表皮毛和棉花纖維特異啟動子pltp及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于植物基因工程【技術領域】，涉及表皮毛和棉花纖維特異啟動子PLTP及其應用。本發(fā)明要解決的技術問題是為棉花品種的改良提供一種新選擇。本發(fā)明的技術方案是表皮毛和棉花纖維特異啟動子PLTP，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本發(fā)明還提供了含有所述啟動子PLTP的表達載體。本發(fā)明還提供了含有所述載體的宿主。本發(fā)明還提供了所述的啟動子PLTP在獲得轉基因植物中的應用。本發(fā)明的啟動子可用于煙草和棉花品質的改良以及棉花纖維品質的改善。
【專利說明】表皮毛和棉花纖維特異啟動子PLTP及其應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物基因工程【技術領域】，涉及表皮毛和棉花纖維特異啟動子及其應 用。

【背景技術】
[0002] 表皮毛由植物表皮細胞發(fā)育而來，廣泛分布于陸生植物，是生長在植物表皮組織 的一種特化結構。其形態(tài)多種多樣，由一個細胞或多個細胞構成；有產生分支的，也有不分 支的；有的有腺體，可分泌生物堿（如尼古丁、類萜等），有的則無腺體（高英等，植物學報 2011，46(1) : 119 - 127)。表皮毛除具有增加表皮層厚度，減少熱量和水分散失的功能外，還 能夠保護植物免受昆蟲和病原體的侵害以及降低機械損傷和紫外光傷害等（Szymanskiet al.，2000)。此外，中國蕨類植物蜈蟻草（Pterisvittata)的表皮毛還具有高度吸收重金屬 化學元素的能力，這無疑對提高土壤重金屬污染的主動防御以及新防御措施的開發(fā)利用有 重要的啟示作用（Lietal.，2005)。
[0003] 從植物學的角度，棉花纖維也是生長在種皮上的一種表皮毛。棉花纖維是重要的 紡織工業(yè)原料，我國是棉紡織品消費和出口大國，因此，棉花生產在我國國民經(jīng)濟中占有重 要的地位，同時也是農民重要的經(jīng)濟來源。能否迅速提高我國棉花品種的纖維品質，直接關 系到我國棉花產業(yè)的興衰和紡織品生產加工、紡織設備制造、外貿出口等行業(yè)的生存與發(fā) 展。雖然利用傳統(tǒng)的育種方法曾在棉花品種改良上取得了很大的成功，但近20年來，世界 棉花品種在產量上已經(jīng)達到一個平臺期，利用現(xiàn)有的遺傳資源和育種手段難以再大幅度提 高棉花產量（MeredithW.R.BetterCrops200084(4) :6?9)。單純依靠常規(guī)育種改良棉 花纖維品質相當困難。這是因為：1)棉花纖維強力、細度等品質性狀基因與皮棉產量存在 負連鎖，常規(guī)育種方法很難打破這種遺傳上的負相關；2)我國的棉花栽培品種主要是陸地 棉，而優(yōu)良纖維品質基因主要源于二倍體的瑟伯氏棉（纖維強度）、異常棉（纖維強度與細 度）以及四倍體的海島棉（纖維強度與細度）等，這些優(yōu)良性狀基因的利用在常規(guī)育種中 受到諸多限制。瑟伯氏棉與異常棉為二倍體野生種，與四倍體陸地棉雜交后，存在遠緣雜交 帶來的農藝性狀差、后代難于穩(wěn)定、周期太長等問題；即便是同為四倍體的海X陸雜交，同 樣存在后代分離強烈，產量-品質負連鎖關系仍難打破等問題（潘家駒1998棉花育種學 99?104北京：中國農業(yè)出版社）。JeffreyChen甚至認為：一在不影響產量的前提下要 改進棉花纖維品質幾乎是不可能的II(NatureBiotechnology，2011, 29(5) :407-409)。
