一種用于鑒定中藥木通的引物對(duì)及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于鑒定中藥木通的引物對(duì)及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的用于鑒定或輔助鑒定中藥木通的引物對(duì)，具體為由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)。實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明所提供的引物，通過快速PCR方法及熒光染色的方法實(shí)現(xiàn)了中藥木通與川木通和關(guān)木通的快速、準(zhǔn)確鑒別，并引入了熒光染料法對(duì)真?zhèn)舞b別結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)，為實(shí)現(xiàn)藥材分子鑒別的現(xiàn)場(chǎng)運(yùn)用提供技術(shù)支撐。
【專利說明】一種用于鑒定中藥木通的引物對(duì)及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種用于鑒定中藥木通的引物對(duì)及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 中藥木通為木通科植物木通Akebia quinata(Thunb. )Decne、三葉木通 Akebia trifoliate (Thunb. ) Koidz.或白木通 Akebia trifoliate (Thunb. ) Koidz. var. australis(Diels)Rehd.的莖藤。有利尿通淋、清心除煩、通經(jīng)下乳之功效?？芍瘟茏C、水 月中、心煩尿赤、口舌生瘡等。
[0003] 據(jù)文獻(xiàn)考證，古代所用木通正品是木通科的木通。清代《植物名實(shí)圖考》提出毛茛 科木通，即川木通。歷代本草中未見有"關(guān)木通"的記載。1954年任仁安通過調(diào)查發(fā)現(xiàn)我 國(guó)商品木通主要為馬兜鈴科植物東北馬兜鈴Aristolochia mamshuriensis的藤莖。其后， 關(guān)木通收載于《中國(guó)藥典》1963年版，同時(shí)分別收錄了木通科植物木通的藤莖、毛茛科植物 川木通的藤莖。但因藥源短缺，1977年版、1985年版、1990年版、2000年版《中國(guó)藥典》則 將木通刪去，僅收錄了川木通和關(guān)木通，而醫(yī)師處方和藥物制劑的實(shí)用名則仍為木通，同名 異物現(xiàn)象甚為嚴(yán)重。在中醫(yī)藥科技工作者的努力下，對(duì)木通類商品進(jìn)行了系統(tǒng)的研宄工作， 《中國(guó)藥典》2005年版收載木通科植物木通、三葉木通或白木通的藤莖為木通。由于歷史變 迀、本草記述中異物同名、同名異物和地區(qū)習(xí)慣用藥等原因，商品木通存在嚴(yán)重的品種混亂 情況，據(jù)樓之岑教授等1996年對(duì)全國(guó)商品木通的調(diào)查有馬兜鈴科、毛茛科、木通科等3科10 種植物在全國(guó)藥用，木通商品主要為關(guān)木通和川木通，而木通科的木通商品已不易見到，僅 在民間草藥店中尚有出售?！吨袊?guó)藥典》2005年版將木通正名后，商品木通的市場(chǎng)大有好轉(zhuǎn)， 但仍存在川木通、關(guān)木通、淮通混淆作木通使用的情況，必須引起充分的注意。關(guān)木通含有 腎毒性成分馬兜鈴酸，已取消作為中藥成方制劑的原料藥使用，臨證用藥也應(yīng)按處方藥規(guī) 定管理，不可多用、久服；川木通成分、藥理和功能與木通有相近之處，但并不一致，基源有 另IJ，應(yīng)注意鑒別，各以其名、其效辨證施藥。一切實(shí)邪所致的經(jīng)脈不通，阻滯氣化諸證應(yīng)用木 通，濕熱瘀血所致的經(jīng)脈不通，阻滯氣化諸證應(yīng)用川木通，心火亢盛所致的經(jīng)脈不通，阻滯 氣化諸證應(yīng)用關(guān)木通，切不可將木通、川木通、關(guān)木通混淆應(yīng)用或互為代用（孔增科等.木 通與川木通及關(guān)木通的鑒別與合理應(yīng)用，河北中醫(yī)，2007, 29(1) :58)。三種不同來源的銷 售商品木通多加工為飲片（薄片），外觀上區(qū)別不大，很容易混淆不清，因此，建立一種用于 鑒別木通、川木通和關(guān)木通的方法非常重要。
