生產(chǎn)聚羥基丁酸-戊酸酯的基因工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了生產(chǎn)聚羥基丁酸－戊酸酯的基因工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。本發(fā)明的基因工程菌是真氧羅氏菌的基因缺失株或?qū)⒓谆釂熙］o酶A變位酶的編碼基因yliK、GTP激酶的編碼基因argK和甲基丙二酸單酰輔酶A脫羧酶的編碼基因ygfG導(dǎo)入真氧羅氏菌或真氧羅氏菌的基因缺失株中得到的；所述真氧羅氏菌的基因缺失株是將真氧羅氏菌的2-甲基檸檬酸合酶-1的編碼基因和2-甲基檸檬酸合酶-2的編碼基因中至少一個缺失得到的。利用本發(fā)明所構(gòu)建的重組菌生產(chǎn)聚羥基丁酸－戊酸酯，具有以下優(yōu)點：菌株安全，原料相對低廉，發(fā)酵過程容易控制，易于規(guī)模化生產(chǎn)。
【專利說明】生產(chǎn)聚羥基丁酸一戊酸酯的基因工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng) 用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及生產(chǎn)聚羥基丁酸一戊酸酯的基因工程菌及其 構(gòu)建方法與應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 由于塑料工業(yè)對石油的依賴性以及塑料廢棄物對環(huán)境的污染的嚴(yán)重性，迫使人們 去尋找能替代化工塑料的環(huán)保的可持續(xù)發(fā)展的材料。聚-3-羥基丁酸酯（以下簡稱聚羥 基丁酸酯，PHB)是基于生物基生產(chǎn)并可以被生物降解的高分子材料，其性能類似塑料。但 是PHB性脆，后處理加工有一定的難度，若在PHB中摻入3-羥基戊酸（3HV)組分，得到的 聚-3-羥基丁酸共聚3-羥基戊酸酯（以下簡稱聚羥基丁酸一戊酸酯，PHBV)可以使材料的 性能獲得改善，硬度、強度、熔點均下降，但分解溫度不降，這更利于拓寬產(chǎn)品的應(yīng)用范圍。 PHBV可用于組織和器官修復(fù)的支架平臺，緩釋藥物的外包裝，骨再生引導(dǎo)膜，構(gòu)建心臟生物 瓣膜，醫(yī)用紡織品，可降解包裝材料和吸附材料等等。
[0003] 目前規(guī)?；a(chǎn)PHBV時使用的唯一生產(chǎn)用菌株是真養(yǎng)羅氏菌突變株，但需要在 培養(yǎng)時添加丙酸（鹽）或戊酸（鹽）。丙酸（鹽）合成丙酰輔酶A，丙酰輔酶A與乙酰輔酶 A縮合生成戊酰輔酶A，是合成3-羥基戊酸（3HV)的直接前體物，戊酸（鹽）可以直接合 成戊酰輔酶A。而丙酸（鹽）或戊酸（鹽）有細(xì)胞毒性，且價格較貴。因此，現(xiàn)有技術(shù)生產(chǎn) PHBV時需要嚴(yán)格控制丙酸（鹽）或戊酸（鹽）的流加過程，既達到一定的細(xì)胞量，又能夠滿 足丙酰輔酶A合成的需要?，F(xiàn)有技術(shù)生產(chǎn)PHBV的控制過程復(fù)雜且增加了生產(chǎn)成本，使應(yīng)用 受限。近些年來，研宄人員利用基因工程技術(shù)改造菌株，但菌株的性能遠(yuǎn)達不到實現(xiàn)商業(yè)化 生產(chǎn)的要求，且宿主菌或為致病菌。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的一個目的是提供一種重組菌。
[0005] 本發(fā)明提供的重組菌是將甲基丙二酸單酰輔酶A變位酶的編碼基因yliK、GTP激 酶的編碼基因argK和甲基丙二酸單酰輔酶A脫羧酶的編碼基因ygfG導(dǎo)入宿主真氧羅氏菌 Ralstonia eutropha 得到的。
[0006] 上述重組菌中，所述宿主真氧羅氏菌為真氧羅氏菌Rem-1或真氧羅氏菌Rem-3或 真氧羅氏菌Rem-5或真氧羅氏菌Rem-7。
[0007] 上述重組菌中，所述Rem-3是真氧羅氏菌Rem-1缺失2-甲基檸檬酸合酶-1基因 prpCl后得到的菌；所述真氧羅氏菌Rem-1可以通過同源重組敲除prpCl基因，或者通過插 入滅活prpCl基因，還可以通過誘變獲得prpCl基因缺失的菌株；所述Rem-3的具體獲得方 法是：