[0004] 利用基因工程的方法可以打破物種間的遺傳障礙，實現(xiàn)目的基因的定向轉移，同 時具有后代易于穩(wěn)定，育種周期短等優(yōu)點。因此，在明確棉花纖維發(fā)育分子機理的基礎上， 分離促進棉花纖維發(fā)育相關的基因，進而利用基因工程的手段對棉花纖維產量和品質實行 定向改良，近年來一直是國內外研究中的熱點。
[0005]啟動子是RNA聚合酶能夠特異識別的一段DNA分子，也就是使轉錄開始的部位。 在基因表達的調控中，轉錄是基因表達的第一步，也是表達調控的關鍵一步（Lewi，2005基 因VIII669?705,北京：科學出版社）。隨著基因工程的發(fā)展，常常需要構建一種能高水 平表達異源蛋白質的表達載體，啟動子對外源基因在生物中的表達部位與表達水平影響很 大，是基因工程表達載體的重要元件。在棉花纖維品質的基因工程改良中，往往需要外源基 因特異地在纖維細胞中表達，從而降低外源基因對棉花正常生長的影響。在有關棉花纖維 發(fā)育的基因調控機理研究中，通常采用轉基因的手段，將目的基因超量表達或表達沉默，從 而推測其功能。因此，在通過轉基因手段驗證其功能時，會干擾轉基因棉的正常生長，產生 無法預料的結果，影響實驗結果的準確性和實驗進度。如果采用棉花纖維特異啟動子，則可 以使目的基因的表達控制在纖維發(fā)育過程中。因此，棉花纖維或種皮特異啟動子的克隆及 其表達分析，對棉花纖維發(fā)育的基因功能研究和纖維品質的基因工程改良，都具有十分重 要的價值。
[0006] 前人通過利用纖維特異啟動子，嘗試通過生物工程技術改良棉花纖維的品質，如 將聚羥基丁酸合成酶系在棉花纖維中特異表達改善了棉花纖維的保暖性能。1996年美國 Agracetus公司首次報道基因工程改良棉纖維的探索性試驗。經(jīng)遺傳轉化的棉纖維中含有 一種天然的脂肪族聚酯化合物--多聚一D-(-)_3羥基丁酸（PHB)。PHB聚酯是一種天然的 可降解的熱性塑料（thermoplastic)，其理化性質與聚丙烯相似。PHB常以包涵體的形式存 在于某些細菌的體內作為碳源。PHB的生物合成涉及3種酶d-酮硫解酶、乙酰CoA還原 酶和PHB合成酶。John等（JohnME,KellerG.MetabolicProcNatlAcadSci,USA1996， 93 :12768-12773)將乙酰CoA還原酶基因（phaB)和PHB合成酶基因（phaC)分別與纖維特 異性啟動子E6和FbL2A連接，構建植物表達載體，運用基因槍技術，將phaB和phaC基因共 轉化到陸地棉栽培種DP50中，成功獲得同時表達phaB和phaC基因的轉基因棉花。⑶S基 因表達、Northern雜交等分子檢測結果均證明：phaB和phaC□在轉基因棉株纖維中表達。 熒光顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察一致顯示：轉基因棉纖維細胞中含有PHB顆粒。對轉基 因棉纖維提取物的GC-MC分析表明，纖維中有與細菌PHB質譜相同的物質，證明轉基因棉 纖維中合成了PHB大分子物質。HPLC分析結果表明：每克纖維干重含約30-3440iig的PHB， PHB的合成始于開花后10d，纖維成熟后PHB含量沒有降低。利用植物體內自身的乙酰CoA 合成大分子PHB，并沒有對棉花纖維品質如長度、強度和馬克隆值帶來任何影響，然而PHB 的存在的確提高了纖維的熱絕緣性能。但是因纖維中PHB含量仍較低，絕緣性提高的幅度 尚有限。
