氧化型輔酶i制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種氧化型輔酶I制備方法，所述方法是將核糖先進行溴代，再和煙酰胺進行偶聯，得到煙酰胺核糖；再用基因工程的方法，在大腸桿菌里表達人NRK1和NNMT酶，用鎳離子螯合柱純化得到二個酶；在緩沖體系內，以合成的煙酰胺核糖為底物，加入二種酶和ATP反應，即可制備氧化型輔酶I。本發(fā)明是一個低成本的工業(yè)化制備氧化型輔酶I的方法。
【專利說明】氧化型輔酶I制備方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種氧化型輔酶I制備方法。

【背景技術】
[0002]傳統(tǒng)的氧化型輔酶I的制備方法，是采用酵母作為原料提取制備。工藝復雜，工業(yè)化成本高，價格較高，醫(yī)藥行業(yè)尚可以接受。但高昂的成本限制了它在其它工業(yè)化應用。特別是近期采用生物還原法制備醫(yī)藥中間體，對輔酶I的需求，非常巨大，采用傳統(tǒng)方法制備輔酶，成本較高，市場難以接受，低成本制備氧化型輔酶I的工藝研發(fā)非常重要，是拓展輔酶I在其它工業(yè)領域使用的瓶頸。


【發(fā)明內容】

[0003]本發(fā)明的目的在于克服上述不足，提供一種成本低、適合工業(yè)化生產的氧化型輔酶I制備方法。
[0004]本發(fā)明的目的是這樣實現的:
一種氧化型輔酶I制備方法，所述方法是將保護核糖先進行溴代，再和煙酰胺進行偶聯，得到煙酰胺核糖；再用基因工程的方法，在大腸桿菌里表達人NRKl和NNMT酶，用鎳離子螯合柱純化得到二個酶；在一定緩沖體系內，以合成的煙酰胺核糖為底物，加入二種酶和ATP (三磷酸腺苷)反應，即可制備氧化型輔酶I，是一個低成本的工業(yè)化制備氧化型輔酶I的方法。
[0005]所述的緩沖體系為磷酸緩沖液。
[0006]以合成的煙酰胺核糖為底物，加入二種酶和ATP (三磷酸腺苷)，在37°C反應16-24小時，制備氧化型輔酶I。
[0007]與現有技術相比，本發(fā)明的有益效果是:
合成煙酰胺核糖為底物，用酶法合成氧化型輔酶已有大量文獻和專利報道，但制備煙酰胺核糖的方法都是采用價格昂貴的三氟甲磺酸三甲基硅酯作為催化試劑，我們采用溴代糖的方法，合成煙酰胺核糖，生產成本制備成本顯著下降，非常適合工業(yè)化。
[0008]商業(yè)化的NRKl和NNMT酶價格昂貴，我們用基因重組的方法獲得了人NRKl和NNMT酶cDNA，并實現在大腸桿菌里的高效表達，并用鎳離子螯合柱進行純化，獲得低成本高質量的酶，極大地降低了酶的成本。
[0009]本申請建立的用溴代核糖合成煙酰胺核糖和自行用重組的方法制備輔酶I合成相關的酶，實現輔酶I的低成本制備。本申請建立的方法可以實現低成本制備氧化型輔酶I，為氧化型輔酶I在生物還原領域的使用提供必要的保證，是一個低成本的工業(yè)化制備氧化型輔酶I的方法。

【具體實施方式】
[0010]實施例1: 將乙?；暮颂牵苡贒MF通入溴化氫，將5位的進行溴代，然后加入煙酰胺，得到保護的溴代核糖，加入煙酰胺，反應24小時，加入氨水去掉核糖上保護基，得到煙酰胺核糖。
[0011 ] 將上述得到的煙酰胺核糖，溶于磷酸緩沖液，加入2倍摩爾量的ATP —定比例和適量的NRKl和NNMT酶，37°C反應16-24小時，用TLC監(jiān)控氧化型的輔酶I的生成和ATP的減少，直到接近反應完全。反應完的產物用陰離子交換樹脂純化，得到純度98%的氧化型輔酶
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【權利要求】
1.一種氧化型輔酶I制備方法，其特征在于:所述方法是將核糖先進行溴代，再和煙酰胺進行偶聯，得到煙酰胺核糖；再用基因工程的方法，在大腸桿菌里表達人NRKl和NNMT酶，用鎳離子螯合柱純化得到二個酶；在緩沖體系內，以合成的煙酰胺核糖為底物，加入二種酶和ATP反應，即可制備氧化型輔酶I。
2.根據權利要求1所述的一種氧化型輔酶I制備方法，其特征在于，所述的緩沖體系為磷酸緩沖液。
3.根據權利要求1或2所述的一種氧化型輔酶I制備方法，其特征在于，以合成的煙酰胺核糖為底物，加入二種酶和ATP反應條件為:在37°C反應16-24小時。
【文檔編號】C12P19/32GK104480170SQ201410792996
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年12月20日 優(yōu)先權日:2014年12月20日
【發(fā)明者】郁慶明 申請人:郁慶明