專利名稱：特異性因子對(duì)視網(wǎng)膜損傷和變性的預(yù)防作用的制作方法
本申請(qǐng)是1992年2月14號(hào)申請(qǐng)的美國(guó)專利申請(qǐng)No.07/836，090的后續(xù)申請(qǐng)，No.07/836，090是1991年4月25日申請(qǐng)的No.07/691，612的后續(xù)申請(qǐng)，No.07/691，612是1990年8月20日申請(qǐng)的No.07/570，657的后續(xù)申請(qǐng)，No.07/570，657又是1989年8月30日申請(qǐng)的No.07/400，591的后續(xù)申請(qǐng)。
本發(fā)明涉及一種防止和延緩由暴露于光或其他環(huán)境創(chuàng)傷因素或引起視網(wǎng)膜神經(jīng)元或光感受器死亡或損傷的任何病理狀況所導(dǎo)致的視網(wǎng)膜變性的方法。它是基于特異性存活促進(jìn)因子在導(dǎo)入活體哺乳動(dòng)物眼中時(shí)可防止由于光照而產(chǎn)生的光感受器的損傷和變性的發(fā)現(xiàn)，它也基于這些因子能夠延緩與視網(wǎng)膜遺傳性疾病相關(guān)的光感受器變性的進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)。
營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)發(fā)育過(guò)程中神經(jīng)元的存活和生長(zhǎng)以及已分化的神經(jīng)元的維持起重要的作用。這些因子也顯示出對(duì)中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)損傷神經(jīng)元的存活和再生起一定的作用。
在哺乳動(dòng)物中，許多視網(wǎng)膜疾病包括了視網(wǎng)膜相關(guān)神經(jīng)元的損傷或變性。能夠恢復(fù)這些神經(jīng)元的營(yíng)養(yǎng)因子可為這類疾病的治療提供有用的治療手段。
有一些證據(jù)表明神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性因子NGF(神經(jīng)生長(zhǎng)因子)能使視神經(jīng)切斷后的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的軸索再生(Carmignoto，etal，J.Neuroscience9(1989)∶1263-1272)。豬腦提取物刺激了視網(wǎng)膜移出物中的軸索的生長(zhǎng);而這種生長(zhǎng)被證明是由NGF以外的一種因子引起的(Turner，etal.Dev.BrainRes.6(1983)77-83)。由腦中純化的BDNF(來(lái)源于大腦的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子)促進(jìn)了體外視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的存活(Johnson，etal.J.Neuroscience6(1986)∶3031-3038;Thanos，etal.Eur.J.Neurosciencel(1989)∶19-26)。其他研究者已報(bào)道了新生體上丘腦提取物可以維持視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，以及由這些提取物中純化的一種因子促進(jìn)了體內(nèi)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)(Schultz，etal.J.Neurochemistry55(1990)∶832-303)。而且，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子應(yīng)用于切斷的視神經(jīng)時(shí)也促進(jìn)了成年大鼠神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的存活(Sievers，etal.Neurosci.Let.76(1987)∶157-162)。
除了視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的存活外，也有一些證據(jù)表明某些細(xì)胞因子可以促進(jìn)光感受器的存活和/或再生。光感受器包括作為視網(wǎng)膜光敏感細(xì)胞的視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞。視桿細(xì)胞含有視紫紅質(zhì)(視桿細(xì)胞光敏色素)，而視錐細(xì)胞則含有三種能對(duì)光發(fā)生反應(yīng)并最終觸發(fā)視網(wǎng)膜輸出細(xì)胞(神經(jīng)節(jié)細(xì)胞)神經(jīng)放電的不同光敏色素。最后，產(chǎn)生的信號(hào)被定為視覺(jué)皮質(zhì)中的視覺(jué)沖動(dòng)。
視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE)產(chǎn)生、貯存和運(yùn)輸許多種負(fù)責(zé)光感受器正常功能和存活的因子。RPE細(xì)胞是從光感受器的血供中和眼睛的絨毛毛細(xì)血管中運(yùn)送代謝物至光感受器的多功能細(xì)胞。RPE細(xì)胞也有當(dāng)維生素A在光亮和暗適應(yīng)過(guò)程中移動(dòng)于光感受器和RPE之間時(shí)再利用維生素A的功能。RPE還有巨噬細(xì)胞的功能，即吞噬視桿和視錐細(xì)胞外層部分節(jié)律性脫落的末端的功能。不同的離子、蛋白質(zhì)和水在RPE細(xì)胞和光感受器間隙中運(yùn)動(dòng)，而且這些分子最終影響了光感受器的代謝和活力。
