發(fā)酵法生產(chǎn)木糖醇的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種發(fā)酵法生產(chǎn)木糖醇，包括以下步驟：富含多縮戊糖植物原料水解得水解產(chǎn)物，水解產(chǎn)物經(jīng)提純、解毒得木糖溶液；將熱帶假絲酵母接種于YPD平板培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)活化，然后用無菌牙簽轉(zhuǎn)接單菌落于 100mL 的液體培養(yǎng)基中生長，再按照 2％的接種量接種于 1000mL 以 3％木糖為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中在30℃，200rpm下發(fā)酵24h。本發(fā)明用于生產(chǎn)低聚果糖操作簡單、作用條件溫和、易掌握，木糖 - 木糖醇的轉(zhuǎn)化率最高提高到了91.4％，發(fā)酵時(shí)間需要不到2h即可，大大提高了發(fā)酵法生產(chǎn)木糖醇的產(chǎn)量，是發(fā)酵工藝中的重大的創(chuàng)新，值得推廣。
【專利說明】發(fā)酵法生產(chǎn)木糖醇
[0001](一)

【技術(shù)領(lǐng)域】
本發(fā)明涉及木糖醇，具體涉及發(fā)酵法生產(chǎn)木糖醇。
[0002](二)

【背景技術(shù)】
木糖醇是一種重要的功能性多元糖醇，木糖醇在體內(nèi)代謝不需要胰島素的參與，食用后不會(huì)提高血糖值，可用于糖尿病食品中。它在口腔中不會(huì)被微生物發(fā)酵，可防止齲齒發(fā)生。木糖醇還可作為非腸道營養(yǎng)的能量來源等。正是因?yàn)槟咎谴季哂幸陨瞎δ芴匦裕粡V泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥等工業(yè)。
[0003]木糖醇的生產(chǎn)方法可分成三種:提取、化學(xué)合成、生物合成。目前，工業(yè)生產(chǎn)主要采用化學(xué)合成法。生物合成法是利用微生物中的還原酶來生產(chǎn)木糖醇，它可有效降低木糖醇的生產(chǎn)成本。發(fā)酵法不僅有可能省去木糖純化步驟，還可以簡化木糖醇的分離步驟，是一種很有前途的生產(chǎn)方法。
[0004]自然界的微生物中，酵母比較容易將木糖轉(zhuǎn)化生成木糖醇。其中，產(chǎn)木糖醇性能優(yōu)越的酵母菌株主要集中于假絲酵母屬(Candida)，如季樂蒙地假絲酵母(C.guiIliermondii)、熱帶假絲酵母(C.tropicalis)、莫基假絲酵母(C.mogii)、平滑假絲酵母
(C.parasilosis)等等。工業(yè)化生產(chǎn)主要使用熱帶假絲酵母。酵母對D-木糖的轉(zhuǎn)化途徑首先是木糖還原酶以NADPH或NADH為輔酶(主要是NADPH);將D-木糖還原為木糖醇，木糖醇既可以作為主要產(chǎn)物進(jìn)入培養(yǎng)基內(nèi)，也可以被以NAD+為輔酶的木糖醇脫氫酶催化氧化成D-木酮糖，最后進(jìn)入磷酸戊糖代謝途徑。酵母代謝木糖時(shí)會(huì)經(jīng)過D-木酮糖途徑，消耗一部分已經(jīng)生成的木糖醇，所以木糖醇轉(zhuǎn)化率一般只能達(dá)到理論值的65%?90%。但在實(shí)際工業(yè)化生產(chǎn)過程中，木糖-木糖醇轉(zhuǎn)化率只有50%?70%。酵母中的木糖還原酶的活性受到溫度、pH、NADPH濃度和離子濃度的影響，而該酶的活性直接影響到木糖-木糖醇的轉(zhuǎn)化率。
[0005]如何提高工業(yè)化生產(chǎn)中木糖-木糖醇轉(zhuǎn)化率，一直是本領(lǐng)域亟待解決的問題。2010年8月4公開的一種提高木糖醇得率的發(fā)酵方法，提出了向培養(yǎng)基中添加Zn2+至終濃度0.3?0.6mmol/L以提高木糖醇發(fā)酵得率。木糖-木糖醇的轉(zhuǎn)化率從68%提高到了79%。轉(zhuǎn)化率提高率仍是有限，需要進(jìn)一步加強(qiáng)，本發(fā)明是在上述方案的技術(shù)上進(jìn)行進(jìn)一步的研究。
[0006](三)


【發(fā)明內(nèi)容】

