專利名稱：：糖類的制備方法
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：本發(fā)明涉及獲得葡萄糖、麥芽糖、麥芽低聚糖等糖鏈長固定的高純度單體糖類的制備方法。獲得特定糖鏈長的高純度單體糖類的方法迄今已知有下面這些用一種或兩種以上適當的淀粉酶類分解淀粉等葡聚糖，用公知的各種柱層析法等將其從其它非目的低聚糖和單糖中分離出來(例如，淀粉科學手冊p.452，1987、特開昭57-209000號公報、特開昭62-19210號公報、特公平2-17158號公報)，或將其再結晶，從而從其它微量混入的非目的低聚糖和單糖中分離出來(例如，淀粉科學手冊，p456，1987)。然而，上述任何方法本質上均伴有葡萄糖和未切斷的糊精、以及其它非目的低聚糖副產品，均未能實際上從反應系中去除這些非目的糖類。此外，人們已知，微量非目的糖類的共存，還明顯地妨礙作為目的物的特定糖鏈長的糖類的結晶化。而且，用上述公知的方法，若要獲得盡可能高純度的低聚糖，則制備工序變復雜，收率和成本方面也有問題。因此，本發(fā)明者們認為糖類公知的制備方法很有改善余地，特別嘗試了建立實質上不含非醫(yī)藥用目的糖類而僅含葡萄糖、麥芽糖、麥芽低聚糖等特定糖鏈長的糖類單體的制備方法。本發(fā)明的要點在于連續(xù)進行以下一系列操作。即在糖鏈轉移酶的作用下，直接地或經中間體介導，將糖鏈從其它的糖鏈供給源轉移到對于作為目的物的特定糖鏈長的糖類實質上可分離的物質(以下稱作“可分離物質”)上，使所得到的低聚糖受將低聚糖特定長度的糖鏈切成exo型的酶(以下稱作“exo型切斷酶”)的作用，從而分離作為目的物的特定糖鏈長的糖類的方法。下面對本發(fā)明加以詳述。在本發(fā)明中所用的可分離物質為殼聚糖珠、離子交換樹脂、合成高分子樹脂、或作為其他固定化載體被使用的載體或以下面的通式(Ⅰ)(式中R為氫、低級烷基、羥烷基、苯基烷基、苯基鏈烯基、苯基炔基、苯氧基烷基、苯氧基鏈烯基或苯氧基炔基，此處苯基中也包含被取代的苯基)表示的化合物(以下稱作“脫二氧亞胺基葡糖醇類”)、野尻霉素、氨基環(huán)醇、氨基環(huán)醇衍生物、或葡糖醛酸或其葡糖基或低聚葡糖基體等能吸附在離子交換樹脂上的有極性的糖類(以下稱作“極性糖”)等。載體不管是珠狀、膜狀、纖維狀等均可。脫二氧亞胺基葡糖醇類可從桑白皮和放線菌等獲得(如，特願昭54-159417號、特願昭55-76838號、特公昭56-9919號公報、特願昭57-93997號、特公昭59-27337號公報)。脫二氧亞胺基葡糖醇類的葡糖基和低聚葡糖基體可用已公開的方法制備(如，AgricultralandBiologicalChemistry49，2159(1985))。從有效霉素類獲得氨基環(huán)醇的方法已被揭示(如，特願昭55-128157號)，也可從市售的有效霉素制劑制得氨基環(huán)醇。為了將糖鏈轉移到載體上，此載體上不具有末端葡糖基或極性糖等可被糖鏈轉移酶轉移糖鏈的殘基，必須預先在載體上直接地或通過間隔物結合上具有可被糖鏈轉移酶轉移糖鏈的殘基的中間體。此處，中間體可為極性糖、葡萄糖等單糖、麥芽糖、麥芽三糖等低聚糖。為了將中間體結合到載體上，可有例如在氰基硼氫化鈉(NaBH3CN)這樣的還原劑作用下將中間體麥芽糖結合到已結合了具有末端氨基的間隔物的殼聚糖珠載體上的方法等。