[0004] 不同研宄學(xué)者分別采用高效液相色譜法、近紅外光譜法、紫外光譜法等對(duì)3種不 同來源的木通進(jìn)行鑒定（李睿，樊夏雷，周小華，等.關(guān)木通、川木通和三葉木通的近紅外漫 反射光譜鑒別，中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2008, 42(12) :933 ;謝麗莎，談遠(yuǎn)鋒.紫外光譜組法鑒別 三種不同科屬的木通，上海中醫(yī)藥雜志，2004, 38(9) :58)，但這些方法比較繁瑣，不利于推 廣。近年來發(fā)展的以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法如DNAbarcoding和位點(diǎn)特異性PCR等 克服了藥材傳統(tǒng)鑒別方法準(zhǔn)確度不高、主觀性大等缺點(diǎn)。對(duì)木通、川木通和關(guān)木通之間的分 子特異性鑒別還尚未見報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種用于鑒定或輔助鑒定中藥木通的引物對(duì)。
[0006] 本發(fā)明所提供的用于鑒定或輔助鑒定中藥木通的引物對(duì)，具體為由序列表中序列 1和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)。
[0007] 所述引物對(duì)中，兩條單鏈DNA分子既可以分別單獨(dú)包裝，也可以按照摩爾比為1:1 的比例混合后包裝在一起。
[0008] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種用于鑒定或輔助鑒定中藥木通的試劑盒。
[0009] 本發(fā)明所提供的用于鑒定或輔助鑒定中藥木通的試劑盒，具體可含有所述引物 對(duì)、dNTP和DNA聚合酶。
[0010] 根據(jù)需要，所述試劑盒中還可含有熒光染料SYBR Green I。
[0011] 制備所述引物對(duì)的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0012] 制備所述引物對(duì)的方法，具體可包括將組成所述引物對(duì)的兩條單鏈DNA分子分別 單獨(dú)包裝的步驟。
[0013] 制備所述試劑盒的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0014] 制備所述試劑盒的方法，具體可包括如下A)或B)的步驟：
[0015] A)將組成所述引物對(duì)的兩條單鏈DNA分子分別單獨(dú)包裝后，與分別單獨(dú)包裝的 dNTP和DNA聚合酶包裝于同一個(gè)試劑盒內(nèi)：
[0016] B)將組成所述引物對(duì)的兩條單鏈DNA分子分別單獨(dú)包裝后，與分別單獨(dú)包裝的 dNTP、DNA聚合酶和SYBR Green I包裝于同一個(gè)試劑盒內(nèi)。
[0017] 所述引物對(duì)，或所述試劑盒，在鑒定或輔助鑒定中藥木通中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明 的保護(hù)范圍。
[0018] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種利用所述引物對(duì)或所述試劑盒鑒定或輔助鑒定 待測(cè)中藥樣品中是否含有中藥木通的方法。
[0019] 本發(fā)明所提供的利用所述引物對(duì)或所述試劑盒鑒定或輔助鑒定待測(cè)中藥樣品中 是否含有中藥木通的方法，具體可包括如下步驟：
[0020] (a)從待測(cè)樣品中提取基因組DNA作為模板，采用所述引物對(duì)（序列1和序列2) 進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0021] (b)為如下（bl)或（b2):
[0022] (bl)根據(jù)步驟（a)所得PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法確定待測(cè)中藥樣品中是 否含有中藥木通：若PCR產(chǎn)物中含有大小為250-750bp (如450-550bp)的DNA片段，則所 述待測(cè)中藥樣品中含有或候選含有中藥木通；若PCR產(chǎn)物中不含有大小為250-750bp (如 450-550bp)的DNA片段，則所述待測(cè)中藥樣品中不含有或候選不含有中藥木通；
[0023] 所述250-750bp (如450-550bp)的DNA片段具體為大小約為500bp的DNA片段 (在瓊脂糖凝膠電泳圖譜上與DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)位于500bp處的條帶處于同一水平線上）。
[0024] (b2)向步驟（a)擴(kuò)增后的反應(yīng)體系中加入熒光染料SYBR Green I，得到含有熒光 染料的體系，按照如下方法確定待測(cè)中藥樣品中是否含有中藥木通：若觀察到所述含有熒 光染料的體系產(chǎn)生綠色熒光，則所述待測(cè)中藥樣品中含有或候選含有中藥木通；若觀察不 到所述含有熒光染料的體系產(chǎn)生綠色熒光，則所述待測(cè)中藥樣品不含有或候選不含有中藥 木通。
