本發(fā)明涉及動(dòng)物養(yǎng)殖飼料技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及酵母培養(yǎng)物在制備改善魚(yú)類生長(zhǎng)、提高魚(yú)類非特異性免疫力的飼料中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
酵母培養(yǎng)物(yeast culture，YC)是指在一定的工藝條件下酵母菌在特定培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)深度發(fā)酵而得到復(fù)雜發(fā)酵產(chǎn)物，它包括細(xì)胞代謝產(chǎn)物(含多肽、有機(jī)酸、氨基酸、核酸、酶類、未知生長(zhǎng)因子等)、變性培養(yǎng)基(含寡糖、多肽等)和酵母細(xì)胞本身(蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸、細(xì)胞壁多糖等)，營(yíng)養(yǎng)成分十分豐富，可為動(dòng)物腸道內(nèi)共生菌提供“全價(jià)營(yíng)養(yǎng)底物”，最大限度維持體內(nèi)腸道各菌系之間的平衡，促進(jìn)腸道功能正常，提高飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收率，從而改善動(dòng)物生產(chǎn)性能。
但是，現(xiàn)有技術(shù)中，酵母培養(yǎng)物的研究多是在以飼料添加成分對(duì)反芻動(dòng)物的生長(zhǎng)性能影響的研究，而對(duì)魚(yú)類生長(zhǎng)性能，尤其是在影響魚(yú)類非特異性免疫的研究卻很少。因此，將酵母培養(yǎng)物作為魚(yú)類飼料添加成分，對(duì)提高魚(yú)類生產(chǎn)水平、優(yōu)化魚(yú)飼料具有重要的意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種酵母培養(yǎng)物在制備改善魚(yú)類生長(zhǎng)、提高魚(yú)類非特異性免疫力的飼料中的應(yīng)用。
為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
酵母培養(yǎng)物在制備改善魚(yú)類生長(zhǎng)、提高魚(yú)類非特異性免疫力的飼料中的應(yīng)用，其中的酵母培養(yǎng)物是按照包括如下步驟的方法制備得到的：將保藏號(hào)為CGMCC No.2.399的釀酒酵母，經(jīng)斜面菌種活化后，得到的酵母菌種繼續(xù)接種制備種子液，將種子液依次進(jìn)行液體有氧發(fā)酵，固體厭氧發(fā)酵，將得到的固體發(fā)酵產(chǎn)物通過(guò)干燥及粉碎得到酵母培養(yǎng)物。
作為進(jìn)一步的技術(shù)方案，斜面菌種活化包括如下步驟：將冷凍保藏的保藏號(hào)為CGMCCNo.2.399的釀酒酵母接種到斜面培養(yǎng)基上，靜置恒溫28～35℃，培養(yǎng)40～70h，得到活化后的酵母菌種。
斜面培養(yǎng)基為固體麥芽汁培養(yǎng)基，包括麥芽膏粉、氯霉素、瓊脂；各成分含量?jī)?yōu)選為麥芽膏粉130g/L、氯霉素0.1g/L，瓊脂2％。
上述種子液的制備包括如下步驟：將酵母菌種接種至液體培養(yǎng)基中，在28～35℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速120～200r/min；培養(yǎng)18～30h。
作為進(jìn)一步的技術(shù)方案，液體有氧發(fā)酵包括如下步驟：將種子液以10％～20％接種量接種到裝有新的液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，控制通氣量為1～5L/min，溫度為28～35℃，發(fā)酵時(shí)間為20～35h；得到擴(kuò)大培養(yǎng)的液體菌種液。
液體培養(yǎng)基為麥芽汁培養(yǎng)基，包括麥芽膏粉、氯霉素，兩者含量?jī)?yōu)選為麥芽膏粉130g/L、氯霉素0.1g/L；pH值為5.6～6.5。