本發(fā)明為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種發(fā)酵法生產(chǎn)木糖醇，操作方便，過程易于控制，反應(yīng)時(shí)間短，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0007]本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
一種發(fā)酵法生產(chǎn)木糖醇，其特殊之處在于:包括以下步驟:
(O制備木糖溶液:富含多縮戊糖植物原料水解得水解產(chǎn)物，水解產(chǎn)物經(jīng)提純、解毒得木糖溶液；
(2)菌株發(fā)酵:將熱帶假絲酵母接種于YPD平板培養(yǎng)基上30°C培養(yǎng)活化，然后用無菌牙簽轉(zhuǎn)接單菌落于10mL的液體培養(yǎng)基中生長，再按照2%的接種量接種于100mL以3%木糖為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中在30°C，200rpm下發(fā)酵24h ；
(3)種子培養(yǎng):10g/L木糖、5g/L 酵母膏、0.2g/L MgSO4.7Η20、2.5g/L KH2PO4 ;裝液量為50mL/250mL，培養(yǎng)基pH值自然，接入斜面種子，30°C，180rpm搖床上培養(yǎng)20h ;
(4)發(fā)酵木糖產(chǎn)木糖醇:按2%的接種量將液體種子接入發(fā)酵瓶中，培養(yǎng)基組份為木糖 100 g/L、酵母膏 10.0 g/L, NaCl 10 g/L、MgSO4.7H2
O 4 g/L、KH2P043 g/L、(NH4)2HPO4,裝液量為 120mL/250mL、CaCl2 0.4 g/L，氟硼酸鋅 4g/L，培養(yǎng)基pH值自然，往發(fā)酵瓶中，分別添加Fe3+、Zn2+，使其達(dá)到8-10mmOl/L、l-4mmOl/L，于 30°C，200rpm，250mL 搖瓶培養(yǎng) 40min_2h 后終止。
[0008]本發(fā)明的發(fā)酵法生產(chǎn)木糖醇，富含多縮戊糖植物原料為玉米芯、草木樨中的至少一種。
[0009]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明用于生產(chǎn)低聚果糖操作簡單、作用條件溫和、易掌握，木糖-木糖醇的轉(zhuǎn)化率最高提高到了 91.4%，發(fā)酵時(shí)間需要不到2h即可，大大提高了發(fā)酵法生產(chǎn)木糖醇的產(chǎn)量，是發(fā)酵工藝中的重大的創(chuàng)新，值得推廣。
[0010](四)【具體實(shí)施方式】實(shí)施例1
現(xiàn)有發(fā)酵法生產(chǎn)木糖醇工藝，其步驟:
(O菌株發(fā)酵
將熱帶假絲酵母(Candida tropicalis ACCC 20148,購于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心)接種于 YPD(Y:yeast extract, P:peptone, D:glucose)平板培養(yǎng)基上 30°C培養(yǎng)活化，然后用無菌牙簽轉(zhuǎn)接單菌落于10mL的液體培養(yǎng)基中生長，再按照2%的接種量接種于100mL以3%木糖為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中發(fā)酵。發(fā)酵條件為30°C，200rpm，24h。
[0011](2)木糖還原酶的純化及酶活測定
純化:將實(shí)施例1中發(fā)酵完畢的發(fā)酵液低溫離心并收集菌體，超聲波破碎后取上清，將上清PH調(diào)到7.0。2.在4°C條件下添加40%飽和度硫酸銨，靜置4?6h，低溫離心去除雜蛋白，然后再添加硫酸銨使溶液的飽和度為80%，4°C靜置20h，離心收集沉淀，沉淀部分溶于少量20mmol/L pH7.0的Tris-HCl緩沖液中，并用Tris-HCl緩沖液充分透析。3.低溫離心取上清。4.將步驟3中濃縮的酶液上樣到DEAE-Sepharose柱層析中，在充分洗去雜蛋白后洗脫，流速為1.0mL/min，洗脫液為20mmol/L pH7.0的Tris_HCl，活性部分被含0.5MNaCl的洗脫液洗脫下來，收集蛋白峰。5.用1KDa的YM超濾膜及Amicon超濾杯借助N2壓(壓力為0.4Mpa)對收集的活性部分進(jìn)行超濾濃縮、除鹽獲得純化產(chǎn)物。