[0007] 在基因工程改良棉纖維方面頗為人們關注的另一個焦點是美國Auburn大學 Daniell的研究工作。Daniell(HenryDaniell，BeltwideCottonConferences，1998， 595?598)試圖將編碼含Val-Pro-Gly-Val-Gly重復單兀的蛋白聚體（protein-based polymers，PBPs)基因遺傳轉化棉花，使棉花細胞能特異表達出PBPs蛋白。PBPs蛋白廣泛存 在于自然界中，如哺乳動物結締組織中的彈性蛋白，分子內含有由多個氨基酸組成的重復 順序，PBPs分子常表現(xiàn)出較強的彈性（彈性系數(shù)10. 6?10. 9Pa)oDaniell(HenryDaniell， BeltwideCottonConferences，1998, 595 ?598)認為將PHBs引進棉纖維，一方面有望提 高纖維的彈性和強度，另一方面纖維中蛋白質含量的提高，纖維吸水能力增強，與染料的親 和力亦相應增強，這是目前常規(guī)育種方法所做不到的。
[0008] 上述案例說明利用基因工程技術，在纖維特異啟動子控制下，特異表達目的基因 可以改良棉花纖維品質。特異啟動子在棉花基因工程育種中的重要性，在Zhang等人的工 作中表現(xiàn)的更為突出（Zhang,etalNatureBiotechnology，2011，29:453-458)。前人通過 外源施用，發(fā)現(xiàn)生長素對纖維發(fā)育具有促進作用，于是John(1999)將生長素IAA生物合成 酶基因置于纖維專一性啟動子E6控制下，以期通過增加纖維細胞中的生長素來改進棉花 產量或品質。結果發(fā)現(xiàn)，雖然IAA含量在轉基因棉花纖維細胞中顯著增加，但是轉基因纖維 細胞并未發(fā)生明顯的改進。John由此得出結論：超量表達生長素對棉花纖維的長度、強度 和馬克隆值沒有影響（John，M.E. 1999)。Zhang等利用單克隆抗體原位雜交技術對IAA進 行細胞定位，發(fā)現(xiàn)IAA在開花當天的棉花纖維起始細胞中高濃度積累；而無纖維突變體則 沒有明顯的IAA信號，表明IAA對棉花纖維細胞的起始具有十分重要的作用。棉花纖維細 胞是由胚珠外珠被表層細胞經(jīng)分化突起、伸長而形成的。研究表明，只有開花后5天之內突 起的表皮細胞（約占10%左右）可以發(fā)育成為具有紡紗價值的長纖維。他們根據(jù)一生長 素在棉花纖維突起細胞中極性分布II這一發(fā)現(xiàn)，分析了前人利用生長素改良棉花纖維失 敗的原因。認為必須把生長素的極性分布與棉花纖維細胞發(fā)育的特點結合起來，利用特異 啟動子對生長素合成酶基因進行特定部位、時間和強度上的精確調控，方能達到改良纖維 產量和品質的目的。于是他們將來自矮牽牛而且表達活性區(qū)在胚珠外表皮，控制基因表達 的時間在開花前2天到開花后8天的FBP7啟動子，與生長素生物合成基因iaaM融合并導 入棉花中。轉基因棉花表型分析結果表明，不僅胚珠表面纖維數(shù)目增加、衣分得到提高，而 且纖維細度也得到改良，即轉基因棉花纖維的產量和品質得到同步改良。與John所用的啟 動子E6主要在開花后5-24天的纖維細胞中表達相比，該實驗選用了另外一個具有如下特 點的啟動子：①表達的時間是在開花前2天至開花后5天之間；②表達的部位不是在已經(jīng) 分化形成的纖維細胞，而是胚珠外表皮細胞，促進了更多的胚珠外表皮細胞分化發(fā)育為纖 維細胞，進而提高棉花的產量和品質；③表達的強度不同，特別對激素水平的調控應始終， 否則植物生長發(fā)育不正常，還會導致減產或品質下降。因此，先鋒公司部門副總裁Michael Lassner認為，該研究一清楚地證明了啟動子的選擇在性狀改良上的重要性||(《Faculty of1000》，2011年9月14日）。該研究一展現(xiàn)了新一代轉基因作物的光明前景||(Jeffrey Chen,NatureBiotechnology,2011，29(5):407-409)。