具有由于RPE細(xì)胞中突變基因的表達(dá)而產(chǎn)生的遺傳性視網(wǎng)膜萎縮以及繼發(fā)光感受器細(xì)胞死亡的RCS(皇家外科學(xué)院)大鼠(Mullen&LavailScience192(1976)∶799-801)，為研究營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)視網(wǎng)膜的作用提供了一種有用的模型系統(tǒng)。應(yīng)用這種大鼠，在實(shí)驗(yàn)性嵌合體(Mullen&Lavail，Science192(1976)∶799-801)和移植實(shí)驗(yàn)中(Li＆Turner，Exp.EyeRes47∶911-917，1988)，通過(guò)將變性前的正常RPE細(xì)胞與光感受器并置，可使遺傳缺陷引起的光感受器變性延遲。在這些實(shí)驗(yàn)中，產(chǎn)生“恢復(fù)”作用的范圍超過(guò)正常RPE細(xì)胞的界限。這些發(fā)現(xiàn)表明RPE細(xì)胞產(chǎn)生了一種可擴(kuò)散的因子。隨后得知視網(wǎng)膜下或眼內(nèi)注射堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)可使RCS大鼠產(chǎn)生廣泛的光感受器的恢復(fù)(Faktorovich，etal.Nature347(1990)∶83-86)。在雞的胚胎中，堿性FGF出表現(xiàn)出引起源于RPE細(xì)胞的視網(wǎng)膜再生(ParkHollenberg，Dev.Biol.134(1989)∶210-205)。
盡管由注射bFGF所獲得的結(jié)果令人鼓舞，但bFGF在治療上的應(yīng)用非常局限?？紤]到它的致有絲分裂作用和生成血管的作用，可以想到它的有害的副作用。例如，持續(xù)在玻璃體內(nèi)注射bFGF導(dǎo)致了大量巨噬細(xì)胞侵入視網(wǎng)膜內(nèi)層，并偶爾產(chǎn)生大規(guī)模的增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變(Faktorovich，etal.Nature347(1990)∶83-86)。最后，bFGF不能彌補(bǔ)RCS大鼠出現(xiàn)的RPE細(xì)胞不能吞噬變性的神經(jīng)元這一特別的缺陷。
有報(bào)道說(shuō)明注射磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)(Silverman&Hughes，CurrentEyeRes.9(1990)∶183-191;Faktorovichetal.Nature347(1990)∶83-86)。以及用外科的方法能使RCS大鼠的光感受器產(chǎn)生較為局限的恢復(fù)。這些研究意味著在注射過(guò)程中，從受到損傷的RPE細(xì)胞或其它細(xì)胞中可能釋放出的保護(hù)因子能產(chǎn)生局部作用。然而，在這種情況下，其恢復(fù)的水平在數(shù)量上與用bFGF所恢復(fù)的水平不同，即它更局限于針頭行徑區(qū)。
如果用正常照明程度的光持續(xù)照射大白鼠，引起大鼠光感受器的完全變性。用這樣的大鼠作為模型鑒定存活增強(qiáng)因子，所得的結(jié)果顯示出與用RCS大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)所獲得的結(jié)果具有良好的相關(guān)性。而且，用光損傷模型比用RCS大鼠模型(此模型建立在緩慢發(fā)生的萎縮之上)能更快地比較不同因子的作用并評(píng)價(jià)各種因子所產(chǎn)生的并發(fā)癥。更進(jìn)一步說(shuō)，由于光損傷模型中細(xì)胞死亡機(jī)制較RCS大鼠中的機(jī)制被解釋得更為完善，因此，用光損傷模型所做實(shí)驗(yàn)的結(jié)果更易被用于人類疾病。
用大白鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，已經(jīng)確知許多藥劑在全身性應(yīng)用(腹腔內(nèi))時(shí)能改善由光照射引起視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡或損傷。一般來(lái)說(shuō)，光照射產(chǎn)生氧自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化物。因此，作為抗氧化劑或氧自由基清除劑的化合物可減輕光感受器變性。一些藥劑例如抗壞血酸(Organisciaketal，InvestigativeOphthalmology&VisualScience26(1985)∶1580-1588)，氟苯桂嗪(Edward，etal，LaboratoryScience109(1991)∶554-562)和二甲基硫脲(Lam，etal，ArchivesofOphthalmology108(1990)∶1751-1757)已用于改善持續(xù)光照產(chǎn)生的損害作用。然而，沒(méi)有證據(jù)表明這些化合物可改善其它類型的光感受器變性，而且用這些化合物可產(chǎn)生潛在的有害副作用。進(jìn)一步說(shuō)，因?yàn)檫@些化合物是全身性施用的，所以這些研究具有局限性。利用全身性施用對(duì)于評(píng)估特殊藥劑的功效常常是不適宜的。很難估計(jì)該藥劑實(shí)際到達(dá)視網(wǎng)膜的量。為了在視網(wǎng)膜局部獲得足夠濃度，必須注射大劑量的該藥劑。另外，注射一些藥劑還可產(chǎn)生全身性毒性作用。