[0012]酶活力測定:用分光光度計(jì)在340nm波長處檢測還原型輔酶NADH特異吸收值的降低速率，間接檢測酶活力大小。具體參數(shù)為:木糖還原酶液SOyUNADH 0.15mmol/L,木糖0.lmol/L，緩沖液為PBS(0.05mol/L，pH7.0)，反應(yīng)溫度為30°C，總體積為2.5mL。酶活力單位定義為每分鐘消耗lymol NADH所需的酶量為I個(gè)酶活單位。蛋白測定方法采用考馬斯亮藍(lán)G-250法。經(jīng)測定純化后的木糖還原酶的比活力達(dá)12U/mg。
[0013]Zn2+濃度對木糖-木糖醇轉(zhuǎn)化率的影響 1.培養(yǎng)基中Zn2+濃度測定:分別選取1g不同廠家的酵母膏，配置IL溶液，用HI93731鋅濃度測定儀檢測其中Zn2+濃度，經(jīng)檢測，其Zn 2+濃度在8?llmg/L之間。
[0014]2.種子培養(yǎng):10g/L 木糖、5g/L 酵母膏、0.2g/L MgSO4.7Η20、2.5g/L KH2PO4 ;裝液量為50mL/250mL，培養(yǎng)基pH值自然，接入斜面種子，30°C，180rpm搖床上培養(yǎng)20h。
[0015]3.發(fā)酵木糖產(chǎn)木糖醇:按2%的接種量將液體種子接入兩組發(fā)酵瓶中。培養(yǎng)基組份為(g/L)木糖 100、酵母膏 10.0,NaCl 6.0、MgS04.7H20 0.4、KH2P043、(NH4)2ΗΡ04，裝液量為120mL/250mL，培養(yǎng)基pH值自然。向其中一組中添加Zn2+，使其達(dá)到0.5mmol/L，而另一組不添加Zn2+
，兩組均于30°C，200rpm，250mL搖瓶培養(yǎng)50h后終止，木糖-木糖醇的轉(zhuǎn)化率為79%。
[0016]實(shí)施例2
(1)制備木糖溶液:玉米芯水解得水解產(chǎn)物，水解產(chǎn)物經(jīng)提純、解毒得木糖溶液，該步驟常規(guī)技術(shù)進(jìn)行即可；
(2)菌株發(fā)酵:將熱帶假絲酵母接種于YPD平板培養(yǎng)基上30°C培養(yǎng)活化，然后用無菌牙簽轉(zhuǎn)接單菌落于10mL的液體培養(yǎng)基中生長，再按照2%的接種量接種于100mL以3%木糖為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中在30°C，200rpm下發(fā)酵24h ；
(3)種子培養(yǎng):10g/L木糖、5g/L 酵母膏、0.2g/L MgSO4.7Η20、2.5g/L KH2PO4 ;裝液量為50mL/250mL，培養(yǎng)基pH值自然，接入斜面種子，30°C，180rpm搖床上培養(yǎng)20h ;
(4)發(fā)酵木糖產(chǎn)木糖醇:按2%的接種量將液體種子接入發(fā)酵瓶中，培養(yǎng)基組份為木糖 100 g/L、酵母膏 10.0 g/L、NaCl 10 g/L、MgSO4.7H2
O 4 g/L、KH2P043 g/L、(NH4)2HPO4,裝液量為 120mL/250mL、CaCl2 0.4 g/L，氟硼酸鋅 4g/L,培養(yǎng)基pH值自然,往發(fā)酵瓶中，分別添加Fe3+、Zn2+,使其達(dá)到10mmol/L、2.5mmol/L,于30°C，200rpm, 250mL搖瓶培養(yǎng)40min后終止，木糖產(chǎn)木糖醇的轉(zhuǎn)化率為91.4%。
[0017]實(shí)施例3
(O制備木糖溶液:草木樨水解得水解產(chǎn)物，水解產(chǎn)物經(jīng)提純、解毒得木糖溶液；
(2)菌株發(fā)酵:將熱帶假絲酵母接種于YPD平板培養(yǎng)基上30°C培養(yǎng)活化，然后用無菌牙簽轉(zhuǎn)接單菌落于10mL的液體培養(yǎng)基中生長，再按照2%的接種量接種于100mL以3%木糖為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中在30°C，200rpm下發(fā)酵24h ；
(3)種子培養(yǎng):10g/L木糖、5g/L 酵母膏、0.2g/L MgSO4.7Η20、2.5g/L KH2P04 ;裝液量為50mL/250mL，培養(yǎng)基pH值自然，接入斜面種子，30°C，180rpm搖床上培養(yǎng)20h ;
(4)發(fā)酵木糖產(chǎn)木糖醇:按2%的接種量將液體種子接入發(fā)酵瓶中，培養(yǎng)基組份為木糖 100 g/L、酵母膏 10.0 g/L、NaCl 10 g/L、MgSO4.7H2