[0009] 棉花胚珠表皮或纖維特異啟動子在棉花基因工程改良中的巨大潛在價值，使一些 棉花這類特異啟動子得到克隆，然而目前能用于棉花基因改良的啟動子仍然非常有限，因 此，獲得更多棉花纖維特異啟動子，對今后棉花纖維的基因工程改良和纖維發(fā)育基因功能 研究均具有重要的利用價值。


【發(fā)明內容】

[0010] 本發(fā)明要解決的技術問題是為棉花品種的改良提供一種新選擇。
[0011] 本發(fā)明的技術方案是表皮毛和棉花纖維特異啟動子PLTP，其核苷酸序列如SEQID No. 1所示。
[0012] 本發(fā)明還提供了含有所述啟動子PLTP的表達載體。
[0013] 具體的，所述的表達載體為植物表達載體。
[0014] 本發(fā)明還提供了含有所述載體的宿主。
[0015] 具體的，所述的宿主為根癌農桿菌。
[0016] 本發(fā)明還提供了所述的啟動子PLTP在獲得轉基因植物中的應用。
[0017] 本發(fā)明還提供了所述的啟動子PLTP在獲得轉基因棉花或者轉基因煙草中的應 用。
[0018] 本發(fā)明還提供了所述的表達載體在獲得轉基因植物中的應用。
[0019] 本發(fā)明還提供了所述的表達載體在獲得轉基因棉花或者轉基因煙草中的應用。
[0020] 本發(fā)明還提供了所述啟動子PLTP在改善棉花纖維品質中的應用。
[0021] 本發(fā)明還提供了含有所述啟動子的轉基因植物的制備方法，包括下述步驟：
[0022] (1)將表皮毛和棉花纖維特異的啟動子可操作地插入表達載體中，構建植物表達 載體；
[0023] (2)用所述植物表達載體轉化宿主，獲得轉化體；
[0024] (3)將所述轉化體轉化植物，獲得轉基因植物。
[0025] 本發(fā)明的煙草表皮毛和棉花纖維特異啟動子序列，其至少含有SEQIDNO. 1所示 的核苷酸序列，該序列為根據(jù)棉花GhLTP基因序列設計引物，采用PCR方法，得到的長度為 2467bp的PLTP啟動子序列。該序列中包含多個種子胚乳有關的SKn-1，與MYB轉錄因子結 合位點有關的MRE和MBS，與ABA、SA等激素相應有關的ABRE和TCA，與逆境、厭氧等誘導相 關的TC富集區(qū)和ARE、細胞周期和晝夜節(jié)律相關的MSA-like和cricadian，多個CAAT-box、 八-13(?、6-13(?、44644-111〇丨1￡等大量順式調控元件及與了?11結合的核心序列了4了44。通過在 轉基因煙草和轉基因棉花中GUS組織化學染色檢測，證實該啟動子驅動GUS基因在轉基因 煙草表皮毛中以及陸地棉纖維細胞中特異地表達。
[0026] 本發(fā)明中，采用基因工程方法，將PLTP啟動子插入到適宜的表達載體中即可獲得 本發(fā)明的含有該啟動子PLTP的植物表達載體。
[0027] 本發(fā)明將上述植物表達載體轉化適宜的宿主即可獲得本發(fā)明的轉化體。具體的， 采用電擊法將含有PLTP啟動子的植物表達載體轉化到根癌農桿菌LBA4404中獲得轉化體。
[0028] 將本發(fā)明的PLTP啟動子與報告基因構建植物表達載體，將所述植物表達載體轉 化宿主獲得含PLTP啟動子的轉化體，以及用所述轉化體轉化植物獲得轉基因植物。所述轉 基因植物優(yōu)選為煙草或陸地棉。
[0029] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明獲得了棉花纖維特異基因的啟動子PLTP，該啟動子在 煙草中具有表皮毛特異表達活性，在陸地棉中具有纖維優(yōu)勢表達特異性，為基因工程改良 煙草、棉花品種提供了新選擇和有效的途徑。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0030] 圖lGhLTP基因在陸地棉不同組織中的表達量（RelativeExpression)
