肽基核苷類雜合抗生素Nikkoxin E和Nikkoxin F及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及肽基核苷類雜合抗生素Nikkoxin E和 Nikkoxin F及其制備方法，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。本發(fā)明通過將尼可霉素的生物合成基因簇進行突變后導(dǎo)入到多氧霉素工業(yè)菌株中進行異源表達。經(jīng)過質(zhì)譜和核磁共振檢測，確定產(chǎn)生了兩種氧霉素與尼可霉素雜合的核苷類抗生素。這兩種雜合抗生素對人類或植物病原真菌具有更加顯著的抗菌活性。
【專利說明】肽基核苷類雜合抗生素 Nikkoxin E和Nikkoxin F及其制 備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及肽基核苷類雜合抗生素 Nikkoxin E和Nikkoxin F及其制備方法,屬 于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 多氧霉素與尼可霉素是核苷類抗生素的典型代表，其作用機理在于能夠特異性地 抑制幾丁質(zhì)合成酶的活性，從而破壞真菌細胞壁的合成，實現(xiàn)抑制真菌的作用。多氧霉素與 尼可霉素不僅具有廣譜的抗真菌活性，并且對動植物毒性較低。但由于體外活性很難轉(zhuǎn)化 為體內(nèi)活性，這兩個抗生素未能在臨床上得到廣泛應(yīng)用。
[0003] 深部真菌感染又稱為侵襲性真菌感染，近年來隨著廣譜抗生素、抗腫瘤藥物、糖皮 質(zhì)激素和免疫抑制劑的應(yīng)用，器官移植和導(dǎo)管介入等新型治療手段大規(guī)模普及，惡性腫瘤、 艾滋病等臨床嚴(yán)重疾病的發(fā)生率持續(xù)上升，導(dǎo)致念珠菌血癥之類的深部真菌感染的發(fā)病率 不斷增多。然而臨床抗真菌藥物的長期運用使得真菌耐藥性也越來越嚴(yán)重，這給深部真菌 感染的預(yù)防和治療造成巨大困難，因此目前亟待需要研發(fā)出新型的抗真菌藥物來應(yīng)對日益 嚴(yán)重的深部真菌感染問題。

【權(quán)利要求】
1. 兩種肽基核苷類雜合抗生素的Nikkoxin E和Nikkoxin F，其結(jié)構(gòu)如下所示：
2.權(quán)利要求1所述肽基核苷類雜合抗生素NikkoxinE和NikkoxinF的制備方法，包 括以下步驟： 1) 重組菌株LSY4的構(gòu)建 將質(zhì)粒PJTU5701/AnikOAnikQ通過接合轉(zhuǎn)移導(dǎo)入多氧霉素工業(yè)菌株的polOP和polF基因突變株Li3,通過apramycin抗性篩選和PCR驗證，得到重組菌株LSY4 ;所述質(zhì)粒 PJTU5701/AnikOAnikQ是以同框缺失方式將尼克霉素的核苷骨架的生物合成關(guān)鍵基因 nikO和4-甲酰-4-咪唑-2-酮生物合成關(guān)鍵基因nikQ都敲除得到的，所述突變株Li3是 以同源重組的方式在多氧霉素工業(yè)菌株中氨甲酰多聚草氨酸生物合成關(guān)鍵基因polOP和 聚肟酸生物合成關(guān)鍵基因PolF中插入硫連絲菌素抗性基因而得到的雙突變菌株； 2)重組菌株LSY4發(fā)酵和肽基核苷類雜合抗生素NikkoxinE和NikkoxinF提取和純 化 重組菌株LSY4直接進行發(fā)酵培養(yǎng)，用草酸將發(fā)酵液的pH值調(diào)節(jié)至3. 0,離心過濾后 將濾液用陽離子交換樹脂吸附Dowex50Wx8H+，用0.IM氨水洗脫，選擇性收集組分并旋轉(zhuǎn) 蒸發(fā)濃縮；用分析型HPLC進行檢測，再經(jīng)制備型HPLC獲得雜合抗生素純品NikkoxinE和 NikkoxinF0
3.權(quán)利要求1所述肽基核苷類雜合抗生素NikkoxinE和NikkoxinF的制備方法，包 括以下步驟： 1)重組菌株LSY4的構(gòu)建 將質(zhì)粒PJTU5701/AnikO AnikQ通過接合轉(zhuǎn)移導(dǎo)入多氧霉素工業(yè)菌株的polOP和 polF基因突變株Li3,通過apramycin抗性篩選和PCR驗證，得到重組菌株LSY4 ;所述質(zhì)粒 PJTU5701/AnikO A nikQ是以同框缺失方式將尼克霉素的核苷骨架的生物合成關(guān)鍵基因 nikO和4-甲酰-4-咪唑-2-酮生物合成關(guān)鍵基因nikQ都敲除得到的，所述突變株Li3是 以同源重組的方式在多氧霉素工業(yè)菌株中氨甲酰多聚草氨酸生物合成關(guān)鍵基因polOP和 聚肟酸生物合成關(guān)鍵基因PolF中依次插入硫連絲菌素抗性基因而得到的雙突變菌株； 2) 高產(chǎn)菌株QL4的構(gòu)建 將nikS通過NdeI和EcoRI酶切位點克隆到載體pJTU968上，再通過MfeI和EcoRI進 行雙酶切獲得含有紅霉素啟動子的nikS片段，然后再將該片段通過EcoRI酶切位點載體 PPM927上獲得質(zhì)粒pPM927/nikS，以接合轉(zhuǎn)移方式將質(zhì)粒pPM927/nikS轉(zhuǎn)入重組菌株LSY4， 通過streptomycin抗性篩選和PCR驗證，得到高產(chǎn)菌株QL4 ; 3) 高產(chǎn)菌株QL4發(fā)酵和肽基核苷類雜合抗生素Nikkoxin E和Nikkoxin F提取和純化 高產(chǎn)菌株QL4直接進行發(fā)酵培養(yǎng)，用草酸將發(fā)酵液的pH值調(diào)節(jié)至3. 0,離心過濾后將 濾液用陽離子交換樹脂吸附Dowex 50Wx8H+，用0. IM氨水洗脫，選擇性收集組分并旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)濃縮；用分析型HPLC進行檢測，再經(jīng)制備型HPLC獲得雜合抗生素純品Nikkoxin E和 Nikkoxin F0
4.權(quán)利要求1所述的肽基核苷類雜合抗生素Nikkoxin E和Nikkoxin F在制備抗真菌 藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12R1/465GK104497104SQ201510033114
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2015年1月22日 優(yōu)先權(quán)日:2015年1月22日
【發(fā)明者】陳文青, 祁建釗, 鄧子新, 劉進 申請人:武漢大學(xué)