O 4 g/L、KH2P043 g/L、(NH4) 2HP04，裝液量為 120mL/250mL、CaCl2 0.4 g/L，氟硼酸鋅4g/L,培養(yǎng)基pH值自然,往發(fā)酵瓶中，分別添加Fe3+、Zn2+,使其達(dá)到8mmol/L、4mmol/L,于30°C,200rpm,250mL搖瓶培養(yǎng)2h后終止，木糖產(chǎn)木糖醇的轉(zhuǎn)化率為90.8%。
[0018]實(shí)施例4
(O制備木糖溶液:玉米芯、草木樨水解得水解產(chǎn)物(兩者重量比為3:1)，水解產(chǎn)物經(jīng)提純、解毒得木糖溶液，該步驟常規(guī)技術(shù)進(jìn)行即可；
(2)菌株發(fā)酵:將熱帶假絲酵母接種于YPD平板培養(yǎng)基上30°C培養(yǎng)活化，然后用無菌牙簽轉(zhuǎn)接單菌落于10mL的液體培養(yǎng)基中生長，再按照2%的接種量接種于100mL以3%木糖為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中在30°C，200rpm下發(fā)酵24h ；
(3)種子培養(yǎng):10g/L木糖、5g/L 酵母膏、0.2g/L MgSO4.7Η20、2.5g/L KH2PO4 ;裝液量為50mL/250mL，培養(yǎng)基pH值自然，接入斜面種子，30°C，180rpm搖床上培養(yǎng)20h ;
(4)發(fā)酵木糖產(chǎn)木糖醇:按2%的接種量將液體種子接入發(fā)酵瓶中，培養(yǎng)基組份為木糖 100 g/L、酵母膏 10.0 g/L, NaCl 10 g/L、MgSO4.7H20 4 g/L、KH2P043 g/L、(NH4)2HPO4,裝液量為120mL/250mL、CaCl2 0.4 g/L，氟硼酸鋅4g/L，培養(yǎng)基pH值自然，往發(fā)酵瓶中，分別添加 Fe3+、Zn2+,使其達(dá)到 9mmol/L、lmmol/L,于 30°C，200rpm, 250mL 搖瓶培養(yǎng) 50min 后終止，木糖產(chǎn)木糖醇的轉(zhuǎn)化率為89.9%。
[0019]Fe3+、Zn2+可以為 FeCl 3、ZnSO4' ZnCl20
【權(quán)利要求】
1.一種發(fā)酵法生產(chǎn)木糖醇，其特征在于:包括以下步驟: (1)制備木糖溶液:富含多縮戊糖植物原料水解得水解產(chǎn)物，水解產(chǎn)物經(jīng)提純、解毒得木糖溶液； (2)菌株發(fā)酵:將熱帶假絲酵母接種于YPD平板培養(yǎng)基上30°C培養(yǎng)活化，然后用無菌牙簽轉(zhuǎn)接單菌落于10mL的液體培養(yǎng)基中生長，再按照2%的接種量接種于100mL以3%木糖為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中在30°C，200rpm下發(fā)酵24h ； (3)種子培養(yǎng):10g/L木糖、5g/L 酵母膏、0.2g/L MgSO4.7Η20、2.5g/L KH2PO4 ;裝液量為50mL/250mL，培養(yǎng)基pH值自然，接入斜面種子，30°C，180rpm搖床上培養(yǎng)20h ; (4)發(fā)酵木糖產(chǎn)木糖醇:按2%的接種量將液體種子接入發(fā)酵瓶中，培養(yǎng)基組份為木糖 100 g/L、酵母膏 10.0 g/L、NaCl 10 g/L、MgSO4.7H2 O 4 g/L、KH2P043 g/L、(NH4)2HPO4,裝液量為 120mL/250mL、CaCl2 0.4 g/L，氟硼酸鋅 4g/L，培養(yǎng)基pH值自然，往發(fā)酵瓶中，分別添加Fe3+、Zn2+，使其達(dá)到8-10mmOl/L、l-4mmOl/L，于 30°C，200rpm，250mL 搖瓶培養(yǎng) 40min_2h 后終止。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵法生產(chǎn)木糖醇，其特征在于:富含多縮戊糖植物原料為玉米芯、草木樨中的至少一種。
【文檔編號】C12R1/74GK104450800SQ201410755260
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月11日
【發(fā)明者】竇光朋, 張繼紅, 竇寶德 申請人:山東百龍創(chuàng)園生物科技有限公司