本發(fā)明屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種蹄形藻胞內(nèi)液及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

衰老是人類生命過程的必然規(guī)律，也是一種不可抗拒的自然現(xiàn)象，而當(dāng)前全球人口老齡化加劇的事實(shí)，迫使人類社會(huì)面臨著艱巨的養(yǎng)老和抗衰老壓力。衰老的自由基學(xué)說認(rèn)為體內(nèi)的活性氧及其自由基對(duì)機(jī)體細(xì)胞有明顯的破壞作用，會(huì)引起各種生物結(jié)構(gòu)的廣泛損傷，包括生物膜變性、染色體移位、dna突變、組織破壞和老化等，最終導(dǎo)致機(jī)體衰老。運(yùn)用衰老相關(guān)的現(xiàn)代理論，以食療保健的方式來延緩衰老進(jìn)程，是一種有效的抗衰老策略。以食源性的材料為物質(zhì)基礎(chǔ)，通過適宜的提取、制備方法，尋找具有抗氧化、抗衰老功能的生物活性成分，有助于開發(fā)抗衰老功能相關(guān)的保健產(chǎn)品。

微藻是一類于海洋、湖泊、河流等水體環(huán)境中獨(dú)立存在或成鏈狀、團(tuán)狀存在的單細(xì)胞微觀藻類。微藻具有極大的生物多樣性，約有200000～800000種微藻，其中約35000種已有描述，超過15000種從藻類生物物質(zhì)中產(chǎn)生的新型化合物已進(jìn)行化學(xué)鑒定。微藻所生產(chǎn)及含有的活性成分具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在醫(yī)藥、保健品、飼料、化工和環(huán)保等方面有廣泛的應(yīng)用。但目前研究的微藻種類范圍較窄，且大部分微藻的應(yīng)用研究主要集中在高效產(chǎn)油方面，而在醫(yī)藥、保健品方面的應(yīng)用研究，目前主要集中在螺旋藻、小球藻和紫球藻等幾種常見的微藻，對(duì)于其他微藻則相對(duì)報(bào)道較少。

蹄形藻細(xì)胞呈馬蹄形，兩端略細(xì)，不尖銳，缺口為u型，群體具粘質(zhì)膠被，呈球形，細(xì)胞分散排列在膠被內(nèi)。目前對(duì)蹄形藻的研究主要集中在高效產(chǎn)油方面，對(duì)其抗氧化方面的生物活性研究較少。因此積極開發(fā)具有抗氧化與抗衰老作用的蹄形藻提取物將對(duì)衰老相關(guān)疾病的預(yù)防和治療有重大意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供了一種蹄形藻胞內(nèi)液。本發(fā)明提供的蹄形藻胞內(nèi)液具有顯著的抗氧化和抗衰老作用，可應(yīng)用于制備具有抗氧化、抗衰老功能的保健食品和藥品。

本發(fā)明發(fā)明人在對(duì)微藻進(jìn)行研究的過程中，經(jīng)大量的試驗(yàn)意外發(fā)現(xiàn)，經(jīng)反復(fù)凍融法提取得到的蹄形藻胞內(nèi)液能顯著提高超氧化物歧化酶(sod)的活力和降低體內(nèi)活性自由基(ros)的水平，具有顯著的抗氧化作用，同時(shí)其能夠緩解由氧化脅迫引起的早衰現(xiàn)象，具有顯著的抗衰老作用。

本發(fā)明的技術(shù)方案將通過下面的詳細(xì)描述來進(jìn)一步體現(xiàn)和說明。

一種蹄形藻胞內(nèi)液，其制備方法包括如下步驟：

取新鮮的蹄形藻濕藻，在溫度為-20℃～-40℃的條件下冷凍12小時(shí)，室溫融化12小時(shí)，反復(fù)凍融3～5次，在轉(zhuǎn)速為5000r/min～10000r/min的條件下離心5～15min，將上清液和沉淀分離，取上清液，即得蹄形藻胞內(nèi)液。

本發(fā)明所述蹄形藻(kirchneriellasp.)由中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所提供，其在中國(guó)科學(xué)院淡水藻種庫(kù)中的編號(hào)為fachb-1082。

