專利名稱：微生物學(xué)檢測(cè)方法和試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)微生物的方法、實(shí)施該方法的裝置及含實(shí)施該方法所必需的試劑的檢測(cè)試劑盒。
所有的活生物體都利用腺苷三磷酸(ATP)作為化學(xué)能的來(lái)源，而且已知是通過(guò)ATP驅(qū)動(dòng)的蟲(chóng)熒光素酶/蟲(chóng)熒光素反應(yīng)來(lái)測(cè)定。這種由酶反應(yīng)產(chǎn)生的光可以用光度檢測(cè)儀測(cè)定，并與存在的ATP數(shù)量相關(guān)。自從二十世紀(jì)六十年代中期就已經(jīng)知道用ATP作為微生物數(shù)量的指標(biāo)(參見(jiàn)ATP Luminescence Rapid Methods in Microbiology(1989)editor Stanley等人；Blackwell Scientific Publications，London，參見(jiàn)1-10頁(yè))；該法主要的優(yōu)點(diǎn)在于快速靈敏。這種分析方法的檢測(cè)能力可以檢出低至10-12mol/lATP，且簡(jiǎn)單樣品幾分鐘就可以分析完，而復(fù)雜的樣品一般也只要半小時(shí)。然而需要一種既保持了快速和易于操作又更靈敏的檢測(cè)微生物或其內(nèi)容物的方法。
本發(fā)明人現(xiàn)已確定該基于ATP方法的速度和靈敏度可以大幅度提高，只要把分析的目標(biāo)由ATP換成產(chǎn)生它的酶，即腺苷酸激酶。腺苷酸激酶是所有生物體用來(lái)將腺苷二磷酸(ADP)和磷酸轉(zhuǎn)變成腺苷三磷酸(ATP)的酶。此酶的靶底物優(yōu)選是ATP，用本發(fā)明的優(yōu)選的方法、裝置和試劑盒可以檢測(cè)到低至至少10-20摩爾的細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記物腺苷酸激酶。
人們已經(jīng)知道用蟲(chóng)熒光素酶/蟲(chóng)熒光素系統(tǒng)(參見(jiàn)Brolin等人，Journal of Biochemical and Biophysical Methods 1(1979)163～169)分析腺苷酸激酶，以確定其在某些哺乳動(dòng)物和植物組織中的活性(Rodionova等人，F(xiàn)iziologiya Rastenii(1978)25，4，P731～734 for plants)。然而，未見(jiàn)有人提出用這種分析系統(tǒng)檢測(cè)微生物，并且這樣做的好處，即靈敏度的提高，并未同研究所述酶本身聯(lián)系起來(lái)。
盡管腺苷酸激酶存在的量較ADP或ATP小，但通過(guò)它產(chǎn)生的ATP測(cè)定它的存在，用它作為微生物的生物學(xué)標(biāo)記可提供了通常放大了400,000倍的提高的靈敏度；也就是溫育10分鐘存在的每摩爾酶將400,000摩爾的ADP轉(zhuǎn)化成了ATP。因此由測(cè)定酶所催化的反應(yīng)底物或產(chǎn)物而對(duì)酶的估測(cè)可以提供低至10-20摩爾的檢測(cè)。
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供了一種測(cè)定樣品中微生物和/或其細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的存在和/或數(shù)量的方法，包括通過(guò)腺苷酸激酶將腺苷二磷酸(ADP)轉(zhuǎn)變成腺苷三磷酸的能力來(lái)估測(cè)該酶的量，并將其與有機(jī)體和/或其細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的存在/或數(shù)量聯(lián)系起來(lái)。通過(guò)向樣品中加入ADP和磷酸實(shí)現(xiàn)此種轉(zhuǎn)化。
腺苷三磷酸(ATP)優(yōu)選通過(guò)使用蟲(chóng)熒光素/蟲(chóng)熒光素酶系統(tǒng)來(lái)檢測(cè)，以提供一種光度學(xué)上可測(cè)的作為樣品中ATP量的指示信號(hào)。用于測(cè)定ATP的蟲(chóng)熒光素/蟲(chóng)熒光素酶制劑和方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，而且可自市售得到(如參見(jiàn)Brolin等)。一個(gè)典型的配方包括如0.1至10毫克/升蟲(chóng)熒光素酶，15到1000微摩爾/升D-蟲(chóng)熒光素，和試劑，如MgCl2、乙二胺四乙酸、牛血清蛋白，以及pH為7的緩沖液(參見(jiàn)例如EP054676)。