其中，間隔物可為環(huán)氧乙烷、戊二醛(GLA)等用于固定化技術的單功能團和雙功能團物質。為使糖鏈從其它糖鏈供給源轉移過來所用的糖鏈轉移酶可為，例如，環(huán)糊精葡糖基轉移酶(CGTase)、α-淀酚酶等。CGTase，迄今已有由若干種菌株產生的報告，例如，芽胞桿菌屬Bacillusmcaaelins、Bacillusmagtelium、Bacillussaculins、嗜堿性芽胞桿菌、耐熱性芽胞桿菌等。這些菌株產生的環(huán)糊精各自具有特征，而本發(fā)明中所用的CGTase，無論是它們中任何一型的CGTase，都能完全達到其目的。已知除酶以外，也有某種菌株直接形成糖轉移生成物(如，日本農業(yè)化學會大會講演摘要集4N-2，1981.3.10發(fā)行)，即便象那樣的情況也可達到作為本發(fā)明的糖鏈轉移酶的目的。在糖鏈轉移反應中的pH、反應溫度，因所用糖鏈轉移酶的不同而各有所不同，例如在用CGTase時，pH為4.0-11.5范圍，以pH5.5-10.5范圍為佳;反應溫度在20-85℃的范圍，以45-65℃的范圍為佳。糖鏈轉移反應需要的時間，在使用CGTase轉移酶時，因pH、反應溫度、酶濃度、糖鏈供給源的濃度不同而有相當大的差異，通常為數小時至四天。CGTase的用量以在可被糖鏈轉移酶轉移糖鏈的殘基上使盡可能多的糖鏈轉移為好，因此對應于糖鏈供給源的淀粉系多糖，酶的比例越多，越能得到良好的結果，具體地因所用糖鏈供給源淀粉系多糖、pH、反應時間而異，一般來說，每1g淀粉系多糖用500-5000單位(B.V法)酶，較好地為1000-2000單位。此外，糖源供給源可為淀粉，淀粉系糖質或環(huán)糊精。淀粉可用任何一種市場上流通的商業(yè)用淀粉。而淀粉系糖質可用各種糊精、直鏈淀粉、支鏈淀粉這樣的中間加水分解物或高聚合度、中等程度或低聚合度的任何一種物質。淀粉系多糖的濃度按制備上要求的時間，轉移酶的量的不同而不同，以5-60%(較好為10-20%)為宜。若為糊精，以30-50%為實用。用高濃度淀粉作為糖源供給源時，其粘度顯著升高，所以一般在進行糖鏈轉移反應前，用CGTase和α-淀粉酶等先將淀粉液化。為了提高添加的淀粉系多糖的利用率，使淀粉系多糖相對于轉移酶量的添加量以較低的濃度為好，例如，每1g淀粉系多糖2000-3000單位糖鏈酶量為好。作為可分離物質使用極性糖時，例如脫二氧亞胺基葡糖醇，其濃度可上升至15%。然而，糖鏈供給源對脫二氧亞胺基葡糖醇的重量比以2-20倍為有效。作為可分離物質使用載體時，通過在糖鏈轉移反應完成后，將糖鏈被延長的載體充妥洗凈。洗凈后，例如在100℃下加熱5分鐘使殘存的糖鏈轉移酶失活，也可更充分地洗凈。所用的糖鏈轉移酶用超濾法(以下稱作“UF”)等可容易地加以回收。作為可分離物質使用極性糖時，在糖鏈轉移反應完成后，將極性糖及該糖上轉移了葡萄糖低聚糖的物質吸附在離子交換樹脂上。此時所用的糖鏈轉移酶可用UF法等容易地加以回收，因此在不回收糖鏈轉移酶的情況下將反應液直接用離子交換樹脂處理，在回收糖鏈轉移酶的情況下用UF膜處理后，將濾液用離子交換樹脂處理。此處，離子交換樹脂可為Dowex50W-X2(注冊商標)、DiaionSA-11A(注冊商標)、苯酚甲醛離子交換樹脂IR-120(注冊商標)等，按極性糖的極性作適當的選擇。