利用交叉引物和雙探針恒溫擴(kuò)增檢測牛肉源成分的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了屬于食品質(zhì)量控制檢測方法領(lǐng)域的用于交叉引物和雙探針恒溫擴(kuò)增檢測牛肉源成分的引物組，該引物組由一對外圍引物、一對交叉引物和一對檢測探針引物組成，具體由SEQ ID No：1-SEQ ID No：6所示的核苷酸序列組成。本發(fā)明還公開了含有上述引物組的檢測試劑盒，以及利用交叉引物和雙探針恒溫擴(kuò)增檢測牛肉源成分的方法。本發(fā)明引物組特異性強(qiáng)，只能用于檢測牛肉源成分，與其他羊肉、鼠肉、雞肉等肉類的基因無交叉反應(yīng)，靈敏度高；其次，本發(fā)明方法檢測速度快，檢測效率高；此外不需要復(fù)雜儀器設(shè)備，僅用恒溫水浴即可，方便實用，擴(kuò)增產(chǎn)物通過試紙條進(jìn)行檢測結(jié)果的判讀，尤其適用在基層現(xiàn)場檢測。
【專利說明】利用交叉引物和雙探針恒溫擴(kuò)增檢測牛肉源成分的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于食品質(zhì)量控制檢測方法領(lǐng)域，具體涉及用于交叉引物和雙探針恒溫擴(kuò) 增檢測牛肉源成分的引物組，以及含有該引物組的檢測試劑盒，還涉及利用交叉引物和雙 探針恒溫擴(kuò)增檢測牛肉源成分的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 肉制品是人體蛋白質(zhì)的重要來源。不同動物源的肉品質(zhì)、價格上存在較大差異， 由于利益的驅(qū)動，不法商人肉摻假現(xiàn)象時有發(fā)生，嚴(yán)重?fù)p害消費者利益，也帶來食品安全問 題。對動物源性成分進(jìn)行現(xiàn)場檢測，是解決肉摻假市場監(jiān)管問題的有效方法。
[0003] 牛肉相對于鼠肉和兔肉價格較高，是被摻假的對象之一。目前，對于牛肉源成 分的區(qū)分和鑒定主要是利用核酸序列的特異性，即利用核酸擴(kuò)增技術(shù)。常規(guī)PCR檢測 和熒光定量PCR檢測是應(yīng)用最廣的核酸擴(kuò)增技術(shù)，但是PCR技術(shù)需要PCR儀或熒光定 量PCR儀，主要適合在實驗室，而不利于在基層實驗室推廣應(yīng)用等（羅家琴等，中國農(nóng) 業(yè)科學(xué).2008, 41 (7) :2112-2119 ;Kaur J 等.2010, 21 (11) :1536 - 1544.doi :10.1016/ j. foodcont. 2010. 03) 〇
[0004] 動物種源的定性檢測要求所建立的體系具有較高的靈敏度，進(jìn)而可檢測到樣品中 某種動物源的存在與否。因此，目前的定性檢測研究多將目的片段定位于多拷貝基因，例如 線粒體基因，多數(shù)細(xì)胞皆含大量線粒體，且每個線粒體中含數(shù)拷貝線粒體DNA，從而可使檢 測限達(dá)到較低水平，提高靈敏度。分析比對鼠、牛、羊上的線粒體基因組序列，本發(fā)明選用具 有牛屬代表性的線粒體基因組中的ATP8基因作為檢測牛屬的目標(biāo)核酸序列。
[0005] 交叉引物恒溫擴(kuò)增技術(shù)（Crossing Priming Isothermal Amplification，CPA)(專 利號為：ZL200810134583. I)是杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)公司結(jié)合了恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)和核酸 試紙條快速檢測技術(shù)而發(fā)明的一種操作簡單、時間短、成本低的檢測技術(shù)，已廣泛用于病原 體檢測等領(lǐng)域。該技術(shù)還具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點，特別適合用于現(xiàn)場檢測。目前該 技術(shù)結(jié)合膠體金核酸試紙條的檢測方法已被用在諸如沙門氏菌、腸出血性大腸桿菌、結(jié)核 分歧桿菌、惡性瘧疾、霍亂弧菌、志賀氏菌、瓜果類斑病菌等病原菌的檢測（祁軍等.食品研 究開發(fā)，2013, 34(2) :67-70 ;祁軍等.中國媒介生物學(xué)及控制雜志，2013, 24(3) :204-207)。
