)脯氨酸豐富的重復(fù)序列，每個(gè)重復(fù)序列由11個(gè)氨基酸殘基組成。重復(fù)序列數(shù)量的不同似乎主要解釋了源于不同種之相應(yīng)酶之間分子大小和氨基酸構(gòu)成上的差異(Han et al.，1987；Fontaine et al.，1991；Kyger et al.，1989)。這些重復(fù)序列帶有占此蛋白15-20％的糖類的大部分(Baba et al.，1991；Abouakil et al.，1989)。
在BSSL和典型的脂酶之間獨(dú)一無二的結(jié)構(gòu)差別在多肽鏈的C-端，即由11個(gè)氨基酸殘基組成的16個(gè)富含脯氨酸的重復(fù)序列。牛和大鼠相應(yīng)的胰酶分別只有3和4個(gè)重復(fù)序列(Han et al.，1987；Kyger et al.，1989)。因此，可以假設(shè)即，C-端，或至少部分C-端對于脂酶活性抗乳化的長鏈三脂酰甘油的活性是必不可少的。脂類吸收異常脂類吸收異常及由此引起的營養(yǎng)不良，一般原因是管腔內(nèi)共脂酶依賴的胰脂酶和/或膽鹽的水平降低。這種脂酶缺乏的典型例子是囊性纖維性變患者，其中80％的人由于普遍的遺傳性紊亂導(dǎo)致終生缺陷，再就是慢性胰腺炎，通常由慢性酒精中毒引起。
目前，治療胰脂酶缺乏的患者，是口服很大劑量的豬胰酶粗制品。然而，共脂酶依賴的胰脂酶通常由于胃內(nèi)pH低而失活。使用大劑量的酶不能完全克服此影響。因此大劑量口服胰酶對多數(shù)患者是不夠的，而且該制品不純且口味差。
已制定配方的某種藥片，能通過胃的酸性區(qū)，只在空腸的相對堿性環(huán)境中釋放出酶。但是，許多胰病患者空腸呈不正常的酸性，在那些情況下藥片不能釋放酶。
而且，由于目前市場上的制品為非人類來源，有產(chǎn)生免疫反應(yīng)的危險(xiǎn)性，對患者產(chǎn)生有害作用或降低療效。
此制品進(jìn)一步的弊端是，和共脂酶依賴的脂酶比，其它脂解活性的內(nèi)容物尚未陳述。實(shí)際上，它們多半含很低水平的BSSL/CEH活性。這可能是許多患囊性纖維性變的患者盡管用補(bǔ)充療法，但仍患有脂溶性維生素和必需脂肪酸缺乏的一個(gè)原因。
因此，強(qiáng)烈需要具有人類脂酶特性和結(jié)構(gòu)并具有廣泛底物特異性的產(chǎn)品。此產(chǎn)品能給患一或幾種胰脂解酶缺乏的患者口服。使用本發(fā)明的產(chǎn)品本身或同含其它脂酶的制品結(jié)合滿足了這種需要。本發(fā)明構(gòu)思簡述按照本發(fā)明，重組BSSL變異體有穩(wěn)定的催化活性，但比全長BSSL含較少糖基化位點(diǎn)，由此其生產(chǎn)可能降低糖類的異質(zhì)性程度。這種復(fù)雜性的降低使此重組蛋白易于純化及描述特征，將導(dǎo)致更有效地生產(chǎn)具有BSSL活性的多肽。
另一方面，糖基化程度的降低減少了對宿主的要求，并允許幾種宿主細(xì)胞有較高水平的生產(chǎn)。但在另一方面，BSSL變異體糖基化位點(diǎn)數(shù)的降低，允許較低等真核生物進(jìn)行高效生產(chǎn)并限制可引起免疫反應(yīng)的異常糖基化的潛在危險(xiǎn)。這種大小的降低，糖基化復(fù)雜性較低也表明與具有很復(fù)雜及含大量糖類部分的蛋白質(zhì)相比較，宿主范圍比較廣闊。
治療用BSSL變異體的大小較小，但是活性相等，這意謂著補(bǔ)充所需的物質(zhì)重量減少了。進(jìn)一步，重組BSSL變異體缺乏大多數(shù)或全部O-糖基化重復(fù)單位，可能的優(yōu)點(diǎn)是降低接受個(gè)體中產(chǎn)生免疫反應(yīng)的危險(xiǎn)性。這是因?yàn)橐蕾囉诋a(chǎn)生它的細(xì)胞，O-連接的糖可能是很有異源性的。
科學(xué)文獻(xiàn)指出，天然BSSL粘著在小腸粘液中并通過其吸收。篩選的降低了吸收率的BSSL變異體在較長時(shí)期內(nèi)對膳食脂類底物是有活性的，進(jìn)而產(chǎn)生高效的腔內(nèi)消化。這種變異體的例子是具有降低的糖基化的分子。
如上所述，已證實(shí)BSSL對新生兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育上發(fā)揮重要作用的長鏈多不飽和脂肪酸(Herne1l et al.，1993)和維生素的利用是特別重要的。
按照本發(fā)明，在此方面更有效的BSSL變異體可經(jīng)已知方法篩選。截短的酶可能有不同的構(gòu)象，所述構(gòu)象影響對不同的脂類底物的特異性。
本發(fā)明公開一方面，本發(fā)明涉及編碼短于722個(gè)氨基酸的BSSL變異體的核酸分子，所說的BSSL變異體含SEQ ID NO3中所示536-722殘基部分氨基酸序列。
術(shù)語“部分氨基酸序列”理解為含一個(gè)氨基酸及幾個(gè)氨基酸的序列或幾個(gè)結(jié)合的所述序列。
術(shù)語“BSSL變異體”理解為多肽，具有BSSL活性，并且含序列表SEQ ID NO3所示的人BSSL之部分氨基酸序列。
術(shù)語“具有BSSL活性的多肽”理解為至少含有下列特性的多肽(a)適于口服；(b)能被特異性膽鹽活化；(c)在小腸內(nèi)容物中起非特異性脂酶的作用，即能水解脂類，相對地與其化學(xué)結(jié)構(gòu)和物理狀態(tài)(乳化的、微團(tuán)的、可溶的)無關(guān)；并且可選擇地有一或更多下述特性(d)水解有不同鏈長度及不同不飽和程度之脂肪酸的三脂酰甘油的能力；(e)也有水解二脂酰甘油、單脂酰甘油膽甾烯基酯、溶血磷脂酰甘油、視黃基和其它脂溶性維生素酯的能力；(f)不但有水解三脂酰甘油的sn-1(3)酯鍵的能力，而且有水解sn-2酯鍵的能力；(g)不但具有和初級膽鹽相互作用的能力，而且有和次級膽鹽相互作用的能力；(h)最佳活性依賴膽鹽；(i)在胃內(nèi)容物中穩(wěn)定，對其催化效率的影響不會達(dá)到任何實(shí)質(zhì)程度；(j)若膽鹽存在，穩(wěn)定地抗胰酶，如胰蛋白酶失活；(k)結(jié)合肝素和肝素衍生物，如硫酸肝素的能力；
(l)和脂-水界面結(jié)合的能力；(m)對低壓凍干法足夠穩(wěn)定；(n)當(dāng)和食物成分，如人乳或乳膳食成分混合時(shí)穩(wěn)定。
另一些方面，本發(fā)明涉及如上所述的核酸分子，其中所說BSSL變異體在其C-端位置有一個(gè)苯丙氨酸殘基，或在其C-端部分含一個(gè)谷氨酰胺-蛋氨酸-脯氨酸(Gln-Met-Pro)序列，另一方面在其C-端部分可替換含有SEQ ID NO3中第712-722殘基所示的氨基酸序列。
在本發(fā)明中，術(shù)語“C-端位置”命名為最后的C-端殘基位置，而術(shù)語“C-端部分”可理解為組成BSSL變異體C-端的約50個(gè)氨基酸殘基。
如上所述本發(fā)明進(jìn)一步涉及核酸分子，其中所說的BSSL變異體含不到16個(gè)的重復(fù)單位。本發(fā)明中術(shù)語“重復(fù)單位”命名為33個(gè)核苷酸的重復(fù)單位之一，所述每一核苷酸均在序列表SEQ ID NO1中有說明。
另一些方面，本發(fā)明涉及上述編碼一種多肽的核酸分子，所述多肽的氨基酸序列與序列表中的SEQ ID NO5、6或9所示的氨基酸序列有至少90％的同源，并涉及編碼一種多肽的核酸分子，所述多肽的氨基酸序列與序列表SEQ ID NO7所示的氨基酸序列至少有90％的同源，但編碼187位置上有一個(gè)天冬酰胺的多肽的那些核酸分子除外。
本發(fā)明也涉及序列表中SEQ ID NO5、6、7、或9所示的多肽以及如上所說的核酸序列編碼的多肽。
本發(fā)明還涉及一種含上述核酸分子的雜種基因，一種含所述雜種基因的可復(fù)制的表達(dá)載體以及含有所述雜種基因的細(xì)胞。所述細(xì)胞可以是原核細(xì)胞、單細(xì)胞真核有機(jī)體或源于多細(xì)胞有機(jī)體如哺乳動物的細(xì)胞。
在本發(fā)明中，“雜種基因”意思是核酸序列，它一方面包含編碼如上定義的BSSL變異體的核酸序列，另一方面含有能調(diào)控所述雜種基因產(chǎn)物表達(dá)的基因之核酸序列。術(shù)語“基因”意思是在所需組織能調(diào)控和定位雜種基因表達(dá)的一個(gè)完整的基因和其亞序列。通常，所說的亞序列至少有一或多個(gè)啟動子區(qū)、一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、3′和5′非編碼區(qū)和結(jié)構(gòu)序列。
優(yōu)選地，雜種基因通過在體外將編碼BSSL變異體的核酸序列插入到用現(xiàn)有技術(shù)能調(diào)控表達(dá)的基因中而形成的。另外，編碼BSSL變異體的核酸序列在體內(nèi)可通過同源重組插入。
在本發(fā)明中，術(shù)語“可復(fù)制的”意思是指載體能在給定類型的它被導(dǎo)入的宿主細(xì)胞中復(fù)制。緊接核酸的序列上游可提供一個(gè)編碼信號肽的序列，信號肽的存在保證了由含載體的宿主細(xì)胞表達(dá)的BSSL變異體的分泌。信號序列可以是天然和核酸序列有關(guān)的，或是其它來源的。
載體可以是適于重組DNA方法的任何載體，載體的選擇通常依賴于它被導(dǎo)入的宿主細(xì)胞。因此，載體可以是自主復(fù)制載體，即作為染色體外單位存在的載體，其復(fù)制不依賴染色體復(fù)制；此類載體的例子育質(zhì)粒、噬菌體、粘粒、微小染色體或病毒。另外，載體可以是這樣的載體，當(dāng)其引入宿主細(xì)胞時(shí)，整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組中，與其整合的染色體一起復(fù)制。適宜的載體例子是細(xì)菌表達(dá)載體和酵母表達(dá)載體。本發(fā)明的載體可攜帶上述定義的本發(fā)明的任何核酸序列。
另一方面，本發(fā)明涉及重組多肽的生產(chǎn)方法，所說方法包括(i)在能于特異性宿主細(xì)胞或有機(jī)體中復(fù)制的雜種基因中插入上述核酸分子；(ii)將所得的重組雜種基因?qū)胨拗骷?xì)胞或有機(jī)體；(iii)在培養(yǎng)基內(nèi)或上使所得的細(xì)胞生長，或鑒定并繁殖有機(jī)體，以表達(dá)多肽；和(iv)回收多肽。
用于生長細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是適于此目的的任何常規(guī)培養(yǎng)基。合適的載體可以是上述任何載體，而合適的宿主細(xì)胞可以是上述列出的任何類型細(xì)胞。用于構(gòu)建載體和使其引入宿主細(xì)胞的方法可以是重組DNA領(lǐng)域中用于此目的的任何已知方法?？梢苑置诩?xì)胞表達(dá)的人重組BSSL變異體，即通過細(xì)胞膜輸出，這依賴于細(xì)胞的類型和載體的構(gòu)成。
如果BSSL變異體由重組宿主細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生，即，細(xì)胞不分泌出BSSL變異體，則可通過標(biāo)準(zhǔn)方法，包括通過機(jī)械方法，如聲處理或勻漿化，或通過酶學(xué)或化學(xué)方法使細(xì)胞裂解，接著進(jìn)行純化而回收。
為了分泌，編碼BSSL變異體的DNA序列之前應(yīng)有一編碼信號肽的序列，其存在保證了BSSL變異體從細(xì)胞中分泌，以致將至少相當(dāng)比例的表達(dá)的BSSL變異體分泌到培養(yǎng)基中并回收。
本發(fā)明也涉及到一種表達(dá)系統(tǒng)，包括在含有所說的雜種基因的宿主細(xì)胞或有機(jī)體中可以表達(dá)的雜種基因，當(dāng)雜種基因表達(dá)時(shí)產(chǎn)生重組多肽，通過將上述核酸序列插入能調(diào)節(jié)所說雜種基因表達(dá)的基因中產(chǎn)生所述的雜種基因。