離子交換樹脂的量當然必須按反應所用極性糖的量作增減。極性糖及該糖上轉移了葡萄糖低聚糖的物質吸附在離子交換樹脂上以后，通常進行充分洗滌。而且，在洗凈后一般將其從離子交換樹脂上洗脫下來，例如，用1N氨水等洗脫。接著，在對exo型切斷酶適合的pH條件下，通常在30-55℃反應溫度下，使exo型切斷酶作用數小時-2天，exo型切斷酶可為葡萄糖淀粉酶、β-淀粉酶、麥芽糖低聚糖生成酶等。例如，制備麥芽糖時，可采用β-淀粉酶，將反應液調節(jié)到適合于β-淀粉酶的pH4.5-6.0，如pH4.8，在反應液中加入β-淀粉酶，在30-60℃反應溫度下反應1-2天為宜。exo型切斷酶的添加量根據所用的exo切斷酶和可分離物質的種類而定，在可分離物質為載體時，每ml載體加20-100單位酶，可在工業(yè)上1天工作時間內切斷完畢。使用極性糖作為可分離物質，在用前面的操作從離子交換樹脂上使其洗脫的情況下，在exo型切斷酶作用后直接，或用適當的UF膜法等分離方法分離exo型切斷酶后，再次加到吸附所用的極性糖的離子交換樹脂上，這樣實際上可分離單純的目的物-特定糖鏈長的糖類。使用極性糖作為可分離物質，在不用前面的操作從離子交換樹脂上洗脫下來而直接受exo型切斷酶作用的情況下，或使用載體作為可分離物質的情況下，在exo切斷酶作用后，用過濾和UF膜法等適當的分離方法分離exo型切斷酶，這樣實際上可分離單純的目的物-特定糖鏈長的糖類。象上述那樣分離出來的exo切斷酶也可再利用。在最終得到的液體的濃縮上，可采用旋轉式蒸發(fā)器減壓濃縮法、反滲透壓(RO)膜法等通用的濃縮手段。在使用極性糖作為可分離物質時，糖鏈轉移酶和exo型切斷酶也可以溶液狀態(tài)使用，也可以固定化酶的形式使用，此固定化酶是用制備通用的公知的固定化酶的方法制成的。特別是在使用粗酶時，用固定化酶可減少夾雜物，在精制工序上有利。按本發(fā)明涉及的制備法制備麥芽糖的反應式圖解如下。(式中，A為可分離物質，G為葡萄糖，B為β-淀粉酶。但全部A不限于同一種。為β-淀粉酶的切斷部位。)如上式，β-淀粉酶按其特性不切斷二糖或三糖而保留下來(上式中G-G、A-G及A-G-G)。從而可以通過過濾或離子交換樹脂等，從固體狀態(tài)或極性糖的其它物質(A、A-G及A-G-G)中，容易地分離單一的溶液狀態(tài)中性糖-麥芽糖(G-G)。而且，在分離麥芽糖后，糖鏈轉移酶可再在其它殘渣上延長糖鏈，結果，通過反復的糖鏈轉移反應、切斷反應、分離，可連續(xù)生產麥芽糖。從以上所述，可以說，本發(fā)明制備法兼?zhèn)溥B續(xù)性，是可以在實際上得到單體目的物特定糖鏈長的糖類前所未有的新制備法。而且，按本發(fā)明，不僅可得單純的特定糖鏈長的糖類這一優(yōu)點，與以往的方法相比較，它的制備工序非常簡單，可大大節(jié)減經費，勞力等，收率也可充分提高。用本發(fā)明的制備法可制備的糖類，例如麥芽糖，在要求特別高純度的醫(yī)藥上是有用的，其使用形態(tài)可為點滴劑等。當然，這些糖類也作為食品使用。麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖等可用作診斷藥物等。此外，將麥芽糖還原制得的甜味劑麥芽糖醇，因原料麥芽糖純度越高，其結晶化程度越好，因此，用本發(fā)明制備法制備的麥芽糖，對于這一點也是非常有效的。