除了利用bFGF延緩RCS大鼠的遺傳性光感受器變性外，未有實(shí)驗(yàn)表明任何特異性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性或其它細(xì)胞因子可防止哺乳動(dòng)物光感受器的損傷或死亡。在并入本文作為參考文獻(xiàn)的待定美國(guó)專利申請(qǐng)70/400，591中，報(bào)道了一種從視網(wǎng)膜cDNA文庫(kù)中分離出的BDNF表達(dá)克隆?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)以及應(yīng)用重組技術(shù)進(jìn)行純化BDNF的首次表達(dá)，本發(fā)明提供了一種利用純化營(yíng)養(yǎng)因子治療如色素性視網(wǎng)膜炎和其它視網(wǎng)膜變性疾病的方法。如下文詳述，已經(jīng)證實(shí)除了其它神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性和細(xì)胞因子外，BDNF提供了第一種治療大多數(shù)種類的遺傳性、年齡相關(guān)的或環(huán)境誘發(fā)的視網(wǎng)膜變性的藥理學(xué)方法。
本發(fā)明的目的在于提供一種防止視網(wǎng)膜神經(jīng)元損傷或死亡的方法。
本發(fā)明的目的還在于提供一種治療發(fā)生了視網(wǎng)膜變性的病理疾病的方法。
本發(fā)明的目的還在于提供一種在光照射或其它環(huán)境創(chuàng)傷之前或之后處理活體眼睛以防止視網(wǎng)膜細(xì)胞變性的方法。
本發(fā)明的目的還在于提供一種防止活體眼睛中光感受器損傷和變性的方法。
本發(fā)明的目的還在于提供一種不引起副作用而保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)元的方法。
本發(fā)明的目的還在于提供一種使損傷光感受器恢復(fù)或再生的方法。
本發(fā)明的目的還在于提供一種評(píng)估神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性因子和其它細(xì)胞因子對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)元和光感受器存活促進(jìn)活性的活體測(cè)定系統(tǒng)。
本發(fā)明的上述目的和其它目的可以通過(guò)用有效量的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子治療眼睛而實(shí)現(xiàn)，這些因子如來(lái)源于大腦的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性因子(BDNF)、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性因子(CNTF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3(NT-3)或神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-4(NT-4)，或一種細(xì)胞因子如酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(aFGF)、加有肝素的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、加有肝素的aFGF、白介素-1β(1L-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和胰島素樣生長(zhǎng)因子-2(IGF-2)。利用其它神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子或細(xì)胞因子也可獲得相對(duì)較弱的類似效果，這些因子可以單獨(dú)或與本文描述的另外的因子結(jié)合使用，產(chǎn)生有益的治療作用。這些因子包括神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、肝素、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、來(lái)源子血小板的生長(zhǎng)因子(PDGF)和胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)。


圖1表明應(yīng)用神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和細(xì)胞因子后所獲得的ONL厚度的直方圖。
圖2表明應(yīng)用神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和細(xì)胞因子后所獲得的光感受器恢復(fù)程度的直方圖。
圖3由一組三幅光鏡圖譜組成，它顯示了a)未進(jìn)行光照射大鼠的視網(wǎng)膜;b)進(jìn)行了光照射并在之后注射了PBS的大鼠的對(duì)照視網(wǎng)膜;c)進(jìn)行光照射后用BDNF處理的大鼠的視網(wǎng)膜。
圖4表明應(yīng)用神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和細(xì)胞因子后所觀察到的巨噬細(xì)胞匯集程度的直方圖。
本發(fā)明提供了利用神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及其它細(xì)胞因子延緩、預(yù)防或恢復(fù)光感受器以及包括神經(jīng)元或支持細(xì)胞(例如Müller細(xì)胞或RPE細(xì)胞)在內(nèi)的其它視網(wǎng)膜細(xì)胞損傷和變性的方法。其它視網(wǎng)膜神經(jīng)元包括但不限于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、移位的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(displacedretinalganglioncells)、無(wú)長(zhǎng)突神經(jīng)細(xì)胞、移位的無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞(displacedamacrinecells)、水平和兩極神經(jīng)元。