生產(chǎn)本發(fā)明的重組BSSL變異體可能的方法是使用能將BSSL變異體分泌到其乳中的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物。轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物的使用，其優(yōu)點(diǎn)是可以以合理的成本獲得高產(chǎn)率的重組BSSL變異體，尤其若非人類哺乳動物是母牛時(shí)，在乳中生產(chǎn)作為例如嬰兒膳食配方的正常組分的重組BSSL變異體以便當(dāng)使用重組BSSL變異體作為以乳為基本的產(chǎn)品中的營養(yǎng)添加劑時(shí)不必過度純化。
而且在較高等有機(jī)體如非人類哺乳動物中生產(chǎn)通常會對哺乳動物蛋白進(jìn)行正確的加工，如有關(guān)上述的翻譯后加工過程和適當(dāng)折疊，也可以得到大量基本上純的BSSL變異體。
因此，上述表達(dá)系統(tǒng)可以是哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)，其包括編碼BSSL變異體的DNA序列，此序列插入到編碼非人類哺乳動物乳蛋白的基因中，以便形成在成年哺乳動物雌性乳隙內(nèi)可表達(dá)的雜種基因，所述哺乳動物含有所說雜種基因。
通常認(rèn)為，作為表達(dá)組織的乳腺和編碼乳蛋白的基因特別適合于在轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物中生產(chǎn)異源蛋白質(zhì)，由于乳蛋白在乳腺中通常以高表達(dá)水平生產(chǎn)。而且易于大量收集和使用乳。在本發(fā)明中，在重組BSSL變異體的生產(chǎn)中使用乳蛋白基因的進(jìn)一步的益處是，利用表達(dá)調(diào)節(jié)及生產(chǎn)位置(乳腺)在類似其自然生產(chǎn)條件的條件下進(jìn)行生產(chǎn)。
當(dāng)在轉(zhuǎn)基因哺乳動物中使用時(shí)，上述雜種基因優(yōu)選地含有編碼信號肽的序列，以便能將雜種基因產(chǎn)物正確地分泌到乳腺內(nèi)。信號肽典型地通常是在所述研究的乳蛋白基因中發(fā)現(xiàn)的或是與編碼BSSL變異體的DNA序列相關(guān)的。但是，能調(diào)節(jié)雜種基因產(chǎn)物使其分泌到乳腺內(nèi)的其它信號序列，也是相關(guān)的。當(dāng)然，雜種基因的各種元件應(yīng)以如此方式融合，以便使基因產(chǎn)物進(jìn)行正確表達(dá)及加工。因此，應(yīng)將編碼所需信號肽的DNA序列與編碼BSSL變異體的DNA序列的N-末端部分精確融合。在雜種基因中，編碼BSSL變異體的DNA序列，通常含有其終止密碼子，但不是其自身的信息裂解和聚腺苷酸位點(diǎn)。通常保留編碼BSSL變異體的DNA序列的下游，乳蛋白基因的mRNA加工序列。
許多因素被認(rèn)為對某個(gè)特別雜種基因的實(shí)際表達(dá)水平有影響。啟動子及上述其它調(diào)節(jié)序列的能力、哺乳動物基因組中表達(dá)系統(tǒng)的整合位點(diǎn)、編碼BSSL變異體的DNA序列在乳蛋白編碼基因中的整合位點(diǎn)、賦予轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件及其它類似因子對獲得的表達(dá)水平是相當(dāng)重要的。根據(jù)對影響雜種基因表達(dá)水平的各種因子的認(rèn)識，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道怎樣設(shè)計(jì)用于本發(fā)明目的的表達(dá)體系。
所用的乳蛋白基因可源于與表達(dá)體系所插入的乳蛋白基因之種相同，或源于別的種。就此而論已表明，乳腺靶基因表達(dá)的調(diào)節(jié)元件在功能上跨躍了種的界限，這也許是由于可能的共同祖先(Hennighausenet al.1990)。
在構(gòu)建本發(fā)明表達(dá)體系中所用的編碼乳蛋白適宜的基因或其有效的亞序列通常發(fā)現(xiàn)于不同哺乳類源的乳清蛋白之中，如乳清酸蛋白(WAP)基因，優(yōu)選的是鼠源的；和β-乳球蛋白基因，優(yōu)選的是羊源的。而且可能發(fā)現(xiàn)不同來源的酪蛋白基因也適于BSSL變異體的轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)，如牛αS1-酪蛋白和兔β-酪蛋白。目前優(yōu)選的基因是鼠WAP基因，因發(fā)現(xiàn)其可在不同轉(zhuǎn)基因動物乳中使許多外源人類蛋白質(zhì)的高水平表達(dá)(Hennighausen et al.1990)。
另一個(gè)和本發(fā)明表達(dá)系統(tǒng)相關(guān)的優(yōu)選序列是能調(diào)節(jié)高水平表達(dá)的所謂表達(dá)穩(wěn)定序列。強(qiáng)有力證據(jù)表明，此穩(wěn)定序列發(fā)現(xiàn)于乳蛋白基因附近和上游。
本發(fā)明也包括生產(chǎn)能表達(dá)BSSL變異體的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物的方法，包括(a)將上述表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)入受精卵或非人類哺乳動物胚胎細(xì)胞以便使表達(dá)系統(tǒng)摻入哺乳動物種系；和(b)使所得的受精卵或胚胎發(fā)育成為成年雌性非人類哺乳動物。
可使用任何合適的技術(shù)，如在“Manipulating the MouseEmbryo”，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press 1986中描述的將表達(dá)系統(tǒng)摻入哺乳動物種系。例如，幾百個(gè)分子的表達(dá)系統(tǒng)可直接注射進(jìn)受精卵，如受精的一個(gè)細(xì)胞卵或其卵原核，或所用哺乳動物的胚胎，此后將微注射的卵轉(zhuǎn)入假孕代育母親的輸卵管，使其發(fā)育。
生產(chǎn)能表達(dá)BSSL變異體的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物的方法也包括其中所說的哺乳動物基本上不能表達(dá)來自哺乳動物本身的BSSL的方法。所述方法包括(a)損害哺乳動物的BSSL表達(dá)能力以便基本上不表達(dá)哺乳動物BSSL，并按上述將一個(gè)表達(dá)系統(tǒng)以使在哺乳動物中表達(dá)BSSL變異體的方式插入哺乳動物種系，和/或(b)用如上限定的表達(dá)系統(tǒng)取代哺乳動物BSSL基因或其部分。
通過在導(dǎo)致BSSL表達(dá)的DNA序列中引入突變可以方便地破壞哺乳動物的BSSL表達(dá)能力。所述突變可以包括使DNA序列脫離框架、引入終止密碼、缺乏DNA序列的一或多個(gè)核苷酸。
可用上述的表達(dá)系統(tǒng)或通過熟知的同源重組原理用編碼BSSL變異體的DNA序列取代哺乳動物BSSL基因或其部分。
在更重要的方面，本發(fā)明涉及在其基因組中有如上DNA序列的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物。所說DNA序列可優(yōu)選地存在于哺乳動物的胚系及哺乳動物的乳蛋白基因中。優(yōu)選地可從包括小鼠、大鼠、兔、羊、豬和牛篩選轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物。
本發(fā)明也包括如上轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物的后代及從所述轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物獲得的乳。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及含如上乳的嬰兒配方及上述含BSSL變異體的嬰兒配方。嬰兒配方可使用常規(guī)方法制備，而且可含任何必需的添加劑礦物質(zhì)、維生素等。
進(jìn)一步，本發(fā)明涉及含如上BSSL變異體的藥物組合物及所述BSSL變異體在治療中的應(yīng)用。
更進(jìn)一步，本發(fā)明涉及用上述BSSL變異體制造用于治療與外分泌胰腺功能不全膽囊纖維化、慢性胰腺炎、脂肪吸收障礙、脂溶性維生素吸收不良、由于病理原因造成的脂肪吸收不良相關(guān)的病理狀態(tài)之藥物。本發(fā)明也涉及用于藥物制造的BSSL變異體對于改善膳食脂類利用的用途，尤其在早產(chǎn)兒中。
實(shí)施例1.重組BSSL在真核及原核細(xì)胞中的表達(dá)1.1實(shí)驗(yàn)方法1.1.1重組質(zhì)粒被克隆進(jìn)pUC19中的含2.3kb 人BSSL cDNA(NilSSon et al.1990)的質(zhì)粒pS146經(jīng)HindIII和SalI酶解，將BSSL cDNA導(dǎo)入牛乳頭瘤病毒(BPV)表達(dá)載體，pS147(圖1)。此載體含有位于鼠金屬硫因1(mMT-1)控制增強(qiáng)子及啟動元件之下(Paylakis&Hamer，1983)的人BSSL cDNA。mRNA加工信號通過含部分外顯子II、內(nèi)含子II、外顯子III及兔β-球蛋白基因下游元件的基因組片段提供。將該轉(zhuǎn)錄單位克隆進(jìn)含整個(gè)BPV基因組的載體中。對BPV和BSSL轉(zhuǎn)錄單位來說，轉(zhuǎn)錄是單方向的。為了使此載體在大腸桿菌中繁殖，該載體還包含pML2d，它是pBR322的衍生物(Sarver et al.1982)。
表達(dá)載體pS147和在Harrey肉瘤病毒5′-長未端重復(fù)序列及SV40多腺苷酸化信號(Lusd & Botchan，1984)驅(qū)動下的編碼新霉素抗性基因的載體共轉(zhuǎn)染。
為了在大腸桿菌中表達(dá)BSSL，從質(zhì)粒pT7-7(Ausubel et al，1992)中將BSSL cDNA作為NdeI-BamHI片段亞克隆到pGEMEX-1(Promega，Madison，WI，USA)(Studier & Moffat，1986)中。用這種克隆方法，T7基因10編碼序列被前面加起始密碼子的編碼成熟蛋白質(zhì)的BSSL基因置換。最終表達(dá)載體pGEMEX/BSSL通過使用特異的BSSL內(nèi)引物，經(jīng)DNA測序證實(shí)。1.1.1.2誘變指定起始密碼ATG中的A為核苷酸1號。對于氨基酸序號，信號肽中的第一個(gè)蛋氨酸號為-23，將成熟蛋白質(zhì)中第一個(gè)氨基酸殘基，丙氨酸，指定為1號。
為構(gòu)建缺失變異體A(SEQ ID NO4)，合成了兩個(gè)PCR引物，PCR-1和PCR-2(表1)。為了克隆進(jìn)不同的質(zhì)粒，產(chǎn)生了HindIII、SalI和BamHI位點(diǎn)。沒有改變氨基酸序列，在BSSL序列中產(chǎn)生了BclI位點(diǎn)。這樣做為了便于加入合成的DNA，以獲得其它變異體。引物PCR-2含兩個(gè)合成的終止密碼子。所得的PCR片段經(jīng)BamHI和HindIII酶解并克隆進(jìn)pUC18以便序列分析。該質(zhì)粒命名為pS157。正確的PCR片段通過在獨(dú)一無二的Asp700位點(diǎn)(BSSL cDNA中1405位置)和β-球蛋白基因片段前部的SalI位點(diǎn)與BSSL序列融合而插入到BPV表達(dá)載體，結(jié)果產(chǎn)生pS257。
通過使用3、4、7和8號寡核苷酸(表1)獲得了B-變異體構(gòu)建體(SEQ ID NO5)。退火的寡核苷酸正好編碼C-未端氨基酸序列相當(dāng)于全長蛋白質(zhì)中的賴氨酸712至苯丙氨酸722。此片段和谷氨酰胺525融合。一個(gè)翻譯終止子直接插入到最后一個(gè)苯丙氨酸后。此片段在5′端含一個(gè)BclI位點(diǎn)并在3′端含一個(gè)SalI位點(diǎn)，使其能夠?qū)雙S157。所得的質(zhì)粒用Asp700和SalI酶解，將313bp片段導(dǎo)入上述的表達(dá)載體。產(chǎn)生的質(zhì)粒命名為pS258。表1.
