一種發(fā)酵生產(chǎn)l-亮氨酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種發(fā)酵生產(chǎn)L-亮氨酸的方法，包括以下步驟：在搖瓶中裝入LB培養(yǎng)基，接入斜面菌種，然后將搖瓶置于搖床上培養(yǎng)28h，得到種子液，備用；然后將種子液接入有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進行發(fā)酵培養(yǎng)；發(fā)酵過程中，通過控制攪拌轉(zhuǎn)速和風(fēng)量，使發(fā)酵過程的前20h溶解氧為6-8mg/L，20h之后溶解氧為3-6mg/L；通過自動流加氨水控制發(fā)酵過程的pH，在菌體OD值達到25之前控制pH為6.4-6.7，菌體OD值增長到25后，pH每小時提高0.1，直至提高到7.2后保持不變；發(fā)酵結(jié)束后提取和精制L-亮氨酸。本發(fā)明的方法使發(fā)酵周期縮短，發(fā)酵產(chǎn)量提高，工藝簡單易控制，成本較低，非常適合大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用。
【專利說明】一種發(fā)酵生產(chǎn)L-亮氨酸的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于氨基酸生產(chǎn)【技術(shù)領(lǐng)域】，主要涉及一種發(fā)酵生產(chǎn)L-亮氨酸的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]L-亮氨酸，又稱白氨酸，1819年P(guān)roust首先從奶酪中分離得到，后來Braconnot從肌肉與羊毛的酸水解物中得到結(jié)晶，并定名為亮氨酸。L-亮氨酸是常見十八種氨基酸中的一種，也是人體必需氨基酸之一，亮氨酸可作為營養(yǎng)增補劑、調(diào)味增香劑。可配制氨基酸輸液及綜合氨基酸制劑，降血糖劑，植物生長促進劑。L-亮氨酸的生產(chǎn)方法主要有提取法、化學(xué)合成法、酶催化法、微生物發(fā)酵法等。我國大部分廠家采用蛋白質(zhì)水解法生產(chǎn)L-亮氨酸，但水解法生產(chǎn)L-亮氨酸費時、污染嚴(yán)重、收率低、產(chǎn)品質(zhì)量得不到保證，大規(guī)模生產(chǎn)受到限制。化學(xué)合成法得到的亮氨酸是消旋的DL-亮氨酸，為了得到L-亮氨酸，必須進行光學(xué)異構(gòu)體的拆分，因此化學(xué)合成法很少用于L-亮氨酸的生產(chǎn)。酶法生產(chǎn)L-亮氨酸中所用到的酶需通過微生物發(fā)酵生成并提取精制，工藝過程比較復(fù)雜，且成本較高，因此目前尚未得到廣泛的應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種發(fā)酵生產(chǎn)L-亮氨酸的方法，通過對發(fā)酵過程殘?zhí)菨舛瓤刂?、溫度控制、PH與溶解氧分段控制及培養(yǎng)基的基本組成進行調(diào)整，使發(fā)酵周期縮短，發(fā)酵產(chǎn)量提高，工藝簡單易控制，成本較低，非常適合大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用。
[0004]本發(fā)明實現(xiàn)上述目的采用的技術(shù)方案是:一種發(fā)酵生產(chǎn)L-亮氨酸的方法，包括以下步驟:
在搖瓶中裝入LB培養(yǎng)基，接入斜面菌種，然后將搖瓶置于搖床上在攪拌速度為IlOr/min，溫度為31°C條件下，培養(yǎng)28h，得到種子液，備用；然后按照10%接種量將種子液接入有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，并在溫度為31-32°C條件下進行發(fā)酵培養(yǎng)；
發(fā)酵過程中，通過控制攪拌轉(zhuǎn)速和風(fēng)量，使發(fā)酵過程的前20h溶解氧為6-8mg/L，20h之后溶解氧為3-6mg/L ;通過自動流加氨水控制發(fā)酵過程的pH，在菌體OD值達到25之前控制PH為6.4-6.7，菌體OD值增長到25后，pH每小時提高0.1，直至提高到7.2后保持不變；所述菌體OD值為測定樣品稀釋20倍后測定的0D’值與稀釋倍數(shù)的乘積；發(fā)酵結(jié)束后提取和精制L-亮氨酸。