作為進(jìn)一步的技術(shù)方案，固體厭氧發(fā)酵包括如下步驟：將液體菌種液以20％～30％的接種量接種至無(wú)菌固體培養(yǎng)基中，于雙層可控溫隔離干燥設(shè)備中進(jìn)行固體厭氧發(fā)酵，控制水分含量為35％～70％，發(fā)酵溫度為28～35℃，發(fā)酵時(shí)間18～50h；得到固體發(fā)酵產(chǎn)物。
固體培養(yǎng)基包括按質(zhì)量份數(shù)計(jì)的秸稈4～7份、玉米粉3～5份、麩皮1～3份或酒糟3～5份的任三種或四種；培養(yǎng)基碳氮比為(2～7)∶1，通過(guò)添加尿素進(jìn)行控制。
作為進(jìn)一步的技術(shù)方案，干燥包括如下步驟：將固體發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行干燥，干燥方式真空干燥，干燥溫度25℃～45℃，優(yōu)選30℃，得到酵母培養(yǎng)物初產(chǎn)品。
作為進(jìn)一步的技術(shù)方案，粉碎包括如下步驟：將酵母培養(yǎng)物初產(chǎn)品進(jìn)行粉碎，粉碎過(guò)篩40～60目，得到酵母培養(yǎng)物產(chǎn)品。
作為進(jìn)一步的技術(shù)方案，酵母培養(yǎng)物在飼料中的添加量的質(zhì)量百分含量為0.2～1％
作為進(jìn)一步的技術(shù)方案，飼料的日投飼次數(shù)為2～3次，日投飼率為魚(yú)體重的3～5％。
作為進(jìn)一步的技術(shù)方案，飼料的主要營(yíng)養(yǎng)成分包括粗蛋白50％～55％，粗脂肪10％～12％；飼料粉碎后，用80～100目篩去除大顆粒，混合均勻后壓制成粒徑為1～2mm的顆粒飼料，冷藏儲(chǔ)存。
本發(fā)明的有益效果：
本發(fā)明通過(guò)在魚(yú)飼料中添加不同濃度的酵母培養(yǎng)物，來(lái)研究酵母培養(yǎng)物對(duì)魚(yú)類生長(zhǎng)性能和非特異性免疫的影響，為酵母培養(yǎng)物在魚(yú)飼料中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)；試驗(yàn)證明，在大菱鲆的飼料中添加不同濃度的酵母培養(yǎng)物，均能顯著提高大菱鲆增重率(P＜0.05)，并且均能顯著降低飼料系數(shù)(P＜0.05)，可知酵母培養(yǎng)物對(duì)大菱鲆的生長(zhǎng)性能有顯著改善；同時(shí)，均能顯著提高大菱鲆溶菌酶和堿性磷酸酶的活力，進(jìn)而提高大菱鲆非特異性免疫水平。
具體實(shí)施方式
下面對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步說(shuō)明。在此需要說(shuō)明的是，對(duì)于這些實(shí)施方式的說(shuō)明用于幫助理解本發(fā)明，但并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限定。此外，下面所描述的本發(fā)明各個(gè)實(shí)施方式中所涉及的技術(shù)特征只要彼此之間未構(gòu)成沖突就可以相互組合。
下述實(shí)施例中所使用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
下述實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
下述實(shí)施例中所使用的菌株的詳細(xì)信息如下：
釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)：CGMCC編號(hào)為2.399；該釀酒酵母已在申請(qǐng)?zhí)枮镃N201410629012.0，專利名稱為一種黃水醋飲的生產(chǎn)方法的發(fā)明授權(quán)專利中公開(kāi)。
下述實(shí)施例中所使用的大菱鲆由山東某水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)提供；大菱鲆(Scophthalmus maximus)俗稱“多寶魚(yú)”，屬于鰈形目、鲆科菱鲆屬，是產(chǎn)自歐洲的一種冷水性海產(chǎn)魚(yú)類，于1992年引進(jìn)我國(guó)，因其低耗氧量，生長(zhǎng)迅速，適合高密度養(yǎng)殖，迅速成為我國(guó)北方重要水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)種類。
實(shí)施例1，酵母培養(yǎng)物的制備