[0025] 在上述方法中，所述中藥木通為木通科植物木通Akebia quinata(Thunb. )Decne、 三葉木通 Akebia trifoliate (Thunb. ) Koidz.或白木通 Akebia trifoliate (Thunb.) Koidz. var. australis(Diels)Rehd.的莖藤。因此，所述引物對(duì)或所述方法也可以用于木通 科植物木通Akebia quinata (Thunb. )Decne、三葉木通Akebia trifoliate (Thunb. ) Koidz. 或白木通 Akebia trifoliate (Thunb. ) Koidz. var. australis (Diels) Rehd.的鑒定。
[0026] 在所述方法的步驟（a)中，進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增時(shí)采用的退火溫度均可為58°C。
[0027] 在本發(fā)明中，進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增時(shí)采用的具體反應(yīng)條件如下：88°C Imin ;88°C 5s、 58°C 10s、28 個(gè)循環(huán)。
[0028] 在所述方法的步驟（a)中，在進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系中，所述引物對(duì)中每條 單鏈DNA分子的終濃度均為125nM。
[0029] 在本發(fā)明中，進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增時(shí)采用的具體反應(yīng)體系如下：2. OyL IOXbuffer 緩沖液，1. 6 μ L濃度為2. 5mM的dNTP，0. 5 μ L濃度為5 μ M的序列1所示的引物Fl，0. 5 μ L 濃度為5 μΜ的序列2所示的引物F2,0. 2 yL SpeedStar HS Taq DNA聚合酶（Takara公司， 5U/ μ L)，0. 5 μ L模板DNA，無菌雙蒸水補(bǔ)足至20 μ L。
[0030] 在實(shí)際應(yīng)用中，判斷所述PCR產(chǎn)物中是否含有大小為250-750bp (如450-550bp) 的DNA片段，可通過將所述PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，若電泳結(jié)果顯示有大 小為250-750bp (如450-550bp)目的條帶，則所述PCR產(chǎn)物中含有大小為250-750bp (如 450-550bp)的DNA片段；反之，則不含有大小為250-750bp (如450-550bp)的DNA片段。 當(dāng)然也通過測(cè)序的方法判定所述PCR產(chǎn)物中是否含有大小為250-750bp (如450-550bp)的 DNA片段。
[0031] 在上述兩種方法的步驟（b2)中，向所述反應(yīng)體系中加入熒光染料SYBR Green I時(shí)，所述熒光染料SYBR Green I的加入量為：每20 yL所述反應(yīng)體系中加入IyL 100 X SYBR Green I (Invitrogen 公司，其產(chǎn)品目錄號(hào)為 1135054)。
[0032] 在上述兩種方法的步驟（b2)中，確定所述含有熒光染料的體系是否產(chǎn)生綠色熒 光具體是在365nm紫外波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)的。
[0033] 實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明所提供的引物，通過快速PCR方法及熒光染色的方法實(shí)現(xiàn) 了木通與川木通和關(guān)木通的快速、準(zhǔn)確鑒別，并引入了熒光染料法對(duì)真?zhèn)舞b別結(jié)果進(jìn)行檢 測(cè)，為實(shí)現(xiàn)藥材分子鑒別的現(xiàn)場(chǎng)運(yùn)用提供技術(shù)支撐。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0034] 圖1為中藥木通、川木通和關(guān)木通PCR鑒別結(jié)果。其中，泳道1為陰性對(duì)照；泳道 2為三葉木通（湖南衡東）；泳道3為三葉木通（湖南臨澧）；泳道4為三葉木通（重慶梁 平）；泳道5為三葉木通（甘肅徽縣）；泳道6為木通（重慶萬州）；泳道7為木通（安徽含 山）；泳道8為木通（重慶彭水）；泳道9為木通（安徽鳳陽(yáng)）；泳道10為木通（安徽梅山 鎮(zhèn)）；泳道11為白木通（重慶黔江區(qū)）；泳道12-14為白木通（湖南株洲）；泳道15-19為 白木通（湖南慈利）；泳道20為川木通（重慶南川）；泳道21為關(guān)木通（吉林撫松）；泳道 M 為 DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)：從上至下依次為 2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp、IOObp。