將本發(fā)明的糖類作醫(yī)藥用，適用的例子可為諸如輸液等。適用于輸液的情況下，例如，麥芽糖，已知其10%溶液是等滲的，因具有等量葡萄糖2倍的能量值，因此比葡萄糖等還有益。(“麻醉與復蘇”)20(3)163，1984)。同樣，等滲的15%麥芽三糖溶液具有葡萄糖3倍的能量價，其有效性更高。將本發(fā)明的糖類用于醫(yī)藥上時，可使用以下組成的組合物，通常包括單純的糖(麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖等)，或也可同時含有葡萄糖或麥芽糖，再含有適量氯化鈉、氯化鉀、醋酸鈉等無機鹽或有機鹽。輸液組成例將麥芽三糖15g、氯化鉀0.03g、氯化鈣0.02g、氯化鈉0.6g、乳酸鈉0.31g混合，成為100ml輸液的組成。下面用參考例和實施例對本發(fā)明作更詳細且具體的說明，而不是限定本發(fā)明。參考例1固定化CGTase珠的調制首先，將軟化芽胞桿菌(Bacillusmacerans)CGTase(Contizyme、天野制藥社制)200ml對0.01M醋酸緩沖液(pH6.0)作透析。另外，在室溫下，將殼聚糖珠BCW-3010(注冊商標，富士紡織社制，以下同)50ml在含2.5%戊二醛的0.1M醋酸緩沖液(pH5.0)中緩緩振蕩24小時后，充分地用水洗。然后，在此活化的殼聚糖珠中加入上述透析內液離心分離后的上清液，在4℃下緩緩振蕩16小時，使酶的結合完成后，充分水洗。這樣，獲得23.8mg蛋白質/ml珠的本固定化酶。參考例2固定化β-淀粉酶的調制首先，將來源于甘薯的β-淀粉酶(シクマ社制，硫酸銨懸濁液)4.8ml對0.01M醋酸緩沖液(pH5.0)作透析。另外，在室溫下，將殼聚糖珠BCW-301010ml(在含2.5%戊二醛的醋酸緩沖液(pH5.0)中緩緩振蕩24小時后，充分水洗。然后，在此活化的殼聚糖珠中加入上述透析內液離心分離后的上清液，在4℃下緩緩振蕩16小時，使酶的結合完成后，充分水洗。這樣，獲得6.44mg蛋白質/ml珠的本固定化酶。參考例3在殼聚糖珠上結合了麥芽糖的載體的調制將殼聚糖珠(chitopearl)BCW-30105ml與麥芽糖1.8g溶于甲醇/水＝1/1的混合溶媒20ml中，在麥芽糖溶解后，加入氰基硼氫化鈉，用醋酸調節(jié)pH為3-4，令反應進行3天。然后，濾取糖珠，充分進行水洗，得本載體。參考例4固定化葡糖淀酚酶的調制在35l葡糖淀粉酶“GluczymeNL-3”(天野制藥社制)中加入35l離子交換水進行稀釋，在柱中充填的33l殼聚糖株BCW-3010中導入用UF法精制所得的酶濃縮液，使其吸附在糖珠上。即，將此酶濃縮液用終濃度為0.05M的醋酸緩沖液(pH5.0)56l配成溶液，在8℃下經24小時循環(huán)，使其吸附，然后用0.05M醋酸緩沖液(pH5.0)150l洗滌，將含2.5%戊二醛的0.05M醋酸緩沖液(pH5.0)120l在柱中循環(huán)，完成固定化。剩余的戊二醛通過550l水而除去，從而得到24.4mg蛋白質/ml珠的本固定化酶。實施例1分別取300mg脫二氧亞胺基葡糖醇、N-甲基脫二氧亞胺基葡糖醇、N-芐基脫二氧亞胺基葡糖醇、N-羥乙基脫二氧亞胺基葡糖醇、N-丁基脫二氧亞胺基葡糖醇及葡糖基脫二氧亞胺基葡糖醇到50ml三角燒瓶中，各加入可溶性淀粉1200mg，在10ml水中加熱溶解，加入按參考例1的方法調制的固定化CGTase珠5ml，在40℃下振蕩3天進行轉移反應。