1、斜面菌種活化：將冷凍保藏的保藏號(hào)為CGMCC No.2.399的釀酒酵母接種到含有麥芽膏粉130g/L、氯霉素0.1g/L，瓊脂2％的斜面培養(yǎng)基上，靜置恒溫28℃，培養(yǎng)40h，得到活化后的酵母菌種。
2、種子液的制備：將活化后的酵母菌種用1環(huán)接種至含有麥芽膏粉130g/L、氯霉素0.1g/L；pH值為5.6的液體培養(yǎng)基中，在28℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速120r/min；培養(yǎng)18h。
3、液體有氧發(fā)酵：將制備好的種子液以10％接種量接種到裝有新的含有麥芽膏粉130g/L、氯霉素0.1g/L；pH值為5.6的液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，控制通氣量為5L/min，溫度為28℃，發(fā)酵時(shí)間為20h：得到擴(kuò)大培養(yǎng)的液體菌種液。
4、固體厭氧發(fā)酵：將液體菌種液以20％的接種量接種至質(zhì)量份數(shù)為秸稈4份、玉米粉3份、麩皮3份的無(wú)菌固體培養(yǎng)基中，添加尿素控制碳氮比為2∶1，于雙層可控溫隔離干燥設(shè)備中進(jìn)行固體厭氧發(fā)酵，控制水分含量為35％，發(fā)酵溫度為28℃，發(fā)酵時(shí)間18h；得到固體發(fā)酵產(chǎn)物。
5、酵母培養(yǎng)物的獲得
將所述固體發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行干燥，干燥方式真空干燥，干燥溫度25℃～45℃，優(yōu)選30℃，得到酵母培養(yǎng)物初產(chǎn)品。再將所屬酵母培養(yǎng)物初產(chǎn)品進(jìn)行粉碎，粉碎過(guò)篩40～60目，即可得到酵母培養(yǎng)物產(chǎn)品。該產(chǎn)品粗蛋白質(zhì)含量為14.9％，甘露聚糖含量為1.0％，β-葡聚糖含量為3.5％，灰分含量為7.8％。
實(shí)施例2，酵母培養(yǎng)物的制備
1、斜面菌種活化：將冷凍保藏的保藏號(hào)為CGMCC No.2.399的釀酒酵母接種到含有麥芽膏粉130g/L、氯霉素0.1g/L，瓊脂2％的斜面培養(yǎng)基上，靜置恒溫30℃，培養(yǎng)48h，得到活化后的酵母菌種。
2、種子液的制備：將活化后的酵母菌種用1環(huán)接種至含有麥芽膏粉130g/L、氯霉素0.1g/L；pH值為6.5的液體培養(yǎng)基中，在30℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速160r/min；培養(yǎng)24h。
3、液體有氧發(fā)酵：將制備好的種子液以20％接種量接種到裝有新的含有麥芽膏粉130g/L、氯霉素0.1g/L；pH值為5.6的液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，控制通氣量為2L/min，溫度為30℃，發(fā)酵時(shí)間為28h；得到擴(kuò)大培養(yǎng)的液體菌種液。
4、固體厭氧發(fā)酵：將液體菌種液以30％的接種量接種至質(zhì)量份數(shù)為秸稈6份、玉米粉5份、麩皮2份和酒糟3份的無(wú)菌固體培養(yǎng)基中，添加尿素控制碳氮比為3∶1，于雙層可控溫隔離干燥設(shè)備中進(jìn)行固體厭氧發(fā)酵，控制水分含量為55％，發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵時(shí)間42h；得到固體發(fā)酵產(chǎn)物。
5、酵母培養(yǎng)物的獲得
將所述固體發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行干燥，干燥方式真空干燥，干燥溫度25℃～45℃，優(yōu)選30℃，得到酵母培養(yǎng)物初產(chǎn)品。再將所屬酵母培養(yǎng)物初產(chǎn)品進(jìn)行粉碎，粉碎過(guò)篩40～60目，即可得到酵母培養(yǎng)物產(chǎn)品。經(jīng)檢測(cè)得到，該產(chǎn)品粗蛋白質(zhì)含量為15.4％，甘露聚糖含量為1.5％，β-葡聚糖含量為4.2％，灰分含量為5.6％。
實(shí)施例3，大菱鲆的生長(zhǎng)性能及非特異性免疫試驗(yàn)
1，飼料的制備