[0008] (1)將如序列表中序列3所示的DNA片段插入pJQ200mpl8Tc載體的多克隆位點， 得到的重組載體記作pJQ200mpl8Tc : : AprpCl ;
[0009] (2)將所述pJQ200mpl8Tc : : AprpCl載體轉(zhuǎn)化E. coli S17-1，得到的重組菌記作 AprpClpJQ200/S17-l，作為供體菌；
[0010] (3)以Rem-1為受體菌，將所述供體菌A prpClpJQ200/S17_l與受體菌Rem-1進行 接合轉(zhuǎn)移，使Rem-1中的prpCl基因缺失，得到的重組菌即為所述Rem-3。
[0011] 上述重組菌中，所述Rem-5是真氧羅氏菌Rem-1缺失2-甲基檸檬酸合酶-2基因 prpC2后得到的菌；所述真氧羅氏菌Rem-1可以通過同源重組敲除prpC2基因，或者通過插 入滅活prpC2基因，還可以通過誘變獲得prpC2基因缺失的菌株；所述Rem-5的具體獲得方 法是：
[0012] (1)將如序列表中序列6所示的DNA片段插入pJQ200mpl8Tc載體的多克隆位點， 得到的重組載體記作pJQ200mpl8Tc : : AprpC2 ;
[0013] (2)將所述pJQ200mpl8Tc : : AprpC2載體轉(zhuǎn)化E. coli S17-1，得到的重組菌記作 AprpC2pJQ200/S17-l，作為供體菌；
[0014] (3)以Rem-1為受體菌，將所述供體菌A prpC2pJQ200/S17_l與受體菌Rem-1進行 接合轉(zhuǎn)移，得到prpC2基因缺失的Rem-1記作AprpC2/Rem_l，即所述Rem-5。
[0015] 上述重組菌中，所述Rem-7是真氧羅氏菌Rem-1缺失所述2-甲基檸檬酸合酶-1 基因prpCl和所述2-甲基檸檬酸合酶-2基因prpC2后得到的菌；所述真氧羅氏菌Rem-1 可以通過同源重組敲除prpCl和prpC2基因，或者通過插入滅活prpCl和prpC2基因，還可 以通過誘變獲得prpCl和prpC2基因缺失的菌株；所述Rem-7的具體獲得方法是：
[0016] (1)將如序列表中序列6所示的DNA片段插入pJQ200mpl8Tc載體的多克隆位點， 得到的重組載體記作pJQ200mpl8Tc : : AprpC2 ;
[0017] (2)將所述pJQ200mpl8Tc : : AprpC2載體轉(zhuǎn)化E. coli S17-1，得到的重組菌記作 AprpC2pJQ200/S17-l，作為供體菌；
[0018] (3)以所述Rem-3為受體菌，將所述供體菌A prpC2pJQ200/S17_l與受體菌Rem-3 進行接合轉(zhuǎn)移，得到prpC2基因缺失的Rem-3記作AprpC2/Rem-3,即所述Rem-7。
[0019] 上述重組菌中，所述2-甲基檸檬酸合酶-1的氨基酸序列如序列表中序列2所示； 所述2-甲基檸檬酸合酶-1的編碼基因序列如序列表序列1中自5'端第878-2035位核苷 酸分子所示；所述2-甲基檸檬酸合酶-2的氨基酸序列如序列表中序列5所示；所述2-甲 基檸檬酸合酶-2的編碼基因序列如序列表中序列4中自5'端第1032-2229位核苷酸分子 所示。
[0020] 上述重組菌中，所述甲基丙二酸單酰輔酶A變位酶的編碼基因yliK、所述GTP激酶 的編碼基因argK和所述甲基丙二酸單酰輔酶A脫羧酶的編碼基因ygfG通過重組表達載體 pZMwf導(dǎo)入所述宿主真氧羅氏菌。
[0021] 上述重組菌中，所述重組表達載體pZMwf的構(gòu)建方法包括如下步驟：將如序列表 中序列7所示的yliK-argK-ygfG基因簇片段插入表達載體pLXMl的多克隆位點中，得到的 重組載體記作pZMwf。
[0022] 上述重組菌中，所述甲基丙二酸單酰輔酶A變位酶的氨基酸序列如序列表中序列 8所示；所述GTP激酶的氨基酸序列如序列表中序列9所示；所述甲基丙二酸單酰輔酶A脫 羧酶的氨基酸序列如序列表中序列10所示。