然后，從各自這些反應液中取出3ml，加到10ml強酸型離子交換樹脂Dowex50W-X2上，進行充分水洗，用1N氨水60ml洗脫，用旋轉式蒸發(fā)器濃縮至干。此糖鏈轉移物的重量列于表1，各自的薄層色譜(TLC)見圖1。(硅膠G60F254、メルク社制;展開溶劑正丙醇/氨水＝6/2/1;顯色劑噴霧10%硫酸的乙醇溶液后，在火焰上加熱，以下同。)然后，將糖鏈轉移物按50mg/ml溶于水中，用2N鹽酸調節(jié)pH至5-6，加入按參考例2的方法調制的固定化β-淀粉酶200粒，在37℃下反應5小時。此β-淀粉酶反應液的TLC見圖2。從圖2很明顯可看出，分別生成麥芽糖。接著，將各β-淀粉酶反應液加到10ml強酸型離子交換樹脂Dowex50W-X2上，通過液用2N苛性納中和后，用旋轉式蒸發(fā)器濃縮至干。各自所得的麥芽糖重量列于表1。表1</tables>這些麥芽糖部分的TLC見圖3。從圖3可知生成的僅僅為麥芽糖。實施例2在50ml三角燒瓶中加入Validamine60mg和可溶性淀粉1200mg，加10ml水，加熱溶解，在其中加入按參考例1的方法調制的固定化CGTase珠5ml，在40℃下振蕩3天進行轉移反應。然后，從此反應液中取出3ml，加到10ml強酸型離子交換樹脂Dowex50W-X2上，充分水洗，用1N氨水60ml洗脫，在旋轉式蒸發(fā)器中濃縮至干。此糖鏈轉移物的重量為274mg，糖鏈轉移物的TLC見圖4。在此糖鏈轉移物中加水5.5ml，用2N鹽酸調節(jié)pH至5-6，加入按參考例2的的方法調制的固定化β-淀粉酶200粒，在37℃下反應5小時。此β-淀粉酶反應液的TLC見圖5。從圖5很明顯可看出生成的僅僅為麥芽糖。接著，將此β-淀粉酶反應液加到10ml強酸型離子交換樹脂Dowex50W-X2上，通過液用2N苛性鈉中和后，用旋轉式蒸發(fā)器濃縮至干。所得的麥芽糖重量為113mg。此麥芽糖部分的TLC見圖6。從圖6表明生成的僅僅為麥芽糖。實施例3在螺口試管內加入N-(1，3-二羥基-2-丙基)valiolamine60mg和酶糊精“Amycol”(注冊商標，日本淀粉社制)240mg，再加入CGTase“Contizyme”(天野制藥社制)1ml，加水至約2ml，在50℃下振蕩48小時，使發(fā)生轉移反應。將全部反應液通過約10ml強酸型離子交換樹脂Dowex50W-X2，充分水洗，用1N氨水60ml洗脫，將洗脫部分用旋轉式蒸發(fā)器濃縮至干。所得糖鏈轉移物的重量為118.6mg。在此糖鏈轉移物中加入0.1M醋酸緩沖液(pH4.8)10ml，使其溶解，接著加入100μlβ-淀粉酶(來源于甘薯、硫酸銨懸濁液，生化學工業(yè)社制)，于37℃下反應16小時。然后，將此β-淀粉酶反應液加到10ml強酸型離子交換樹脂Dowex50W-X2上，通過的流分和洗液一起，用2N氫氧化鈉中和，用旋轉式蒸發(fā)器濃縮至干，得129.8mg麥芽糖。實施例4將低聚葡糖基脫二氧亞胺基葡糖醇4.7g溶于170ml水中，用1N鹽酸調節(jié)至pH4.9后，加入1mlβ-淀粉酶(SERVA社制，來源于甘薯，848U/mg蛋白，三次重結晶品，5mg/ml)，于37℃下反應20小時。