一種提高冬蟲夏草多糖產(chǎn)量的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提高冬蟲夏草多糖產(chǎn)量的方法，屬于生物工程領(lǐng)域。本發(fā)明利用的是一株從西藏冬蟲夏草子實體中分離獲得的中國被毛孢（CJMCC No.9046），利用糖蜜（含糖量50%）、高F值寡肽、山藥提取物作為培養(yǎng)基，通過流加山藥提取物和間歇攪拌等微生物技術(shù)手段，將菌體逐級擴(kuò)大培養(yǎng)，過濾烘干后得到菌絲體粉，經(jīng)檢測冬蟲夏草多糖含量可達(dá)13-14%，遠(yuǎn)高于野生冬蟲夏草。本發(fā)明培養(yǎng)基營養(yǎng)成分經(jīng)濟(jì)合理，培養(yǎng)方法對設(shè)備無特殊要求，且減少了動力消耗降低了生產(chǎn)成本，能夠很好的提高冬蟲夏草多糖的產(chǎn)量，為該菌株進(jìn)一步開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。CGMCC No.904620140529
【專利說明】一種提高冬蟲夏草多糖產(chǎn)量的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種提高冬蟲夏草多糖產(chǎn)量的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 冬蟲夏草又名中華蟲草，是冬蟲夏草菌寄生于高山草甸中的蝠蛾幼蟲，使幼蟲身 軀僵化，即冬蟲夏草菌的子實體與僵蟲菌核構(gòu)成的復(fù)合體，屬于可食用的真菌。冬蟲夏草是 我國一種傳統(tǒng)的名貴滋補(bǔ)中藥材，有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能、抗腫瘤、抗疲勞等多重功效。由于 具有獨特的藥用價值，加上野生資源不斷減少、市場價格飆升，冬蟲夏草受到國內(nèi)外各界人 士的關(guān)注也成為近年科學(xué)研宄的熱點。
[0003] 冬蟲夏草中含量最高的活性物質(zhì)是冬蟲夏草多糖，因其可以抗氧化、抗腫瘤和增 強(qiáng)免疫力等功效而受廣大人群青睞。冬蟲夏草多糖是由甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、 巖藻糖等組成的多聚糖。冬蟲夏草多糖有固本培元、扶正祛邪的作用，能調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、 護(hù)腎、延緩衰老、抗疲勞、調(diào)節(jié)脂代謝與糖代謝、抗肝纖維化和抗輻射等多種功能，是值得挖 掘的一大生物寶庫。


【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種提高冬蟲夏草多糖產(chǎn)量的方法。具體說是利用一株從西 藏冬蟲夏草子實體中分離的中國被毛孢（Hisutella sinensis)，利用特制培養(yǎng)基通過特殊 的培養(yǎng)條件，發(fā)酵培養(yǎng)獲得菌絲體。經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草多糖含量高達(dá)13-14%，遠(yuǎn)高于野 生冬蟲夏草。
[0005] 為了達(dá)成上述目的，本發(fā)明可通過如下技術(shù)措施實現(xiàn)：
[0006] -種提高冬蟲夏草多糖產(chǎn)量的方法，采用中國被毛孢菌種M-010,已于2014年5月 29日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，經(jīng)鑒定該菌株為中 國被毛孢（Hisutella sinensis)，保藏編號：CGMCC No. 9046,保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰 西路1號院3號，分類命名：冬蟲夏草Ophiocordyceps sinensis。
[0007] 包括如下步驟：
[0008] (1)菌種斜面培養(yǎng)
[0009] 培養(yǎng)基：馬鈴薯培養(yǎng)基；
[0010] 挑取斜面培養(yǎng)的菌絲體一環(huán)，接種于新鮮斜面培養(yǎng)基，置于15-25?恒溫培養(yǎng)箱靜 置培養(yǎng)5-15天；
[0011] ⑵菌種種子培養(yǎng)
[0012] 種子培養(yǎng)基：糖蜜2-6%、高F值寡肽0. 2-1. 0%、山藥提取物0. 5-1. 0%，其余為 水，pH自然。
[0013] 挑取一環(huán)新鮮斜面生長的菌絲體，于液體種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為15-25°C，培 養(yǎng)轉(zhuǎn)速為100_200rpm，培養(yǎng)周期5-10天；以5-15% (V/V)的接種量接種于二級種子罐，培 養(yǎng)溫度為15_25°C，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為100-200rpm，通氣量為1:0. 1-0. 5,培養(yǎng)周期4-7天；