同任何放大檢測(cè)一樣，本發(fā)明腺苷酸激酶檢測(cè)的靈敏度受試劑純度的限制。在這種情況下，主要的污染物是底物ADP中的ATP和蟲(chóng)熒光素酶制劑中的腺苷酸激酶。對(duì)于用作為微生物的靈敏度檢測(cè)，特別是在這些微生物可能具有潛在危害并且需要在低量時(shí)檢測(cè)的情況下，對(duì)于檢測(cè)中與其反應(yīng)的物質(zhì)而言，各種試劑都應(yīng)有盡可能高的純度。必需的磷酸鹽試劑例如緩沖液不能含有ATP。
說(shuō)到第一個(gè)問(wèn)題，高純度的市售ADP(純度＞99.5％)最好經(jīng)柱色譜法進(jìn)一步純化后再用。這是合乎需要的，因?yàn)榧词购苌倭康腁TP污染物也足以引起高背景解讀。例如，用二乙基氨基乙基纖維素柱和0.02mM的鹽酸洗脫，ATP從柱上洗脫下來(lái)的速度比ADP慢得多，而能基本上將它們分離開(kāi)。用其它的色譜介質(zhì)和洗脫劑組合也可以達(dá)到相似的效果。將含高ADP/ATP比率的初始部分保留備用。在腺苷酸激酶作用后，通過(guò)蟲(chóng)熒光素/蟲(chóng)熒光素酶試劑的生物發(fā)光測(cè)定ADP的水平，在無(wú)腺苷酸激酶的條件下測(cè)定污染物ATP的水平來(lái)估測(cè)純度。從ADP底物中去除ATP的另一種方法是使用特異性降解ATP的酶，如蟲(chóng)熒光素酶或腺苷三磷酸雙磷酸酶。也可用這些酶進(jìn)一步純化已經(jīng)色譜法純化過(guò)的ADP，或者經(jīng)酶純化的ADP可以再進(jìn)一步用柱色譜法純化。應(yīng)注意的是腺苷三磷酸雙磷酸酶也是一種ADP酶，但由于它對(duì)ATP的活性更高，而且ADP大量存在，因此不會(huì)造成很大的問(wèn)題。
至于第二個(gè)問(wèn)題，作為一種基本的“家政”酶的腺苷酸激酶，在所有有機(jī)體內(nèi)都存在，且一般存在于蟲(chóng)熒光素酶制劑中。也許僅是很少的一點(diǎn)污染物，但由于目的是檢測(cè)樣品中很低水平的腺苷酸激酶，因此其蟲(chóng)熒光素酶中的腺苷酸激酶的存在就可能是一個(gè)限制因素。蟲(chóng)熒光素酶和腺苷酸激酶的分子量差異很大，分別為61KD和21KD。而且蟲(chóng)熒光素酶是一種膜結(jié)合蛋白，因此具一定疏水性，而腺苷酸激酶是一種可溶性酶。因此有可能通過(guò)比如粒度排阻(size exclusion)色譜法、反相色譜法或兩者的結(jié)合去除蟲(chóng)熒光素酶制劑中的腺苷酸激酶。另外或除此以外，可以通過(guò)就在測(cè)定之前或測(cè)定時(shí)加入生物發(fā)光試劑(蟲(chóng)熒光素酶和蟲(chóng)熒光素)，以使任何腺苷酸激酶污染物沒(méi)有時(shí)間產(chǎn)生明顯的影響，從而避免蟲(chóng)熒光素酶的腺苷酸激酶污染問(wèn)題。
為使與靶微生物有關(guān)的所有腺苷酸激酶(adenyl kinase)都能接觸到ADP和本發(fā)明的蟲(chóng)熒光素酶/蟲(chóng)熒光素檢測(cè)試劑，有必要將微生物裂解以使細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)釋放出來(lái)或使其暴露于試劑中。實(shí)現(xiàn)這種裂解可以通過(guò)使用機(jī)械手段如超聲波發(fā)生器，通過(guò)滲透打擊，任選地與冷休克或如溶菌酶這樣的試劑聯(lián)合使用，或更方便地通過(guò)使用洗滌劑。這樣的洗滌劑可自市售獲得，且一般將其稱為“提取劑”。典型的提取劑包括一般的陽(yáng)離子洗滌劑如CTAB(溴化十六烷基三甲基銨)和專賣試劑如Enzymatics ATP釋放試劑、BiotraceXKM提取劑(可得自Biotrace，Bridgend UK)和Lumac NRM(核苷酸釋放試劑，可得自Lumac BV，Holland)。當(dāng)用CTAB時(shí)適宜的制劑包括0.01～1％的CTAB水溶液，例如0.2％，但也可選用本領(lǐng)域的技術(shù)人員可想到的其它濃度。