[0031]以陸地棉根（root)、莖（stem)、葉（leaves)、花冠（petal)、下胚軸（hypocotyl)、 子葉（cotyledon)、開花當天胚珠（0-0&F)、開花后lid的纖維（11-F)和開花后lid的胚 珠（11-0)中的cDNA為模板，經(jīng)實時定量PCR擴增的結果；該基因在根中幾乎不表達，開花 當天的胚珠中表達量也很低；在下胚軸、子葉、葉片、莖、花瓣及開花后lid胚珠中表達量較 低，而在開花后lid纖維中高表達。
[0032] 圖2GhLTP基因在陸地棉纖維不同發(fā)育時期的表達量（RelativeExpression)
[0033]開花當天胚珠（0-0&F)、開花后3天的胚珠（3-0&F)、開花后7天的胚珠（7-0)、開 花后9天的胚珠（9-0)、開花后11天的胚珠（11-0)、開花后13天的胚珠（13-0)、開花后19 天的胚珠（19-0)、開花后26天的胚珠（26-0)、開花后7d的纖維（7-F)、開花后9d的纖維 (9-F)、開花后lid的纖維（11-F)和開花后13d的纖維（13-F)。
[0034]圖3表示PLTP啟動子的核苷酸序列圖，圖上標記的是一些順式作用元件的位置， 分別與多個種子胚乳有關的SKn-1 (GTCAT)，與MYB轉錄因子結合位點有關的MRE(AACCTAA) 和MBS(CGGTCA)，與ABA、SA等激素相應有關的ABRE(GACACGTGGC)和TCA(CCATCTTTTT)，與 逆境、厭氧等誘導相關的TC富集區(qū)（GTTTTCTTAC)和ARE(TGGTTT)、細胞周期和晝夜節(jié)律相 關的MSA-like(TCAAACGGT)和cricadian(CAANNNNATC)。
[0035] 圖4表示PLTP啟動子克隆到pEASY-Blunt載體上的質粒圖譜。
[0036] 其中載體主要元件標示，pUCorigin質粒復制起點；Ampicillinresistance 〇RF:氨節(jié)青霉素抗性基因；KanamycinresistanceORF:卡那霉素抗性基因；其余為限制 性內切酶位點。
[0037] 圖5陸地棉PLTP啟動子表達載體的構建流程圖；
[0038] 圖6PLTP啟動子表達載體pBI101-PLTP的結構圖。
[0039] 圖5和圖6中載體主要元件標示，reporigin質粒復制起點；NPTII:新霉素磷酸 轉移酶基因；GUS: 0 -葡萄糖酸昔酶基因；NOSterminato和N0S:終止子；N0SPromoter: N0S組成性啟動子；LB、RB:T-DNA插入左、右邊界。
[0040] 圖7表示轉PLTP::⑶S融合基因煙草的PCR驗證結果。18、19、38為標準分子量 DNA(Mark2000)，1-17、20 ?37 為不同的轉基因株系。結果表明 1、2、6、8、12-17、20、23、24、 31?36為轉基因陰性株系，其余株系為轉基因陽性株系。
[0041] 圖8表示轉PLTP::⑶S融合基因煙草中的⑶S染色結果，⑶S在轉基因煙草葉片、 莖、果柄和花的表皮毛上優(yōu)勢表達。其中，A:萌發(fā)后5天的幼苗；B:真葉；C:幼莖橫切；D:葉 柄橫切；E:C中幼莖的放大；F:D中葉柄的放大；G:開花當天的子房；H:開花當天的花冠。
[0042] 圖9表示轉PLTP::⑶S融合基因棉花的PCR驗證結果。1、18、19、36為標準分子 量DNA，2-17、20-35為不同的轉基因株系，結果表明轉基因株系均為陽性株系。
[0043] 圖10表示轉PLTP::⑶S融合基因陸地棉的⑶S染色結果；其中A:根；B:莖；C: 葉；D:P十柄；E:花；F:花誕；G:開花當天的胚珠；H:開花后3天的胚珠；I:開花后7天的胚 珠J:開花后12天的胚珠；K:開花后15天的胚珠；L:開花后18天的胚珠。