本發(fā)明提供的蹄形藻胞內(nèi)液具有顯著的抗氧化和抗衰老作用，可應(yīng)用于制備具有抗氧化和/或抗衰老功能的保健食品和藥品。

本發(fā)明蹄形藻胞內(nèi)液可單獨(dú)或與其他活性成分合用，作為唯一或主要活性成分應(yīng)用于制備具有抗氧化和/或抗衰老功能的保健食品和藥品，所述保健食品和藥品的劑型優(yōu)選為片劑、膠囊劑、注射液、口服液、顆粒劑、丸劑、散劑和滴丸劑等。

本發(fā)明所述的抗氧化、抗衰老作用是指對(duì)以病理或生理?xiàng)l件下因發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)所產(chǎn)生的變化為主要特征的衰老及衰老相關(guān)疾病的防治作用。

此外，本發(fā)明發(fā)明人在進(jìn)一步的研究中，意外地發(fā)現(xiàn)，對(duì)上述制備蹄形藻胞內(nèi)液過程中，分離蹄形藻胞內(nèi)液后剩余的沉淀進(jìn)行進(jìn)一步處理得到的蹄形藻乙醇提取物，同樣具有顯著的抗氧化、抗衰老作用，可應(yīng)用于制備具有抗氧化和/或抗衰老功能的保健食品和藥品。其中，所述蹄形藻乙醇提取物的制備方法包括如下步驟：

s1、取新鮮的蹄形藻濕藻，在溫度為-20℃～-40℃的條件下冷凍12小時(shí)，室溫融化12小時(shí)，反復(fù)凍融3～5次，在轉(zhuǎn)速為5000r/min～10000r/min的條件下離心5～15min，將上清液和沉淀分離，取沉淀備用；上清液即為蹄形藻胞內(nèi)液；

s2、向步驟s1所述的沉淀中按濕藻與乙醇的固液比1g/ml加入體積分?jǐn)?shù)為70％～99％的乙醇超聲提取2～4次，超聲提取的頻率為35～40khz，溫度為4℃，每次超聲的時(shí)間為10～30min，在轉(zhuǎn)速為5000r/min～10000r/min的條件下離心5～15min，將上清液和沉淀分離，取上清液進(jìn)行真空干燥，將真空干燥后的產(chǎn)物用一級(jí)水溶解，即得蹄形藻乙醇提取物。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

(1)本發(fā)明提供的蹄形藻胞內(nèi)液可以顯著降低體內(nèi)活性氧自由基(ros)水平，提高體內(nèi)超氧化物歧化酶(sod)的活力，具有顯著的抗氧化作用。

(2)本發(fā)明提供的蹄形藻胞內(nèi)液可以延長(zhǎng)自然條件下秀麗隱桿線蟲平均壽命，并且可以顯著提高氧化脅迫條件下秀麗隱桿線蟲的存活率，具有顯著的抗衰老和抗氧化作用。

(3)本發(fā)明提供的蹄形藻胞內(nèi)液的制備方法具有周期短，有機(jī)溶劑消耗少，工藝簡(jiǎn)單，安全無毒，穩(wěn)定高效等特點(diǎn)，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

附圖說明

圖1蹄形藻胞內(nèi)液對(duì)氧化脅迫條件下秀麗隱桿線蟲存活率的影響。

圖2蹄形藻胞內(nèi)液對(duì)自然條件下秀麗隱桿線蟲平均壽命的影響。

圖3蹄形藻胞內(nèi)液對(duì)秀麗隱桿線蟲體內(nèi)ros水平的影響。

圖4蹄形藻胞內(nèi)液對(duì)秀麗隱桿線蟲體內(nèi)sod活力的影響。

圖5蹄形藻乙醇提取物對(duì)氧化脅迫條件下秀麗隱桿線蟲存活率的影響。

圖6蹄形藻乙醇提取物對(duì)秀麗隱桿線蟲體內(nèi)ros水平的影響。

具體實(shí)施方式

下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明。

本發(fā)明實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑，如無特殊說明，均為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。