令反應液通過30ml強堿型離子交換樹脂DiaionSA-11A，用離子交換水充分洗凈。然后，將通過液和洗液合并，通過50ml強酸型離子交換樹脂Dowex50W-X2，用離子交換水充分洗凈。接著，將通過液和和洗液合并，濃縮至干，得粉末1.4g。用高速液相色譜法(柱Nucleosil5NH2、5μm、4mmi.d.×25;移動相乙腈/水＝70/30;檢測示差折射計)分析的結果，此麥芽糖的含量為98.3%。實施例5將可溶性淀粉15g在100ml水中加熱溶解后，溶解脫二氧亞胺基葡糖醇5g。然后，加水使全容積為170ml，加入按參考例1的方法調制的固定化CGTase珠20ml，于55℃下反應42小時。接著，過濾去除固定化CGTase珠，水洗后，將濾液和洗液合并，令其通過50ml強酸型離子交換樹脂Dowex50W-X2。將此充分水洗后，用1N氨水洗脫，將洗脫液凍結干燥，得11.3g。將此粉末溶于250ml水中，用2N鹽酸調節(jié)pH至5.0后，加入按參考例2的方法調制的固定化β-淀粉酶10ml，于37℃下反應3小時。然后，將此反應液過濾除去固定化β-淀粉酶，水洗后，將濾液與洗液合并，令其通過30ml強堿型離子交換樹脂DiaionSA-11A，進行充分水洗。接著，將通過液與洗液合并，減壓濃縮至約20ml，令其通過100ml強堿型離子交換樹脂Dowex50W-X2。輕輕地水洗后，將通過液與洗液合并，凍結干燥，得麥芽糖粉末800mg。將本品麥芽糖85mg/ml濃度的樣品10μl按與實施例4同樣的高速液相色譜條件進行分析的結果，本品如圖7所示，為100%麥芽糖。實施例6在按參考例3調制的5ml麥芽糖結合殼聚糖珠中加入酶糊精“Amycol”(注冊商標，日淀化學社制)3g、水10ml，用2N鹽酸調至pH6.0后，加入CGTase(Contizyme，天野制藥社制)5ml，于50℃下緩緩振蕩24小時。在濾去載體珠后，充分水洗，于100℃沸水中加熱5分鐘，進一步作充分水洗。另外，將未處理的殼聚糖珠代替麥芽糖結合殼聚糖珠同樣地進行反應以作對照。在這樣得到的載體珠5ml中，加入0.2M醋酸緩沖液10ml，再加β-淀粉酶(SERVA社制)50μl，于37℃緩緩振蕩。將反應液經時地取樣500μl，加入1ml3，5-二硝基水楊酸試劑，于100℃沸水中加熱10分鐘后，用水冷卻，加5ml水，以535nm處的吸光度來測定游離的麥芽糖。結果見圖8-A。與未處理的殼聚糖珠比較，經麥芽糖結合處理的殼聚糖珠明顯地顯示麥芽糖的游離。將此β-淀粉酶處理后的上清液濃縮，用TLC檢測，只檢出麥芽糖，未見其它小糖類的混入。實施例7將實施例6所用的β-淀粉酶切斷后的麥芽糖結合殼聚糖珠與對照的殼聚糖珠于100℃加熱處理5分鐘，充分水洗，在50ml三角燒瓶中，加入該水洗后的樣品5ml和酶糊精“Amycol”(注冊商標，日本淀粉社制)3g、水10ml、CGTase“Contizyme”(天野制藥社制)5ml，于50℃下振蕩24小時，再次進行反應。然后，將糖珠過濾洗凈，再于100℃加熱處理5分鐘，進一步地充分水洗。將此糖珠5ml加到0.2M醋酸緩沖液(pH4.8)10ml中，再加入50μlβ-淀粉酶(來源于甘薯，硫酸銨懸濁液，生化學工業(yè)社制)，于37℃下孵育，經時地取樣0.5ml，加入3，5-二硝基水楊酸試劑1ml，于100℃沸水中加熱5分鐘后，用水冷卻，加5ml水，以535nm處的吸光度來測定游離的麥芽糖，吸光度的變化見圖8-B。