因此，在向疑有微生物的分析試樣中加入ADP和蟲(chóng)熒光素酶/蟲(chóng)熒光素試劑之前，最好用裂解試劑將它們裂解，使其細(xì)胞內(nèi)容物可接觸到發(fā)光試劑。如果想?yún)^(qū)分開(kāi)靶細(xì)胞和那些如真菌孢子的細(xì)胞，可以分別進(jìn)行兩種單獨(dú)的檢測(cè)，一種為用僅能裂解這些孢子和多細(xì)胞動(dòng)物的“體”細(xì)胞的非離子型洗滌劑(如Triton TX-100)處理，另一種為用上面詳述過(guò)的陽(yáng)離子洗滌劑‘提取劑’以裂解所有細(xì)胞。如果將ATP酶，如腺苷三磷酸雙磷酸酶加到洗滌劑/蟲(chóng)熒光素酶/測(cè)定循環(huán)之間，對(duì)于相同的樣品就可以進(jìn)行這些檢測(cè)；在第一循環(huán)步驟中，一個(gè)循環(huán)用非離子型洗滌劑，另一循環(huán)用陽(yáng)離子洗滌劑。
本發(fā)明裝置的特征在于，它包括有待于在其含水懸浮液中分析微生物存在的樣品的接收裝置，將ADP、蟲(chóng)熒光素酶和蟲(chóng)熒光素加到懸浮液中的裝置和用于所產(chǎn)生的光的檢測(cè)裝置。該裝置優(yōu)選地在加蟲(chóng)熒光素酶和蟲(chóng)熒光素的裝置前，包括將洗滌劑加到懸浮液中的裝置。優(yōu)選地在蟲(chóng)熒光素酶和蟲(chóng)熒光素之前，將ADP與如洗滌劑一起加入，以便有時(shí)間生成ATP，但是如果利用發(fā)光動(dòng)力學(xué)，所有試劑可以一起加入。優(yōu)選地應(yīng)分別加入蟲(chóng)熒光素酶/蟲(chóng)熒光素試劑與ADP。
優(yōu)選地，該裝置包括在加入蟲(chóng)熒光素酶和蟲(chóng)熒光素的基礎(chǔ)上測(cè)定從懸浮液中發(fā)出的光量的檢測(cè)裝置，而且可選擇地包括一計(jì)算機(jī)處理器和可見(jiàn)顯示裝置，以用于接收指示所發(fā)出的光量的、檢測(cè)裝置的信號(hào)，并從該光量計(jì)算可能存在的微生物和其數(shù)量，并將結(jié)果顯示出來(lái)。通過(guò)設(shè)計(jì)處理器的程序，考慮到輸入信號(hào)的確定順序，其中一些信號(hào)作為包括空白和非離子洗滌劑的對(duì)照組，或者考慮到預(yù)先輸入的標(biāo)準(zhǔn)，如溫度以加速這種計(jì)算。
優(yōu)選的裝置包括一個(gè)傳送器裝置，該裝置接收來(lái)自一個(gè)或多個(gè)試劑位點(diǎn)的一定體積的載樣液體介質(zhì)以傳送到光檢測(cè)裝置。因此例如，傳送器接受一系列樣品容器，優(yōu)選為光度檢測(cè)容器，這些容器預(yù)先裝有含待測(cè)的微生物存在的物質(zhì)的含水液體懸浮液的磷酸鹽，或者通過(guò)所述懸浮液放置其中的裝置位點(diǎn)。例如這些容器是頂端開(kāi)口的，然后在傳送器上傳送到加洗滌劑的位點(diǎn)下、加ADP和蟲(chóng)熒光素酶/蟲(chóng)熒光素的位點(diǎn)下、再到光檢測(cè)器處。光檢測(cè)器可以是標(biāo)準(zhǔn)制式的光度檢測(cè)儀(luminometer)，如Biotrace Multi-lite或者Biotrace M3。
就在加入蟲(chóng)熒光素酶和蟲(chóng)熒光素之后或同時(shí)通過(guò)光檢測(cè)器內(nèi)例如光度檢測(cè)管內(nèi)所留的樣品體積，測(cè)量光。因此，在優(yōu)選的裝置中，光度檢測(cè)試劑就在進(jìn)入光檢測(cè)器位點(diǎn)之前或在光檢測(cè)器位點(diǎn)內(nèi)加入。優(yōu)選的裝置在試劑加入后立即測(cè)量發(fā)出的光，經(jīng)一段時(shí)間后再測(cè)量一次?；蛘?，在經(jīng)一適當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間后檢測(cè)發(fā)出的光，例如在用發(fā)光動(dòng)力學(xué)法時(shí)，這樣可以對(duì)其進(jìn)行累積估測(cè)。
本發(fā)明檢測(cè)試劑盒包括本發(fā)明方法必需的基本試劑，即腺苷二磷酸和蟲(chóng)熒光素酶及蟲(chóng)熒光素。優(yōu)選的試劑盒包括所有這些試劑，并且蟲(chóng)熒光素酶和蟲(chóng)熒光素作為一種單一的試劑溶液提供，還包括適于將意欲分析的靶細(xì)胞裂解的試劑盒試劑中的洗滌劑。通常檢測(cè)微生物只需要陽(yáng)離子洗滌劑，然而如果真菌孢子和體細(xì)胞可能較顯著時(shí)，則進(jìn)一步地須用非離子洗滌劑來(lái)估測(cè)其數(shù)量。試劑盒為單包裝形式，優(yōu)選地包括說(shuō)明如何完成本發(fā)明方法的使用說(shuō)明書(shū)；裝于容器內(nèi)的試劑，它具有適于直接使用或稀釋后再用的濃度。還可以包括為生成ATP提供磷酸的磷酸鹽緩沖液。
