一種豬源抗菌肽pr-39突變體及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種新型豬源抗菌肽PR-39突變體及其制備方法和應用。本發(fā)明通過生物軟件對豬源抗菌肽PR-39的氨基酸序列進行空間結構分析，將其39個氨基酸中的3處氨基酸進行突變，獲得一種新型豬源抗菌肽PR-39突變體，使其抗菌效力獲得顯著提高。在此基礎上，選用畢赤酵母偏愛密碼子，人工合成新型豬源抗菌肽PR-39突變體基因，克隆于畢赤酵母中表達，獲得新型抗菌肽重組酵母菌株，并將發(fā)酵規(guī)模放大到發(fā)酵罐水平，實現抗菌肽產品的高密度發(fā)酵和高效表達。發(fā)酵液進一步純化后可制成粉劑、液體等抗菌肽制劑用于畜禽疾病的預防和治療。
【專利說明】一種豬源抗菌肽PR-39突變體及其制備方法和應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于功能基因改造【技術領域】，具體涉及一種新型豬源抗菌肽PR-39突變體 及其制備方法和應用。

【背景技術】
[0002] 世界上第一個抗菌肽天蠶素cecropin是瑞典科學家G. Boman等人于1980年從惜 比古天蠶蛹中誘導分離得到的，繼而許多抗菌肽被分離、純化。目前為止，已經有千余種抗 菌肽被分離，它們廣泛分布于哺乳動物、甲殼動物、魚類、昆蟲、兩棲動物、鳥類、植物、細菌 和病毒等生物體內。
[0003] 天然的抗菌肽普遍抑菌活性偏低、抑菌譜窄以及存在溶血毒性等技術難題，大大 限制了其走向臨床。近年來，隨著人們對抗菌肽研究的深入，科研人員嘗試人工合成抗菌 肽，并在醫(yī)療應用方面取得了一定的成果。利用抗菌肽研制的藥物已進入市場，如：美國馬 蓋寧制藥公司研發(fā)出來的馬蓋寧（magainin)藥物可殺死病毒和腫瘤細胞，作蠶抗菌肽能 抑制乙型肝炎和殺滅腫瘤細胞，在醫(yī)藥上已制成腎肝寧膠囊治療腎炎及肝炎等。
[0004] 豬源抗菌肽PR-39 (GenBank登錄號：NM_214450. 1)由39個氨基酸組成，是 Agerberth B等于1991年首先從豬腸道分離得到的。其富含精氨酸（Arg)和脯氨酸（Pro) 兩種氨基酸殘基，形成一種Pro-Arg-Pro結構，可能與細菌磷脂膜相互作用有關。經圓二色 譜和傅立葉變換紅外色譜分析表明，抗菌肽PR-39在水溶液中并不像其他抗菌肽形成a螺 旋或者P片層構象，而是呈伸展性螺旋構象，這可能與其脯氨酸含量有關?？咕腜R-39 對多種革蘭氏陰性菌、陽性菌均具有抑制作用。但在實際使用過程中，抗菌肽PR-39的效價 不高，導致難以進行實際開發(fā)使用。


【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種豬源抗菌肽PR-39突變體，從而彌補現有技術的不足。
[0006] 本發(fā)明首先提供一種新型豬源抗菌肽PR-39突變體，其編碼蛋白的氨基酸序列為 SEQ ID NO:1 ;
[0007] 編碼上述蛋白的核苷酸片段，其序列為SEQ ID NO:2 ;
[0008] 本發(fā)明的豬源抗菌肽PR-39突變體可用做畜禽飼料添加劑或畜禽疾病的預防和 治療制劑。
[0009] 本發(fā)明還提供一種新型豬源抗菌肽PR-39突變體的重組畢赤酵母的制備方法，其 制備步驟如下：
[0010] 1)根據新型豬源抗菌肽PR-39突變體的氨基酸序列，選用畢赤酵母偏好密碼子， 合成抗菌肽基因序列，連入重組酵母表達載體中，構建成表達重組質粒；
[0011] 2)將構建的表達重組質粒電轉化宿主酵母菌，構建能表達豬源抗菌肽PR-39突變 體的重組基因工程酵母菌；用該重組基因工程菌高密度發(fā)酵表達出豬源抗菌肽PR-39突變 體；