正如本發(fā)明所仔細(xì)考慮的，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子或其它細(xì)胞因子被用于治療導(dǎo)致光感受器或其它視網(wǎng)膜細(xì)胞損傷或死亡的任何病理狀況。這些病理狀況的例子包括視網(wǎng)膜脫落;年齡相關(guān)的和其它的視網(wǎng)膜斑病變;光視網(wǎng)膜病，外科手術(shù)引起的視網(wǎng)膜病(或是機(jī)械性的，或是光引起的);包括由眼中的外源性異物引起的中毒性視網(wǎng)膜病;糖尿病性視網(wǎng)膜病;早熟性視網(wǎng)膜病;病毒性視網(wǎng)膜病(例如CMV或與AIDS相關(guān)的HIV視網(wǎng)膜病);葡萄膜炎;由靜脈或動(dòng)脈堵塞或其它血管性疾病引起的缺血性視網(wǎng)膜病;由眼外傷或穿透性病變引起的視網(wǎng)膜病;外周玻璃體視網(wǎng)膜病和遺傳性視網(wǎng)膜變性。
在本發(fā)明應(yīng)用中，有效的因子包括一種或多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，例如來(lái)源大腦的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3(NT-3)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-4(NT-4)或其功能性衍生物或類似物，或一種或多種細(xì)胞因子，例如加入肝素的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)，酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(aFGF)、加入肝素的aFGF、白血病抑制因子(LIF)、白介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和胰島素樣生長(zhǎng)因子-2(IGF-2)，或其功能衍生物或類似物。其它表現(xiàn)出較弱程度作用的因子包括神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、肝素、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、來(lái)源于血小板的生長(zhǎng)因子(PDGF)和胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)。一種因子的功能性衍生物指的是其類似物的化合物，或是此化合物的活性部位，或是此部位的類似物。為取得最佳結(jié)果，也可將神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和細(xì)胞因子聯(lián)合使用。
所應(yīng)用的每一種因子可以通過(guò)本領(lǐng)域中專業(yè)人員熟知的方法獲得。例如，這些因子可以從天然來(lái)源中純化。另一種方式是，利用可獲得的序列數(shù)據(jù)，借助重組方法制備這些因子(見(jiàn)，例如，制備CNTF;Masiakowski，etal.J.Neurochemistry57(1991)∶1003-1012;制備NT-3;Maisonpierre，etal.Science247(1990)∶1446-1451)。一種含有有關(guān)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-4的人基因組順序的重組噬菌體(HG7-2)于1991年8月22日保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，12301ParklawnDrive，Rockville，Maryland20852，其登記號(hào)為ATCC75070。
在本發(fā)明的應(yīng)用中，最合適的因子是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。正如在本發(fā)明中所應(yīng)用的，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是負(fù)責(zé)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及維持的蛋白質(zhì)。在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育過(guò)程中伴有廣泛的神經(jīng)元細(xì)胞的死亡，而這種細(xì)胞的死亡很明顯對(duì)調(diào)節(jié)觸及預(yù)定靶區(qū)的神經(jīng)元數(shù)目起著關(guān)鍵的作用(Berg，D.K.1982，NeuronalDevelopment297-331)。切除和移植研究已表明，神經(jīng)元之間競(jìng)爭(zhēng)有限數(shù)量的存活因子(“神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子”)引起了神經(jīng)元細(xì)胞的死亡。目前所鑒定出的重要神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是NGF、BDNF、CNTF、NT-3和NT-4。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，BDNF被用于治療導(dǎo)致光感受器或其它視網(wǎng)膜相關(guān)細(xì)胞損傷或死亡的任何病理狀況。