[0023] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種含有甲基丙二酸單酰輔酶A變位酶的編碼基因 yliK、GTP激酶的編碼基因argK和甲基丙二酸單酰輔酶A脫羧酶的編碼基因ygfG的重組 表達載體。
[0024] 本發(fā)明提供的含有甲基丙二酸單酰輔酶A變位酶的編碼基因yliK、GTP激酶的編 碼基因argK和甲基丙二酸單酰輔酶A脫羧酶的編碼基因ygfG的重組表達載體是將如序列 表中序列7所示的yliK-argK-ygfG基因簇片段插入表達載體pLXMl的多克隆位點中得到 的。
[0025] 上述重組表達載體中，所述甲基丙二酸單酰輔酶A變位酶的氨基酸序列如序列表 中序列8所示；所述GTP激酶的氨基酸序列如序列表中序列9所示；所述甲基丙二酸單酰輔 酶A脫羧酶的氨基酸序列如序列表中序列10所示。
[0026] 本發(fā)明還有一個目的是提供上述所述的Rem-3或上述所述的Rem-5或上述所述的 Rem_7 〇
[0027] 上述所述的重組菌或上述所述的重組表達載體或上述所述的Rem-3或Rem-5或 Rem-7在生產(chǎn)聚羥基丁酸一戊酸酯中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0028] 上述所述的重組菌或上述所述的重組表達載體或上述所述的Rem-3或Rem-5或 Rem-7在提高菌株合成PHBV中3HV組分含量中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0029] 本發(fā)明的最后一個目的是提供一種生產(chǎn)聚羥基丁酸一戊酸酯的方法。
[0030] 本發(fā)明提供的生產(chǎn)聚羥基丁酸一戊酸酯的方法包括如下步驟：以葡萄糖為底物， 發(fā)酵培養(yǎng)上述所述的重組菌或上述所述的Rem-3或Rem-5或Rem-7,得到所述聚羥基丁酸一 戊酸酯。
[0031] 上述方法中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基；所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備方法：每升 基礎(chǔ)培養(yǎng)基含有 6. 7g Na2HP04.2H20、1. 5g KH2P04、lg(NH4)2S04、0. 2g MgS04.71120、11111 的微 量元素和20g葡萄糖；所述微量元素的制備方法：每升的微量元素中含有0. 3g H3B03、0. 2g C〇C12,0. lg ZnS04 *7H20,0. 03g MnCl2 *4H20,0. 02g NaMo04 *2H20,0. 02g NiCl2 *6H20,0. Olg CuS04 ? 5H20、0. Olg CaCl2 ? 2H20 和 0? 06g Fe(NH4)2(S04)2。
[0032] 上述方法中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基中不含有丙酸或丙酸鹽或戊酸或戊酸鹽。
[0033] 利用本發(fā)明所構(gòu)建的重組菌生產(chǎn)聚羥基丁酸一戊酸酯具有以下優(yōu)點：菌株安全， 原料相對低廉，發(fā)酵過程容易控制，易于規(guī)模化生產(chǎn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0034] 圖 1 為敲除載體 A prpClpJQ200mpl8Tc 和 A prpC2pJQ200mpl8Tc 的驗證。
[0035] 圖2為帶有yliK-argK-ygfG基因簇表達載體pZMwF的示意圖。
[0036] 圖3為PHBV標(biāo)準(zhǔn)品的GC測定結(jié)果。
[0037] 圖4為Rem-1合成PHBV的GC測定結(jié)果。
[0038] 圖5為基因工程菌合成PHBV的GC測定結(jié)果。

【具體實施方式】
[0039] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0040] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0041] 真氧羅氏菌（Ralstonia eutropha)H16 購自 DSM。
