一種多重pcr鑒別分枝桿菌病原核酸的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種多重PCR鑒別分枝桿菌病原核酸的試劑盒，包括引物組合物：5'-acggtgggtactaggtgtgggtttc-3'、5'-tctgcgattagcgactaagacttca-3'；5'-gcgttgaccgagatggattat-3'、5'-gctcatctcacccagttggc-3'；5'-ttccgaatcccttgtga-3'、5'-ggagagcgccgttgta-3'或5'-agtcgccgtggcttctctttta-3'。本發(fā)明該試劑盒靈敏度好，特異性高，操作簡(jiǎn)單，能實(shí)現(xiàn)致病性與非致病性分枝桿菌快速、大通量的檢測(cè)。
【專利說明】—種多重PCR鑒別分枝桿菌病原核酸的試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物檢測(cè)鑒別【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種多重PCR鑒別分枝桿菌病原核酸的試劑盒，具體涉及對(duì)結(jié)核分枝桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌BCG及非致病性分枝桿菌進(jìn)行PCR鑒別用引物及使用該引物組合的PCR鑒別方法。

【背景技術(shù)】
[0002]牛結(jié)核病是由牛分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌引起的一種人畜共患慢性消耗性傳染病，人和動(dòng)物交叉感染造成該病廣泛流行，嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生安全。結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群包括結(jié)核分枝桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌、卡介苗、田鼠分枝桿菌、非洲分枝桿菌I型和II型、caprae分枝桿菌及canettii分枝桿菌。
[0003]控制結(jié)核病的關(guān)鍵在于快速準(zhǔn)確的診斷和嚴(yán)格淘汰。目前OIE規(guī)定(0ΙΕ 1996年頒布的《診斷試驗(yàn)和疫苗標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)》)動(dòng)物結(jié)核病的診斷和檢疫方法主要是病原分離鑒定、遲發(fā)性過敏反應(yīng)試驗(yàn)和血清學(xué)檢測(cè)(如淋巴細(xì)胞增生試驗(yàn)、Y-干擾素試驗(yàn)、ELISA)，其中血清學(xué)檢測(cè)可作為遲發(fā)性過敏反應(yīng)試驗(yàn)的補(bǔ)充。而我國(guó)2002年制定的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 18641—2002)則對(duì)OIE規(guī)定中一些在我國(guó)還無法進(jìn)行的檢驗(yàn)技術(shù)作了刪減(如:淋巴細(xì)胞增生試驗(yàn)；Y-干擾素試驗(yàn))。牛分枝桿菌純化蛋白衍生物(purified proteinderivatives, PPD)皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)為牛結(jié)核病的世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)法定檢驗(yàn)方法，目前在世界各國(guó)廣泛采用。但不足之處也較明顯，如檢測(cè)時(shí)間偏長(zhǎng)、耗費(fèi)人力、易受牛個(gè)體和結(jié)核菌素使用量影響、容易造成主觀判斷錯(cuò)誤、造成假陰性和假陽性，且短期內(nèi)不能進(jìn)行復(fù)檢等缺點(diǎn)，另外，該方法以牛PPD為刺激原，并不能區(qū)分牛分枝桿菌感染和環(huán)境分枝桿菌的感染。
[0004]近年來，以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR為代表的技術(shù)在結(jié)核快速檢測(cè)鑒別方面發(fā)展迅速，但多數(shù)為針對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、結(jié)核分枝桿菌和牛結(jié)核分枝桿菌單獨(dú)菌種的方法，如周向梅等申報(bào)的一種鑒別牛分枝桿菌的P CR引物及方法(201110391925.X)，它主要是用5對(duì)引物分別針對(duì)分枝桿菌屬16SrRNA保守區(qū)、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群RV0577基因，結(jié)核分枝桿菌RD7區(qū)的Rv0577基因，牛分枝桿菌pncA基因和RDl區(qū)基因進(jìn)行擴(kuò)增。