用于構(gòu)建BSSL變異體的合成的寡核苷酸在限制性位點(diǎn)的核苷酸下面劃了線。翻譯終止信號由黑體字標(biāo)出。變異體N中可變密碼在PCR-3中用黑體字和星號標(biāo)出。<

為了構(gòu)建編碼C-變異體(SEQ ID NO6)的基因，使用1至6號寡核苷酸(表1)。退火的DNA片段含兩個(gè)重復(fù)序列，編碼11個(gè)氨基酸與共有序列(Nilsson et al.1990)一致，在谷氨酰胺535和賴氨酸712-苯丙氨酸722序列之間插入。此片段也含一個(gè)5′端的BclI位點(diǎn)及一個(gè)3′端SalI位點(diǎn)，以允許與上述相同的克隆策略。所得的質(zhì)粒命名為pS259。
為構(gòu)建變異體N(非-N-糖基化的變異體，SEQ ID NO7)，合成了兩個(gè)PCR引物(PCR-3和PCR-4，表1)。產(chǎn)生EcoRI和BamHI位點(diǎn)，以使360bp的PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)pUC19中進(jìn)行序列分析。將潛在N-連接的糖基化位點(diǎn)，在天冬酰胺187，變成谷氨酰胺。分離作為BalI-HindIII片段的修飾的序列然后與含mMT-1啟動子和5′端BSSL cDNA的SacI和BalI片段一起克隆進(jìn)SacI和HindIII消化過的pUC19，一個(gè)約1.2kb的SacI-DraIII片段由此質(zhì)粒分離到，然后分別插入到在表達(dá)載體之內(nèi)的mMT-1元件和BSSL cDNA序列中。所得的質(zhì)粒命名為pS299。1.1.3.哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染根據(jù)磷酸鈣沉淀法(Graham &amp; Van der Eb，1973)將載體共轉(zhuǎn)染進(jìn)鼠細(xì)胞系C127(ATCC CRL 1616)。
在補(bǔ)充10％胎牛血清的Ham′s F12-Dulbecco′s ModifiedEagle′s培養(yǎng)基(DMEM)(1∶1)中培養(yǎng)C127細(xì)胞。用1.5mg×ml-1的G418篩選新霉素抗性細(xì)胞克隆，10-15天后，抗性細(xì)胞克隆從主平皿中分離，傳代，用于分析。1.1.4細(xì)菌菌株和培養(yǎng)條件為了表達(dá)實(shí)驗(yàn)將載體pGEMEX/BSSL轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株JM109(DE3)和BL21(DE3)pLysS中。表達(dá)實(shí)驗(yàn)按Studier等人(1986)的描述進(jìn)行。收集細(xì)菌后，通過離心(4℃，5,000xg 10分鐘，)沉淀細(xì)胞。為制備周質(zhì)和胞質(zhì)部分，將沉淀重懸于每克沉淀4ml20mM Tris-Cl/20％蔗糖，pH8.0，200μl0.1MEDTA及40μl的溶菌酶(15mg/每ml水)中。重懸液置冰上40分鐘。每克沉淀物加160μl0.5M MgCl2，此后在12000xg，離心懸液20分鐘，產(chǎn)生的上清液含周質(zhì)蛋白質(zhì)，沉淀物代表細(xì)胞質(zhì)部分。另外，為制備可溶性蛋白質(zhì)，將細(xì)胞懸于40mM Tris-Cl，0.1mMEDTA，0.5mM(苯基甲基磺酰氟化物pH8.2)，凍融和聲處理幾次使其溶解。離心細(xì)胞溶解液(25℃，30,000xg 30分鐘)。1.1.5.核酸分析從分離的哺乳動物細(xì)胞系或大腸桿菌細(xì)胞(Ausubel et al，1992)制備RNA和DNA。在瓊脂糖凝膠中使RNA或DNA分離，轉(zhuǎn)印到GeneScreen Plus(New England Nuclear)上，按供應(yīng)商的說明雜交。1.1.6.天然酶的制備按前述的方法(Blckberg &amp; Hernell，1981)從人乳中純化膽鹽刺激的脂酶。純化的制品經(jīng)SDS-PAGE判斷同源性，當(dāng)用長鏈三脂酰甘油為底物檢測時(shí)，比活性為每分鐘，每mg釋放100μmol脂肪酸。1.1.7酶分析使用阿拉伯樹膠乳化的三油酸甘油酯為底物，按所述的方法(Blckberg &amp; Hernell，1981)進(jìn)行酶檢測。用10mM膽酸鈉為激活的膽鹽，進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)檢測膽鹽依賴性時(shí)，加入膽鹽(膽酸鈉或脫氧膽酸鈉，Sigma Chem. Co)達(dá)到表3中所給的濃度。1.1.8 Western印跡為了在印跡實(shí)驗(yàn)中獲得有意義的反應(yīng)，通過Blue Sepharose(Pharmaci LKB Biotechnology)層析濃縮條件培養(yǎng)基。將各個(gè)培養(yǎng)基和Blue Sepharose(每ml凝膠約10ml培養(yǎng)基)混合。用含0.1MKCl的0.5M Tris-Cl緩沖液，pH7.4洗滌凝膠(每ml膠10ml)。酶活性用同一緩沖液的1.5M KCl洗脫。用此方法濃縮了25-30倍，純化了3-5倍。按Laemmli(1970)方法，必要地在10％聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行SDS-PAGE。轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，與抗純化的BSSL的多克隆兔抗血清一起孵育后，用和堿性磷酸酶結(jié)合的山羊抗兔IgG及來自Bio-Rad的發(fā)育試劑盒進(jìn)行測定結(jié)果。1.1.9用N-糖苷酶F處理加1μl 1M的β-巰基乙醇和0.5μl 10％(w/v)的SDS到含BSSL活性為每分鐘釋放2.5μmol脂肪酸的10μl變異體B中。煮沸5分鐘后，加入10μl 0.1M磷酸鈉緩沖液pH8.0，6μl0.1M EDTA，4μl 7.5％(w/v)Nonidet P40和5μl(IU)N-糖苷酶F(Boechringer Mannheim)。作為對照，處理了同等量的變異體B，除無糖苷酶加入外。在37℃溫育過夜后樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳，并使用多克隆兔BSSL抗血清進(jìn)行印跡。1.2.結(jié)果1.2.1構(gòu)建BSSL變異體在表2和圖1中概括了關(guān)于全長BSSL，BSSL變異體的修飾。用于產(chǎn)生這些變異體的策略在1.1.部分描述了。對變異體A(SEQ IDNO4)而言，終止密碼引入到谷氨酰胺535位置后，去除了全長蛋白質(zhì)的最后187個(gè)氨基酸。對變異體B(SEQ ID NO5)而言，編碼正巧11個(gè)氨基酸的區(qū)域和原始翻譯終止子與谷氨酰胺-535融合，因此，這種變異體缺乏所有的重復(fù)序列。對變異體C(SEQ IDNO6)而言，含兩個(gè)重復(fù)序列的片段，插入到谷氨酰胺-535和賴氨酸-712至苯丙氨酸722序列之間。所述重復(fù)序列含有與共有序列(Nilsson et al，1990)相同的序列。
為了分析唯一不明確的N-連接的碳水化合物結(jié)構(gòu)(其位置接近活性位點(diǎn)絲氨酸-194)的重要性構(gòu)建變異體。通過將天冬酰胺-187變成谷氨酰胺而改變潛在的N-糖基化位點(diǎn)獲得變異體N(SEQ IDNO7)。表2和人類BSSL相關(guān)的BSSL變異體的氨基酸序列

1.2.2哺乳動物細(xì)胞系重組DNA的特征描述重組DNA樣品從用編碼不同BSSL變異體的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系中制備。制備的DNA用BamHI消化，在瓊脂糖凝膠上分開，并轉(zhuǎn)移至雜交膜上。使用的探針是32P標(biāo)記的BSSL cDNA。雜交結(jié)果證實(shí)了重組基因的存在，而且載體拷貝數(shù)在不同的細(xì)胞系大約相等(圖2)。雜交片段的位置反映了各種BSSL序列的長度并與期望大小一致。位置也類似于起源于細(xì)菌的用于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的DNA，表明在細(xì)胞系中沒有主要的載體DNA的重排(圖2)。代表變異體A的DNA一樣品中上邊的雜交信號可能歸因于部分消化。1.2.3在哺乳動物細(xì)胞中全長和突變BSSL mRNA的表達(dá)為分析不同重組BSSL基因的表達(dá)，從分離的細(xì)胞系中制備了mRNA。Northern印跡實(shí)驗(yàn)和用32P-標(biāo)記的BSSL cDNA雜交實(shí)驗(yàn)表明，在含有BSSL裁體(圖3)的所有細(xì)胞系中都可檢測到重組mRNA。在對照樣品中沒有雜交，所述對照樣品得自含除BSSL cDNA外的相同載體的細(xì)胞系(圖3)。
雜交mRNA的不同長度與cDNAs的修飾一致。在不同樣品中重組BSSLmRNA變異體的穩(wěn)定狀態(tài)水平除了變異體A(圖3)外，幾乎是相同的。變異體A mRNA積累降低的原因尚未知曉，但觀察到兩個(gè)細(xì)胞系群及分離的克隆。在不同樣品中等量RNA的存在，通過用鼠β-actin探針(圖3，較低組)雜交證實(shí)1.2.4生產(chǎn)哺乳動物全長和BSSL變異體收集了源于單個(gè)克隆的用全長BSSL及其不同突變形式轉(zhuǎn)染的C127-細(xì)胞培養(yǎng)基并分析BSSL的活性(圖4)。對于全長分子和變異體N、B和C，最高表達(dá)克隆的活性范圍是每分鐘每毫升培養(yǎng)基釋放0.7-2.3μmol脂肪酸。和天然人乳中BSSL的比活性比較，此表達(dá)水平為每毫升培養(yǎng)基7-23μg。對變異體A而言，所有分析的克隆其活性低于每分鐘每毫升培養(yǎng)基釋放0.05μmol脂肪酸。在Blue-Sepharose柱上濃縮和冷凍干燥顯示最高活性的克隆，表明的確表達(dá)了有活性的酶，盡管表達(dá)水平較低不能排除。通過相當(dāng)?shù)捅然钚越忉屢宰儺愺wA部分獲得的低活性可能性。
源于不同轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)克隆的Western印跡顯示于圖5A。BSSL變異體明顯的Mr正如所望。但是應(yīng)注意到，對全長BSSL及變異體B和C而言，出現(xiàn)了雙條帶。因?yàn)樗羞@三個(gè)都有單一完整的N-糖基化位點(diǎn)，而沒出現(xiàn)雙條帶的變異體N缺少N-糖基化位點(diǎn)，所以可能解釋為，雙條帶產(chǎn)生于N-糖基化的差別。因此變異體B應(yīng)該用N-糖苷酶F消化。如圖5B所示，上面的帶只保留痕量，而下面的帶強(qiáng)度增加，表明只有部分表達(dá)的變異體N-糖基化了。
BSSL的特性之一是其可通過初級膽鹽，如膽酸鹽(Hernell，1975)將異性活化。所有不同重組形式的BSSL證明了膽酸鹽活化的相同濃度依賴性(圖6)。在使用的實(shí)驗(yàn)體系中約10mM獲得了最大活性。當(dāng)將膽酸鹽換成脫氧膽酸鹽(次級膽鹽)，無此活化產(chǎn)生。因此，重組全長及不同的變異體證明了膽鹽活化的同一特異性。1.2.5.大腸桿菌中全長BSSL的表達(dá)及生化特性用含位于T7啟動子控制下的人BSSL cDNA的表達(dá)載體pGEMEX/BSSL轉(zhuǎn)化兩個(gè)大腸桿菌菌株JM109(DE3)和BL21(DE3)pLysS(Studier et al.，1986)。鑒別來自于兩個(gè)菌株的轉(zhuǎn)化體，將其培養(yǎng)并用IPTG誘導(dǎo)約90分鐘(Studier et al.，1986)。通過使用BSSL cDNA為32P標(biāo)記的探針，經(jīng)Northern印跡分析總mRNA表明，兩個(gè)菌株中均有效地誘導(dǎo)了表達(dá)而且轉(zhuǎn)錄受到密切調(diào)節(jié)(圖7A)。明顯的重組BSSL mRNA的大小約2.4kb，和期望長度一致。蛋白質(zhì)樣品的SDS-PAGE分離及用抗BSSL抗體的免疫測定表明在大腸桿菌中有效地產(chǎn)生了全長BSSL(圖7B)。BL21(DE3)pLysS菌株比JM109(DE)(圖7B)菌株有更多的蛋白質(zhì)被分泌到周質(zhì)。
IPTG誘導(dǎo)的大腸桿菌培養(yǎng)基含相當(dāng)于0.5-4μg蛋白質(zhì)/ml培養(yǎng)基的活性可溶的BSSL。Western印跡證明20-60％的反應(yīng)物在不溶的沉淀物中。未誘導(dǎo)的細(xì)菌不包含任何明顯的BSSL活性。
來自培養(yǎng)細(xì)菌的脂酶活性表明和天然乳中BSSL有同樣的膽鹽依賴性。2.重組全長和突變的膽鹽刺激脂酶的純化及特征描述2.1.實(shí)驗(yàn)方法2.1.1.酶和酶變異體如上所述構(gòu)建和表達(dá)了重組全長BSSL和BSSL變異體B、C和N。和天然的酶比較，變異體B(SEQ ID NO5)缺少所有16個(gè)獨(dú)一無二的，O-糖基化的，富含脯氨酸、C-未端重復(fù)序列(aa 526-711)，但含有大部分的融合于谷氨酰胺-535的C-未端片段(aa712-722)。變異體C(SEQ ID NO6)含同樣的C-未端片段和在谷氨酰胺-535與賴氨酸-712之間的兩個(gè)11個(gè)殘基的重復(fù)單位。在變異體N(非-N-糖基化變異體，SEQ ID NO7)，負(fù)責(zé)唯一連接糖的天冬酰胺-187換成了谷氨酰胺殘基。天然BSSL從人乳中按所述方法純化(Blckberg &amp; Hernell，1981)。2.1.2.酶分析用阿拉伯乳化的三油酸甘油酯為底物，如所述(Blckberg &amp;Hernell，1981)測定了脂酶活性，用膽酸鈉(10mM)為活化膽鹽。此測定的不同變化在