[0042] 真氧羅氏菌（Ralstonia eutropha) Rem-1 (曾命名為65-7)是真氧羅氏菌 (Ralstonia eutropha)H16經(jīng)誘變處理后得到的菌株，真氧羅氏菌（Ralstonia eutropha) Rem-1在文獻"陳琦等，利用葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)聚￠-羥基丁酸菌株的選育，微生物學(xué)通報， 1994, 21 (6)，333-335"中公開過，公眾可從中國科學(xué)院微生物研宄所獲得。
[0043] E. coli S17-1 在文獻 "Simon R PU, Puller A.，A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering:transposon mutagenasis in gram negative bacteria, Nat. Biotechnol.，1983, 1 (9) : 784-789" 中公開過，公眾可從中 國科學(xué)院微生物研宄所獲得。
[0044] pJQ200mpl8Tc 載體在文獻 "Potter M. , Steinbilchel A.,Poly(3-hydroxybutyrate)granule-associated proteins:impacts on poly (3-hydroxybutyrate) synthesis and degradation, Biomacromo1 ecu 1 es, 20056(2)，552-60. "中公開過，公眾可從中國科學(xué)院微生物研宄所獲得。
[0045] pLXMl質(zhì)粒在文獻"盧雪梅等，Ralstonia eutropha W50的L-阿拉伯糖代謝途徑 工程改造，微生物學(xué)報，2013, 53 (12) 1147 - 1155. "中公開過，公眾可從中國科學(xué)院微生 物研宄所獲得。
[0046] 大腸桿菌 W3110 在文獻"Barfknecht T. R.，Smith K. C.，Ultraviolet radiation-induced mutability of isogenic uvrA and uvrB strains of Escherichia coli K-12W3110. Photochemistry and photobiology, 1977 (26) ,643-645?"中公開過，公眾 可從中國科學(xué)院微生物研宄所獲得。
[0047] pMDT19-simple質(zhì)粒購買于寶生物工程有限公司，產(chǎn)品目錄號為TAKARA Code : D104〇
[0048] PG培養(yǎng)基的配制方法：每升PG培養(yǎng)基中含蛋白胨10g、酵母粉5g、葡萄糖3g、硫酸 銨3g。
[0049] 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備方法：每升基礎(chǔ)培養(yǎng)基含有6. 7g Na2HP04 ? 2H20、1. 5g KH2P04、 lg(NH4)2S04、0. 2g MgS04 ? 7H20、lml 的微量元素和 20g 葡萄糖。
[0050] 每升的微量元素中含有 0? 3g H3B03、0. 2g C〇C12、0. lg ZnS04 ? 7H20、0. 03g MnCl2 *4H20,0. 02g NaMo04 *2H20,0. 02g NiCl2 *6H20,0. Olg CuS04 *5H20,0. Olg CaCl2 *2H20 和 0? 06g Fe(NH4)2(S04)2〇
[0051] 實施例1、prpCl與prpC2的基因敲除載體的構(gòu)建
[0052] 1、prpCl基因敲除載體的構(gòu)建
[0053] 以真養(yǎng)羅氏菌（Ralstonia eutropha)H16的基因組DNA為模板，采用prpCldf/ prpCldr引物進行PCR擴增。引物序列如下所示：

【權(quán)利要求】