【具體實(shí)施方式】
[0035] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0036] 下述實(shí)施例中所用的試劑如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0037] 下述實(shí)施例中所用材料如表1所示：
[0038] 表1樣品來源表
[0039]

【權(quán)利要求】
1. 用于鑒定或輔助鑒定中藥木通的引物對(duì)，其特征在于：所述引物對(duì)為由序列表中序 列1和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)。
2. 用于鑒定或輔助鑒定中藥木通的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒中含有權(quán)利要求 1所述的引物對(duì)、dNTP和DNA聚合酶。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒中還含有熒光染料SYBR Green 1〇
4. 制備權(quán)利要求1所述引物對(duì)的方法，包括將組成所述引物對(duì)的兩條單鏈DNA分子分 別單獨(dú)包裝的步驟。
5. 制備權(quán)利要求2或3所述試劑盒的方法，包括如下A)或B)的步驟： A) 將組成所述引物對(duì)的兩條單鏈DNA分子分別單獨(dú)包裝后，與分別單獨(dú)包裝的dNTP和 DNA聚合酶包裝于同一個(gè)試劑盒內(nèi)： B) 將組成所述引物對(duì)的兩條單鏈DNA分子分別單獨(dú)包裝后，與分別單獨(dú)包裝的dNTP、 DNA聚合酶和SYBR Green I包裝于同一個(gè)試劑盒內(nèi)。
6. 權(quán)利要求1所述的引物對(duì)，或權(quán)利要求2或3所述的試劑盒，在鑒定或輔助鑒定中藥 木通中的應(yīng)用。
7. 利用權(quán)利要求1所述的引物對(duì)，或權(quán)利要求2或3所述的試劑盒，鑒定或輔助鑒定待 測(cè)中藥樣品中是否含有中藥木通的方法，包括如下步驟： (a) 從待測(cè)中藥樣品中提取基因組DNA作為模板，采用權(quán)利要求1所述的引物對(duì)進(jìn)行 PCR擴(kuò)增； (b) 為如下（bl)或（b2): (bl)根據(jù)步驟（a)所得PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法確定待測(cè)中藥樣品中是否含有 中藥木通：若PCR產(chǎn)物中含有大小為250-750bp的DNA片段，則所述待測(cè)中藥樣品中含有或 候選含有中藥木通；若PCR產(chǎn)物中不含有大小為250-750bp的DNA片段，則所述待測(cè)中藥樣 品中不含有或候選不含有中藥木通； (b2)向步驟（a)擴(kuò)增后的反應(yīng)體系中加入熒光染料SYBR Green I，得到含有熒光染 料的體系，按照如下方法確定待測(cè)中藥樣品中是否含有中藥木通：若觀察到所述含有熒光 染料的體系產(chǎn)生綠色熒光，則所述待測(cè)中藥樣品中含有或候選含有中藥木通；若觀察不到 所述含有熒光染料的體系產(chǎn)生綠色熒光，則所述待測(cè)中藥樣品不含有或候選不含有中藥木 通。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于：在步驟（a)中，進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增時(shí)采用 的退火溫度為58°C。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于：進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增時(shí)采用的擴(kuò)增程序?yàn)椋?88°C lmin ;88°C 5s、58°C 10s、28 個(gè)循環(huán)。
10. 根據(jù)權(quán)利要求7-9中任一所述的方法，其特征在于：在步驟（b2)中，確定所述含有 熒光染料的體系是否產(chǎn)生綠色熒光是在365nm紫外波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)的。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104480213SQ201410827574
【公開日】2015年4月1日 申請(qǐng)日期:2014年12月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月25日
【發(fā)明者】黃璐琦, 袁媛, 崔占虎, 蔣超 申請(qǐng)人:中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所