通過擴(kuò)增條帶的大小判定結(jié)果，操作步驟較多，時(shí)間較長(zhǎng)。多重PCR技術(shù)是在同一 PCR反應(yīng)體系中含有多對(duì)特異性引物、同時(shí)特異性地針對(duì)不同靶區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增的一種方法。國(guó)內(nèi)外已有一些多重PCR方法可以用于檢測(cè)和鑒別結(jié)核分枝桿菌和卡介苗(LeeH.R.等，2010)，區(qū)分結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、鳥結(jié)核復(fù)合體及慢生長(zhǎng)分枝桿菌(孟祥紅等，2007);區(qū)分禽結(jié)核分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌等的多重PCR方法(Gopinath K等，2009)，但至今尚無可同時(shí)檢測(cè)致病性分枝桿菌(如結(jié)核分枝桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌)、卡介苗、非致病性分枝桿菌(禽結(jié)核分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌等)的多重PCR方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種鑒別致病性分枝桿菌與非致病性分枝桿菌病原核酸的多重PCR引物及PCR鑒別方法。
[0006]本發(fā)明用于PCR鑒別分枝桿菌的特異性引物組合，用于鑒別分枝桿菌屬、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、結(jié)核分枝桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG株。其能同時(shí)對(duì)分枝桿菌16S rRNA保守區(qū)、結(jié)核分枝桿菌的RV3873基因及可區(qū)分結(jié)核分支桿菌和牛結(jié)核分支桿菌的RV1506C基因進(jìn)行擴(kuò)增，生成特異性的擴(kuò)增片段。
[0007]本發(fā)明具體通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0008]一種多重PCR鑒別分枝桿菌病原核酸的試劑盒，包括引物組合物:16SrRNA_F:5’-acggtgggtactaggtgtgggtttc-3’、16SrRNA_R:5，-tctgcgattagcgactaagacttca-3’ ；RV3873-F:5，-gcgttgaccgagatggattat-3，、RV3873-R:5，-gctcatctcacccagttggc-3，；RV1506c-F:5，-ttccgaatcccttgtga-3，、RV1506c-Rl:5，-ggagagcgccgttgta-3，、RV1506c-R2:5，-agtcgccgtggcttctctttta-3，。
[0009]本發(fā)明所述的引物組合物可針對(duì)分枝桿菌屬16S rRNA保守區(qū)、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群RDl的RV3873基因和區(qū)分結(jié)核分支桿菌與牛結(jié)核分支桿菌的RV1506c基因進(jìn)行同時(shí)擴(kuò)增，生成特異性的擴(kuò)增片段。
[0010]本發(fā)明提供一種致病性和非致病性分枝桿菌病原核酸的多重PCR鑒別方法，該方法以樣品總DNA為模板，利用上述引物組合同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳判定結(jié)果。含有上述引物組合的PCR反應(yīng)程序?yàn)?預(yù)變性95°C，5min，再經(jīng)95°C變性45s, 57°C退火 45s, 72°C延伸 50s, 30 個(gè)循環(huán)，72°C延伸 1min0
[0011]本發(fā)明所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)，以25 μ L計(jì)量，反應(yīng)體系的具體配置為16sRNA-F (10 μ Μ):1 μ L，16s RNA-R:1 μ L ；RV1506c-F (10 μ Μ):1 μ L，RV1506c-Rl (10 μ Μ):I μ L, RV1506c-R2(10μ Μ):1μ L, Rv3873_F(10 μ Μ):1μ L, Rv3873-R(10μ Μ):1 μ L,10 XBuffer:2.5 μ L ；MgC12 (2.5mM):2μ L ；dNTP(2.5mM):4yL;DNA 模板:0.5 μ L ;rTaq:0.5 μ L ；ddH20:2.5 μ L。
[0012]本發(fā)明試劑盒可由多個(gè)紙質(zhì)或泡沫隔斷形成，以容納固定一個(gè)或多個(gè)小管或小瓶形容器。這些容器可裝有本發(fā)明的引物組合，根據(jù)需要該引物組合可以是凍干形式或溶于緩沖液中。另外，本發(fā)明試劑盒中還可以包括用于PCR反應(yīng)的酶試劑，及實(shí)施本發(fā)明所需要的其他成分及用具。