利用如USSN400，591中所描述的BDNF的分子克隆，以及生成和純化的重組BDNF，使測(cè)定BDNF對(duì)發(fā)育中的神經(jīng)元的生理作用以及用免疫測(cè)定的方法對(duì)組織中BDNF的水平定量和用免疫細(xì)胞化學(xué)法對(duì)組織中的BDNF定位成為可能。而且，已在視網(wǎng)膜文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)了BDNF的CDNA，并發(fā)現(xiàn)了在發(fā)育成熟的視網(wǎng)膜中進(jìn)行表達(dá)的BDNF的mRNA(Maisonpierre，etal.Neuron，5(1990)∶501-509)，這意味著這種蛋白質(zhì)在視網(wǎng)膜中的產(chǎn)生和它可能的促進(jìn)視網(wǎng)膜細(xì)胞存活的作用。
正如本發(fā)明所描述的，對(duì)眼睛施用BDNF可引起暴露于例如光的環(huán)境創(chuàng)傷因素的光感受器的存活增加。令人吃驚的是，BDNF并不導(dǎo)致在用bFGF治療視網(wǎng)膜時(shí)所觀察到的巨噬細(xì)胞的匯集。而且，由于BDNF沒(méi)有與bFGF相似的生成血管或?qū)е掠薪z分裂的性質(zhì)，因此，估計(jì)BDNF不會(huì)有bFGF樣的副作用。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，已用睫狀體神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)防止或延緩光感受器變性。如BDNF一樣，CNTF可有效地保護(hù)光感受器而不引起巨噬細(xì)胞匯集，它也沒(méi)有bFGF的生成血管或致有絲分裂的性質(zhì)。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，已用NT-4防止光感受器變性。例如BDNF和CNTF一樣，NT-4可有效地保護(hù)光感受器而不引起巨噬細(xì)胞匯集，它也沒(méi)有任何致有絲分裂或生成血管的作用。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，已用白血病抑制因子(LIF)防止光感受器的損傷。
在另一實(shí)施方案中，已用aFGF防止感受器變性。該因子，不像bFGF，顯示出其保護(hù)作用而沒(méi)有產(chǎn)生應(yīng)用bFGF時(shí)所觀察到的巨噬細(xì)胞匯集現(xiàn)象。
在另一實(shí)施方案中，bFGF與一能抑制單用bFGF時(shí)所觀察到的巨噬細(xì)胞匯集的化合物聯(lián)合應(yīng)用。肝素顯示出這種作用。肝素與bFGF的聯(lián)合應(yīng)用可防止光感受器的損傷而不引起巨噬細(xì)胞匯集，而且肝素增強(qiáng)了aFGF以及bFGF的作用(見(jiàn)圖4)。
在另一實(shí)施方案中，其它因子如IL-1β和TNF-α也很大程度地保護(hù)了視網(wǎng)膜。然而，已觀察到IL-1β可引起折疊和玫瑰花結(jié)的形成，而且其引起的巨噬細(xì)胞出現(xiàn)的數(shù)目較在對(duì)照視網(wǎng)膜或用BDNF或CNTF保護(hù)的視網(wǎng)膜中觀察到的略高。應(yīng)用TNF-α也引起了比正常水平略高的巨噬細(xì)胞數(shù)。
在另一實(shí)施方案中，光損傷模型被用于評(píng)價(jià)各種存活促進(jìn)因子對(duì)視網(wǎng)膜的作用。正如在本發(fā)明中所顯示的，將各種因子施用于大白鼠眼睛中的玻璃體內(nèi)，可對(duì)這些因子恢復(fù)變性光感受器的能力以及每一因子引起的例如巨噬細(xì)胞匯集等副作用進(jìn)行快速評(píng)估。盡管本發(fā)明描述的模型是大白鼠，但其它白化哺乳動(dòng)物如小白鼠和大白兔的眼睛也同樣適用。
盡管以前已用光損傷模型評(píng)估各種因子例如抗氧化劑對(duì)視網(wǎng)膜的作用，但在這些研究中，常常是進(jìn)行全身性(腹腔內(nèi))給藥。正如本發(fā)明所描述的，對(duì)潛在的存活促進(jìn)因子進(jìn)行玻璃體內(nèi)注射為評(píng)價(jià)因子提供了一種新方法，它與全身性給藥相比有幾項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)。由于眼睛是圓形、相對(duì)包容的結(jié)構(gòu)，在將一特異因子直接注入眼睛時(shí)，可更精確地確定達(dá)到視網(wǎng)膜的特異因子的量。而且，必須注入特異因子的量與全身性注射相比是很小的。例如，玻璃體內(nèi)注射1微升(約1微克的因子)相當(dāng)于必須全身性注射1到數(shù)毫升(10到數(shù)百毫克的因子)。另外，通過(guò)玻璃體給藥這一途徑，可以避免一些因子的潛在地毒性作用。
根據(jù)本發(fā)明，所用的因子可防止視網(wǎng)膜細(xì)胞變性。進(jìn)一步觀察到，在動(dòng)物已暴露于可造成損害的光中后回到正常光的環(huán)境中時(shí)，這些因子也可使視網(wǎng)膜的內(nèi)層和外層部分再生。因此，本發(fā)明中的因子不僅可以保護(hù)和防止光感受器變性，也可促進(jìn)視網(wǎng)膜細(xì)胞再生。
本發(fā)明中的因子可通過(guò)不同的途徑給眼睛給藥。它們可以通過(guò)在眼睛局部應(yīng)用或通過(guò)眼內(nèi)注射進(jìn)入眼中的例如玻璃體或視網(wǎng)膜下(光感受器間)間隙。另外，因子也可借助植入或注射入眼睛周圍的組織中的方法進(jìn)行局部給藥。它們也可以通過(guò)口服或皮下、靜脈內(nèi)或肌肉內(nèi)注射進(jìn)行全身性給藥。而且這些因子也可通過(guò)導(dǎo)管和植入物的方法給藥，其中的植入物是由包括如硅膠膜的膜片或纖維、可生物降解的聚合物或蛋白物質(zhì)的多孔、無(wú)孔或膠凝狀物制成的。這些因子可以在病損發(fā)生之前給藥以防止病理?yè)p害的發(fā)生，例如，在對(duì)眼睛進(jìn)行外科手術(shù)期間，或在病理?yè)p害發(fā)生后立即施用，或者在急性或持久的病理?yè)p害發(fā)生期間施用。