本發(fā)明實(shí)施例中，蹄形藻由中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所提供，其在中國(guó)科學(xué)院淡水藻種庫(kù)中的編號(hào)為fachb-1082。

sbasal溶液：稱取5.8gnacl，1.3gk2hpo4·3h2o和6.0gkh2po4置于試劑瓶中，加入750ml去離子水，完全溶解后定容至1l，滅菌30min，冷卻至40-50℃?zhèn)溆谩?/p>

smedium溶液：取1l滅菌后的sbasal溶液，逐滴加入1ml5.0mg/ml膽固醇乙醇溶液，邊加變振搖，使其充分溶解(溶液由無色透明轉(zhuǎn)為微乳白透明，無明顯沉淀)，然后依次加入3ml1mcacl2溶液，3ml1mmgso4，10ml1m檸檬酸鉀溶液(ph＝6.0)和10ml微量元素溶液，常溫放置備用。

實(shí)施例1蹄形藻胞內(nèi)液的制備

取新鮮的蹄形藻濕藻，在溫度為-30℃的條件下冷凍12小時(shí)，室溫融化12小時(shí)，反復(fù)凍融4次，在轉(zhuǎn)速為8000r/min的條件下離心10min，將上清液和沉淀分離，取上清液，加一級(jí)水調(diào)節(jié)其相對(duì)于蹄形藻(濕藻)重量的濃度為2ga/ml(a表示蹄形藻濕藻)，即得蹄形藻胞內(nèi)液。

實(shí)施例2蹄形藻胞內(nèi)液的制備

取新鮮的蹄形藻濕藻，在溫度為-20℃的條件下冷凍12小時(shí)，室溫融化12小時(shí)，反復(fù)凍融5次，在轉(zhuǎn)速為10000r/min的條件下離心5min，將上清液和沉淀分離，取上清液，加一級(jí)水調(diào)節(jié)其相對(duì)于蹄形藻(濕藻)重量的濃度為2ga/ml(a表示蹄形藻濕藻)，即得蹄形藻胞內(nèi)液。

實(shí)施例3蹄形藻胞內(nèi)液的制備

取新鮮的蹄形藻濕藻，在溫度為-40℃的條件下冷凍12小時(shí)，室溫融化12小時(shí)，反復(fù)凍融3次，在轉(zhuǎn)速為5000r/min的條件下離心15min，將上清液和沉淀分離，取上清液，加一級(jí)水調(diào)節(jié)其相對(duì)于蹄形藻(濕藻)重量的濃度為2ga/ml(a表示蹄形藻濕藻)，即得蹄形藻胞內(nèi)液。

實(shí)施例4蹄形藻胞內(nèi)液對(duì)氧化脅迫條件下秀麗隱桿線蟲存活率的影響

百草枯，學(xué)名甲基紫精，是一種強(qiáng)氧化劑，可誘導(dǎo)體內(nèi)大量產(chǎn)生活性氧自由基(ros)，使機(jī)體處于氧化脅迫環(huán)境，進(jìn)而出現(xiàn)早衰現(xiàn)象。

取實(shí)施例1制得的蹄形藻胞內(nèi)液，按終濃度100mga/ml，300mga/ml分別加入到成蟲初期的野生型秀麗隱桿線蟲(n2)(由美國(guó)明尼蘇達(dá)大學(xué)秀麗隱桿線蟲遺傳信息保藏中心提供)中，對(duì)照組加入等體積的smedium溶液，置于20℃培養(yǎng)24h后，加入終濃度為50mm的百草枯進(jìn)行氧化脅迫造模，然后每隔12h統(tǒng)計(jì)秀麗隱桿線蟲存活的比例，直至其全部死亡。秀麗隱桿線蟲的存活率以生存曲線表示，結(jié)果用kaplan-meier法進(jìn)行分析。結(jié)果如圖1所示。