[0013]本發(fā)明所述的引物以進(jìn)行鑒別的樣品來源包括分離的菌種資源或動(dòng)物組織、動(dòng)物呼吸道分泌物。
[0014]本發(fā)明一種多重PCR鑒別分枝桿菌病原核酸的試劑盒用于檢測(cè)和鑒別致病性和非致病性分枝桿菌病原的用途。
[0015]本發(fā)明提供的7條引物是經(jīng)過篩選和優(yōu)化獲得的，可以同時(shí)檢測(cè)分枝桿菌屬、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、結(jié)核分枝桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG株。通過使用本發(fā)明的7條引物，同時(shí)對(duì)所測(cè)樣品的DNA進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，生成1、2或3條特異性片段，從而能簡(jiǎn)單、快速且準(zhǔn)確地對(duì)分枝桿菌進(jìn)行鑒別。該方法操作簡(jiǎn)便，普通PCR儀即可完成，實(shí)現(xiàn)快速、大通量診斷和檢測(cè)，比單獨(dú)采用一對(duì)引物鑒別所測(cè)菌株更可靠，降低了鑒別時(shí)間和檢測(cè)成本，研究表明本發(fā)明提供的這一多重PCR檢測(cè)方法，特異性達(dá)100%，靈敏度達(dá)pg級(jí)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)多重PCR產(chǎn)物的結(jié)果，產(chǎn)物條帶大小分別為575bp，262bp，255bp和168bp ；M,分子量標(biāo)準(zhǔn)為DL2000marker, 1:結(jié)核分枝桿菌參考株C68503 ;2?4:牛結(jié)核分枝桿菌參考株C68001，C68004，C68010 ；5:BCG ;6_7:禽結(jié)核分支桿菌C68201，C68203 ；8:副結(jié)核分支桿菌C68787 ；9:鳥-胞內(nèi)分枝桿菌C68226 ；10:陰性對(duì)照(大腸桿菌)；11:空白對(duì)照；
[0017]圖2為1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)多重PCR的敏感性；1:200pg ；2::1OOpg ；3:50pg ；4:25pg ；5: 12.5pg ；6:6.25pg ；7:3.1pg ；8: 1.6pg ；9:0.8pg ； 10:400fg ； 11:200fg ； 12:10fg ；
[0018]圖3對(duì)臨床上疑似結(jié)核分枝桿菌感染的牛鼻氣管分泌液多重PCR鑒別；1:結(jié)核分枝桿菌對(duì)照，2:牛結(jié)核分枝桿菌對(duì)照，3:BCG對(duì)照，4:禽結(jié)核分枝桿菌對(duì)照，5:大腸桿菌陰性對(duì)照，6:疑似樣品，7:空白對(duì)照。

【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，以下所述，僅是對(duì)本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明做其他形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更為同等變化的等效實(shí)施例。凡是未脫離本發(fā)明方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以下實(shí)施例所做的任何簡(jiǎn)單修改或等同變化，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0020]若未特別指明，實(shí)施例中所使用的化學(xué)試劑均為常規(guī)市售試劑，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0021]本發(fā)明所用菌株為:結(jié)核分枝桿菌參考株C68503,牛結(jié)核分枝桿菌參考株C68001、C68004、C68010，牛分枝桿菌BCG參考株C68017,鳥分枝桿菌參考株C68201和C68203、鳥-胞內(nèi)分枝桿菌C68226，副結(jié)核分支桿菌C68787均購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，大腸桿菌為本實(shí)驗(yàn)室保存，編號(hào)YZU0702。
[0022]實(shí)施例1
[0023]1、特異性引物的設(shè)計(jì)
[0024]16S rRNA基因是分支桿菌屬特異性基因，具有高度保守性，根據(jù)保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，目的片段大小為575bp，可以將分支桿菌屬與非分枝桿菌進(jìn)行區(qū)分。引物序列為:
[0025]16S rRNA-F:5’ _acggtgggtactaggtgtgggtttc_3’ ；