[0006] 經(jīng)檢索，沒有發(fā)現(xiàn)交叉引物恒溫擴(kuò)增技術(shù)用于動物肉源檢測方面的報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對目前動物源成分檢測中存在的需要專門儀器設(shè)備和專門技術(shù)人才、檢測方法 復(fù)雜和檢測速度慢等問題，本發(fā)明目的在于提供用于交叉引物和雙探針恒溫擴(kuò)增核酸序列 檢測牛源性成分的引物組。
[0008] 本發(fā)明另一目的在于提供利用交叉引物和雙探針恒溫擴(kuò)增檢測牛源性成分的試 劑盒。
[0009] 本發(fā)明第三目的在于提供利用交叉引物和雙探針恒溫擴(kuò)增檢測牛源性成分的方 法。
[0010] 實現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0011] 本發(fā)明用于交叉引物和雙探針恒溫擴(kuò)增檢測牛源性成分的引物組，由一對外圍引 物、一對交叉引物和一對檢測探針引物組成；
[0012] 其中所述的一對外圍引物為：
[0013] 正向外圍引物 B0S4s :5'-CGATAAGGGCTACGAGAGG-3'（SEQ ID No:l)，
[0014] 反向外圍引物 B0S5a :5'-AGATCATTGTCAGTCATGTTG-3'（SEQ ID No:2)，
[0015] 所述的交叉引物為：
[0016] 正向交叉引物B0S2als :
[0017] 5'-TGGGAAAAATAGTAGAAAGTTGATTGTTGGTGTCAGTTCTGGATTG-3'（SEQ ID No:3)，
[0018] 反向交叉引物B0Sls2a :
[0019] 5' -TTGTTGGTGTCAGTTCTGGATTGTGGGAAAAATAGTAGAAAGTTGA-3' （SEQ ID No:4)，
[0020] 所述一對檢測探針引物為：
[0021] 檢測探針引物B0Sls2a* :
[0022] 5' -TTGTTGGTGTCAGTTCTGGATTGTGGGAAAAATAGTAGAAAGTTGA-3' （SEQ ID No:5)，
[0023] 檢測探針引物 B0SHP* :5'-ATTTCCAACACAAAACT-3'（SEQ ID No:6);
[0024] 其中B0Sls2a*的5'端標(biāo)記修飾生物素，B0SHP*的5'端標(biāo)記修飾熒光素 FAM。
[0025] 本發(fā)明利用交叉引物和雙探針恒溫擴(kuò)增檢測牛源性成分的試劑盒，包括下列6個 部分，分別為核酸檢測試紙條、SSC緩沖液、恒溫擴(kuò)增反應(yīng)液、Bst DNA聚合酶液、無菌雙蒸水 以及陽性對照；其中所述的恒溫擴(kuò)增反應(yīng)液（A管）括上述的一對外圍引物、一對交叉擴(kuò)增 引物和一對檢測探針引物，以及Thermol pol buffer、dNTPs溶液。
[0026] 上述試劑盒中所述的核酸檢測試紙條是指3號核酸檢測試紙條，可于杭州優(yōu)思達(dá) 生物技術(shù)有限公司購買。
[0027] 上述試劑盒中所述的SSC緩沖液的組成成分及其比例為：0. 3mol/L NaCl, (λ 03mol/L 檸檬酸鈉，用 lmol/L HCl 調(diào)節(jié) pH 至 L 0。
[0028] 所述的SSC緩沖液制備方如下：按照比例稱取17. 53g氯化鈉、8. 82g檸檬酸 鈉· 2H20,用800mL水溶解，用少量鹽酸調(diào)pH值至7. 0,定容1升，過濾后高壓滅菌使用。