中給出。2.1.3.制備免疫吸附劑按制造者的描述用CMBr，使純化的乳BSSL(5mg)結(jié)合到Sepharose上?？辜兓娜锽SSL兔產(chǎn)生的多克隆抗血清40ml通過此柱。用0.1M甘氨酸-HCl pH2.5洗脫特異抗體。用固態(tài)Tris使pH立即調(diào)至8左右。脫鹽和凍干后，將6mg親和純化抗體與上述Sepharose結(jié)合。2.1.4.純化方法含5-25μg重組表達(dá)BSSL或BSSL變異體的條件培養(yǎng)基，以每ml配好凝膠10ml培養(yǎng)基與Blue Sepharose混合(Pharmacia，Swedan)。徹底混合30分鐘后，用0.05M Tris-Cl pH7.0，0.05MKCl流洗凝膠；脂酶活性用0.05M Tris-Cl，pH7.0，1.5MKCl洗脫。收集活性峰，對5mM佛多那鈉，pH7.4，0.05M NaCl透析。透析液用于肝素-Sepharose柱。此柱用在5mM佛多那鈉緩沖液，pH7.4中的梯度0.05-1.0M NaCl洗脫。收集含脂酶活性的組分，用于免疫吸附柱，用0.05M Tris-Cl pH7.5，0.1 5M NaCl流洗后，0.1M甘氨酸-HCl、pH2.5洗脫結(jié)合的脂酶。用固態(tài)Tris使組分的pH立即調(diào)到8左右。2.1.5.電泳基本根據(jù)Laemmli(1970)方法，進(jìn)行了十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)蛋白質(zhì)用考馬斯亮藍(lán)染色。2.1.6.N-未端序列分析在Applied Biosystems公司的477A脈沖液相測序儀及帶有來于制造商的規(guī)范循環(huán)程序和化學(xué)品的連網(wǎng)苯硫乙內(nèi)酰脲120A分析儀上進(jìn)行氨基酸序列分析。從測得的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)序列(β-乳球蛋白)計(jì)算，最初及重復(fù)產(chǎn)量分別為47％和97％。2.2.結(jié)果2.2.1.重組BSSL和BSSL變異體的純化主要用在Blue Sepharose柱上層析條件培養(yǎng)基作為濃縮步驟。接著在肝素-Sepharose柱上層析主要是去除培養(yǎng)基中存在的大部分白蛋白得到初步純化。此步驟也說明，重組BSSL分子都具有肝素結(jié)合能力。免疫吸附后，所有BSSL變異體，象經(jīng)SDS-PAGE(圖8)制定的那樣，純度超過90％。全長酶及變異體B和C作為成對物遷移。不同變異體的表觀Mr列于表3。N-未端序列分析對所有8個(gè)循環(huán)的變異體測出了一個(gè)單一順序Ala-Lys-Leu-Gly-Ala-Val-Tyr-Thr-。2.2.2.脂酶活性表3顯示了不同制品的表觀分子量。制品的比活性范圍是每分鐘每毫克蛋白質(zhì)釋放游離脂肪酸75-120μmol。因此沒有觀察到全長BSSL和BSSL變異體間活性的顯著差別。
所有制品說明絕對需要對抗長鏈三脂酰甘油的初級膽汁鹽(膽酸鈉)活性(圖9A)。脫氧膽酸鈉不能提供任何變異體活性(資料未列出)。但是，一旦結(jié)合不同的膽鹽，脫氧膽酸鹽就有雙重作用(圖9B和C)。首先它降低活化必需的膽酸鹽濃度，其次在較高膽鹽濃度下抑制酶的活性。表3重組全長BSSL和BSSL變異體的表觀Mr

2.2.3.重組BSSL和BSSL變異體的穩(wěn)定性重組BSSL和BSSL變異體與天然乳BSSL顯示了同樣的pH穩(wěn)定性(圖10)。pH在2.5-3左右所有情況下都有失活發(fā)生。pH在3以上，所有變異體是完全穩(wěn)定的，提供的蛋白質(zhì)濃度足夠高。這通過加入小牛血清白蛋白或卵清蛋白達(dá)到(資料未列出)在所有測試的pH，稀釋的樣品都是不太穩(wěn)定的，但閾值是一樣的(資料未列出)。圖11顯示和天然乳酶比較，重組酶的熱穩(wěn)定性。在37-40℃此活性開始降低。變異體(B、C、N)穩(wěn)定性比全長重組酶和乳酶略低。但是，如果蛋白質(zhì)濃度通過加入小牛血清白蛋白得到提高，所有變異體在40℃也是穩(wěn)定的(圖11)。
天然乳BSSL和所有重組變異體對胰蛋白酶都敏感。一種依賴時(shí)間的失活獲得了(圖12)。但是，如果膽鹽，即膽酸鹽存在于緩沖液中，脂酶變異體就得到了保護(hù)，脂酶活性保留下來(圖12)。
因此，鑒于許多體外特征，即膽鹽活化、肝素結(jié)合、pH和溫度穩(wěn)定性及對蛋白酶失活的膽鹽保護(hù)將不同的BSSL變異體與天然乳BSSL比較，沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異。3.在轉(zhuǎn)基因動物中表達(dá)3.1.表達(dá)裁體的構(gòu)建為了構(gòu)建在轉(zhuǎn)基因動物乳中生產(chǎn)重組人BSSL變異體的表達(dá)載體，使用了下列策略(圖13)。
應(yīng)用Lidberg等人(1992)敘述的方法，獲得了含人BSSL基因不同部分的質(zhì)粒(pS309、pS310、pS311)。質(zhì)粒pS309含一個(gè)SphI片段，此片段包含5′-非轉(zhuǎn)錄區(qū)至第四內(nèi)含子的部分序列。質(zhì)粒pS310含一個(gè)SacI片段，此片段含有一從第一內(nèi)含子的部分序列至第六內(nèi)含子的部分序列的BSSL變異體基因序列。最后質(zhì)粒pS311含一個(gè)BamHI片段，此片段含BSSL基因的第五內(nèi)含子的主要部分及缺失第十一外顯子的內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu)的其余部分。缺失的序列是231bp，它能產(chǎn)生一個(gè)編碼BSSL變異體的序列，此變異體實(shí)際上含77個(gè)氨基酸或比全長BSSL少七個(gè)重復(fù)單位。產(chǎn)生BSSL變異體(變異體T)的核苷酸序列列于序列表SEQ ID NO8中。變異體T的氨基酸序列列于序列表SEQ ID NO9中。
由于在人BSSL基因第十一外顯子有高度的重復(fù)序列，在這種序列克隆進(jìn)質(zhì)?；蛟诩?xì)菌中繁殖時(shí)，可設(shè)想有相當(dāng)高的重排頻度。根據(jù)這種假設(shè)，含有截短第十一外顯子的所需BSSL變異體基因得到了鑒定、分離、進(jìn)行了序列分析。另一個(gè)質(zhì)粒pS283，含部分在HindIII和SacI位點(diǎn)克隆進(jìn)pUC19的部分人BSSL cDNA，用于基因組序列的融合。質(zhì)粒pS283也用于獲得合適的限制酶酶切位點(diǎn)，KpnI位于BSSL5′非翻譯前導(dǎo)序列中。
用NcoI和SacI消化質(zhì)粒pS283，通過電泳分離到一約2.7kb的片段。用NcoI和BspEI消化質(zhì)粒pS309，分離到一包含BSSL基因5′-部分約2.3kb的片段。用BspEI和SacI消化質(zhì)粒pS310，分離到一含BSSL基因中間段部分約2.7kb的片段。這三個(gè)片段連接在一起，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌菌株TG2，經(jīng)氨基芐青霉素篩選分離轉(zhuǎn)化體。
從許多轉(zhuǎn)化體制備了質(zhì)粒，一個(gè)含所要構(gòu)建物的質(zhì)粒，叫pS312(圖14)，用于進(jìn)一步研究。
為了獲得pS311的修飾形式，位于終止密碼下游的BamHI位點(diǎn)換成SalI位點(diǎn)，便于進(jìn)一步克隆，使用了下列方法通過BamHI部分消化，使質(zhì)粒pS311線性化。分離到線性化的片段，將BamHI換成SalI位點(diǎn)的合成DNA接頭(5′-GATCGTCGAC-3′)插入，破壞了BamHI位點(diǎn)。由于有兩個(gè)潛在的用于整合合成接頭的位置，所以通過限制酶切割分析所得的質(zhì)粒。在11外顯子下游理想位置插入接頭的質(zhì)粒得到分離，命名為pS313。
為了獲得含有人BSSL變異體基因組序列的最終表達(dá)載體構(gòu)建體，使用現(xiàn)有的表達(dá)載體pS314，設(shè)計(jì)它來調(diào)節(jié)泌乳期乳腺細(xì)胞的階段和組織特異性表達(dá)。質(zhì)粒pS314含一個(gè)克隆為NotI片段的鼠乳清酸性蛋白(WAP)基因(Campbell et al.1984)的基因組片段。
基因組片段含約4.5kb的上游調(diào)節(jié)序列(URS)，所有四個(gè)鼠WAP外顯子及所有內(nèi)含子序列、約3kb的最后外顯子的下游序列。獨(dú)一無二的KpnI位點(diǎn)位于天然WAP翻譯起始密碼上游第一個(gè)外顯子24bp內(nèi)。另一個(gè)獨(dú)一無二的限制酶位點(diǎn)位于第三外顯子內(nèi)SalI位點(diǎn)。
人BSSL變異體基因組序列用下列方法插入到KpnI和SalI位點(diǎn)間，第一，用KpnI和SalI消化pS314，電泳分離代表裂解質(zhì)粒的片段，第二，用KpnI和BamHI消化pS312一個(gè)約4.7kb，代表BSSL基因5′部分的片段得到分離。第三，用BamHI和SalI消化pS313，分離到人BSSL基因的3′一部分。這三個(gè)片段連接起來，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，經(jīng)氨基芐青霉素選擇后分離轉(zhuǎn)化體。
質(zhì)粒從幾個(gè)轉(zhuǎn)化體中得到制備，通過限制酶圖譜和序列分析仔細(xì)分析。確定了代表所需的表達(dá)載體的一個(gè)質(zhì)粒，命名為pS317(圖15)。
為了移去原核質(zhì)粒序列，用NotI消化pS317。此后，含人BSSL變異體基因組片段和側(cè)翼的鼠WAP序列的重組載體因子經(jīng)瓊脂糖電泳分離。分離的片段在注進(jìn)鼠胚胎之前進(jìn)一步經(jīng)電洗脫純化。
在轉(zhuǎn)基因鼠乳中表達(dá)人BSSL變異體的重組基因顯示于圖16。3.2.轉(zhuǎn)基因動物的產(chǎn)生按照3.1.部分從質(zhì)粒pS317分離一個(gè)NotI片段。此DNA片段含連接到編碼人BSSL變異體基因組序列的鼠WAP啟動子。這種分離片段以3ng/μl的濃度，將其注射進(jìn)從供體小鼠獲取的350C57B1/6J×CBA/2J-f2胚胎的原核中，供體小鼠預(yù)先用5IU懷孕母馬牛清用于排卵過速的促性腺激素處理。C57B1/6J×CBA/2J-f1動物從Bomholtgard Breeding和Research Center LTD，Ry，Denmark獲得。從輸卵管采集胚胎后，用M2培養(yǎng)基(Hogan etal.1986)中的透明質(zhì)酸酶處理，從丘細(xì)胞分離胚胎。清洗后，將胚胎轉(zhuǎn)至M16培養(yǎng)基(Hogan et al，1986)，保存在5％CO2孵箱中。使用液壓微操作器和帶有Nomarski鏡片的Nikon倒置顯微鏡，在輕石蠟油下的M2微粒中進(jìn)行注射。注射后，267個(gè)看上去健康的胚胎埋植進(jìn)12個(gè)假孕的，經(jīng)腹膜內(nèi)注射0.3個(gè)ml，2.5％AvertinC57B1/6J×CBA/2J-f1受體中。從動物生后三周獲得的尾尸檢標(biāo)本DNA，經(jīng)PCR分析，識別整合轉(zhuǎn)基因的小鼠。用Southern Blot分析證實(shí)了陽性結(jié)果。
為收集乳，雌性泌乳期動物用2IU催產(chǎn)素經(jīng)腹膜內(nèi)注射，十分鐘后用0.40ml，2.5％的Avertin腹膜內(nèi)麻醉。集乳器通過一個(gè)硅化過的管附在乳頭上，通過輕輕按摩哺乳動物腺體，將乳收集到一個(gè)1.5ml的Eppendorf管中。乳量隨泌乳天數(shù)改變，每個(gè)小鼠及每次收集在0.1和0.5ml之間。3.3.轉(zhuǎn)基因小鼠中BSSL變異體的表達(dá)通過剪尾樣本制備的DNA分析鑒別轉(zhuǎn)基因鼠。組織樣品與蛋白酶K溫育，經(jīng)酚/氯仿抽提。如存在代表表達(dá)載體片段的異源引入的DNA擴(kuò)增特異的片段的帶引物的聚合酶鏈反應(yīng)中使用分離的DNA。用DNA雜交實(shí)驗(yàn)分析動物以證實(shí)PCR數(shù)據(jù)并檢測可能的重排，整合載體元件的結(jié)構(gòu)并得到有關(guān)整合載體元件拷貝數(shù)的資料。
在一套實(shí)驗(yàn)中，用兩種方法分析了31只小鼠，結(jié)果表明，一只鼠帶有pS317的異源DNA載體元件。PCR分析和雜交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致(圖17)。
總共65個(gè)測試動物，有10個(gè)是pS317轉(zhuǎn)基因的。
將鑒定帶有載體DNA元件(建立者動物)的小鼠配對，F(xiàn)1動物用同樣的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因分析。
通過瓊脂糖福爾馬林凝膠電泳分離在泌乳期從pS317轉(zhuǎn)基因雌性動物不同組織中分離的RNA，然后轉(zhuǎn)至濾紙上，以32P一標(biāo)記的BSSLcDNA為探針雜交。獲得的結(jié)果證明，在泌乳期表達(dá)在乳腺表達(dá)受限制(圖18)。
從麻醉的用催產(chǎn)素處理誘導(dǎo)泌乳的建立者動物收集乳樣品，分析重組BSSL變異體的存在。此是通過SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，及與產(chǎn)生的抗天然人BSSL的多克隆抗體孵育實(shí)現(xiàn)。
獲得的結(jié)果證實(shí)了轉(zhuǎn)基因小鼠乳中重組人BSSL變異體的表達(dá)。圖19證實(shí)了轉(zhuǎn)基因小鼠乳中重組8SSL變異體的存在。SDS-PAGE分離及源于不同pSB17轉(zhuǎn)基因小鼠的乳樣品免疫印跡分析顯示，和全長源于轉(zhuǎn)基因pS314的小鼠乳中重組BSSL比較，帶有還原性表觀分子量的重組BSSL產(chǎn)量高。質(zhì)粒pS314類似pSB17，不同的是，pS314含全長人BSSL cDNA，不含基因組變異體。出現(xiàn)在所有鼠乳樣品中的雙帶代表鼠BSSL，并因此顯出抗血清的交叉反應(yīng)。出現(xiàn)在圖19的第9泳道明顯的雙帶(包含純化的鼠BSSL)的觀察進(jìn)一步支持這個(gè)結(jié)論。
穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因動物系產(chǎn)生了。
用相似的方法，也可制備能表達(dá)人BSSL變異體的其它轉(zhuǎn)基因動物，如兔、奶牛或綿羊。保藏根據(jù)布達(dá)佩斯條約在DSM(Deutsche Sammlung VonMikroorganismen und Zellkulturen)保藏了下列質(zhì)粒

附圖概述圖1A.用于表達(dá)不同BSSL變異體的BPV為基本載體的圖譜。B.分析不同BSSL變異體的圖例說明。FL表示全長BSSL?；钚晕稽c(diǎn)用圓圈表示，潛在的N-連接的碳水化合物位點(diǎn)用三角形表示。含重復(fù)序列的區(qū)域用條線區(qū)表示，保守的C-未端用涂滿黑色區(qū)表示。圖2源于表達(dá)BSSL變異體細(xì)胞系的DNA的Southern印跡分析。分析了從表達(dá)全長BSSL(FL)、變異體A(A)、變異體B(B)、變異體C(C)和變異體N(N)制備的DNA。用BamHI消化5μg各自制備的細(xì)胞DNA(左)及1ng純化的細(xì)菌裁體DNA(右)。DNA樣品在瓊脂糖凝膠上分離，轉(zhuǎn)移至GeneScreen Plus膜上，與32P-標(biāo)記的人BSSL cDNA雜交。圖3從表達(dá)BSSL變異體的細(xì)胞系分離的RNA的Northern印跡分析。分析了從生產(chǎn)全長BSSL(FL)、變異體A(A)、變異體B(B)、變異體C(C)、變異體N(N)的細(xì)胞系制備的10μg總RNA。用來自C127細(xì)胞系的RNA作負(fù)對照(-)(上邊組)所述細(xì)胞系含有與圖1中載體相同的BPV-載體，除了編碼一個(gè)與BSSL不相干的蛋白質(zhì)外，用32P-標(biāo)記的BSSL cDNA與濾膜雜交。用鼠β-肌動蛋白cDNA為探針，與濾膜再次雜交。β-肌動蛋白mRNA信號(下邊組)用作上樣到每一泳道m(xù)RNA量的內(nèi)標(biāo)對照。圖4在用全長和突變形式的人BSSL轉(zhuǎn)染的C127細(xì)胞中BSSL的表達(dá)活性。C127細(xì)胞用不同的BSSL構(gòu)建體轉(zhuǎn)染全長BSSL(FL)、變異體N(N)、變異體C(C)、變異體B(B)、變異體A(A)。起始生長期后，篩選個(gè)別克隆，使之成長至匯合。篩選的克隆(n)數(shù)表示在圖中。在條件培養(yǎng)基上確定脂酶活性。其數(shù)值用每ml條件培養(yǎng)基每分鐘釋放的游離脂肪酸的μmol表示。圖5A.全長和突變的重組BSSL的Western印跡分析。脂酶活性的量表示為，每分鐘釋放脂肪酸的μmol，用于凝膠是，全長0.2(泳道1)、變異體NO.16(泳道2)、變異體C0.6(泳道3)、變異體B0.8(泳道4)及天然BSSL0.1(泳道5)。所用的抗血清是在抗從人乳純化的BSSL的兔中產(chǎn)生的。分子大小標(biāo)記(Prestained SDS-PAGEStandard，Low Range，BioRad)標(biāo)在左邊。B.N-糖苷酶F處理的變異體B的Western印跡。用實(shí)驗(yàn)方法所述的N-糖苷酶F消化變異體B。泳道1是未處理的，泳道2是處理的變異體B。圖6全長及突變BSSL的膽鹽依賴性。在改變濃度的膽酸鈉(實(shí)線)或脫氧膽酸鈉(斷線)存在的情況下，在來自全長重組BSSL(*)、變異體A(□)、變異體B(▲)變異體C(■)、變異體N(●)及純化的人乳BSSL(○)的條件培養(yǎng)基上確定脂酶活性。對A變異體而言，按實(shí)驗(yàn)方法所述，在Blue Sepharose上濃縮條件培養(yǎng)基。除了最大活性只有其它酶的1/10變異體A外，選擇各來源的酶量以獲得同樣的最大活性水平。對照實(shí)驗(yàn)表明生長培養(yǎng)基不影響活性水平或天然BSSL的膽鹽依賴性(數(shù)據(jù)未列出)。圖7A.使用pGEMEX通過不同的大腸桿菌菌株產(chǎn)生的BSSL Northern印跡。細(xì)菌用實(shí)驗(yàn)方法中所述的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。
實(shí)驗(yàn)條件見圖2所示。泳道1，菌株BL21(DE3)pLysS，未誘導(dǎo)的泳道2，菌株BL21(DE3)pLysS，誘導(dǎo)的；泳道3，菌株JM109(DE3)，未誘導(dǎo)的；泳道4，菌株JM109(DE3)，誘導(dǎo)的。B.使用抗純化的乳BSSL的抗體8-18％SDS-PAGE Western印跡表明，使用pGEMEX在不同大腸桿菌菌株中重組BSSL的表達(dá)。用IPTG誘導(dǎo)細(xì)菌，按實(shí)驗(yàn)方法所述從裂解液制備細(xì)胞質(zhì)和周質(zhì)蛋白質(zhì)。上樣至泳道2-5(周質(zhì)制品)和7-10(胞質(zhì)制品)的細(xì)菌蛋白質(zhì)量代表了使菌株和生產(chǎn)水平成比例的相同培養(yǎng)量。泳道1，Pharmacia分子大小標(biāo)記；泳道2和3，菌株JM109(DE3)，誘導(dǎo)的；泳道3和7，菌株JM109(DE3)，未誘導(dǎo)的；泳道4和10，菌株BL21(DE3)pLysS，誘導(dǎo)的；泳道5和9，菌株BL21(DE3)pLysS，未誘導(dǎo)的；泳道6，25ng純化的天然BSSL。圖8純化的重組BSSL及BSSL變異體的SDS-PAGE。全長重組BSSL(FL)和BSSL變異體N、B及C按所述純化。除了B用1.5μg外，每種用3μg純化的天然乳BSSL(NAT)用5μg。分子大小標(biāo)記的位置在左邊。圖9通過膽酸鈉，脫氧膽酸鈉對重組BSSL及BSSL活化的作用。在無(左邊組)或存在5mM(中間組)或10mM(右邊組)脫氧膽酸鹽的條件下，用不同濃度的膽酸鈉分析了純化的重組全長BSSL(●)、重組BSSL變異體B(○)、C(■)和N(▲)、及純化的天然乳BSSL(□)制品的脂酶活性。圖10重組BSSL和BSSL變異體在不同pH的穩(wěn)定性。在37℃，pH2-8的不同緩沖液中溫育天然BSSL、重組全長BSSL及BSSL變異體。所有緩沖液均含1mg/ml牛血清白蛋白，30分鐘后，撤去分裝品，分析脂酶活性，符號的解釋見圖9的說明。圖11重組BSSL和BSSL變異體的熱穩(wěn)定性。在50mM Tris-Cl緩沖液pH7.5，指定的溫度下溫育純化的重組全長BSSL.BSSL變異體及天然乳BSSL。一組牛血清白蛋白(BSA)樣品加至1mg/ml。30分鐘后撤出樣品并分析脂酶活性。活性表示為在0分鐘每份樣品的活性百分比，符號的解釋見圖9的說明。圖12膽鹽對通過胰蛋白酶使重組BSSL及BSSL變異體失活的影響。在25℃，有(實(shí)線)無(斷線)10mM膽酸鈉存在條件下，將純化重組全長BSSL、BSSL變異體及天然乳BSSL(15μl含14μg)加到含10μg胰蛋白酶(TPCK-胰蛋白酶、Boehringer-Mannheim)60μl，1.0M Tris-Cl pH7.4的溶液中。在指定時(shí)間，撤除測定樣品，分析脂酶活性。數(shù)值表示為無胰蛋白酶條件下對照溫育中獲得值的百分比。符號解釋見圖9的說明。圖13生產(chǎn)質(zhì)粒pS317的方法，更詳細(xì)資料見3.1部分圖14質(zhì)粒pS312的圖示結(jié)構(gòu)。圖15質(zhì)粒pS317的圖示結(jié)構(gòu)。圖16表示3.1部分所述WAP第一外顯子內(nèi)人BSSL變異體基因組結(jié)構(gòu)物理上引入的物理圖譜。圖17A.用于轉(zhuǎn)基因動物鑒定的PCR引物的定位圖示。5′-引物位于在融合上游位置-148bp開始的WAP序列內(nèi)，所述融合在WAP和BSSL變異體之間。3′-引物位于編碼融合點(diǎn)下游400bp的第一BSSL變異體內(nèi)含子中。B.使用的PCR引物序列C.瓊脂糖凝膠顯示潛在建立者動物典型的PCR分析。M分子量標(biāo)記。泳道1產(chǎn)生于質(zhì)粒pS317的對照PCR產(chǎn)物。泳道2-13；從潛在建立者動物制備的DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)。圖18從pS317轉(zhuǎn)基因雌性小鼠分離的不同組織制備的RNA Northern印跡分析。在泌乳第四天分離組織。通過瓊脂糖-甲醛分離分析源于每一組織的10μg總RNA，轉(zhuǎn)移其至濾膜上，與32P-標(biāo)記的人BSSLcDNA進(jìn)行雜交。泳道含Mg乳腺Li肝；Ki腎；Sp脾；He心；Lu肺；Sg唾液腺；Br腦。RNA的核苷酸大小在右邊標(biāo)出。圖19從pS317轉(zhuǎn)基因小鼠、全長cDNA載體pS314轉(zhuǎn)基因小鼠及對照動物乳的Western印跡。樣品經(jīng)SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移至Immobilon濾膜上，用抗天然人BSSL產(chǎn)生的抗血清進(jìn)行免疫印跡分析。泳道1分子量標(biāo)記；泳道2、3和42μl來自3個(gè)pS317建立者FO#91F1雌仔的乳(F1 30、31和33)。泳道52μl來自建立者#90pS317的乳。泳道6、7和82μl源于非BSSL轉(zhuǎn)基因動物乳；泳道9純化的鼠BSSL；泳道10純化的人天然BSSL。參考文獻(xiàn)Abouakil，N.，Rogalska，E.，and Lombardo，D.(1989)Biochim.BiophysActa 1002，225-230Atkinson，S.A.，Brvan，M.H.，and Andersson，G.H.(1981)J.Pediatr.99，617-624Ausubel，F(xiàn).M.，Brent，R.，Kingston，R.E.，Moore，D.D.，Seidman，J.G.，Smith，J.A.，Struhl，K.(eds.)inCurrent Protocols in Molecular Biology(JohnWiley &amp; Sons，New York；edition of 1992)Baba，T.，Downs，D.，Jackson，K.W.，Tang，J. and Wang，C.S.(1991)Biochemistry 30，500-510.Bembck，S.，Blckberg，L.，and Hernell，O.(1990)J.Clin.Invest.85，1221-1226Bjrksten，B.，Burman，L.G.，deChateau，P.，F(xiàn)redrikzon，B.，Gothefors，L.&amp;Hemell，O.(1980)Br.Med.J.201，267-272.Blckberg，L.&amp; Hernell，O.(1981)Eur.J.Biochem 116，221-225.Blckberg，L.and Hemell，O.(1983)FEBS Lett.157，337-341Campbell，S.M.，Rosen，J.M.，Hennighausen，L.G.，Strech-Jurk，U.andSippel，A.E.(1984)Nucleic Acid Res.12，8685-8697.Chappell，J.E.，Clandinin，M.T.，Kearney-Volpe，C.，Reichman，B.，andSwyer，P.W.(1986)J.Pediatr.108，439-447Fontaine，R.，Carter，C.，and Hui，D.(1991)Biochemistry 30，7008-1014Graham，F(xiàn).L.，and Van der Eb，A.J.(1973)Virology 52，456-467Hamosh，M.，F(xiàn)reed，L.M.，York，C.M.，Sturman，J.A，and Hamosh，P.(1986)Fed.Proc.45，1452Han，J.H.，Stratowa，C.，and Rutter，W.J.(1987)Biochemistry 26，1617-1625Hennighausen，L.，Ruiz，L.&amp; Wall，R(1990)Current Opinion inBiotechnology 1，74-78.Hernell，O.(1975)Eur.J.Clin.Invest.5，267-272Hernell，O.，Blckberg，L.，and Lindberg，T.inTextbook ofgastroenterology and nutrition in infancy(Lebenthal，E.ed)pp.209-217(Raven Press，New York 1989)Hernell，O.，Staggers，J.E.and Carev， M.C.(1990)Biochemistry 29，2041-2056Hernell，O.and Blckberg，L.inEncyclopedia of human biology(Dulbecco，R.ed.)Vol.3，pp.47-56(Academic Press，San Diego 1991)Hernell，O.，Blckberg，L.，Chen，Q.，Sternby，B.and Nilsson，(1993)J.Pediatr.Gastroenterol.Nutr.(In press)Hogan，B.，Constantini，F(xiàn).and Lacy，E.(1986)Manipulating the mouseembryo.A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press.Hui，D.and Kissel，J.A.(1990)Febs Lett.276，131-134.Kyger，E.M.，Wiegand，R.C.，and Lange，L.G.(1989)Biochem.Biophys.Res.Commun.164.1302-1309Laemmli，U.K.(1970)Nature(London)227，680-685Lidberg，U.，Nilsson，J.，Strmberg，K.，Stenman，G.，Sahlin，P.，Enerbck，S.G.and Bjursell，G.(1992)Genomics 13，630-640Lusky，M.，and Botchan，M.R.(1984)Cell 36，391-401Nilsson，J.，Blckberg，L.，Carlsson，P.，Enerbck，S.，Hemell，O.andBjursell，G.(1990)Eur.J.Biochem.192，543-550.Pavlakis，G.N.，and Hamer，D.H.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80，397-401Reue，K.，Zambaux，J.，Wong，H.，Lee，G.，Leete，T.H.，Ronk，M.，Shively，J.E.，sternby，B.，Borgstrm，B.，Ameis，D.and Schotz，M.C.(1991)J.Lipid.Res.32，267-276.Sarver，N.，Byme，J.C.，and Howell，P.M.(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA79，7147-7151Studier，F(xiàn).W.and Moffat，B.A.(1986)J.Mol.Biol. 189，113-130Willamson，S.，F(xiàn)inucane，E.，Ellis，H.，and Gamsu，H.R.(1978)Arch.Dis.Childhood 53，555-563