可以對(duì)本發(fā)明中的因子進(jìn)行改造以增強(qiáng)其穿透血液-視網(wǎng)膜屏障的能力。這種改造包括通過(guò)如糖基化的方法增強(qiáng)其親脂性，或通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法增強(qiáng)其靜電荷。
這些因子可以單獨(dú)或聯(lián)合施用，并且可以與藥學(xué)上可接受的載體一起施用。理想的情況是，這種載體應(yīng)能增強(qiáng)穩(wěn)定性和/或轉(zhuǎn)運(yùn)特性。本發(fā)明也提供了含有活性因子或其片段或其衍生物的藥物組合物，這種組合物借助于適宜的載體如脂質(zhì)體、微粒或微膠囊加以施用。在本發(fā)明的不同實(shí)施方案中，應(yīng)用這樣的組合物對(duì)于活性成分的持續(xù)釋放是有用的。
有效治療某種特殊疾病或病變的因子的量依賴于疾病或病變的性質(zhì)并且決定于所用的標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)。
實(shí)施例1應(yīng)用神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和細(xì)胞因子防止光引起的光感受器損傷所用的大白鼠為2-5月齡的F344或Sprague-Dawley種大鼠。大鼠在暴露于持續(xù)光照之前，在周期性光照的環(huán)境中(12小時(shí)光照12小時(shí)無(wú)光照，飼養(yǎng)籠中的亮度小于25英尺燭光)飼養(yǎng)9天或更長(zhǎng)的時(shí)間。大鼠在光強(qiáng)為115-200英尺燭光(大多數(shù)大鼠受到125-170英尺燭光的光照)的持續(xù)光照中暴露1周或2周，所說(shuō)的光照由懸掛于飼養(yǎng)籠底部上方60厘米處帶有一白色反射鏡的兩個(gè)40瓦“冷-白色”熒光燈(通用電氣公司)提供。在光照期間，大鼠飼養(yǎng)在帶有不銹鋼網(wǎng)架蓋的透明聚碳酸酯籠中。
在進(jìn)行持續(xù)光照的兩天前，用氯胺酮-甲苯噻嗪混合物麻醉大鼠，并在其玻璃體內(nèi)注射1微升溶于磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中的各種因子，濃度為50-1000ng/μl。注射是用32號(hào)針頭約在視網(wǎng)膜鋸齒緣與眼球的赤道之間的正中穿過(guò)鞏膜、脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜進(jìn)行的。注射了因子的動(dòng)物或與未注射的動(dòng)物比較，或與僅在玻璃體內(nèi)注射了1微升PBS的動(dòng)物比較以及與未進(jìn)行持續(xù)光照的動(dòng)物比較。對(duì)照鼠包括只注射1微升的PBS，或插入一干燥針頭但并不進(jìn)行注射白鼠。在所有情形中，均是在眼球的上半部分進(jìn)行注射的。
在持續(xù)光照后，立即用過(guò)量的二氧化碳?xì)⑺来笫蟛⒕o接著用混合醛進(jìn)行血管灌注。將眼球包埋于環(huán)氧樹(shù)脂中，以便將整個(gè)視網(wǎng)膜沿眼球垂直子午線切成1微米厚的切片。光照引起的視網(wǎng)膜變性的程度用兩種方法進(jìn)行定量。第一種方法是測(cè)量外周核心層(ONL)厚度，此厚度被用作光感受器細(xì)胞喪失指數(shù)。借助Bioquant形態(tài)測(cè)定系統(tǒng)對(duì)每一動(dòng)物的單個(gè)切片進(jìn)行測(cè)量，獲得平均ONL厚度。在眼球的每一個(gè)上、下半球中，均測(cè)量了9張切片，每個(gè)切片測(cè)了3次(總共每個(gè)半球測(cè)27次)才獲得ONL厚度。每張切片的觀察均集中于視網(wǎng)膜周圍的440μm的區(qū)域(為400倍放大倍數(shù)顯微鏡的視野直徑)。所測(cè)的第一張切片是在距視神經(jīng)起始部約440μm處制備的。其后的切片的位置逐步遠(yuǎn)離視神經(jīng)。在視網(wǎng)膜每一440μm長(zhǎng)度中，所做的3次測(cè)量是在彼此相距75μm的定點(diǎn)處進(jìn)行的，定點(diǎn)間的距離由目鏡測(cè)微尺測(cè)得。按照這種辦法，對(duì)作為樣本的兩個(gè)半球的54個(gè)測(cè)量代表了幾乎整個(gè)視網(wǎng)膜部分的區(qū)域。每一種因子所產(chǎn)生的結(jié)果總結(jié)于圖1中。
第二種測(cè)定光感受器恢復(fù)程度的方法是采用病理學(xué)家對(duì)恢復(fù)判別的一種0-4+的分級(jí)方法，4+表示大量程度的恢復(fù)和幾乎正常的視網(wǎng)膜?；谂c同一大鼠對(duì)照眼的比較，由四個(gè)人對(duì)每一切片中光感受器恢復(fù)的程度計(jì)分。該方法的優(yōu)點(diǎn)是不僅考慮ONL厚度，而且還考慮光感受器內(nèi)層和外層部分的更細(xì)微的變性改變以及眼球中空間上的變性層次。用該方法獲得的數(shù)據(jù)總結(jié)于圖2中。除了胰島素和昆布寧外，對(duì)每種因子均測(cè)量了大于或等于10只的眼睛，而對(duì)胰島素和昆布氨酸則分別各測(cè)6只眼睛。