本發(fā)明優(yōu)選的檢測(cè)試劑盒包括純度高于99.95％的ADP試劑，和實(shí)質(zhì)上無(wú)腺苷酸激酶活性的蟲(chóng)熒光素酶試劑。另外所用蟲(chóng)熒光素酶/蟲(chóng)熒光素的比率，反映在所用試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)中和/或其相對(duì)濃度中，該比率是使蟲(chóng)熒光素酶能足夠快速地作用于蟲(chóng)熒光素底物，致使與蟲(chóng)熒光素酶結(jié)合的腺苷酸激酶在起始發(fā)光完成后產(chǎn)生ATP；因此，用閃光動(dòng)力學(xué)反應(yīng)指示由微生物產(chǎn)生的腺苷酸激酶，而污染物DNA則由發(fā)光來(lái)指示。
上述方法可提供優(yōu)選的純化的試劑。應(yīng)注意到蟲(chóng)熒光素酶里的腺苷酸激酶活性經(jīng)將蟲(chóng)熒光素酶放置數(shù)月或數(shù)年就會(huì)喪失。
下面參照下列非限制性實(shí)施例和附圖，通過(guò)舉例方式說(shuō)明本發(fā)明的方法、裝置、試劑及試劑盒。本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)上述說(shuō)明還可以完成本發(fā)明的其他實(shí)施方案。
附圖

圖1表示根據(jù)實(shí)施例4和5檢測(cè)不同數(shù)量的E.coli，每分鐘光度檢測(cè)儀計(jì)數(shù)的增長(zhǎng)圖，圖2表示實(shí)施例6的裝置的示意圖。
實(shí)施例1制備純化的腺苷二磷酸試劑用液相色譜法進(jìn)一步純化市售的高純度的(＞99.95％)的ADP(Sigma公司)。小色譜柱用10毫升一次性的塑料注射器針管制備，并將圓形的玻璃纖維濾紙(Whatman GF/A)放在柱子里覆蓋住其出口。將色譜介質(zhì)二乙基氨基乙基纖維素(Whatman DE-52)小心地傾入每根柱子并固定好以得到大約4毫升的柱床體積。另一圓形玻璃濾紙放在柱填充物的頂端。
用約15毫升的洗脫液(0.02M HCl)洗柱子后，加入在約0.5毫升0.02M HCl中的100mM高純度的ADP，用0.02M HCl，以每分鐘1毫升的流速進(jìn)行洗脫。從一次性塑料比色杯中可收集3～4毫升級(jí)份，該比色杯可以方便地被監(jiān)測(cè)光密度，進(jìn)而監(jiān)測(cè)ADP(在265nm)。保留高ADP∶ATP比值的起始部分備用。
為確定這樣純化的成功性，用市售的蟲(chóng)熒光素/蟲(chóng)熒光素酶制劑(Enzymatrix.Cambridge，UK和HM by Biotrace，Bridgend，UK)按照制造商的使用說(shuō)明來(lái)檢測(cè)ATP存在的數(shù)量。在有腺苷酸激酶存在的情況下進(jìn)行類似的檢測(cè)，以確定ADP的量。
50微升稀釋了3000倍的100mM市售(Sigma)的高純度的ADP，光度檢測(cè)儀的計(jì)數(shù)是8919，這是ATP不純水平的量度。在與100毫微微摩爾的腺苷酸激酶溫育后，同一樣品的光度計(jì)數(shù)為1,370,839，這測(cè)的是ADP的數(shù)量。此ADP溶液經(jīng)柱色譜法純化后的部分，在相同的條件下ATP的計(jì)數(shù)為223，而腺苷酸激酶的計(jì)數(shù)為1,442,054。在此情況下，信號(hào)與背景比從153提高到了6466。
實(shí)施例2其它制備腺苷二磷酸試劑的方法通過(guò)腺苷三磷酸雙磷酸酶對(duì)污染物ATP的作用，進(jìn)一步純化高純度的ADP。兩種不同來(lái)源的ADP制成0.1mM的溶液。出售時(shí)，一種(A)純度為98％，另一種(B)的純度為99％。用市售的蟲(chóng)熒光素/蟲(chóng)熒光素酶制劑測(cè)定ATP，對(duì)樣品A和B的光度檢測(cè)儀計(jì)數(shù)分別為54,768和305,500。然后將8μl每毫升100單位的腺苷三磷酸雙磷酸酶(馬鈴薯腺苷三磷酸雙磷酸酶，Sigma公司)溶液加入到10毫升0.1mM的A溶液和B溶液中，經(jīng)在室溫下溫育約22小時(shí)后，煮沸以破壞掉腺苷三磷酸雙磷酸酶，光度檢測(cè)儀再測(cè)定A和B時(shí)，其計(jì)數(shù)分別為5100和6600，表明污染物ATP的量顯著降低。