序列表(1)一般資料(i)申請人(A)名字AB ASTRA(B)街道Kvarnbergagatan 16(C)市 Sodertalje(E)國家Sweden(F)郵編(ZIP)S-151 85(G)電話+46-8-553 260 00(H)電傳+46-8-553 288 20(I)電掛19237 astra s(ii)發(fā)明題目新多肽(iii)序列數(shù)9(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC可容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1.0，Version #1.25(EPO)(vi)在先申請資料(A)申請?zhí)朣E 9300686-4(B)申請1993.3.1(vi)在先申請資料(A)申請?zhí)朣E 9300722-7(B)申請日1993.3.4(2)SEQ ID NO1的資料
(i)序列特征(A)長度2428bp(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA到mRNA(iii)假設(shè)無(iii)反義無(vi)來源(A)有機(jī)體Homo sapiens(F)組織類型乳腺(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置82..2319(D)其它資料/產(chǎn)物＝“膽鹽刺激的脂酶”(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置985..1173(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)應(yīng)置1174..1377(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1378..1575(ix)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1576..2415(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞mat_肽(B)位置151..2316(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞polyA_信號(B)位置2397..2402(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞重復(fù)_區(qū)域(B)位置1756..2283(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞5′UTR(B)位置1..81(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞重復(fù)_單位(B)位置1756..1788(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞重復(fù)_單位(B)位置1789..1821(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞重復(fù)_單位(B)位置1822..1854(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞重復(fù)_單位
(B)位置1855..1887(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞重復(fù)_單位(B)位置1888..1920(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞重復(fù)_單位(B)位置1921..1953(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞重復(fù)_單位(B)位置1954..1986(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞重復(fù)_單位(B)位置1987..2019(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞重復(fù)_單位(B)位置2020..2052(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞重復(fù)_單位(B)位置2053..2085(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞重復(fù)_單位(B)位置2086..2118(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞重復(fù)_單位(B)位置2119..2151
(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞重復(fù)_單位(B)位置2152..2184(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞重復(fù)_單位(B)位置2185..2217(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞重復(fù)_單位(B)位置2218..2250(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞重復(fù)_單位(B)位置2251..2283(xi)序列描述SEQ ID NO1ACCTTCTGTA TCAGTTAAGT GTCAAGATGG AAGGAACAGC AGTCTCAAGA TAATGCAAAG 60AGTTTATTCA TCCAGAGGCT G ATG CTC ACC ATG GGG CGC CTG CAA CTG GTT111Met Leu Thr Met Gly Arg Leu Gln Leu Val-23 -20 -15GTG TTG GGC CTC ACC TGC TGC TGG GCA GTG GCG AGT GCC GCG AAG CTG159Val Leu Gly Leu Thr Cys Cys Trp Ala Val Ala Ser Ala Ala Lys Leu-10 -5 1GGC GCC GTG TAC ACA GAA GGT GGG TTC GTG GAA GGC GTC AAT AAG AAG207Gly Ala Val Tyr Thr Glu Gly Gly Phe Val Glu Gly Val Asn Lys Lys5 l0 15CTC GGC CTC CTG GGT GAC TCT GTG GAC ATC TTC AAG GGC ATC CCC TTC255Leu Gly Leu Leu Gly Asp Set Val Asp Ile Phe Lys Gly Ile Pro Phe20 25 30 35GCA GCT CCC ACC AAG GCC CTG GAA AAT CCT CAG CCA CAT CCT GGC TGG303Ala Ala Pro Thr Lys Ala Leu Glu Asn Pro Gln Pro His Pro Gly Trp40 45 50CAA GGG ACC CTG AAG GCC AAG AAC TTC AAG AAG AGA TGC CTG CAG 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(iii)假設(shè)無(vi)來源(A)有機(jī)體Homo sapiens(F)組織類型乳腺(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置1..535(D)其它資料/標(biāo)記＝變異體_A(xi)序列描述SEQ ID NO4Ala Lys Leu Gly Ala Val Tyr Thr Glu Gly Gly Phe Val Glu Gly Val1 5 10 15Asn Lys Lys Leu Gly Leu Leu Gly Asp Ser Val Asp Ile Phe Lys Gly20 25 30Ile Pro Phe Ala Ala Pro Thr Lys Ala Leu Glu Asn Pro Gln Pro His35 40 45Pro Gly Trp Gln Gly Thr Leu Lys Ala Lys Asn Phe Lys Lys Arg Cys50 55 60Leu Gln Ala Thr Ile Thr Gln Asp Ser Thr Tyr Gly Asp Glu Asp Cys65 70 75 80Leu Tyr Leu Asn Ile Trp Val Pro Gln Gly Arg Lys Gln Val Ser Arg85 90 95Asp Leu Pro Val Met Ile Trp Ile Tyr Gly Gly Ala Phe Leu Met Gly100 105 110Ser Gly His Gly Ala Asn Phe Leu Asn Asn Tyr Leu Tyr Asp Gly Glu115 120 125Glu Ile Ala Thr Arg Gly Asn Val lle Val Val Thr Phe Asn Tyr Arg130 135 140Val Gly Pro Leu Gly Phe Leu Ser Thr Gly Asp Ala Asn Leu Pro Gly145 150 155 160Asn Tyr Gly Leu Arg Asp Gln His Met Ala Ile Ala Trp Val Lys Arg165 170 175Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asp Pro Asn Asn Ile Thr Leu Phe Gly180 185 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Leu Lys Val Thr Asp Pro Arg Ala Leu Thr Leu Ala Tyr Lys Val260 265 270Pro Leu Ala Gly Leu Glu Tyr Pro Met Leu His Tyr Val Gly Phe Val275 280 285Pro Val Ile Asp Gly Asp Phe Ile Pro Ala Asp Pro Ile Asn Leu Tyr290 295 300Ala Asn Ala Ala Asp Ile Asp Tyr Ile Ala Gly Thr Asn Asn Met Asp305 310 315 320Gly His Ile Phe Ala Ser Ile Asp Met Pro Ala Ile Asn Lys Gly Asn325 330 335Lys Lys Val Thr Glu Glu Asp Phe Tyr Lys Leu Val Ser Glu Phe Thr340 345 350Ile Thr Lys Gly Leu Arg Gly Ala Lys Thr Thr Phe Asp Val Tyr Thr355 360 365Glu Ser Trp Ala Gln Asp Pro Ser Gln Glu Asn Lys Lys Lys Thr Val370 375 380Val Asp Phe Glu Thr Asp Val Leu Phe Leu Val Pro Thr Glu Ile Ala385 390 395 400Leu Ala Gln His Arg Ala Asn Ala Lys Ser Ala Lys Thr Tyr Ala Tyr405 410 415Leu Pne Ser His Pro Ser Arg Met Pro Val Tyr Pro Lys Trp Val Gly420 425 430Ala Asp His Ala Asp Asp Ile Gln Tyr Val Phe Gly Lys Pro Pne Ala435 440 445Thr Pro Thr Gly Tyr Arg Pro Gln Asp Arg Thr Val Set Lys Ala Met450 455 460Ile Ala Tyr Trp Thr Asn Phe Ala Lys Thr Gly Asp Pro Asn Met Gly455 470 475 480Asp Ser Ala Val Pro Thr His Trp Glu Pro Tyr Thr Thr Glu Asn Ser485 490 495Gly Tyr Leu Glu Ile Thr Lys Lys Met Gly Ser Ser Ser Met Lys Arg500 505 510Ser Leu Arg Thr Asn Phe Leu Arg Tyr Trp