[0029] 上述試劑盒中所述的恒溫擴(kuò)增反應(yīng)液（A管）的組成成分及其比例為：正向外圍 引物B0S4s 0. 125ymol/L，反向外圍引物B0S5a 0. 125ymol/L，正向交叉引物B0S2als 1 μ mol/L，反向交叉引物 B0Sls2a 0· 5 μ mol/L，檢測探針引物 B0Sls2a*0. 5 μ mol/L，檢測 探針引物 B0SHP*0. 5 μ mol/L，dNTPs 溶液(λ 25mmol/L，Betiane 甜菜堿(λ 25M，I XThermol pol buffer。
[0030] 上述試劑盒中所述的I XThermol pol buffer的組成成分及其比例為：IOmM KCl、 10mM(NH4)2S04、20mM Tris-HCl、2mM MgS04、0. 1% TritonX-100、pH8.8 ;
[0031] 上述試劑盒中所述的Bst DNA聚合酶液（B管）為Bst DNA聚合酶液（8U/yL)，可 于市場上購買。
[0032] 上述試劑盒中所述的無菌雙蒸水（C管）可作為陰性對照或補(bǔ)足反應(yīng)體系用。所 述的無菌雙蒸水的制備方法為雙蒸水經(jīng)高壓滅菌后，分裝到滅菌的小管中。
[0033] 上述試劑盒中所述的陽性對照（D管）為含有牛線粒體ΑΤΡ8基因片段的質(zhì)粒DNA。 所述的牛線粒體ATP8基因片段由SEQ ID N〇:9所示的核苷酸序列組成。
[0034] 上述試劑盒中所述的陽性對照，按照如下方法制備：（1)提取新鮮牛肉的基因組 DNA，（2)以牛肉的基因組 DNA 為模板，以 B0S3F(SEQ ID No:7)和 B0S3R(SEQ ID No:8)為 引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得大小為271bp的ATP8基因片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；（2)將271bp的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物與PEASY-Tl克隆載體鏈接，轉(zhuǎn)化到Transl-Tl感受態(tài)細(xì)胞中，IPTG誘導(dǎo)藍(lán)白斑產(chǎn) 生，取白色菌落，先用牛的引物（B0S3F(SEQ ID No:7)和B0S3R(SEQ ID No:8))進(jìn)行菌落 PCR驗證；將陽性重組子搖菌培養(yǎng)，采用試劑盒提取質(zhì)粒DNA，以質(zhì)粒DNA為模板，以M13引 物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR驗證與預(yù)期片段相一致的質(zhì)粒送上海生物工程技術(shù)有限公司測序；測 序正確（見SEQ ID No:9)的重組子菌落繼續(xù)搖菌培養(yǎng)，用試劑盒提取質(zhì)粒DNA，得陽性DNA 樣品；
[0035] 其中所述的B0S3F和B0S3R引物為：
[0036] B0S3F :5, -GCCATATACTCTCCTTGGTGACA-3'（SEQ ID No:7)
[0037] B0S3R :5, -GTAGGCTTGGGAATAGTACGA-3'（SEQ ID No:8)。
[0038] 本發(fā)明利用交叉引物和雙探針恒溫擴(kuò)增檢測牛源性成分的方法，包括以下步驟：
[0039] (1)、提取待測牛肉源樣品基因組DNA ;利用SDS、蛋白酶K常規(guī)哺乳動物DNA提取 方法或者其他商業(yè)上使用的動物基因組DNA提取試劑盒提取待測樣品的總DNA作為待測樣 品DNA模板；
[0040] ⑵、利用上述試劑盒配制恒溫擴(kuò)增反應(yīng)液：反應(yīng)體系（25ul):恒溫擴(kuò)增反應(yīng)液（A 管）20ul，Bst DNA聚合酶液（B管）lul，雙蒸水（C管）3ul，待測樣品DNA或陽性對照（D 管）分別為Iul或空白對照（C管）Iul ;
[0041] 先按反應(yīng)體系依次向反應(yīng)管中加入雙蒸水（C管）、恒溫擴(kuò)增反應(yīng)液（A管）、Bst DNA聚合酶液（B管）的和待測樣品DNA或陽性對照（D管），移液器吹打混勻（陽性對照應(yīng) 在陰性對照和所有樣品之后加入）；