實(shí)施例3無(wú)腺苷酸激酶的分析的估測(cè)分析用的腺苷酸激酶貯存液用pH7.2的含有1％的牛血清白蛋白和0.25％的Triton X-100的磷酸鹽緩沖鹽水制得，而且分析是在適宜進(jìn)行光度檢測(cè)的3毫升的一次性塑料試管里進(jìn)行的。將200微升pH7.8的Tris緩沖液移取加入到分析試管內(nèi)，再加入100微升大約1mM的ADP(按上文詳述的方法純化)。然后加入10微升用pH7.8的Tris緩沖液稀釋的腺苷酸激酶以啟動(dòng)此反應(yīng)。試管在旋轉(zhuǎn)混合后在室溫下溫育，溫育10分鐘后，加入100到150微升的蟲(chóng)熒光素/蟲(chóng)熒光素酶試劑，隨后即用光度檢測(cè)儀測(cè)量由腺苷酸激酶活性產(chǎn)生的ATP發(fā)光量(參見(jiàn)表1)。
應(yīng)該注意到，因?yàn)橄佘账峒っ傅腒m是在毫摩爾的范圍內(nèi)，在反應(yīng)介質(zhì)中使用較高濃度的ADP，可以提高分析的靈敏度。市售的ADP含有顯著量的ATP，使此毫摩爾量的ADP的效果不理想，但本發(fā)明純化ADP的利用就能得到所述的提高并伴隨有好處。增加溫育時(shí)間也可提高靈敏度。通過(guò)參考已知的腺苷酸激酶濃度和10分鐘溫育內(nèi)產(chǎn)生的ATP相關(guān)的校準(zhǔn)曲線來(lái)估計(jì)未知的腺苷酸激酶的量。由于分析的靈敏性，需要采取預(yù)防措施以防止ATP或腺苷酸激酶的偶然污染。分析在可能的情況下應(yīng)使用無(wú)ATP的溶液、一次性橡膠手套和低ATP的塑料消費(fèi)品在層流通風(fēng)櫥里進(jìn)行。
表1檢測(cè)的ATP的量和存在的腺苷酸激酶(AK)的量之間的關(guān)系10分鐘溫育內(nèi)放大倍數(shù)(amplification)等于形成的ATP/mol AK
應(yīng)認(rèn)識(shí)到，當(dāng)用腺苷酸激酶來(lái)確定可能存在的特定有機(jī)體時(shí)，如果估測(cè)預(yù)期含有的腺苷酸激酶量，就可以提高定量關(guān)系的精確性。因此校準(zhǔn)曲線最好使用根據(jù)特定靶有機(jī)體繪制的。
實(shí)施例4E.coli的檢測(cè)用一周的每200微升pH7.4的磷酸鹽緩沖鹽水里大約含有2.2×107個(gè)微生物體的E.coli肉湯培養(yǎng)作原液，并用該緩沖液將其連續(xù)稀釋10倍，得到每200微升樣品含有107至0.1個(gè)有機(jī)體范圍的樣品。緩沖液提供用于合成ATP的磷酸鹽反應(yīng)物。
每200微升的樣品加入到一3毫升光度檢測(cè)儀的試管中，再加入10微升1mN的ADP和100微升0.1％含水的溴化十六烷基三甲基銨，所得混合物在室溫下溫育1分鐘。溫育完后，加入100微升陳年的Biotrace HM(2年檢測(cè)不到腺苷酸激酶活性)，用Biotrace M3光度檢測(cè)儀測(cè)量最初10秒鐘間隔內(nèi)發(fā)出的光，然后測(cè)量10秒鐘間隔至最高達(dá)1分鐘內(nèi)發(fā)出的光以確定光的累積式增加。最終讀數(shù)減去起始信號(hào)值就得出以每分鐘的計(jì)數(shù)表示的信號(hào)的測(cè)量數(shù)值。
在1分鐘溫育內(nèi)測(cè)得的超出對(duì)照組的計(jì)數(shù)隨E.coli數(shù)的變化如下106-39297每分鐘計(jì)數(shù)；105-3199每分鐘計(jì)數(shù)；104-189每分鐘計(jì)數(shù)；103-67每分鐘計(jì)數(shù)；102-26每分鐘計(jì)數(shù)。進(jìn)一步的結(jié)果表示在圖1中。
已知提取劑對(duì)于蟲(chóng)熒光素酶/蟲(chóng)熒光素系統(tǒng)的作用很重要(參見(jiàn)如SimPson等人(1991)J.Biolumin Chemilumin6(2)97～106頁(yè))；已知陽(yáng)離子洗滌劑能促進(jìn)反應(yīng)但會(huì)引起蟲(chóng)熒光素酶逐漸失活，而陰離子洗滌劑抑制該反應(yīng)，并已知非離子洗滌劑和兩性離子洗滌劑在寬范圍內(nèi)促進(jìn)該反應(yīng)。為了估測(cè)洗滌劑對(duì)E.coli細(xì)胞的腺苷酸激酶檢測(cè)的作用，將上述所用方案加以改變，用不同的提‘提取劑’來(lái)分析200微升磷酸鹽緩沖鹽水里的107個(gè)E.coli。
用Lumac NRM(226924每分鐘計(jì)數(shù))和CETAB(226924每分鐘計(jì)數(shù))來(lái)分析所得計(jì)數(shù)最高，而另兩種提取劑所得計(jì)數(shù)分別為79,280和29,280每分鐘計(jì)數(shù)。這一點(diǎn)從Simpson等發(fā)現(xiàn)陽(yáng)離子和陰離子洗滌劑對(duì)蟲(chóng)熒光素酶的有害作用來(lái)看并不奇怪；可能認(rèn)為這些試劑，設(shè)計(jì)用來(lái)單獨(dú)和蟲(chóng)熒光素酶/蟲(chóng)熒光素一起使用以測(cè)定ATP，對(duì)腺苷酸激酶有抑制作用。