本試驗(yàn)所選用的基礎(chǔ)飼料包括魚(yú)粉、大豆?jié)饪s蛋白、小麥粉、α-淀粉、羧甲基纖維素鈉、甜菜堿、大豆軟磷脂、魚(yú)油、大豆油、抗氧化劑、預(yù)混料，其中，抗氧化劑為魚(yú)飼料中常見(jiàn)的抗氧化劑，預(yù)混料為每千克日糧提供5400IU維生素A、900IU維生素D3、48mg維生素E、2.4mg維生素K3、1.8mg維生素B1、7.2mg維生素B2、12mg維生素B6、0.2mg維生素B12、24mg煙酰胺、15mg泛酸鈣、0.06mg生物素、120mg維生素C、150mg鐵、2.8mg銅、60mg鋅、60mg錳、0.75mg碘、0.32mg硒、150mg鎂的混合料。
上述基礎(chǔ)飼料各組成的添加量見(jiàn)下表1。
2，試驗(yàn)過(guò)程
試驗(yàn)前，將大菱鲆在養(yǎng)殖系統(tǒng)中馴養(yǎng)2周，選擇規(guī)格一致初始均重為(15.84±0.26)g，且體質(zhì)健壯的個(gè)體300尾，隨機(jī)分成5組，分別喂料，以喂料為基礎(chǔ)飼料作為對(duì)照組；喂料為在基礎(chǔ)飼料中分別添加實(shí)施例1和實(shí)施例2制備的酵母培養(yǎng)物的飼料，其中加入實(shí)施例1中的酵母培養(yǎng)物的質(zhì)量分別為3000mg/kg、5000mg/kg、10000mg/kg，作為試驗(yàn)組1、試驗(yàn)組2、試驗(yàn)組3；加入實(shí)施例2中的酵母培養(yǎng)物的質(zhì)量為5000mg/kg，作為試驗(yàn)組4。每個(gè)試驗(yàn)組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)的大菱鲆數(shù)量為20尾。
上述5組試驗(yàn)中，飼料配方及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。將表中各組分粉碎后，用80～100目篩去除大顆粒，混合均勻后壓制成粒徑為1～2mm的顆粒飼料，4℃冷藏儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>
表1飼料各組成及主要營(yíng)養(yǎng)成分表(飼喂基礎(chǔ))
表1中的主要營(yíng)養(yǎng)成分為實(shí)測(cè)值。
試驗(yàn)在山東某水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)進(jìn)行，試驗(yàn)用魚(yú)在網(wǎng)箱(規(guī)格為1m×1m×1m)中采用循環(huán)海水充氣養(yǎng)殖，本試驗(yàn)共15個(gè)網(wǎng)箱。循環(huán)海水經(jīng)過(guò)砂慮、臭氧處理后進(jìn)入網(wǎng)箱。試驗(yàn)期為70d，飼料每天投喂2次(上午07:00、下午17:00)，日投飼率為體重的3～5％。試驗(yàn)期間控制水溫在15～18℃之間，溶解氧量＞7.0mg/L，pH值7.5～8.5，鹽度28～30％。
3，樣品采集與分析
養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，試驗(yàn)魚(yú)在網(wǎng)箱中停食24h，然后逐箱起捕。記錄每個(gè)網(wǎng)箱中大菱鲆的尾數(shù)，測(cè)定對(duì)蝦的體重，計(jì)算增重率、特定生長(zhǎng)率、飼料系數(shù)。每個(gè)網(wǎng)箱隨機(jī)選取6尾試驗(yàn)魚(yú)經(jīng)麻醉后尾靜脈取血。血液在4℃冰箱中靜置6h后離心(4℃，5000r/min，35min)，取上清液。整個(gè)過(guò)程在冰上進(jìn)行，樣品放入-80℃冰箱中保存待測(cè)。
溶菌酶(LZM)采用空白對(duì)照比濁法測(cè)定，總超氧化物歧化酶(SOD)采用羥胺法測(cè)定，過(guò)氧化氫酶(CAT)采用可見(jiàn)光分光光度計(jì)法測(cè)定，堿性磷酸酶(AKP)采用磷酸苯二鈉法測(cè)定，以上指標(biāo)均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒進(jìn)行測(cè)定。
4，試驗(yàn)結(jié)果
4.1酵母培養(yǎng)物對(duì)大菱鲆生長(zhǎng)性能的影響