用引起感受器損傷的光照損傷模型所得的數(shù)據(jù)示于圖1、2和3中。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF、NT-4和CNTF產(chǎn)生了較高程度的恢復(fù)。因子LIF、bFGF、aFGF，加有肝素的bFGF、加有肝素的aFGF、TNF-α、IL-1β、NT-3和IGF-2也產(chǎn)生了顯著程度的恢復(fù)。令人注意的是，如圖4所示，除了bFGF以外的所有因子均可增強(qiáng)存活而不導(dǎo)致大量巨噬細(xì)胞匯集(IL-1β和TNF-α引起稍多巨噬細(xì)胞匯集)。與對(duì)照視網(wǎng)膜(在同一動(dòng)物中用PBS注射的視網(wǎng)膜)相比，某些因子實(shí)際上抑制了巨噬細(xì)胞匯集。這些因子包括BDNF、aFGF和加有肝素的bFGF。
以前報(bào)道的與bFGF相比對(duì)RCS大鼠無(wú)效的酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(aFGF)顯示出對(duì)光損傷模型中的光感受器產(chǎn)生顯著的保護(hù)作用。另外，用bFGF注射后正常觀察到的巨噬細(xì)胞的匯入在bFGF與肝素合用時(shí)并未見(jiàn)到，因此，消除了潛在地阻礙bFGF應(yīng)用的副作用。
用肝素、PDGF、NGF、EGF和IGF-1也可觀察到盡管較小但存在的某種程度的恢復(fù)。本發(fā)明并不局限于本文所描述的特定實(shí)施方案的范圍。實(shí)際上，除了本文所描述的之外，對(duì)本領(lǐng)域的專業(yè)人員來(lái)說(shuō)，根據(jù)前文所述和附圖來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行多種修改是顯而易見(jiàn)的。這些修改應(yīng)包括在所附的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種減少或防止哺乳動(dòng)物由于暴露于光或其它環(huán)境創(chuàng)傷因素引起的視網(wǎng)膜神經(jīng)元變性的方法，它包括在暴露之前、期間或之后給哺乳動(dòng)物施用治療有效量的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所說(shuō)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子指的是來(lái)源于大腦的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-4及其復(fù)合物。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所說(shuō)的視網(wǎng)膜神經(jīng)元指光感受器。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所說(shuō)的施用指在眼內(nèi)施用。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所說(shuō)的施用指進(jìn)入玻璃體或視網(wǎng)膜下(光感受器間)間隙。
6.權(quán)利要求3的方法，其中所說(shuō)的施用指全身性施用。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所說(shuō)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子已被修飾，以增加其穿透血液-視網(wǎng)膜屏障的能力。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所說(shuō)的修飾包括增加因子的親脂性。
9.權(quán)利要求7的方法，其中所說(shuō)的修飾包括因子的糖基化。
10.權(quán)利要求7的方法，其中所說(shuō)的修飾包括增加所說(shuō)因子的靜正電荷。
11.權(quán)利要求6的方法，其中所說(shuō)的全身性施用指通過(guò)口服途徑進(jìn)行。
12.權(quán)利要求7的方法，其中所說(shuō)的全身性施用指通過(guò)皮下，靜脈內(nèi)或或肌內(nèi)注射進(jìn)行施用。
13.一種防止或減少哺乳動(dòng)物由于暴露于光或其它環(huán)境創(chuàng)傷因素引起的視網(wǎng)膜神經(jīng)元變性的方法。它包括在所說(shuō)的暴露之前，期間或之后給哺乳動(dòng)物施用治療有效量的一種或多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，這些因子來(lái)自于白血病抑制因子(LIF)、酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(aFGF)、加有肝素的bFGF、加有肝素的aFGF、白介素-1β(1L-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所說(shuō)的視網(wǎng)膜神經(jīng)元指光感受器。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所說(shuō)的施用指在眼內(nèi)施用。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所說(shuō)的施用指在進(jìn)入玻璃體或視網(wǎng)膜下(光感受器間)間隙。
17.權(quán)利要求14的方法，其中所說(shuō)的施用指全身性施用。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所說(shuō)的全身性施用指通過(guò)口服途徑進(jìn)行施用。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所說(shuō)的全身性施用指通過(guò)皮下、靜脈內(nèi)或肌內(nèi)注射進(jìn)行施用。