實(shí)施例5在E.coli檢測(cè)中被檢測(cè)的腺苷酸激酶的定位。
為了確定實(shí)施例4的檢測(cè)中被檢測(cè)的腺苷酸激酶的位置，用E.coli新鮮未洗滌的細(xì)胞、新鮮洗滌的細(xì)胞，在37℃貯存了3天未洗滌的細(xì)胞和新鮮細(xì)胞的介質(zhì)作樣品得到每分鐘計(jì)數(shù)。這些分析的結(jié)果表明，大部分的腺苷酸激酶位于細(xì)胞內(nèi)，被釋放到介質(zhì)中的不到10％，而且腺苷酸激酶的量不依細(xì)胞的年齡而顯著變化(見(jiàn)圖1)。
實(shí)施例6本發(fā)明的裝置本發(fā)明的裝置包括圓盤傳送帶傳送器(1)，適于固定頂端開(kāi)口的光度檢測(cè)儀試管(2)的固定支架，該支架上沿試管運(yùn)行的方向有許多位于不同位點(diǎn)的試劑注入位點(diǎn)。運(yùn)行開(kāi)始時(shí)將含有待測(cè)樣品的光度檢測(cè)試管(2)安置在圓盤傳送帶上，傳送到第一個(gè)注入位點(diǎn)時(shí)，在該處由計(jì)算機(jī)控制的蠕動(dòng)泵(3)操縱陽(yáng)離子洗滌劑(4)和ADP試劑(5)的供給以分別加入所需要的100微升和10微升。接下來(lái)圓盤傳送帶將試管運(yùn)送到光度檢測(cè)儀盒(6)內(nèi)，在此用計(jì)算機(jī)控制的蠕動(dòng)泵(7)來(lái)控制從供給(8)中同時(shí)分加100微升蟲(chóng)熒光素酶/蟲(chóng)熒光素試劑(如，Biotrace HM)。試管從洗滌劑/ADP注入位點(diǎn)傳送到光度檢測(cè)儀/蟲(chóng)熒光素酶/蟲(chóng)熒光素位點(diǎn)需要至少1分鐘以使微生物裂解及合成ATP。
加入蟲(chóng)熒光素酶/蟲(chóng)熒光素試劑后，試管在光度檢測(cè)儀盒內(nèi)駐留70秒鐘，得到7個(gè)每10秒期間計(jì)數(shù)的讀數(shù)。從70秒后的累積值減去10秒鐘后的累積值以得出每分鐘的計(jì)數(shù)。由光度檢測(cè)儀向與之相連的計(jì)算機(jī)(9)輸入一個(gè)每分鐘計(jì)數(shù)信號(hào)，計(jì)算由該計(jì)算機(jī)進(jìn)行，而圓盤傳送帶上的每個(gè)試管的結(jié)果顯示在一可見(jiàn)顯示裝置(10)上。這樣，計(jì)算機(jī)就能控制向已知試管中分加試劑的時(shí)間，以便如需要?jiǎng)t改變溫育時(shí)間。
實(shí)施例7本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒由一個(gè)裝有按實(shí)施例1或2所述制備的、10mM(按實(shí)施例4所述方法增加其濃度以提高靈敏性)的純化ADP溶液(純度＞99.95％)的容器；一個(gè)裝有陳年的蟲(chóng)熒光素酶/蟲(chóng)熒光素溶液(BiotraceHM)的容器和一個(gè)裝有溴化十六烷基三甲基銨(0.1％的水溶液)的容器組成；所有的容器和本發(fā)明方法的使用說(shuō)明書(shū)包裝在一起。對(duì)活動(dòng)的實(shí)驗(yàn)室的使用來(lái)說(shuō)，應(yīng)用每個(gè)容器都有彈性裝備的塑料盒包裝，也就是有容器外形的充滿凹陷的泡沫。
包裝里還可以任選包括一個(gè)裝非離子洗滌劑溶液(0.2％TritonX-100或其等同物)的容器和/或一個(gè)裝象腺苷三磷酸雙磷酸酶的ATP酶的容器，該酶用來(lái)破壞由非離子洗滌劑作用于樣品釋放的ATP，使樣品適于作加入陽(yáng)離子洗滌劑的重新分析。
磷酸緩沖液可以作為單獨(dú)的緩沖液包括在試劑盒里，或者特別是如果洗滌劑和ADP試劑以最終濃度狀態(tài)存在時(shí)，磷酸緩沖液也可以包括在洗滌劑或ADP試劑容器內(nèi)?；蛘?，緩沖液也可以和濃縮狀態(tài)的洗滌劑和/或ADP包括在一起以備稀釋。這樣，為ATP的形成提供磷酸鹽就得到保證。