[0042] (3)、交叉引物恒溫擴(kuò)增程序：將反應(yīng)管放置恒溫水浴鍋內(nèi)，63°C溫浴60-70min ;
[0043] (4)、擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測：將擴(kuò)增產(chǎn)物滴加到核酸試紙條的加樣區(qū)，再將核酸試紙條 放入SSC緩沖液中，5?IOmin后通過試紙條的顯色進(jìn)行判讀，擴(kuò)增產(chǎn)物通過核酸檢測試紙 條進(jìn)行判讀；若結(jié)果為陽性，則樣本中含有檢測的核酸，試紙條出現(xiàn)兩條紅色條帶，一條位 于質(zhì)控區(qū)，一條位于檢測區(qū)；若結(jié)果是陰性，則只有質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)一條紅色條帶，檢測區(qū)沒有 條帶。
[0044] 上述方法中所述的核酸檢測試紙條是指3號核酸檢測試紙條，可從杭州優(yōu)思達(dá)生 物技術(shù)有限公司購買。
[0045] 所述的引物組在檢測牛源性成分上的應(yīng)用。
[0046] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下突出優(yōu)點和有益效果：（1)特異性強(qiáng)，本發(fā)明所 用的線粒體ATP8基因是牛屬特異性的，只能用于檢測牛肉源成分，與其他羊肉、鼠肉、雞肉 等肉類的基因無交叉反應(yīng)；(2)檢測速度快，與傳統(tǒng)的檢測方法相比，本發(fā)明將檢測時間縮 短到lOOmin，明顯提高了檢測效率；（3)方便實用，擴(kuò)增產(chǎn)物通過一次性試紙條進(jìn)行檢測， 5?IOmin即可完成檢測結(jié)果的判讀，尤其適用在基層現(xiàn)場檢測。（4)不需要復(fù)雜儀器設(shè)備。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0047] 圖1.為以不同加工牛肉DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增的線粒體ATP8基因271bp片段 的電泳檢測圖譜；其中1為新鮮牛肉，2為熏制切片的熟肉，3為新鮮牛肉，4為尖椒牛柳牛 肉。
[0048] 圖2.為節(jié)選的不同組引物的CPA擴(kuò)增后檢測結(jié)果電泳圖譜；其中1、2分別為第 1，2組引物，3為第7組引物。
[0049] 圖3.內(nèi)外引物濃度比優(yōu)化的CPA擴(kuò)增后檢測電泳圖譜；其中1為體系1，2為體系 2, 3為體系3。
[0050] 圖4.探針濃度優(yōu)化的CPA擴(kuò)增后核酸試紙條檢測照片；其中I. B0SHP*和 B0Sls2a* 分別為 0· 4 和 0· 4 μ mol/L，2. B0SHP* 和 B0Sls2a* 分別為 0· 5 和 0· 4 μ mol/L ; 3. B0SHP* 和 B0Sls2a* 分別為 0· 6 和 0· 4 μ mol/L。
[0051] 圖5. CPA反應(yīng)體系建立的電泳檢測圖譜，1為未加 DNA模板對照，2為添加 DNA模 板體系處理，3為添加模板常溫放置。
[0052] 圖6. CPA反應(yīng)體系的試紙條檢測結(jié)果照片，其中1為未加 DNA模板的對照處和2 為添加 DNA模板處理2, 3為添加模板常溫放置。
[0053] 圖7.本發(fā)明方法檢測檢測羊、鼠、雞肉結(jié)果照片，其中1為羊肉，2為鼠肉，3為雞 肉，4為牛肉，5為牛肉。

【具體實施方式】：
[0054] 下面的實施例僅用于對本發(fā)明作進(jìn)一步的解釋和說明，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍不 限于實施例。如無特別說明，下述實施例中所用的試驗方法和試劑皆為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟 知的常規(guī)技術(shù)和試劑。下述實施例中引物與探針由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成、 Thermo pol Buffer (熱聚合緩沖液）和Bst DNA pol多聚酶購自北京紐英倫生物技術(shù)有限 公司、dNTPs購自北京全式金生物技術(shù)有限公司、Betiane (甜菜堿）購自阿拉丁試劑有限公 司。