20.一種減少或防止發(fā)生了視網(wǎng)膜變性病理狀況的哺乳動(dòng)物的視網(wǎng)膜神經(jīng)元變性的方法，它包括對(duì)所說(shuō)哺乳動(dòng)物施用治療有效量的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所說(shuō)的病理狀況指視網(wǎng)膜脫落、年齡相關(guān)的或其它的視網(wǎng)膜斑病變、光視網(wǎng)膜病、外科引起的視網(wǎng)膜病(或是機(jī)械性的，或是光引起的)、中毒性視網(wǎng)膜病、糖尿病性視網(wǎng)膜病、早熟性視網(wǎng)膜病、病毒性視網(wǎng)膜病(如CMV或與AIDS相關(guān)的HIV視網(wǎng)膜病)，葡萄膜炎，由靜脈或動(dòng)脈堵塞或其它血管性疾病引起的缺血性視網(wǎng)膜病、由眼創(chuàng)傷或穿透性病變引起的視網(wǎng)膜病、外周玻璃體視網(wǎng)膜病或遺傳性視網(wǎng)膜變性。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所說(shuō)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子指來(lái)源于大腦的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-4或其復(fù)合物。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所說(shuō)的視網(wǎng)膜神經(jīng)元指光感受器。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所說(shuō)的施用指在眼內(nèi)施用。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所說(shuō)的施用指進(jìn)入玻璃體或視網(wǎng)膜下(光感受器間)間隙。
26.權(quán)利要求23的方法，其中所說(shuō)的施用指全身性施用。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所說(shuō)的全身性施用指通過(guò)口服途徑施用。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所說(shuō)的全身性施用指通過(guò)皮下、靜脈內(nèi)或肌內(nèi)注射進(jìn)行施用。
29.一種減少或防止發(fā)生了視網(wǎng)膜變性病理狀況的哺乳動(dòng)物的視網(wǎng)膜神經(jīng)元變性的方法，它包括對(duì)所說(shuō)哺乳動(dòng)物施用一種或多種治療有效量的因子，它們選自于白血病抑制因子(LIF)、酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(aFGF)、加有肝素的bFGF、加有肝素的aFGF、IL-1β、TNF-α和IGF-2。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所說(shuō)的視網(wǎng)膜神經(jīng)元指光感受器。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所說(shuō)的施用指在眼內(nèi)施用。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所說(shuō)的施用指進(jìn)入玻璃體或視網(wǎng)膜下(光感受器間)間隙。
33.權(quán)利要求30的方法，其中所說(shuō)的施用指全身性施用。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所說(shuō)的全身性施用指通過(guò)口服途徑施用。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所說(shuō)的全身性施用指通過(guò)皮下、靜脈內(nèi)或肌內(nèi)注射施用。
36.一種評(píng)估因子對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)元或光感受器存活促進(jìn)能力的方法，它包括(1)在對(duì)哺乳動(dòng)物持續(xù)光照之前、期間或之后，將因子注射入白化哺乳動(dòng)物眼睛的玻璃體內(nèi);(2)與在同樣光照下未注入因子的對(duì)照眼相比較，評(píng)估注射了因子眼睛的視網(wǎng)膜神經(jīng)元或光感受器的變性;其中與對(duì)照眼相比較，視網(wǎng)膜變性的減少表明因子具有存活促進(jìn)的能力。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所說(shuō)的哺乳動(dòng)物指大鼠。
38.權(quán)利要求36的方法，其中所說(shuō)的對(duì)照眼指一只眼睛玻璃體內(nèi)進(jìn)行注射的大鼠的另外一只眼睛。
全文摘要
將特異的存活促進(jìn)因子導(dǎo)入活體哺乳動(dòng)物眼中，可防止光感受器損傷或細(xì)胞死亡(視網(wǎng)膜變性)。在暴露于有有害作用的光之前、期間或之后，將這些特異因子導(dǎo)入活體的眼中，可防止光感受器損傷和變性，并且，這些因子可以延緩由遺傳性疾病引起的光感受器損傷。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1080188SQ9310308
公開(kāi)日1994年1月5日 申請(qǐng)日期1993年2月13日 優(yōu)先權(quán)日1992年2月14日
發(fā)明者M·M·拉維爾, R·H·斯坦伯格, G·D·揚(yáng)科普洛斯 申請(qǐng)人:里珍納龍藥品有限公司, 加州大學(xué)評(píng)議會(huì)