【具體實施方式】
[0044] 以下結合附圖對本發(fā)明進行進一步的詳細說明，但以下說明并不對本發(fā)明進行限 定，任何對本發(fā)明的變形和改變，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應屬于本發(fā)明所附權利要 求所定義的范圍。
[0045] 本發(fā)明實例中的試劑藥品未做具體說明的均為普通市售，材料方法未做具體說明 的均參考《分子克隆實驗指南》（Sambrook和Russell, 2001)。
[0046] 實施例1陸地棉各個組織RNA的提取及定量PCR分析
[0047] 利用EASYspin植物RNA快速提取試劑盒（Aidlab)提取棉花各個組織的RNA。參 照RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit(MBI)說明書進行cDNA-鏈的逆轉錄， 用作定量RT-PCR分析模板。采用iQSYBRGreenSupermix(BIO-RAD)試劑分析目的基因的 相對表達量。內標基因選擇陸地棉的Ghhis3基因（AF024716)，引物為Ghhisl(5'-GAAGCC TCATCGATACCGTC-3'）和Ghhis2(5'-CTACCACTACCATCATGGC-3'），分別如SEQID NO. 8 和SEQIDNO. 9 所示；GhLTP基因定量PCR引物為，Ltp-1 (5'CGCCCAAACAACACCAGAC3，） 和1^?-2(5'(：1'1'11^04611^6了6〇^66 3'），分別如5￡0 10勵.2和5￡0 10勵.3所示。擴增 條件為：951：預變性3111111;951：變性2〇8,561：退火2〇8,721：延伸3〇8,40個循環(huán)。
[0048]計算各材料中目的基因和內標的比值，可得目的基因在不同器官組織中的相對表 達量。如圖1所示，該基因在根中幾乎不表達，開花當天的胚珠中表達量也很低；在下胚軸、 子葉、葉片、莖、花瓣及開花后lid胚珠中表達量較低，而在開花后lid纖維中高表達。進一 步對不同發(fā)育階段的棉纖維和棉花胚珠進行檢測，結果如圖2所示，該基因在7天至11天 的纖維中表達較高，相應的在胚珠中的表達量較低。
[0049] 實施例2陸地棉PLTP啟動子的克隆
[0050] 采用艾德萊生物公司新型植物基因組DNA快速提取試劑盒，按照說明書的方法提 取陸地棉冀棉14的基因組DNA，用設計合成的該啟動子的特異引物PLTP-up和PLTP-dn(SEQ IDNO. 4和5)，以上述的DNA為模板，擴增該啟動子序列。擴增體系如下：10XPCRbuffer forKODPlus5uL，25mmolMgS045uL，2mmol/LdNTPs2uL,弓 | 物PLTP-up(5umol/ L) 2iiL，引物PLTP-dn(5iimol/L) 2iiL，K0DPlus聚合酶 1U/iiL，陸地棉DNA約 60ng，雙蒸 水補足至 50iiL。擴增程序為：94°C，2min;94°C，15sec，53°C，30sec，68°C，2min，35 個循環(huán)。 擴增完成后，瓊脂糖電泳并回收相應DNA條帶，按照說明書的方法克隆至pEASY_Blunt平端 載體上，陽性克隆寄至上海英俊公司測序驗證，得到PEASY-PLTP1131載體（見圖4)。結果 顯示獲得的PLTP啟動子序列如SEQIDNO. 1所示。利用分析軟件（PlantCARE，http:// intra.psb.ugent.be:8080/PlantCARE/)，從植物啟動子數(shù)據(jù)庫中對該序列進行啟動子調 控元件分析，從中發(fā)現(xiàn)大量的順式調控元件（見圖3)，這些順式調控元件包括多個種子胚 乳有關的SKn-1 (GTCAT)，與MYB轉錄因子結合位點有關的MRE(AACCTAA)和MBS(CGGTCA)， 與脫落酸ABA、水楊酸SA等激素相應有關的ABRE(GACACGTGGC)和TCA(CCATCTTTTT)，與逆 境、厭氧等誘導相關的TC富集區(qū)（GTTTTCTTAC)和ARE(TGGTTT)、細胞周期和晝夜節(jié)律相關 的MSA-like(TCAAACGGT)和cricadian(CAANNNNATC)。