[0026]16S rRNA-R:5’ _tctgcgattagcgactaagacttca_3’。
[0027]牛結(jié)核分枝桿菌BCG缺失結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群RDl區(qū)基因，針對(duì)RDl區(qū)基因RV3873設(shè)計(jì)特異性引物，可將BCG和結(jié)核分枝桿菌群其他成員區(qū)分開來。PCR擴(kuò)增的目的片段大小為255bp，引物序列為:
[0028]Rv3873-F:5，-gcgttgaccgagatggattat-3’ ；
[0029]Rv3873-R:5，-gctcatctcacccagttggc-3，。
[0030]牛分枝桿菌相對(duì)于結(jié)核分枝桿菌缺失一段大小為12.7kb的基因片段，因此針對(duì)該缺失片段的上游設(shè)計(jì)區(qū)分結(jié)核分枝桿菌和牛結(jié)核分支桿菌的通用引物RV1506C-F:5’-ttccgaatcccttgtga-3’，設(shè)計(jì)可特異性擴(kuò)增牛結(jié)核分支桿菌的下游引物RV1506c_Rl:5’-ggagagcgccgttgta-3’ , PCR擴(kuò)增的目的片段大小為168bp,設(shè)計(jì)可特異性擴(kuò)增結(jié)核分支桿菌的下游引物RV1506c-R2:5’ -agtcgccgtggcttctctttta-3’ , PCR擴(kuò)增的目的片段大小為262bp,使用這3條引物,可有效區(qū)分結(jié)核分支桿菌和牛結(jié)核分支桿菌。
[0031]2、多重PCR擴(kuò)增方法的建立
[0032]多重PCR反應(yīng)體系以細(xì)菌總DNA為模板，進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，25 μ L反應(yīng)體系為:
[0033]16s RNA-F (10 μ Μ):1 μ L ；
[0034]16s RNA-R:1 μ L ;
[0035]RV1506c-F (10 μ Μ):1 μ L ；
[0036]RV1506C-R1 (10 μ Μ):1 μ L ；
[0037]RV1506C-R2 (10 μ Μ):1 μ L ；
[0038]Rv3873-F(10 μ Μ):1 μ L ；
[0039]Rv3873-R(10yM):lyL ；
[0040]1XBuffer:2.5 μ L ；
[0041]MgCl2(2.5mM):2μ L ；
[0042]dNTP(2.5mM):4μ L ；
[0043]DNA 模板:0.5yL;
[0044]rTaq:0.5 μ L ；
[0045]ddH20:2.5 μ L0
[0046]PCR反應(yīng)條件:含有16SrRNA、RV3873和RV1506c引物組合的反應(yīng)程序?yàn)?預(yù)變性95°C，5min，再經(jīng)95°C變性45s，57。。退火45s，72。。延伸50s，30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸1min0反應(yīng)結(jié)束后擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳判定結(jié)果。
[0047]3、特異性檢驗(yàn)
[0048]分別以結(jié)核分枝桿菌參考株C68503，牛結(jié)核分枝桿菌參考株C68001、C68004、C68010,牛分枝桿菌BCG參考株C68017，鳥分枝桿菌參考株C68201和C68203、副結(jié)核分枝桿菌C68787，鳥-胞內(nèi)分枝桿菌C68226的基因組DNA為模板，同時(shí)用本發(fā)明的4對(duì)7條引物組合，通過本發(fā)明建立的多重PCR方法進(jìn)行檢驗(yàn)，PCR反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳擴(kuò)增條帶的特異性和條帶數(shù)判定結(jié)果。
[0049]試驗(yàn)結(jié)果:
[0050]如圖1所示，結(jié)核分枝桿菌株出現(xiàn)3條特異性條帶(575bp，262bp和255bp，因262bp和255bp非常接近，使得瓊脂糖凝膠電泳上呈現(xiàn)2條特異性條帶);牛結(jié)核分枝桿菌株出現(xiàn)3條特異性條帶(575bp，255bp和168bp) ；BCG出現(xiàn)2條特異條帶(575bp，168bp)，禽分枝桿菌菌種出現(xiàn)I條特異性條帶(575bp)。
[0051]反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，膠回收后，與pMDT-18載體連接，轉(zhuǎn)換DH5a感受態(tài)細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)后以質(zhì)粒提取試劑盒純化重組質(zhì)粒，送生工測(cè)序公司測(cè)序。結(jié)果表明:本發(fā)明設(shè)計(jì)的4對(duì)引物具有很好的特異性，能特異性地鑒別出分支桿菌屬、結(jié)核分枝桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌及BCG。