[0012] 3)對重組表達的豬源抗菌肽PR-39突變體進一步濃縮、純化后，測定效價。稀釋分 裝，即為抗菌肽制劑。
[0013] 本發(fā)明在對豬源抗菌肽PR-39的氨基酸序列進行空間結構分析的基礎上，將豬源 抗菌肽PR-39的39個氨基酸中的3處氨基酸進行突變（K9UH29G和K34F)，獲得一種新型 豬源抗菌肽PR-39突變體，使其抗菌效力獲得顯著提高，從而使豬源抗菌肽PR-39具有廣闊 的市場前景和開發(fā)價值。

【具體實施方式】
[0014] 本發(fā)明是通過堿基替換的方法對豬源抗菌肽PR-39 (GenBank登錄號： NM_214450. 1)進行改造，獲得一種新型豬源抗菌肽PR-39突變體，大大提高了其抑菌，特別 是對革蘭氏陽性菌的抑菌活性，極具市場開發(fā)價值
[0015] 下面結合【具體實施方式】來進一步描述本發(fā)明，但本領域技術人員應該理解的是， 在不偏離本發(fā)明的技術方案的情況下可以對本發(fā)明的技術方案的細節(jié)和形式進行修改或 替換，這些修改和替換均落入本發(fā)明保護范圍內。
[0016] 實施例1新型豬源抗菌肽PR-39突變體及其基因的獲得
[0017] 1、豬源抗菌肽PR-39 (GenBank登錄號：NM_214450. 1)是由39個氨基酸組成的抗 菌肽。為了進一步提高其抑菌活性，通過對豬源抗菌肽PR-39的氨基酸序列進行空間結構 分析，最后完成豬源抗菌肽PR-39中3處氨基酸突變（K9UH29G和K34F)，獲得一種新型豬 源抗菌肽PR-39突變體，其氨基酸序列為SEQ ID NO: 1。
[0018] 2、根據獲得的新型豬源抗菌肽PR-39突變體的氨基酸序列SEQ ID NO: 1，按照畢赤 酵母基因密碼子偏好性進行重新設計，獲得編碼新型豬源抗菌肽PR-39突變體的核苷酸序 列SEQ ID N0:2。并在其N端引入Kex2酶切位點。兩端引入XhoI和XbaI酶切位點，以便 于克隆入畢赤酵母表達載體中。
[0019] 實施例2基因工程豬源抗菌肽突變體表達載體的構建與工程菌的獲得
[0020] 1、將含抗菌肽基因的載體和酵母表達載體均用XhoI和XbaI雙酶切，酶切產物回 收并連接，進行PCR鑒定、測序。
[0021] 2、陽性質粒經SacI單酶切線性化后加入畢赤酵母感受態(tài)細胞懸液中。電轉化后 均勻涂布于含100 y g/mL Zeocin的YPDS選擇平板上，30°C孵育3-5天。待YPDS平板上的 陽性轉化子生長較大，將各轉化子依次點種至含Zeocin 200 ii g/mL、500ii g/mL、1000 ii g/ mL的YPDS選擇平板，以在高濃度Zeocin平板上正常生長的菌落為可能高拷貝重組菌株。
[0022] 3、將篩選到的陽性重組菌單菌落接種于含100 ii g/mL Zeocin的YTO培養(yǎng)液中， 28°C振搖培養(yǎng)18個小時。取此菌液按4%體積比轉接于5ml BMGY培養(yǎng)基中，28°C搖振培養(yǎng) 18-24h左右，0D600值約為5-6。培養(yǎng)物直接轉接于25ml BMMY培養(yǎng)基中，28°C繼續(xù)搖振培 養(yǎng)。為了維持誘導表達，每隔24h補加100%甲醇使終濃度達1%。48h后，4°C 5000r/min 離心lOmin，收集上清，進行抑菌活性測定。能產生抑菌活性的重組酵母菌株即為能產生新 型豬源抗菌肽PR-39突變體的陽性菌株。
[0023] 實施例3發(fā)酵、純化新型豬源抗菌肽PR-39突變體的制備
[0024] 1、發(fā)酵工藝