[0051] 實施例3DNA片段回收、表達載體構建并大腸桿菌轉化
[0052] 紫外燈下，用潔凈的刀片切下含目的片段的瓊脂糖凝膠塊，按照試劑盒（Roche公 司）的方法回收相應的DNA片段，構建到。載體構建的具體流程見圖5,首先從該啟動子的 克隆載體PEASY-PLTP1131中利用限制性內切酶SalI和SmaI將啟動子片段切出，然后 克隆到表達載體PBI101 (購自CL0NTECH公司）的SalI和SmaI位點中并置于⑶S報告 基因上游，從而構建pPLTP-GUS的正向表達載體（圖6)。所有限制性內切酶均購自Roche 公司，按照使用說明書操作。
[0053] 回收的片段與載體片段的連接體系為：10XT4DNA連接緩沖液liiL，載體DNA片 段1UL，外源連接產物DNA片段1yL，T4DNA連接酶1yL，用雙蒸水補足體積至10yL。其 中，載體DNA片段與外源連接產物DNA片段摩爾比為1 : 3，16°C連接12h。之后將連接產 物轉化至大腸桿菌DH5a中。
[0054] 實施例4農桿菌及煙草和棉花的遺傳轉化
[0055] 用電激法將構建的植物表達載體質粒導入農桿菌LBA4404。
[0056] 按照OMEGA公司質粒提取試劑盒（D6943-01)說明書的步驟，提取PLTP::⑶S植 物表達載體質粒，參考Bio-RADMicroPulser用戶說明書，通過電激轉化法將該質粒轉入農 桿菌LBA4404中。
[0057]煙草的遺傳轉化：利用農桿菌介導的葉盤轉化法（Horsch,etal.，1985)，對煙草 進行遺傳轉化，將獲得的轉基因煙草植株通過PCR擴增的方法進行篩選，采用艾德萊生物 公司新型植物基因組DNA快速提取試劑盒，按照說明書的方法提取轉基因煙草的DNA，然后 將PCR呈陽性的植株種植于溫室中，常規(guī)管理。
[0058]陸地棉的遺傳轉化：采用農桿菌介導的方法對棉花進行遺傳轉化（Luoetal.， 2007)，將獲得的轉基因棉花植株通過PCR擴增的方法進行篩選，采用艾德萊生物公司新型 植物基因組DNA快速提取試劑盒，按照說明書的方法提取轉基因棉花的DNA，然后進行PCR 擴增鑒定，將陽性的幼苗置于清水中，22°C培養(yǎng)1周后移栽至溫室中，進行正常管理。
[0059] 實施例5轉基因植株的PCR驗證
[0060] 采用艾德萊生物公司新型植物基因組DNA快速提取試劑盒，按照說明書 的方法提取轉基因煙草和棉花的DNA。根據(jù)GUS報告基因的序列設計特異引物 N0. 7)用于特異PCR擴增。轉基因植株DNA進行PCR體外擴增驗證的條件：反應總體積為 25iiL，包括 10XLATaqbuffer2.5iiL、每種dNTP100iimol/L、1.5mmol/LMgC12、模板 DNA10ng、上下游引物各400nmol/L、l單位LATaqDNA聚合酶（TaKaRa公司）。
[0061] 擴增條件：94°C變性4min，繼以94°C變性30s、55°C退火30s、72°C延伸lmin，共35 個循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。
[0062] 擴增產物在含溴乙錠的1%瓊脂糖凝膠上以5V/cm的電壓電泳后，紫外燈下觀察 照像。