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)樣品中微生物和/或其細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的存在和/或數(shù)量的方法，包括通過(guò)腺苷酸激酶將腺苷二磷酸(ADP)轉(zhuǎn)變成腺苷三磷酸(ATP)的能力來(lái)估測(cè)腺苷酸激酶的量，并將其與有機(jī)體和/或細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的存在/或數(shù)量相聯(lián)系起來(lái)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中的樣品是含水懸浮液或溶液，通過(guò)在只要有任何腺苷酸激酶存在就能將ADP轉(zhuǎn)變成ATP的條件下加入ADP、加入蟲(chóng)熒光素酶和蟲(chóng)熒光素試劑、確定樣品發(fā)出的光量、并將其與腺苷酸激酶的存在和數(shù)量聯(lián)系起來(lái)，進(jìn)行其中的腺苷酸激酶的估測(cè)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中的ADP中具有的ADP與ATP的比率為2000比1或更高。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中的ADP是通過(guò)將市售的純度高于98％的高純的ADP，通過(guò)二乙基氨基乙基纖維素柱并以1ml/分的速率用0.02M的鹽酸洗脫，將其分離成ADP和ATP部分而得到的。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中就ATP而言的ADP純度，當(dāng)用100微升Biotrace Enzyme HM蟲(chóng)熒光素酶和蟲(chóng)熒光素試劑進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，要使50微升100mM1/3000稀釋的該ADP溶液每分鐘計(jì)數(shù)少于1000。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中當(dāng)用100微升BiotraceEnzyme HM蟲(chóng)熒光素酶和蟲(chóng)熒光素試劑檢測(cè)時(shí)，其ADP每分鐘計(jì)數(shù)少于300。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中就ATP而言的ADP純度，其ADP與ATP的摩爾比率大于6000。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中ADP是通過(guò)用ADP酶將純度為98％或更高的ADP處理足夠的時(shí)間，使其中的ATP減少到0.1摩爾％或更少而得到的。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中對(duì)蟲(chóng)熒光素酶試劑進(jìn)行處理，以消除了它的腺苷酸激酶活性。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中用粒度排阻色譜法、反相色譜法或上述兩者去除蟲(chóng)熒光素酶中的腺苷酸激酶。
11.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中就在測(cè)量前或測(cè)量時(shí)加入蟲(chóng)熒光素酶和/或蟲(chóng)熒光素，以使任何腺苷酸激酶污染物沒(méi)有時(shí)間產(chǎn)生明顯作用。
12.根據(jù)前面兩個(gè)權(quán)利要求中的任一權(quán)利要求所述的方法，其中的樣品經(jīng)過(guò)預(yù)處理，以裂解任何存在的微生物，使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來(lái)或者暴露于分析試劑中。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中的裂解處理用洗滌劑來(lái)實(shí)現(xiàn)。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中的洗滌劑包括陽(yáng)離子洗滌劑。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述測(cè)定也是用非離子洗滌劑預(yù)處理的樣品進(jìn)行的，并且從用陽(yáng)離子洗滌劑測(cè)定產(chǎn)生的ATP量中減去所產(chǎn)生的ATP的量。