[0055] 實施例1牛肉源成分特異性基因區(qū)段的確定
[0056] 選用新鮮牛肉樣品，用動物組織DNA試劑盒（杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司，以 下同）提取的牛肉基因組DNA為模板，用PCR檢測牛肉線粒體ATP8基因檢測的一對正反向 引物（即引物B0S3F/3R:SEQ ID No :7/8))進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系（Taq酶0.25yL， Taq Buffer 2 μ L，dNTPs 2 μ L，B0S3F 1 μ L，B0S3R 1 μ L，模板 3 μ L，加雙蒸水 10. 75 μ L)， PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果（見圖1，泳道1)。PCR產(chǎn)物送上海生物工程技術(shù)有限 公司測序驗證，測序結(jié)果與預(yù)期的271bp序列一致。
[0057] 用動物組織DNA試劑盒分別提取鼠肉、羊肉、雞肉、鴨肉的基因組DNA為模板，以 B0S3F/3R引物（SEQ ID No :7/8)，分別PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測均未得到 明顯的DNA條帶。說明牛肉線粒體ATP8基因的271bp的基因片段是牛屬特異性的，可用于 牛肉源成分的特異性檢測。
[0058] 實施例2不同加工的牛肉樣品中牛肉線粒體ATP8基因 PCR擴(kuò)增檢測
[0059] 選用新鮮牛肉、熏制品牛肉、尖椒牛柳樣品，碾磨成牛肉松，各取0.25mg樣品；利 用動物組織DNA試劑盒分別進(jìn)行DNA提?。徊捎肞CR反應(yīng)體系同實施例I (Taq酶0. 25 μ L， Taq Buffer 2yL，dNTPs 2yL，B0S 3F lyL，B0S3R lyL，模板 3yL，加雙蒸水 10.75yL)， 經(jīng)PCR擴(kuò)增后電泳檢測不同來源的牛肉樣品均獲得一致的271bp片段（見圖1)。說明不管 加工方式如何，利用牛肉線粒體ATP8基因的271bp的基因片段都可以對牛肉進(jìn)行特異性的 檢測。
[0060] 實施例3本發(fā)明恒溫擴(kuò)增反應(yīng)體系中交叉引物設(shè)計和篩選
[0061] 試驗設(shè)計：參考 CPA 反應(yīng)（Fang RD 等· Journal of C Iinical Microbiology, 2009, 47(3) :847 ;Xu GL 等.Scientific R 印 orts，2012, 2:246. doi: 10. 1038/ srep00246)和 LAMP 在線軟件（http://primerexplorer. jp/e/)設(shè)計引物體系、利用 oligo 7、primer 5等軟件分析引物參數(shù)，共在PCR擴(kuò)增271bp區(qū)段序列內(nèi)設(shè)計了 7組交叉引物 (其中6組被淘汰交叉引物的未列出），目的片段是150bp-250bp之間，在設(shè)計引物時要求： 引物中的G、C堿基含量高；要避免引物間形成二聚體；擴(kuò)增片段之間的距離；避免形成發(fā)夾 結(jié)構(gòu)。綜合以上因素我們經(jīng)過多次篩選，第7組引物為本發(fā)明交叉引物，如下 ：
[0062] 其中所述的一對外圍引物為：
[0063] 正向外圍引物 B0S4s :5'-CGATAAGGGCTACGAGAGG-3'（SEQ ID No:l)，
[0064] 反向外圍引物 B0S5a :5'-AGATCATTGTCAGTCATGTTG-3'（SEQ ID No:2)，