1. 重組菌，包括將甲基丙二酸單酰輔酶A變位酶的編碼基因 yliK、GTP激酶的編碼基 因 argK和甲基丙二酸單酰輔酶A脫羧酶的編碼基因 ygfG導(dǎo)入宿主真氧羅氏菌Ralstonia eutropha，得到所述重組菌。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組菌，其特征在于：所述宿主真氧羅氏菌為真氧羅氏菌 Rem-1或真氧羅氏菌Rem-3或真氧羅氏菌Rem-5或真氧羅氏菌Rem-7 ; 所述Rem-3是真氧羅氏菌Rem-1缺失2-甲基檸檬酸合酶-1基因 prpCl后得到的菌； 所述Rem-5是真氧羅氏菌Rem-1缺失2-甲基檸檬酸合酶-2基因 prpC2后得到的菌； 所述Rem-7是真氧羅氏菌Rem-1缺失所述2-甲基梓檬酸合酶-1基因 prpCl和所述 2_甲基檸檬酸合酶_2基因 prpC2后得到的菌； 所述2-甲基檸檬酸合酶-1的氨基酸序列如序列表中序列2所示； 所述2-甲基檸檬酸合酶-2的氨基酸序列如序列表中序列5所示。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組菌，其特征在于：所述甲基丙二酸單酰輔酶A變位 酶的編碼基因 yliK、所述GTP激酶的編碼基因 argK和所述甲基丙二酸單酰輔酶A脫羧酶的 編碼基因 ygfG通過重組表達載體pZMwf導(dǎo)入所述宿主真氧羅氏菌； 所述重組表達載體pZMwf?的構(gòu)建方法包括如下步驟：將如序列表中序列7所示的 yliK-argK-ygfG基因簇片段插入表達載體pLXMl的多克隆位點中，得到的重組載體記作 pZMwf ； 所述甲基丙二酸單酰輔酶A變位酶的氨基酸序列如序列表中序列8所示； 所述GTP激酶的氨基酸序列如序列表中序列9所示； 所述甲基丙二酸單酰輔酶A脫羧酶的氨基酸序列如序列表中序列10所示。
4. 含有甲基丙二酸單酰輔酶A變位酶的編碼基因 yliK、GTP激酶的編碼基因 argK和 甲基丙二酸單酰輔酶A脫羧酶的編碼基因 ygfG的重組表達載體； 所述甲基丙二酸單酰輔酶A變位酶的氨基酸序列如序列表中序列8所示； 所述GTP激酶的氨基酸序列如序列表中序列9所示； 所述甲基丙二酸單酰輔酶A脫羧酶的氨基酸序列如序列表中序列10所示。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組表達載體，其特征在于：所述重組表達載體是將含有 y 1 iK-argK-ygfG基因簇片段插入表達載體pLXMl的多克隆位點中得到的。
6. 權(quán)利要求2所述的Rem-3或權(quán)利要求2所述的Rem-5或權(quán)利要求2所述的Rem-7。
7. 權(quán)利要求1-3任一所述的重組菌或權(quán)利要求4或5所述的重組表達載體或權(quán)利要求 6所述的Rem-3或Rem-5或Rem-7在生產(chǎn)聚羥基丁酸一戊酸酯中的應(yīng)用。
8. 權(quán)利要求1-3任一所述的重組菌或權(quán)利要求4或5所述的重組表達載體或權(quán)利要求 6所述的Rem-3或Rem-5或Rem-7在提高菌株合成PHBV中3HV組分含量中的應(yīng)用。
9. 一種生產(chǎn)聚羥基丁酸一戊酸酯的方法，包括如下步驟：以葡萄糖為底物，發(fā)酵培養(yǎng) 權(quán)利要求1-3任一所述的重組菌或權(quán)利要求6所述的Rem-3或Rem-5或Rem-7,得到所述聚 羥基丁酸一戊酸酯。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于：所述發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基中不含有丙酸或 丙酸鹽或戊酸或戊酸鹽。
【文檔編號】C12P7/62GK104450594SQ201410758183
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月10日
【發(fā)明者】丁久元, 張英姿, 劉桂明, 翁維琦, 劉雙江 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所