[0005]所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中包括以下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的含碳化合物和含氮化合物:無水葡萄糖0_3%、玉米漿3-6%、硫酸銨1-1.5%、醋酸銨0.7-1.0%、磷酸二氫鉀0.05-0.1%、硫酸鎂0.2-0.3%、蛋氨酸0.04%、異亮氨酸0.006%和谷氨酸0.07% ；
所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中微量元素和維生素的添加量為VBi 300ug/L、VH50 ug/L、FeSO40.02-0.05mg/L、MnSO4 0.01-0.03mg/L 和 ZnSO4 0.02-0.05mg/L.發(fā)酵過程中控制殘?zhí)堑馁|(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.005-0.05%。
[0006]所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中，外加其重量0.3%的消泡劑。
[0007]本發(fā)明的有益效果
本發(fā)明提供的發(fā)酵生產(chǎn)L-亮氨酸的方法，通過對發(fā)酵過程殘?zhí)菨舛瓤刂?、溫度控制、PH與溶解氧分段控制及培養(yǎng)基的基本組成進行調(diào)整，使發(fā)酵周期縮短，發(fā)酵產(chǎn)量提高，工藝簡單易控制，成本較低，非常適合大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用。尤其重量的是，PH與溶解氧分段控制，目的是為了縮短菌種的發(fā)酵時間、增加產(chǎn)量。通過發(fā)酵過程控制優(yōu)化，菌體生長健壯，在10噸發(fā)酵罐內(nèi)試驗,發(fā)酵周期由原來的50小時縮短至35小時，產(chǎn)酸單位由原來的30g/L增加到38g/L,效果十分顯著。

【具體實施方式】
[0008]一種發(fā)酵生產(chǎn)L-亮氨酸的方法，包括以下步驟:
在搖瓶中裝入LB培養(yǎng)基，接入斜面菌種，然后將搖瓶置于搖床上在攪拌速度為IlOr/min，溫度為31°C條件下，培養(yǎng)28h，得到種子液，備用；然后按照10%接種量將種子液接入有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，10%接種量指種子液的體積為接種后發(fā)酵培養(yǎng)液總體積的10%，并在溫度為31-32°C條件下進行發(fā)酵培養(yǎng)；
發(fā)酵過程中，通過控制攪拌轉(zhuǎn)速和風(fēng)量，使發(fā)酵過程的前20h溶解氧為6-8mg/L，20h之后溶解氧為3-6mg/L ;通過自動流加氨水控制發(fā)酵過程的pH，在菌體OD值達到25之前控制pH為6.4-6.7，菌體OD值增長到25后，pH每小時提高0.1，直至提高到7.2后保持不變；發(fā)酵結(jié)束后提取和精制L-亮氨酸。
[0009]所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中包括以下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的含碳化合物和含氮化合物:無水葡萄糖0_3%、玉米漿3-6%、硫酸銨1-1.5%、醋酸銨0.7-1.0%、磷酸二氫鉀0.05-0.1%、硫酸鎂0.2-0.3%、蛋氨酸0.04%、異亮氨酸0.006%和谷氨酸0.07% ；
所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中微量元素和維生素的添加量為VBi 300ug/L、VH50 ug/L、FeSO40.02-0.05mg/L、MnSO4 0.01-0.03mg/L和 ZnSO4 0.02-0.05mg/L。
[0010]所述發(fā)酵培養(yǎng)基中除上述成分外，余量為水，并在配置完成后外加0.3%的消泡劑。
[0011]發(fā)酵過程中控制殘?zhí)堑馁|(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.005-0.05%。
[0012]以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明:
實施例1:
一種發(fā)酵生產(chǎn)L-亮氨酸的方法，包括以下步驟:
在2L搖瓶中裝入LB培養(yǎng)基600ml，接入斜面菌種(菌種選用黃色短桿菌TL0412 (Met—+2-TAr+- a -ABr+ β -HLr+SGr+Rifr,天津科技大學(xué)代謝控制發(fā)酵實驗室保藏菌株)，然后將搖瓶置于搖床上在攪拌速度為llOr/min，溫度為31°C條件下，培養(yǎng)28h，得到種子液，備用；然后按照10%接種量將種子液接入有發(fā)酵培養(yǎng)基的1L發(fā)酵罐中，并在溫度為31°C條件下進行發(fā)酵培養(yǎng)；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中包括以下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的含碳化合物和含氮化合物:無水葡萄糖2%、玉米漿6%、硫酸銨1.5%、醋酸銨1.0%、磷酸二氫鉀0.1%、硫酸鎂0.2%、蛋氨酸0.04%、異亮氨酸0.006%和谷氨酸0.07% ;發(fā)酵培養(yǎng)基中微量元素和維生素的添加量為VBi300ug/L、VH50 ug/L,FeSO4 0.02mg/L,MnSO4 0.0lmg/L和 ZnSO4 0.05mg/L，外加的消泡劑的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.3%。
[0013]發(fā)酵過程中，初始通風(fēng)量為72m3/h，然后通過控制攪拌轉(zhuǎn)速和風(fēng)量，使發(fā)酵過程的前20h溶解氧為6-8mg/L，20h之后溶解氧為3_6mg/L ;通過自動流加氨水控制發(fā)酵過程的pH,在菌體OD值達到25之前控制pH為6.5，菌體OD值增長到25后，pH每小時提高0.1，直至提高到7.2后保持不變；且發(fā)酵過程中控制殘?zhí)堑馁|(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.005-0.05%,發(fā)酵12小時后，每4個小時取一次樣進行測定，發(fā)酵結(jié)束后提取和精制L-亮氨酸。
[0014]按照本實施例的方法進行L-亮氨酸的生產(chǎn)，發(fā)酵時間33小時，L-亮氨酸產(chǎn)量為41g/L。
[0015]實施例2:
一種發(fā)酵生產(chǎn)L-亮氨酸的方法，包括以下步驟:
在2L搖瓶中裝入LB培養(yǎng)基600ml，接入斜面菌種，然后將搖瓶置于搖床上在攪拌速度為llOr/min，溫度為31°C條件下，培養(yǎng)28h，得到種子液，備用；然后按照10%接種量將種子液接入有發(fā)酵培養(yǎng)基的1L發(fā)酵罐中，并在溫度為32°C條件下進行發(fā)酵培養(yǎng)；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中包括以下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的含碳化合物和含氮化合物:無水葡萄糖2%、玉米漿6%、硫酸銨1.5%、醋酸銨1.0%、磷酸二氫鉀-0.1%、硫酸鎂0.2%、蛋氨酸0.04%、異亮氨酸0.006%和谷氨酸0.07%;發(fā)酵培養(yǎng)基中微量元素和維生素的添加量為VBi 300ug/L、VH50 ug/L、FeSO4 0.05mg/L, MnSO4 0.03mg/L 和 ZnSO4 0.05mg/L，外加的消泡劑的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為 0.3%。
[0016]發(fā)酵過程中，初始通風(fēng)量為72m3/h，然后通過控制攪拌轉(zhuǎn)速和風(fēng)量，使發(fā)酵過程的前20h溶解氧為6-8mg/L，20h之后溶解氧為3_6mg/L ;通過自動流加氨水控制發(fā)酵過程的pH,在菌體OD值達到25之前控制pH為6.7，菌體OD值增長到25后，pH每小時提高0.1，直至提高到7.2后保持不變；且發(fā)酵過程中控制殘?zhí)堑馁|(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.005-0.05%，發(fā)酵12小時后，每4個小時取一次樣進行測定，發(fā)酵結(jié)束后提取和精制L-亮氨酸。
[0017]按照本實施例的方法進行L-亮氨酸的生產(chǎn)，發(fā)酵時間35小時，L-亮氨酸產(chǎn)量為38g/L。
[0018]對比試驗例