[0052]4、靈敏度檢驗(yàn)
[0053]以牛結(jié)核分枝桿菌參考株C68001基因組DNA為模板，檢測(cè)其DNA濃度為200pg/U L,進(jìn)行梯度稀釋，最后結(jié)核分枝桿菌參考株的每個(gè)稀釋度含200pg、100pg、50pg、25pg、12.5pg、6.25pg、3.lpg、l.6pg、0.8pg、400fg、200fg 和 10fgDNA,按照上述多重 PCR 反應(yīng)體系和條件進(jìn)行擴(kuò)增，檢驗(yàn)其敏感性。PCR產(chǎn)物在I %瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳(見圖2)。
[0054]結(jié)果表明，該方法的最低檢測(cè)靈敏度達(dá)3pg，說明本發(fā)明多重PCR具有很好的檢測(cè)靈敏度。
[0055]實(shí)施例2臨床應(yīng)用
[0056]試驗(yàn)方法:1份奶牛鼻氣管分泌液采自泰州市I家奶牛場(chǎng)結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)陽性淘汰牛。采用本發(fā)明的PCR方法進(jìn)行鑒別，具體是從鼻氣管分泌液中提取樣品DNA，用本發(fā)明實(shí)施例1所建立的多重PCR方法進(jìn)行鑒別。
[0057]結(jié)果如圖3顯示，結(jié)核分支桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌、BCG及禽結(jié)核分枝桿菌陽性對(duì)照均出現(xiàn)相對(duì)應(yīng)的特異性條帶，陰性對(duì)照未擴(kuò)增出任何條帶，陰性對(duì)照和空白對(duì)照均未擴(kuò)增出任何條帶，疑似檢測(cè)樣品僅擴(kuò)增出16S rRNA條帶，說明該牛感染了非致病性的結(jié)核分枝桿菌。
【權(quán)利要求】
1.一種多重PCR鑒別分枝桿菌病原核酸的試劑盒，其特征在于包括引物組合物:16SrRNA_F:5，-acggtgggtactaggtgtgggtttc-3，、16Sr RNA-R:5'-tctgcgattagcgactaagacttca-3' ;RV3873_F:5'-gcgttgaccgagatggattat-3'、RV3873-R:5’-gctcatctcacccagttggc-3’ ；RV1506c_F:5’-ttccgaatcccttgtga-3’、RV1506c-Rl:5’-ggagagcgccgttgta-3’、RV1506c_R2:5’-agtcgccgtggcttctctttta-3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種多重PCR鑒別分枝桿菌病原核酸的試劑盒，其特征在于:所述的引物組合物針對(duì)分枝桿菌屬16sRNA保守區(qū)、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群RDl的RV3873基因和區(qū)分結(jié)核分支桿菌與牛結(jié)核分支桿菌的RV1506C基因進(jìn)行同時(shí)擴(kuò)增，生成特異性的擴(kuò)增片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種多重PCR鑒別分枝桿菌病原核酸的試劑盒，其特征在于:所述的多重PCR反應(yīng)體系，以25 μ L計(jì)量具體配置為:16s RNA-F=IyL, 16s RNA-R=Iy L ；RV1506c-F:1 μ L, RV1506c-Rl:1 μ L, RV1506c-R2:1 μ L, Rv3873_F:1 μ L, Rv3873-R:1 μ L,1XBuffer:2.5μ L ；MgC12:2μ L ；dNTP:4μ L ；DNA 模板:0.5μ L ；rTaq:0.5μ L ；ddH20:2.5 μ L0
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種多重PCR鑒別分枝桿菌病原核酸的試劑盒，其特征在于:所述的多重PCR反應(yīng)程序?yàn)?預(yù)變性95°C，5min，再經(jīng)95°C變性45s，57°C退火45s，72°C延伸50s, 30個(gè)循環(huán)，72°C延伸1min0
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種多重PCR鑒別分枝桿菌病原核酸的試劑盒用于檢測(cè)和鑒別致病性和非致病性分枝桿菌病原的用途。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104388575SQ201410758583
【公開日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月10日
【發(fā)明者】張泉, 譚海明, 蔡驍垚, 張文成, 范乃成, 王建明 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)