上述對(duì)照組、試驗(yàn)組1～4的酵母培養(yǎng)物對(duì)大菱鲆生長(zhǎng)性能的影響，5組試驗(yàn)的結(jié)果數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。
表2酵母培養(yǎng)物對(duì)各試驗(yàn)組大菱鲆特定生長(zhǎng)率、增重率和飼料系數(shù)的影響
上述表2中，上角標(biāo)a，b表示同列數(shù)據(jù)肩注不同字母表示差異顯著(P＜0.05)。
增重率(％)＝(末體重-初體重)/初體重×100；
特定生長(zhǎng)率(％/d)＝(ln末均重-ln初均重)/飼養(yǎng)天數(shù)×100；
飼料系數(shù)＝投飼量/(試驗(yàn)?zāi)┛傮w重+試驗(yàn)中死亡魚(yú)體重-試驗(yàn)初總體重)
數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS14.0版統(tǒng)計(jì)軟件中One-Way過(guò)程進(jìn)行方差分析，并進(jìn)行Duncan’s法多重比較，顯著水平為0.05，結(jié)果采用(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示。
由表2可知，向大菱鲆的飼料中添加3000mg/kg酵母培養(yǎng)物、5000mg/kg酵母培養(yǎng)物和10000mg/kg酵母培養(yǎng)物的試驗(yàn)組1～4，與對(duì)照組相比，在喂料后，大菱鲆的特定生長(zhǎng)率分別提高了5.2％、7.6％、8.77％和11.11％(P＜0.05)；增重率分別提高了9.09％、12.95％、15.17％和19.82(P＜0.05)；飼料系數(shù)降低了13.40％、16.49％、18.56％和18.56％(P＜0.05)。
4.2酵母培養(yǎng)物對(duì)大菱鲆非特異性免疫的影響
上述對(duì)照組、試驗(yàn)組1～4的酵母培養(yǎng)物對(duì)大菱鲆非特異性免疫的影響，5組試驗(yàn)的結(jié)果數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。
表3酵母培養(yǎng)物對(duì)各試驗(yàn)組大菱鲆血清非特異性免疫的影響
上述表3中，上角標(biāo)a，b表示同列數(shù)據(jù)肩注不同字母表示差異顯著(P＜0.05)。
數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS14.0版統(tǒng)計(jì)軟件中One-Way過(guò)程進(jìn)行方差分析，并進(jìn)行Duncan’s法多重比較，顯著水平為0.05，結(jié)果采用(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示。
由表3可知，與對(duì)照組相比，各試驗(yàn)組能顯著提高大菱鲆溶菌酶和堿性磷酸酶的活力(P＜0.05)，同時(shí)能在一定程度上提高超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶的活力，但差異不顯著(P＞0.05)。
綜上，試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，在大菱鲆的飼料中添加不同濃度的酵母培養(yǎng)物均能顯著提高大菱鲆增重率(P＜0.05)，并且均能顯著降低飼料系數(shù)(P＜0.05)，可知酵母培養(yǎng)物對(duì)大菱鲆的生長(zhǎng)性能有顯著改善；同時(shí)，均能顯著提高大菱鲆溶菌酶和堿性磷酸酶的活力，進(jìn)而提高了大菱鲆非特異性免疫水平。
以上對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式作了詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明不限于所描述的實(shí)施方式。對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，在不脫離本發(fā)明原理和精神的情況下，對(duì)這些實(shí)施方式進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，仍落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。