圖1結(jié)果顯示，蹄形藻胞內(nèi)液能夠延長(zhǎng)氧化脅迫條件下秀麗隱桿線蟲的生存時(shí)間，提高其存活率，當(dāng)蹄形藻胞內(nèi)液終濃度為300mga/ml時(shí)，效果最為顯著。試驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明提供的蹄形藻胞內(nèi)液能夠緩解由氧化脅迫引起的早衰現(xiàn)象，具有顯著的抗氧化和抗衰老作用。

實(shí)施例5蹄形藻胞內(nèi)液對(duì)自然條件下秀麗隱桿線蟲平均壽命的影響

向同步化后的l4期野生型秀麗隱桿線蟲(n2)中加入終濃度為100mga/ml的實(shí)施例1制備的蹄形藻胞內(nèi)液，對(duì)照組加入等體積的smedium溶液，置于20℃培養(yǎng)，然后每隔1天統(tǒng)計(jì)秀麗隱桿線蟲的存活情況，直至其全部死亡。秀麗隱桿線蟲的壽命以生存曲線表示，結(jié)果用kaplan-meier法進(jìn)行分析。結(jié)果如圖2所示。

圖2結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，蹄形藻胞內(nèi)液相能夠延長(zhǎng)秀麗隱桿線蟲的平均壽命。試驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明提供的蹄形藻胞內(nèi)液具有延緩衰老進(jìn)程的作用。

實(shí)施例6蹄形藻胞內(nèi)液對(duì)秀麗隱桿線蟲體內(nèi)ros水平的影響

取24孔培養(yǎng)板，設(shè)試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組設(shè)兩個(gè)孔，每孔終體積為1ml，試驗(yàn)組加同步化后的l4期野生型秀麗隱桿線蟲(n2)和實(shí)施例1制得的蹄形藻胞內(nèi)液，蹄形藻胞內(nèi)液的終濃度100mga/ml，對(duì)照組加同步化后的l4期野生型秀麗隱桿線蟲(n2)和與試驗(yàn)組蹄形藻胞內(nèi)液等體積的smedium溶液，置于20℃培養(yǎng)24h后，每孔加入百草枯至終濃度為2mm，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，收集各組秀麗隱桿線蟲，將其分別在冰浴條件下勻漿，將勻漿液在4℃、10000g條件下離心5min，收集上清液，向上清液中加入終濃度為50μm的dcfh-da探針(購(gòu)于sigma公司，cas號(hào)：2044-85-1)溶液，利用熒光酶標(biāo)儀在485nm激發(fā)波長(zhǎng)和538nm發(fā)射波長(zhǎng)下檢測(cè)熒光強(qiáng)度，室溫檢測(cè)2h，每10min測(cè)一次。結(jié)果用f檢驗(yàn)分析，結(jié)果如圖3所示。

圖3結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，經(jīng)蹄形藻胞內(nèi)液飼喂后，秀麗隱桿線蟲體內(nèi)ros水平顯著下降。試驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明提供的蹄形藻胞內(nèi)液能夠促進(jìn)體內(nèi)ros的清除，降低體內(nèi)ros水平，具有顯著的抗氧化能力。

實(shí)施例7蹄形藻胞內(nèi)液對(duì)秀麗隱桿線蟲體內(nèi)sod活力的影響

取24孔培養(yǎng)板，設(shè)試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組設(shè)兩個(gè)孔，每孔終體積為1ml，試驗(yàn)組加同步化后的l4期野生型秀麗隱桿線蟲(n2)和實(shí)施例1制得的蹄形藻胞內(nèi)液，蹄形藻胞內(nèi)液的終濃度100mga/ml，對(duì)照組加同步化后的l4期野生型秀麗隱桿線蟲(n2)和與試驗(yàn)組蹄形藻胞內(nèi)液等體積的smedium溶液，置于20℃培養(yǎng)72h后，收集各組秀麗隱桿線蟲，將其分別在冰浴條件下勻漿，將勻漿液在4℃、10000g條件下離心5min，收集上清液，利用總sod活性檢測(cè)試劑盒(購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所，產(chǎn)品編號(hào)：s0101)測(cè)定秀麗隱桿線蟲勻漿上清液中sod活力。結(jié)果如圖4所示。