按照10%接種量將種子液600ml接入有5.4L發(fā)酵培養(yǎng)基的1L發(fā)酵罐中；通風(fēng)量為
1.2L/min ;攪拌轉(zhuǎn)速500_700r/min ;通過自動流加氨水控制PH在7.0 ;培養(yǎng)溫度28°C ;美國進口陶氏103消泡劑按照0.3%的比例加入；發(fā)酵12小時后，每4個小時取一次樣進行測定。發(fā)酵培養(yǎng)基中包括以下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的含碳化合物和含氮化合物:無水葡萄糖13%，玉米漿3.7%，硫酸銨2%，醋酸銨1.5%，磷酸二氫鉀0.1%，硫酸鎂0.04%,蛋氨酸0.07%,異亮氨酸0.006%，谷氨酸0.042% ;發(fā)酵培養(yǎng)基中微量元素和維生素的添加量為VB1 300ug/L、VH50ug/L。
[0019]該實驗例進行L-亮氨酸生產(chǎn)的發(fā)酵時間為55小時，L-亮氨酸產(chǎn)量為29.7g/L。
[0020]將對比實驗例的發(fā)酵時間和產(chǎn)量與實施例1和2對比可知，本發(fā)明提供的發(fā)酵生產(chǎn)L-亮氨酸的方法能夠使發(fā)酵周期由原來的50小時縮短至35小時，產(chǎn)酸單位由原來的30g/L增加到38g/L，效果十分顯著。
【權(quán)利要求】
1.一種發(fā)酵生產(chǎn)L-亮氨酸的方法，其特征在于:包括以下步驟: 在搖瓶中裝入LB培養(yǎng)基，接入斜面菌種，然后將搖瓶置于搖床上在攪拌速度為110r/min，溫度為31°C條件下，培養(yǎng)28h，得到種子液，備用；然后按照10%接種量將種子液接入有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，并在溫度為31-32°C條件下進行發(fā)酵培養(yǎng)； 發(fā)酵過程中，通過控制攪拌轉(zhuǎn)速和風(fēng)量，使發(fā)酵過程的前20h溶解氧為6-8mg/L，20h之后溶解氧為3-6mg/L ;通過自動流加氨水控制發(fā)酵過程的pH，在菌體0D值達到25之前控制pH為6.4-6.7，菌體0D值增長到25后，pH每小時提高0.1，直至提高到7.2后保持不變；發(fā)酵結(jié)束后提取和精制L-亮氨酸，即完成L-亮氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)。
2.如權(quán)利要求1所述的一種發(fā)酵生產(chǎn)L-亮氨酸的方法，其特征在于:所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中包括以下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的含碳化合物和含氮化合物:無水葡萄糖0-3%、玉米漿3-6%、硫酸銨1-1.5%、醋酸銨0.7-1.0%、磷酸二氫鉀0.05-0.1%、硫酸鎂0.2-0.3%、蛋氨酸0.04%、異亮氨酸0.006%和谷氨酸0.07%ο
3.如權(quán)利要求1或2所述的一種發(fā)酵生產(chǎn)L-亮氨酸的方法，其特征在于:所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中微量元素和維生素的添加量為VBi 300ug/L、VH50 ug/L、FeS04 0.02-0.05mg/L、MnS04 0.01-0.03mg/L 和 ZnS04 0.02-0.05mg/L。
4.如權(quán)利要求1所述的一種發(fā)酵生產(chǎn)L-亮氨酸的方法，其特征在于:發(fā)酵過程中控制殘?zhí)堑馁|(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.005-0.05%。
5.如權(quán)利要求1所述的一種發(fā)酵生產(chǎn)L-亮氨酸的方法，其特征在于:所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中，外加其重量0.3%的消泡劑。
【文檔編號】C12R1/13GK104404095SQ201410666558
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年11月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月20日
【發(fā)明者】劉帥, 李靜, 宋朋睿 申請人:河南巨龍生物工程股份有限公司