Thr Leu Thr Tyr Leu Ala515 520 525Leu Pro Thr Val Thr Asp Gln Lys Glu Ala Gln Met Pro Ala Val Ile530 535 540Arg Phe545(2)SEQ ID NO6的資料(i)序列特征(A)長度568個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)無(vi)來源(A)有機(jī)體Homo sapiens(F)組織類型乳腺(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置1..568(D)其它資料/標(biāo)記＝變異體_C(xi)序列描述SEQ ID NO6Ala Lys Leu Gly Ala Val Tyr Thr Glu Gly Gly Phe Val Glu Gly Val1 5 10 15Asn Lys Lys Leu Gly Leu Leu Gly Asp Ser Val Asp Ile Phe Lys Gly20 25 30Ile Pro Phe Ala Ala Pro Thr Lys Ala Leu Glu Asn Pro Gln Pro His35 40 45Pro Gly Trp Gln Gly Thr Leu Lys Ala Lys Asn Phe Lys Lys Arg Cys50 55 60Leu Gln Ala Thr Ile Thr Gln Asp Ser Thr Tyr Gly Asp Glu Asp Cys65 70 75 80Leu Tyr Leu Asn Ile Trp Val Pro Gln Gly Arg Lys Gln Val Ser Arg85 90 95Asp Leu 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(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置1..722(D)其它資料/標(biāo)記＝變異體_N(xi)序列描述SEQ ID NO7Ala Lys Leu Gly Ala Val Tyr Thr Glu Gly Gly Phe Val Glu Gly Val1 5 10 15Ash Lys Lys Leu Gly Leu Leu Gly Asp Ser Val Asp Ile Phe Lys Gly20 25 30Ile Pro Phe Ala Ala Pro Thr Lys Ala Leu Glu Asn Pro Gln Pro His35 40 45Pro Gly Trp Gln Gly Thr Leu Lys Ala Lys Asn Phe Lys Lys Arg Cys50 55 60Leu Gln Ala Thr Ile Thr Gln Asp Ser Thr Tyr Gly Asp Glu Asp Cys65 70 75 80Leu Tyr Leu Asn Ile Trp Val Pro Gln Gly Arg Lys Gln Val Ser Arg85 90 95Asp Leu Pro Val Met Ile Trp lle Tyr Gly Gly Ala Phe Leu Met Gly100 105 110Ser Gly His Gly Ala Asn Phe Leu Asn Asn Tyr Leu Tyr Asp Gly Glu115 120 125Glu Ile Ala Thr Arg Gly Asn Val Ile Val Val Thr Phe Asn Tyr Arg130 135 140Val Gly Pro Leu Gly Phe Leu Ser Thr Gly Asp Ala Asn Leu Pro Gly145 150 155 160Asn Tyr Gly Leu Arg Asp Gln His Met Ala Ile Ala Trp Val Lys Arg165 170 175Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asp Pro Asn Gln Ile Thr Leu Phe Gly180 185 190Glu Ser Ala Gly Gly Ala Ser Val Ser Leu Gln Thr Leu Ser Pro Tyr195 200 205Asn Lys Gly Leu Ile Arg Arg Ala Ile Ser Gln Ser Gly Val Ala Leu210 215 220Ser Pro Trp Val Ile Gln Lys Asn Pro Leu Phe Trp Ala Lys Lys Val225 230 235 240Ala Glu Lys Val Gly Cys Pro Val Gly Asp Ala Ala Arg Met Ala Gln245 250 255Cys Leu Lys Val Thr Asp Pro Arg Ala Leu Thr Leu Ala Tyr Lys Val260 265 270Pro Leu Ala Gly Leu Glu Tyr Pro Met Leu His Tyr Val Gly Phe Val275 280 285Pro Val Ile Asp Gly Asp Phe Ile Pro Ala Asp Pro Ile Asn Leu Tyr290 295 300Ala Asn Ala Ala Asp Ile Asp Tyr Ile Ala Gly Thr Asn Asn Met Asp305 310 315 320Gly His Ile Phe Ala Ser Ile Asp Met Pro Ala Ile Asn Lys Gly Asn325 330 335Lys Lys Val Thr Glu Glu Asp Phe Tyr Lys Leu Val Ser Glu Phe Thr340 345 350Ile Thr Lys Gly Leu Arg Gly Ala Lys Thr Thr Phe Asp Val Tyr Thr355 360 365Glu Ser Trp Ala Gln Asp Pro Ser Gln Glu Asn Lys Lys Lys Thr Val370 375 380Val Asp Phe Glu Thr Asp Val Leu Phe Leu Val Pro Thr Glu Ile Ala385 390 395 400Leu Ala Gln His Arg Ala Asn Ala Lys Ser Ala Lys Thr Tyr Ala Tyr405 410 415Leu Phe Ser His Pro Ser Arg Met Pro Val Tyr Pro Lys Trp Val Gly420 425 430Ala Asp His Ala Asp Asp Ile Gln Tyr Val Phe Gly Lys Pro Phe Ala435 440 445Thr Pro Thr Gly Tyr Ar9 Pro Gln Asp Ar9 Thr Val Ser Lys Ala Met450 455 460Ile Ala Tyr Trp Thr Asn Phe Ala Lys Thr Gly Asp Pro Asn Met Gly465 470 475 480Asp Ser Ala Val Pro Thr His Trp Glu Pro Tyr Thr Thr Glu Asn Ser485 490 495Gly Tyr Leu Glu Ile Thr Lys Lys Met Gly Ser Ser Ser Met Lys Arg500 505 510Ser Leu Arg Thr Asn Phe Leu Arg Tyr Trp Thr Leu Thr Tyr Leu Ala515 520 525Leu Pro Thr Val Thr Asp Gln Glu Ala Thr Pro Val Pro Pro Thr Gly530 535 540Asp Ser Glu Ala Thr Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Set Glu Thr Ala545 550 555 560Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr565 570 575Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala580 585 590Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro595 600 605Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly610 615 620Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro625 630 635 640Pro Thr Gly Asp Ala Gly Pro Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser645 650 655Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val660 665 670Thr Pro Thr Gly Asp Ser Glu Thr Ala Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp675 680 685Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Glu Ala Ala Pro690 695 700Val Pro Pro Thr Asp Asp Ser Lys Glu Ala Gln Met Pro Ala Val Ile705 710 715 720Arg Phe(2)SEQ ID NO8的資料(i)序列特征(A)長度2184bp(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(iii)假設(shè)無(iii)反義無(vi)來源(A)有機(jī)體Homo sapiens(F)組織類型乳腺(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置82..2088
(D)其它資料/標(biāo)記＝變異體_T(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞mat_肽(B)位置151..2085(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞重復(fù)_區(qū)域(B)位置1756..2052(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞重復(fù)_單位(B)位置1756..1788(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞重復(fù)_單位(B)位置1789..1821(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞重復(fù)_單位(B)位置1822..1854(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞重復(fù)_單位(B)位置1855..1887(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞重復(fù)_單位(B)位置1888..1920(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞重復(fù)_單位(B)位置1921..1953
(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞重復(fù)_單位(B)位置1954..1986(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞重復(fù)_單位(B)位置1987..2019(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞重復(fù)_單位(B)位置2020..2052(xi)序列描述SEQ ID NO8ACCTTCTGTA TCAGTTAAGT GTCAAGATGG AAGGAACAGC AGTCTCAAGA TAATGCAAAG60AGTTTATTCA TCCAGAGGCT G ATG CTC ACC ATG GGG CGC CTG CAA CTG GTT 111Met Leu Thr Met Gly Arg Leu Gln Leu Val-23 -20 -15GTG TTG GGC CTC ACC TGC TGC TGG GCA GTG GCG AGT GCC GCG AAG CTG 159Val Leu Gly Leu Thr Cys Cys Trp Ala Val Ala Ser Ala Ala Lys Leu-10 -5 1GGC GCC GTG TAC ACA GAA GGT GGG TTC GTG GAA GGC GTC AAT AAG AAG 207Gly Ala Val Tyr Thr Glu Gly Gly Phe Val Glu Gly Val Asn Lys Lys5 10 15CTC GGC CTC CTG GGT GAC TCT GTG GAC ATC TTC AAG GGC ATC CCC TTC 255Leu Gly Leu Leu Gly Asp Ser Val Asp Ile Phe Lys Gly Ile Pro Phe20 25 30 35GCA GCT CCC ACC AAG GCC CTG GAA AAT CCT CAG CCA CAT CCT GGC TGG 303Ala Ala Pro Thr Lys Ala Leu Glu Asn Pro Gln Pro His Pro Gly Trp40 45 50CAA GGG ACC CTG AAG GCC AAG AAC TTC AAG AAG AGA TGC CTG CAG GCC 351Gln Gly Thr Leu Lys Ala Lys Asn Phe Lys 