如圖8-B所示，與實施例6第1節(jié)的反應同樣，與對照比較，可充分確認麥芽糖的生成。由此，用麥芽糖結合珠也能反復進行麥芽糖的制備，即提示了連續(xù)生產的可能性。實施例8將與實施例1同樣獲得的脫二氧亞胺基葡糖醇糖鏈轉移物149mg溶于3ml水中，用2N鹽酸調至pH5.0，加入按參考例4調制的固定化葡糖淀粉酶珠200粒，于40℃下振蕩4小時使葡萄糖游離出來。將此反應液加到Dowex50W-X210ml上，未被吸附流出的部分用2.5N苛性鈉中和后，用旋轉式蒸發(fā)器濃縮至干，得純凈的葡萄糖58.3mg。圖9為其TLC。實施例9將與實施例1同樣得到的N-丙基脫二氧亞胺基葡糖醇和N-芐基脫二氧亞胺基葡糖醇的糖鏈轉移物各12.5mg溶于250μl水中，用2N鹽酸調至pH6.0，在其中加入由灰色鏈霉菌(streptomycesgriseus)NA-468(FERMP-2227)調制的生成麥芽三糖的淀粉酶溶液250μl(95單位/0.25mg蛋白;1單位在1小時內生成相當于1mg麥芽三糖的還原糖的酶量)，于40℃下緩緩振蕩2小時，生成麥芽三糖。圖10所示為此反應液的TLC。再將此反應液放到Dowex50W-X2上，未被吸附而流出的部分用2.5N苛性鈉中和。圖11所示為此麥芽三糖部分的TLC。圖11表明僅產生麥芽三糖。進一步用3，5-二硝基水楊酸法以麥芽三糖標準品為基準進行定量，測得麥芽三糖分別為5.2mg和5.7mg。實施例10在與實施例1同樣得到的N-丙基脫二氧亞胺基葡糖醇和N-芐基脫二氧亞胺基葡糖醇的糖鏈轉移物各12.5mg中，加入由施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)IFO-3773株調制的生成麥芽四糖的淀粉酶溶液250μl(26.25單位/0.24mg蛋白;1單位1小時內生成相當于1mg麥芽四糖的還原糖的酶量)，于40℃下緩緩振蕩2小時，生成麥芽四糖。再將此反應液加到Dowex50W-X2上，收集未被吸附而流出的部分。此麥芽四糖部分反應第20分鐘的TLC見圖12。圖12表明僅產生麥芽四糖。進一步用3，5-二硝基水楊酸法以麥芽四糖標準品為基準進行定量，測得麥芽四糖分別為2.0mg和1.6mg。實施例11在與實施例1同樣得到的N-丙基脫二氧亞胺基葡糖醇和N-芐基脫二氧亞胺基葡糖醇的糖鏈轉移物各12.5mg中，加入由假單胞菌屬Pseudomonssp.kO-8940(FERMP-7456)調制的生成麥芽五糖的淀粉酶溶液250μl(10.13單位/1.85mg蛋白;1單位在1小時內生成相當于1mg麥芽五糖的還原糖的酶量)，于40℃下緩緩振蕩2小時，生成麥芽五糖。再將此反應液加到Dowex50W-X2上，收集未被吸附而流出的部分。圖13所示為從N-芐基脫二氧亞胺基葡糖醇制麥芽五糖部分的反應第90分鐘的TLC圖。圖13表明僅產生麥芽五糖。進一步用3，5-二硝基水楊酸法以麥芽五糖標準品為基準進行定量，測得麥芽五糖分別為0.6mg和0.8mg。圖1為實施例1中的糖鏈轉移物的TLC。