[0063] 轉基因煙草的PCR驗證結果見圖7,結果表明1、2、6、8、12-17、20、23、24、31-36為 轉基因陰性株系，其余株系為轉基因陽性株系。
[0064] 轉基因棉花的PCR驗證結果見圖9,結果表明轉基因株系均為陽性株系。
[0065] 實施例6⑶S的組織化學染色及觀察
[0066] 取新鮮的轉基因煙草、陸地棉材料，切成小塊后置1.5mL離心管中，加入⑶S染 色液（lOmmol/LEDTA，100mmol/L磷酸鈉緩沖液pH7. 0,0?lmol/LK3[Fe(CN)6]，0?lmol/ LK4[Fe(CN)6]，0.1% (V/V)TritonX-100,5mg/mlX-Glue)。將含有植物材料和GUS染液的 離心管，放入37. 0°C恒溫溫箱中，染色3h。最后傾去染色液，通過70%乙醇脫色后，觀察照 相。
[0067] 轉PLTP::⑶S基因煙草中的⑶S染色結果見圖8,結果顯示⑶S在轉基因煙草葉 片、莖、果柄和花的表皮毛上優(yōu)勢表達，而在非表皮毛組織中不表達，即該啟動子具有煙草 表皮毛表達特異性。
[0068] 轉PLTP::⑶S基因陸地棉的⑶S染色結果見圖10,結果發(fā)現(xiàn)在根、葉片、幼莖中 均未觀察到GUS的藍色信號；在花、花冠的表皮毛以及雄蕊、花藥中有GUS陽性信號存在； 而從開花當天開始的棉花胚珠表面開始出現(xiàn)GUS的藍色信號，特別在纖維發(fā)育的快速伸長 期，纖維特異細胞中有強烈的GUS陽性信號存在，表明該啟動子在陸地棉中具有花器官表 皮毛特異性以及纖維細胞特異性，在纖維細胞的基因工程改良中，可以用于驅動目的基因 在纖維細胞中特異表達，具有重要的應用價值。
[0069] 上述實施例表明，本發(fā)明克隆的PLTP啟動子核苷酸長度為2467bp，當該啟動子與 報告基因融合后，在煙早中能指導報告基因在表皮毛中表達；在陸地棉中能指導報告基因 在纖維細胞中表達。
[0070] 以上對本發(fā)明的詳細描述并不限制本發(fā)明，本領域的技術人員可以根據(jù)本發(fā)明 做出各種變形和改變，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應屬于本發(fā)明所附權利要求所定義的 范圍。
【權利要求】
1. 表皮毛和棉花纖維特異啟動子PLTP，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所 /_J、i 〇
2. 含有權利要求1所述啟動子PLTP的表達載體。
3. 如權利要求2所述的表達載體，其特征在于：所述的表達載體為植物表達載體。
4. 含有權利要求2或3所述載體的宿主。
5. 如權利要求4所述的宿主，其特征在于：所述的宿主為根癌農桿菌。
6. 權利要求1所述的啟動子PLTP在獲得轉基因植物中的應用。
7. 權利要求1所述的啟動子PLTP在獲得轉基因棉花或者轉基因煙草中的應用。
8. 權利要求2或3所述的表達載體在獲得轉基因棉花或者轉基因煙草中的應用。
9. 權利要求1所述啟動子PLTP在改善棉花纖維品質中的應用。
10. 含有權利要求1所述啟動子PLTP的轉基因植物的制備方法，包括下述步驟： (1) 將表皮毛和棉花纖維特異的啟動子可操作地插入表達載體中，構建植物表達載 體； (2) 用所述植物表達載體轉化宿主，獲得轉化體； (3) 將所述轉化體轉化植物，獲得轉基因植物。
【文檔編號】C12N15/113GK104328125SQ201410682167
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年11月24日 優(yōu)先權日:2014年11月24日
【發(fā)明者】侯磊, 郭永艷, 劉弼, 余艷, 裴炎, 李先碧, 梁愛敏, 宋水清, 肖月華, 羅明, 閻星穎 申請人:西南大學