16.一種裝置，它包括有待于在含水懸浮液或溶液中檢測(cè)微生物或其細(xì)胞內(nèi)容物存在的樣品的接收裝置，向該懸浮液中加入ADP、蟲(chóng)熒光素酶和蟲(chóng)熒光素的裝置及用于所產(chǎn)生的光的檢測(cè)裝置，其中提供了傳送樣品的傳送器和彼此相關(guān)的裝置以達(dá)到連續(xù)操作的目的。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的裝置，在用于加入蟲(chóng)熒光素酶和蟲(chóng)熒光素的裝置之前，還包括一種向懸浮液中加入洗滌劑的裝置。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的裝置，其中的ADP試劑與洗滌劑一起加入。
19.根據(jù)權(quán)利要求16至18中任一權(quán)利要求所述的裝置，還包括一個(gè)光檢測(cè)位點(diǎn)，在該光檢測(cè)位點(diǎn)向樣品中加入蟲(chóng)熒光素酶和蟲(chóng)熒光素，然后用光檢測(cè)裝置監(jiān)測(cè)其中發(fā)出的光。
20.根據(jù)權(quán)利要求16所述的裝置，包括一個(gè)傳送裝置，該裝置接受一定體積含有樣品的液體介質(zhì)，并將它從一個(gè)或多個(gè)試劑位點(diǎn)傳送到光檢測(cè)裝置。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的裝置，包括傳送器，該傳送器適于接受一系列光度檢測(cè)容器，該容器是預(yù)先裝有待測(cè)微生物存在的物質(zhì)的含水的液體懸浮液，或者所述容器通過(guò)其中放置有這種懸浮液的裝置位點(diǎn)。
22.一種檢測(cè)試劑盒，該試劑盒是用權(quán)利要求1至15中任一權(quán)利要求所述的方法來(lái)檢測(cè)和/或確定微生物的數(shù)量，包括腺苷二磷酸、蟲(chóng)熒光素酶和蟲(chóng)熒光素。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的檢測(cè)試劑盒，還包括適于將待檢測(cè)和/或定量的靶微生物細(xì)胞裂解的洗滌劑試劑。
24.根據(jù)權(quán)利要求22或23所述的檢測(cè)試劑盒，包括陽(yáng)離子洗滌劑和非離子洗滌劑試劑。
25.一種ADP試劑，含有就ATP而言，純化的ADP，其中ADP與ATP的摩爾比率為2000比1或更高。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的含有ADP的ADP試劑，其中ADP與ATP的摩爾比率為99.99比0.1或更高。
27.根據(jù)權(quán)利要求22至24中任一權(quán)利要求所述的檢測(cè)試劑盒，其中的ADP試劑如權(quán)利要求25或26所述。
28.根據(jù)權(quán)利要求22至24中任一權(quán)利要求或權(quán)利要求27所述的檢測(cè)試劑盒，其中的蟲(chóng)熒光素酶實(shí)質(zhì)上無(wú)腺苷酸激酶活性。
29.根據(jù)權(quán)利要求22至24中任一權(quán)利要求或權(quán)利要求27所述的檢測(cè)試劑盒，其中所用的蟲(chóng)熒光素酶/蟲(chóng)熒光素比率或其中關(guān)于一種或其它這樣的試劑的稀釋使用說(shuō)明是這樣的，蟲(chóng)熒光素酶能足夠快速地作用于蟲(chóng)熒光素底物，從而使在起始發(fā)射完成后，與蟲(chóng)熒光素酶結(jié)合的腺苷酸激酶產(chǎn)生ATP。
全文摘要
一種檢測(cè)樣品中微生物和/或其細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的存在和/或數(shù)量的方法，包括通過(guò)腺苷酸激酶將腺苷二磷酸(ADP)轉(zhuǎn)變成腺苷三磷酸(ATP)的能力來(lái)估測(cè)該酶的量，并將其與有機(jī)體和/或細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的存在/或數(shù)量聯(lián)系起來(lái)。該方法提供的提高的靈敏度超過(guò)了現(xiàn)存的蟲(chóng)熒光素酶/蟲(chóng)熒光素檢測(cè)法。本發(fā)明還提供了包括純化的ADP和不含腺苷酸激酶(adenyl kinase)的蟲(chóng)熒光素酶的試劑及包括這些試劑的檢測(cè)試劑盒和自動(dòng)完成該方法的裝置。
文檔編號(hào)C12Q1/48GK1119029SQ9419143
公開(kāi)日1996年3月20日 申請(qǐng)日期1994年1月21日 優(yōu)先權(quán)日1993年1月21日
發(fā)明者D·J·施柯雷爾 申請(qǐng)人:大不列顛及北愛(ài)爾蘭聯(lián)合王國(guó)國(guó)防大臣