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His Gly Ala Asn Phe Leu Asn110 115 120Asn Tyr Leu Tyr Asp Gly Glu Glu Ile Ala Thr Arg Gly Asn Val Ile125 130 135Val Val Thr Phe Asn Tyr Arg Val Gly Pro Leu Gly Phe Leu Ser Thr140 145 150Gly Asp Ala Asn Leu Pro Gly Asn Tyr Gly Leu Arg Asp Gln His Met155 160 165Ala Ile Ala Trp Val Lys Arg Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asp Pro170 175 180 185Asn Asn Ile Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Gly Ala Ser Val Ser190 195 200Leu Gln Thr Leu Ser Pro Tyr Asn Lys Gly Leu Ile Arg Arg Ala Ile205 210 215Ser Gln Ser Gly Val Ala Leu Ser Pro Trp Val Ile Gln Lys Asn Pro220 225 230Leu Phe Trp Ala Lys Lys Val Ala Glu Lys Val Gly Cys Pro Val Gly235 240 245Asp Ala Ala Arg Met Ala G1n Cys Leu Lys Val Thr Asp Pro Arg Ala250 255 260 265Leu Thr Leu Ala Tyr Lys Val Pro Leu Ala Gly Leu Glu Tyr Pro Met270 275 280Leu His Tyr Val Gly Phe Val Pro Val Ile Asp Gly Asp Phe Ile Pro285 290 295Ala Asp Pro Ile Asn Leu Tyr Ala Asn Ala Ala Asp Ile Asp Tyr Ile300 305 310Ala Gly Thr Asn Asn Met Asp Gly His Ile Phe Ala Ser Ile Asp Met315 320 325Pro Ala Ile Asn Lys Gly Asn Lys Lys Val Thr Glu Glu Asp Phe Tyr330 335 340 345Lys Leu Val Ser Glu Phe Thr Ile Thr Lys Gly Leu Arg Gly Ala Lys350 355 360Thr Thr Phe Asp Val Tyr Thr Glu Ser Trp Ala Gln Asp Pro Ser Gln365 370 375Glu Asn Lys Lys Lys Thr Val Val Asp Phe Glu Thr Asp Val Leu Phe380 385 390Leu Val Pro Thr Glu Ile Ala Leu Ala Gln His Arg Ala Asn Ala Lys395 400 405Ser Ala Lys Thr Tyr Ala Tyr Leu Phe Ser His Pro Ser Arg Met Pro410 415 420 425Val Tyr Pro Lys Trp Val Gly Ala Asp His Ala Asp Asp Ile Gln Tyr430 435 440Val Phe Gly Lys Pro Phe Ala Thr Pro Thr Gly Tyr Arg Pro Gln Asp445 450 455Arg Thr Val Ser Lys Ala Met Ile Ala Tyr Trp Thr Asn Phe Ala Lys460 465 470Thr Gly Asp Pro Asn Met Gly Asp Ser Ala Val Pro Thr His Trp Glu475 480 485Pro Tyr Thr Thr Glu Asn Ser Gly Tyr Leu Glu Ile Thr Lys Lys Met490 495 500 505Gly Ser Ser Ser Met Lys Arg Ser Leu Arg Thr Asn Phe Leu Arg Tyr510 515 520Trp Thr Leu Thr Tyr Leu Ala Leu Pro Thr Val Thr Asp Gln Glu Ala525 530 535Thr Pro Val Pro Pro 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MICROORGANISM(PCT Rule 13bis) INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM(PCT Rule 13bis)
權(quán)利要求
1.一種編碼不到722個(gè)氨基酸的多肽的核酸分子，所述多肽是一種BSSL變異體，所說BSSL變異體含SEQ ID NO3所示第536-722個(gè)殘基的部分氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的核酸分子，其中所說的BSSL變異體在其C-末端有一個(gè)苯丙氨酸殘基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的核酸分子，其中所說BSSL變異體在其C-末端部分含有序列Gln-Met-Pro。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3的任一權(quán)利要求的核酸分子，其中所說BSSL變異體在其C-末端部分含SEQ ID NO3中殘基第712-722所示的氨基酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4的任一權(quán)利要求的核酸分子，其中所述BSSL含不到16個(gè)重復(fù)單位。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的編碼多肽的核酸分子，所述多肽的氨基酸序列與序列表SEQ ID NO5、6或9所示的氨基酸序列至少90％同源。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的編碼多肽的核酸分子，所述多肽含序列表SEQ ID NO5、6或9所示的氨基酸序列。
8.一種編碼多肽的核酸分子，所述多肽的氨基酸序列與序列表SEQ ID NO7所示的氨基酸序列至少90％同源，但編碼在187位置為天冬酰胺的多肽的那些核酸分子除外。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的編碼多肽的核酸分子，所述多肽含序列表SEQ ID NO7所示的氨基酸序列。
10.序列表SEQ ID NO5、6、7或9所示的多肽。
11.由根據(jù)權(quán)利要求1-9的任一權(quán)利要求的核酸序列編碼的多肽。
12.基本上純的形式的權(quán)利要求10或11的多肽。
13.含根據(jù)權(quán)利要求1-9的任一權(quán)利要求的核酸分子的雜種基因。
14.一種含權(quán)利要求13的雜種基因的可復(fù)制的表達(dá)載體。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的載體，所述載體為牛乳頭狀瘤病毒載體pS258、pS259或pS299。
16.含有權(quán)利要求13雜種基因的細(xì)胞。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的細(xì)胞，此細(xì)胞來自鼠細(xì)胞系C127或大腸桿菌。
18.一種生產(chǎn)重組多肽的方法，所說方法包括(i)將按照權(quán)利要求1-9的任一權(quán)利要求的核酸分子插入能在特異的宿主細(xì)胞或有機(jī)體中復(fù)制的雜種基因，(ii)將所得的重組雜種基因引入宿主細(xì)胞或有機(jī)體；(iii)在培養(yǎng)基內(nèi)或上鑒定和生長產(chǎn)生的細(xì)胞，或鑒定和繁殖有機(jī)體，以便表達(dá)多肽；(iv)回收多肽。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法、其中雜種基因含于牛乳頭狀瘤病毒裁體pS258、pS259或pS299。
20.一種表達(dá)系統(tǒng)，包含能在含所述雜種基因的宿主細(xì)胞或有機(jī)體中表達(dá)的雜種基因，以致于當(dāng)雜種基因表達(dá)時(shí)生產(chǎn)重組多肽，所說雜種基因是通過將權(quán)利要求1-9的任一權(quán)利要求的核酸序列插入能調(diào)節(jié)所述雜種基因表達(dá)的基因中而產(chǎn)生。
21.產(chǎn)生能表達(dá)BSSL變異體的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物的方法，該方法包括(a)將權(quán)利要求20的表達(dá)系統(tǒng)引入非人類哺乳動物受精卵或胚胎細(xì)胞，以便將表達(dá)系統(tǒng)摻入哺乳動物種系，(b)將所得的被引入的受精卵或胚胎發(fā)育成成年雌性非人類哺乳動物。
22.生產(chǎn)能表達(dá)BSSL變異體并實(shí)質(zhì)上不能由哺乳動物本身表達(dá)BSSL的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物的方法，包括(a)損壞哺乳動物的BSSL表達(dá)能力，以致于實(shí)質(zhì)上沒有哺乳動物BSSL表達(dá)，然后將權(quán)利要求20的表達(dá)系統(tǒng)插入哺乳動物種系，這樣在哺乳動物中表達(dá)BSSL變異體；和/或(b)用按照權(quán)利要求20的表達(dá)系統(tǒng)替代哺乳動物BSSL基因或其部分基因。
23.在其基因組中含權(quán)利要求1-9的任一權(quán)利要求的DNA序列的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物，其中所述DNA序列存在于哺乳動物種系中。
25.根據(jù)權(quán)利要求23或24的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物，其中所述DNA序列存在于哺乳動物乳蛋白基因中。
26.根據(jù)權(quán)利要求23-25的任一權(quán)利要求的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物，選自小鼠、大鼠、兔、綿羊、豬和牛。
27.基據(jù)權(quán)利要求23-26的任一權(quán)利要求的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物的后代。
28.從根據(jù)權(quán)利要求23-27的任一權(quán)利要求的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物獲取的乳。
29.含有根據(jù)權(quán)利要求28乳的嬰兒膳食配方。
30.含有根據(jù)權(quán)利要求10-12的任一權(quán)利要求多肽的嬰兒膳食配方。
31.用權(quán)利要求10-12的任一權(quán)利要求的多肽補(bǔ)充嬰兒食物配方的嬰兒膳食配方生產(chǎn)方法。
32.權(quán)利要求10-12的任一權(quán)利要求的多肽作為嬰兒食物補(bǔ)充劑的用途。
33.含權(quán)利要求10-12的任一權(quán)利要求的多肽的藥物組合物。
34.在治療中應(yīng)用的權(quán)利要求10-12的任一權(quán)利要求的多肽。
35.按權(quán)利要求10-12的任一權(quán)利要求的多肽在制備用于治療與外分泌胰腺功能生理障礙相關(guān)的藥物中的應(yīng)用。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的應(yīng)用，用于制造治療膽囊纖維化藥物。
37.根據(jù)權(quán)利要求35的應(yīng)用，用于制造治療慢性胰腺炎的藥物。
38.根據(jù)權(quán)利要求35的應(yīng)用，用于制造治療脂肪吸收不良的藥物。
39.根據(jù)權(quán)利要求35的應(yīng)用，用于制造治療脂溶性維生素吸收不良的藥物。
40.根據(jù)權(quán)利要求35的應(yīng)用，用于制造治療由生理原因所致脂肪吸收不良的藥物。
41.根據(jù)權(quán)利要求35的應(yīng)用，用于制造改進(jìn)膳食脂類的利用的藥物。
42.根據(jù)權(quán)利要求35的應(yīng)用，用于制造提高早產(chǎn)兒膳食脂類的利用率的藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及作為膽鹽刺激的脂酶(BSSL；EC3.1.1.1)變異體的新多肽。還涉及編碼所述多肽的DNA分子，及含所述DNA分子的亞產(chǎn)物。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)所述的BSSL變異體以及生產(chǎn)能表達(dá)BSSL變異體的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物的方法。此外，本發(fā)明涉及所述的轉(zhuǎn)基因動物以及含有來自所述轉(zhuǎn)基因動物的乳的嬰兒配方。本發(fā)明還涉及含所述多肽的藥物組合物，以及所述多肽和DNA分子對于藥物制造的用途。
文檔編號C12N15/85GK1121355SQ94191848
公開日1996年4月24日 申請日期1994年2月25日 優(yōu)先權(quán)日1993年3月1日
發(fā)明者L·布拉克堡, M·艾龍, L·漢森, O·赫奈爾, L·隆德堡, M·施特龍維斯特, J·特奈爾 申請人:阿斯特拉公司