[0025] 1)將篩選得到的陽性重組子活化后按1% -10%接種量接種于三角瓶，28-30°C， 200r/min搖床培養(yǎng)16-24h后以5 % -20 %接種量接入IOL發(fā)酵罐（實裝培養(yǎng)基6L)，溫度 28-30°C，轉速 500-1500r/min，培養(yǎng)基 pH 值 5. 0-6. 0,通氣量 0? 1-1. 0VVM(1L 發(fā)酵液 Imin 通入的氧氣量），溶氧>20%情況下進行發(fā)酵，在培養(yǎng)18-24h后流加50%甘油4h，待溶氧突 然升至100%時流加甲醇至發(fā)酵結束，整個發(fā)酵持續(xù)48-72h。
[0026] 2)發(fā)酵結束后原罐蒸汽100°C滅菌10_20min，放料，5000r/min離心IOmin,收集發(fā) 酵上清即為抗菌肽半成品。
[0027] 3)新型抗菌肽制劑
[0028] 抗菌肽半成品經微濾、超濾、噴霧干燥、凍干等生產的粉劑和以生化方法精制、純 化后得到液體制劑。
[0029] 上述基因工程抗菌肽可做成畜禽飼料添加劑或畜禽疾病的預防和治療制劑。
[0030] 實施例4新型豬源抗菌肽突變體的最小抑菌濃度測定（MIC)
[0031] 1、試驗菌株
[0032] 金黃色葡萄球菌（Cowan I)、豬金黃色葡萄球菌腸毒素75-1、大腸桿菌K12D31、豬 大腸桿菌078、豬大腸桿菌0157-H71和豬副傷寒沙門氏菌C782
[0033] 2、菌株處理：將菌種復蘇，在固體LB培養(yǎng)基中劃線，在培養(yǎng)箱中37°C過夜培養(yǎng)。將 過夜培養(yǎng)的細菌挑單菌落于含有25ml液體MHB培養(yǎng)基的三角瓶中，將三角瓶放于搖床37°C 培養(yǎng)12-18h。將培養(yǎng)后的菌液在0D600的條件下測其吸光度值，用MHB培養(yǎng)基調節(jié)菌液濃 度，使其處于〇. 6-0. 8之間。之后將菌液稀釋成濃度為5 X 105CFU/mL，依次取90 ill加入到 96孔板的各孔內。
[0034] 3、抗菌肽定量后用MHB培養(yǎng)基依次做倍比稀釋。將稀釋好的抗菌肽各取10 iU依 次加入到96孔板的各個孔中，此時每個孔的反應體系為IOOii 1。96孔板蓋蓋后，37°C振 蕩培養(yǎng)24h后，觀察并用酶標儀在600nm處測量并記錄實驗結果?？咕臉悠方涍^二倍稀 釋后，成一系列濃度，以抑制細菌生長的最小濃度來定義最小抑菌濃度（MIC)。利用菌液和 MHB培養(yǎng)基分別用來做陰性和陽性對照，各自代表抑菌率為0和100%。同時設立豬源抗菌 肽PR-39標準品試驗組作為對照，用于觀察抗菌肽改造前后的抑菌活性變化。
[0035] 4、用微量稀釋法測定重組新型豬源抗菌肽突變體對多種細菌的最低抑菌濃度，結 果表明其對革蘭氏陽性菌和陰性菌均有顯著的抑制效果，特別是改造的新型豬源抗菌肽 PR-39突變體與豬源抗菌肽PR-39標準品相比，在增加了抗菌肽對革蘭氏陰性菌的抑菌能 力的同時，也大大提高了對革蘭氏陽性菌的抑菌活性。
[0036] 表1 :抗菌肽對多種細菌的最低抑菌濃度
[0037]

【權利要求】
1. 一種豬源抗菌肽PR-39,其特征在于，所述的豬源抗菌肽PR-39的氨基酸序列為SEQ ID N0:1。
2. -種核苷酸片段，其特征在于，所述的核苷酸片段用于編碼權利要求1所述的豬源 抗菌肽PR-39。
3. 如權利要求2所述的核苷酸片段，其特征在于，所述的核苷酸片段的序列為SEQ ID N0:2。
4. 權利要求1所述的豬源抗菌肽PR-39在制備畜禽飼料添加劑或免疫增強劑中的應 用。
【文檔編號】C12N15/12GK104356222SQ201410669038
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月20日 優(yōu)先權日:2014年11月20日
【發(fā)明者】王宏華 申請人:青島宏昊生物科技有限公司