[0065] 述的交叉引物為：
[0066] 正向交叉引物B0S2als :
[0067] 5' -TGGGAAAAATAGTAGAAAGTTGATTGTTGGTGTCAGTTCTGGATTG-3' （SEQ ID No:3)，
[0068] 反向交叉引物B0Sls2a :
[0069] 5' -TTGTTGGTGTCAGTTCTGGATTGTGGGAAAAATAGTAGAAAGTTGA-3' （SEQ ID No:4)。
[0070] 以新鮮牛肉提取的DNA為模板或以實施例1中PCR擴(kuò)增的271bp產(chǎn)物為模板，添 加 dNTPS、Betiane (甜菜堿）、Bst DNA聚合酶液后，實驗組內(nèi)引物多種比例、濃度相互組合， 63°C溫浴在60-90minCPA反應(yīng)實驗。以271bp (即CK)作為對照，將設(shè)計的7組不同組交叉 引物恒溫反應(yīng)后，瓊脂糖凝膠電泳電泳檢測。結(jié)果第1，2組交叉引物多次實驗檢測結(jié)果幾 乎沒有條帶，設(shè)計的第3, 4, 5, 6組交叉引物檢測結(jié)果逐漸有階梯式的條帶出現(xiàn)，在第7組交 叉引物設(shè)計之后得到清晰的檢測結(jié)果（見圖2,為節(jié)選的不同組引物的CPA擴(kuò)增后檢測結(jié)果 電泳圖譜；其中泳道1、2分別為第1、2組引物，泳道3為第7組引物結(jié)果。經(jīng)多次實驗篩選 將第7組的引物體系確定為本發(fā)明交叉引物。
[0071] 實施例4 CPA反應(yīng)內(nèi)外引物濃度優(yōu)化試驗
[0072] 對實施例3篩選的第7組引物體系濃度比例（表1)進(jìn)行優(yōu)化。設(shè)計不同內(nèi)外引 物濃度組合的25 μ L反應(yīng)體系。其中外引物濃度范圍在0. 2?0. 4 μ mol/L，內(nèi)引物濃度范 圍在0· 4 μ mol/L?0· 8 μ mol/L。63°C恒溫水浴60min進(jìn)行CPA擴(kuò)增。
[0073] 表I CPA反應(yīng)內(nèi)外引物濃度優(yōu)化體系
[0074]

【權(quán)利要求】
1. 用于交叉引物和雙探針恒溫擴(kuò)增檢測牛源性成分的引物組，其特征在于由一對外圍 引物、一對交叉引物和一對檢測探針引物組成； 其中所述的一對外圍引物為： 反向外圍引物 B0S5a:5' -AGATCAITGTCAGTCATGITG-3'（SEQ ID No:2); 所述的交叉引物為： 正向交叉引物B0S2als : -TGGGAAAAATAGTAGAAAGTTGATTGTTGGTGTCAGTTCTGGATT G-3, (SEQ ID No :3), 反向交叉引物B0Sls2a: 5' -TTGTTGGTGTCAGTTCTGGATTGTGGGAAAAATAGTAGAAAGTT GA-3' （SEQ ID No:4)， 所述一對檢測探針引物為： 檢測探針引物B0Sls2a* : -TTGTTGGTGTCAGTTCTGGATTGTGGGAAAAATAGTAGAAAGTTGA-3, (SEQ ID No:5), 檢測探針引物 B0SHP*:5' -AITTCCAACACAAAACT-3'（SEQ ID No:6); 其中B0Sls2a*的5'端標(biāo)記修飾生物素，BOSHP*的5'端標(biāo)記修飾熒光素FAM。
2. 利用交叉引物和雙探針恒溫擴(kuò)增檢測牛源性成分的試劑盒，其特征在于包括下列6 個部分，分別為核酸檢測試紙條、SSC緩沖液、恒溫擴(kuò)增反應(yīng)液、Bst DNA聚合酶液、無菌雙蒸 水以及陽性對照；其中所述的恒溫擴(kuò)增反應(yīng)液（A管）括權(quán)利要求1所述的一對外圍引物、 一對交叉擴(kuò)增引物和一對檢測探針引物，以及Thermol pol buffer和dNTPs溶液。