圖1中，1-6分別表示脫二氧亞胺基葡糖醇、N-甲基脫二氧亞胺基葡糖醇、N-芐基脫二氧亞胺基葡糖醇、N-羥乙基脫二氧亞胺基葡糖醇、N-丁基脫二氧亞胺基葡糖醇及葡糖基脫二氧亞胺基葡糖醇的各糖鏈轉移物，a、b、c、d、e、f為作為標準品的上述各脫二氧亞胺基葡糖醇類。圖2為實施例1中β-淀粉酶反應液的TLC。圖中1、2、3、4、5、6與圖1所說明的相同。M為麥芽糖。圖3為實施例1中麥芽糖部分的TLC。圖中1、2、3、4、5、6與圖1所說明的相同。M為麥芽糖。圖4為實施例2中糖鏈轉移物的TLC。7和Ba分別表示validamine糖鏈轉移物和validamine。圖5為實施例2中β-淀粉酶反應液的TLC.7為validamine糖鏈轉移物，M為麥芽糖。圖6為實施例2中麥芽糖部分的TLC。7為validamine糖鏈轉移物，M為麥芽糖。圖7為實施例5中所得的麥芽糖粉末的高速液相色譜圖。圖中A為溶劑峰，B為麥芽糖峰。圖8-A是實施例6的結果?！駷椴捎名溠刻墙Y合殼聚糖珠的情形，○為采用未處理的殼聚糖珠的情形，縱軸為溶液的吸光度，橫軸為時間(小時)。圖8-B是實施例7的結果?！駷椴捎名溠刻墙Y合殼聚糖珠的情形，○為采用未處理的殼聚糖珠的情形。縱軸為溶液的吸光度，橫軸為時間(小時)。圖9為實施例8中葡萄糖部分的TLC。圖中8為葡萄糖部分，G為葡萄糖。圖10為實施例9中生成麥芽三糖的淀粉酶反應液的TLC。圖中9、10分別為N-丙基脫二氧亞胺基葡糖醇和N-芐基脫二氧亞胺基葡糖醇的糖鏈轉移物，T為麥芽三糖。圖11為實施例9中麥芽三糖部分的TLC。圖中9為從N-丙基脫二氧亞胺基葡糖醇而來的麥芽三糖部分，10為從N-芐基脫二氧亞胺基葡糖醇而來的麥芽三糖部分，T為麥芽三糖。圖12為實施例10中麥芽四糖部分的TLC。圖中11為從N-丙基脫二氧亞胺基葡糖醇而來的麥芽四糖部分，圖中12為從N-芐基脫二氧亞胺基葡糖醇而來的麥芽四糖部分，Te為麥芽四糖。圖13為實施例11中麥芽五糖部分的TLC。圖中13為從N-芐基脫二氧亞胺基葡糖醇而來的麥芽五糖部分，Pe為麥芽五糖。權利要求1.糖類的制備方法，其特征在于在糖鏈轉移酶的作用下，直接地或經中間體介導地，將糖鏈從其它的糖鏈供給源轉移到對于作為目的物的特定鏈長的糖類實質上可分離的物質上，使所得到的低聚糖受將低聚糖特定長度的糖鏈切成exo型的酶的作用，從而分離作為目的物的特定糖鏈長的糖類。2.按權利要求1所述的糖類的制備方法，其特征在于對于作為目的物的特定糖鏈長的糖類實質上可分離的物質為載體或以下面的通式[Ⅰ]表示的化合物(式中R為氫、低級烷基、羥烷基、苯基烷基、苯基鏈烯基、苯基炔基、苯氧基烷基、苯氧基鏈烯基或苯氧基炔基，其中苯基上也含有取代基)、野尻霉素、氨基環(huán)醇、氨基環(huán)醇衍生物、或葡糖醛酸或其葡糖基或低聚葡糖基體。3.一種輸液，其特征在于以下面的通式[Ⅱ](式中，n為從2-5的整數)表示的麥芽低聚糖為主成分。全文摘要提供可獲得高純葡萄糖、麥芽糖、麥芽低聚糖等固定糖鏈長的糖類單體的簡便制備方法。本制備法系采用糖鏈轉移酶將糖鏈從糖鏈供給源轉移到對于上述糖類實質上可分離的物質上，使所得的低聚糖受將特定的糖鏈切成exo型的酶的作用。文檔編號C12P17/12GK1063897SQ9110801公開日1992年8月26日申請日期1991年12月12日優(yōu)先權日1991年2月5日發(fā)明者江連洋治,丸尾重昭,宮崎克憲,山田直義申請人:日本新藥株式會社