圖4結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，蹄形藻胞內(nèi)液能顯著提高秀麗隱桿線蟲體內(nèi)sod的活力。試驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明提供的蹄形藻胞內(nèi)液能夠顯著提高體內(nèi)sod的活力，具有顯著的抗氧化能力。

實(shí)施例8蹄形藻乙醇提取物的制備

s1、取新鮮的蹄形藻濕藻，在溫度為-30℃的條件下冷凍12小時(shí)，室溫融化12小時(shí)，反復(fù)凍融4次，在轉(zhuǎn)速為8000r/min的條件下離心10min，將上清液和沉淀分離，取沉淀備用；

s2、向步驟s1所述的沉淀中按濕藻與乙醇的固液比1g/ml加入體積分?jǐn)?shù)為85％的乙醇超聲提取3次，超聲提取的頻率為40khz，溫度為4℃，每次超聲的時(shí)間為20min，在轉(zhuǎn)速為8000r/min的條件下離心10min，將上清液和沉淀分離，取上清液進(jìn)行真空干燥，將真空干燥后的產(chǎn)物用一級(jí)水溶解，調(diào)節(jié)其相對(duì)于蹄形藻(濕藻)重量的濃度為1ga/ml(a表示蹄形藻濕藻)，即得蹄形藻乙醇提取物。

實(shí)施例9蹄形藻乙醇提取物對(duì)氧化脅迫條件下秀麗隱桿線蟲存活率的影響

取實(shí)施例8制得的蹄形藻乙醇提取物，按終濃度300mga/ml加入到成蟲初期的野生型秀麗隱桿線蟲(n2)中，對(duì)照組加入等體積的smedium溶液，置于20℃培養(yǎng)24h后，加入終濃度為50mm的百草枯進(jìn)行氧化脅迫造模，然后每隔12h統(tǒng)計(jì)秀麗隱桿線蟲存活的比例，直至其全部死亡。秀麗隱桿線蟲的存活率以生存曲線表示，結(jié)果用kaplan-meier法進(jìn)行分析。結(jié)果如圖5所示。

圖5結(jié)果顯示，蹄形藻乙醇提取物能夠延長(zhǎng)氧化脅迫條件下秀麗隱桿線蟲的生存時(shí)間，提高其存活率。試驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明提供的蹄形藻乙醇提取物能夠緩解由氧化脅迫引起的早衰現(xiàn)象，具有顯著的抗氧化和抗衰老作用。

實(shí)施例10蹄形藻乙醇提取物對(duì)秀麗隱桿線蟲體內(nèi)ros水平的影響

取24孔培養(yǎng)板，設(shè)試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組設(shè)兩個(gè)孔，每孔終體積為1ml，試驗(yàn)組加同步化后的l4期野生型秀麗隱桿線蟲(n2)和實(shí)施例8制得的蹄形藻乙醇提取物，蹄形藻乙醇提取物的終濃度100mga/ml，對(duì)照組加同步化后的l4期野生型秀麗隱桿線蟲(n2)和與試驗(yàn)組蹄形藻乙醇提取物等體積的smedium溶液，置于20℃培養(yǎng)24h后，每孔加入百草枯至終濃度為2mm，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，收集各組秀麗隱桿線蟲，將其分別在冰浴條件下勻漿，將勻漿液在4℃、10000g條件下離心5min，收集上清液，向上清液中加入終濃度為50μm的dcfh-da探針溶液，利用熒光酶標(biāo)儀在485nm激發(fā)波長(zhǎng)和538nm發(fā)射波長(zhǎng)下檢測(cè)熒光強(qiáng)度，室溫檢測(cè)2h，每10min測(cè)一次。結(jié)果用f檢驗(yàn)分析，結(jié)果如圖6所示。

圖6結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，經(jīng)蹄形藻乙醇提取物飼喂后，秀麗隱桿線蟲體內(nèi)ros水平顯著下降。試驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明提供的蹄形藻乙醇提取物能夠促進(jìn)體內(nèi)ros的清除，降低體內(nèi)ros水平，具有顯著的抗氧化能力。

以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說明。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡(jiǎn)單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。