3. 按照權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述的恒溫擴(kuò)增反應(yīng)液（A管）的組成 成分及其比例為：正向外圍引物B0S4s 0? 125iimol/L，反向外圍引物B0S5a 0? 125iimol/ L，正向交叉引物B0S2als liimol/L，反向交叉引物B0Sls2a 0. 5iimol/L，檢測探針引物 B0Sls2a*0. 5iimol/L，檢測探針引物 B0SHP*0. 5iimol/L，dNTPs 溶液 0? 25mmol/L，Betiane 甜菜喊 0.25M，IX Thermol pol buffer。
4. 按照權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述的核酸檢測試紙條是指3號核酸檢 測試紙條。
5. 按照權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述的SSC緩沖液的組成成分及其比例 為：0? 3mol/L NaCl, 0? 03mol/L 檸檬酸鈉，用 lmol/L HC1 調(diào)節(jié) pH 至 7. 0。
6. 按照權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述的lXThermol pol buffer的 組成成分及其比例為：10mM KCl、10mM(NH4)2S04、20mM Tris-HCl、2mM MgS04、0. 1 % TritonX-100、pH8. 8。
7. 按照權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述的Bst DNA聚合酶液（B管）為Bst DNA聚合酶液（8U/ y L)。
8. 按照權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述的陽性對照（D管）為含有牛線粒體 ATP8基因片段的質(zhì)粒DNA;所述的牛線粒體ATP8基因片段由SEQ ID N〇:9所示的核苷酸序 列組成。
9. 利用交叉引物和雙探針恒溫擴(kuò)增檢測牛源性成分的方法，其特征在于包括以下步 驟： (1)、提取待測牛肉源樣品基因組DNA ; (2) 、利用權(quán)利要求2所述的試劑盒配制恒溫擴(kuò)增反應(yīng)液：反應(yīng)體系（25ul):恒溫擴(kuò)增 反應(yīng)液（A管）20ul，Bst DNA聚合酶液（B管）lul，雙蒸水（C管）3ul，待測樣品DNA或陽 性對照（D管）分別為lul或空白對照（C管）lul ;其配制方法為先按反應(yīng)體系依次向反應(yīng) 管中加入雙蒸水（C管）、恒溫擴(kuò)增反應(yīng)液（A管）、Bst DNA聚合酶液（B管）的和待測樣品 DNA或陽性對照（D管），移液器吹打混勻； (3) 、將反應(yīng)管放置恒溫水浴鍋內(nèi)，63°C溫浴60-70min ; (4) 、將擴(kuò)增產(chǎn)物滴加到核酸試紙條的加樣區(qū)，再將核酸試紙條放入SSC緩沖液中，5? lOmin后通過試紙條的顯色進(jìn)行判讀，擴(kuò)增產(chǎn)物通過核酸檢測試紙條進(jìn)行判讀；若結(jié)果為 陽性，則樣本中含有檢測的核酸，試紙條出現(xiàn)兩條紅色條帶，一條位于質(zhì)控區(qū)，一條位于檢 測區(qū)；若結(jié)果是陰性，則只有質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)一條紅色條帶，檢測區(qū)沒有條帶。
10.權(quán)利要求1所述的引物組在檢測動物食品牛源性成分上的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/11GK104388573SQ201410750537
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年12月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月9日
【發(fā)明者】李素芳, 楊韓, 潘家榮, 張雪妍, 馮濤, 朱月城, 董圣祿, 何巧 申請人:中國計量學(xué)院