[0014] (3)菌種發(fā)酵培養(yǎng)
[0015] 發(fā)酵培養(yǎng)基：糖蜜4-10%、高F值寡肽0.5-1. 5%，其余為水，pH自然；
[0016] 補(bǔ)料培養(yǎng)基：山藥提取物1-3%。
[0017] 按5-20% (V/V)接種量接種步驟（2)的種子罐菌液至發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為 100-300rpm，通氣量為1:0. 2-0. 7,于15-25°C條件下培養(yǎng)2天后，間歇攪拌（靜止與攪拌交 替進(jìn)行），分3-10次流加共計0. 1-0. 3% (V/V)的補(bǔ)料培養(yǎng)基，培養(yǎng)周期為7-15天；
[0018] (4)抽濾將步驟（3)發(fā)酵培養(yǎng)所得發(fā)酵液經(jīng)板框過濾棄去濾液，獲得濕菌絲體；
[0019] (5)烘干將步驟（4)獲得的濕菌絲體通過50-70°C烘干粉碎后得菌絲體粉。
[0020] 本發(fā)明的目的還可通過如下技術(shù)措施實現(xiàn)：
[0021] 步驟（3)所述間歇攪拌指每隔2_6h攪拌2_6h，如此循環(huán)；
[0022] 所述冬蟲夏草菌粉中多糖的提取方法為：取冬蟲夏草菌粉，加入菌粉10倍數(shù)量體 積的蒸餾水，沸水浴下反復(fù)浸提并合并濾液，濃縮至原體積的1/5,加入95 %乙醇并低溫沉 淀過夜，離心取沉淀，然后用乙醇和丙酮分別洗滌，干燥后得粗多糖。
[0023] 所述冬蟲夏草多糖含量采用苯酚硫酸法測定。
[0024] 本發(fā)明的有益效果：
[0025] (1)本發(fā)明特制的液體培養(yǎng)基，營養(yǎng)成分經(jīng)濟(jì)合理，培養(yǎng)方法簡單，對設(shè)備無特殊 要求，一般的發(fā)酵設(shè)備均可滿足生產(chǎn)，為該菌株進(jìn)一步開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。
[0026] (2)通過間歇攪拌工藝，降低了動力消耗，從而降低了生產(chǎn)成本。
[0027] (3)通過本發(fā)明培養(yǎng)方法獲得的冬蟲夏草菌粉，蟲草多糖產(chǎn)量可達(dá)13-14%，較野 生冬蟲夏草中多糖含量提高62. 5-75%。

【具體實施方式】
[0028] 以下實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離 本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明 的范圍。
[0029] 下述實施例培養(yǎng)基成分的百分比均為質(zhì)量百分比，以下不再說明。
[0030] 實施例1中國被毛孢的液體培養(yǎng)
[0031] 1.培養(yǎng)基
[0032] 斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯培養(yǎng)基；
[0033] 種子培養(yǎng)基：糖蜜2.0%、高F值寡肽0.2%、山藥提取物0.5%，其余為水，pH自 鋏.
[0034] 發(fā)酵培養(yǎng)基：糖蜜4.0%、高F值寡肽0.5%，其余為水，pH自然；
[0035] 補(bǔ)料培養(yǎng)基：山藥提取物1. 2%，其余為水。
[0036] 2.培養(yǎng)方法
[0037] 挑取一環(huán)新鮮斜面生長的菌絲體，于液體種子培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速lOOrpm，培 養(yǎng)溫度為15-25°C，培養(yǎng)5天，菌絲體干重達(dá)到發(fā)酵液的0. 3 %。
[0038] 以二級種子液體積5 %的接種量接種上述一級種子于二級種子罐，培養(yǎng)溫度為 15-25°C，轉(zhuǎn)速lOOrpm，通氣量為1 :0. 1，培養(yǎng)周期4天，菌絲體干重達(dá)到發(fā)酵液的0.8%。
[0039] 以發(fā)酵培養(yǎng)基體積5 %的接種量將二級種子接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為 15-25°C，轉(zhuǎn)速lOOrpm，通氣量：1:0. 2,罐壓力維持在：0. 05Mpa，培養(yǎng)2天后，以2小時靜 止、2小時攪拌，依次循環(huán)的間歇攪拌方式，分別在發(fā)酵的第3、4、5天，每次流加發(fā)酵液體積 0. 4%體積的補(bǔ)料培養(yǎng)基，流加速度100mL/h，培養(yǎng)周期為7天，此時發(fā)酵液還原糖含量消耗 至0. 1 %，發(fā)酵結(jié)束后菌絲體干重得率達(dá)到2. 0 %。
[0040] 實施例2中國被毛孢的液體培養(yǎng)
[0041] 1.培養(yǎng)基
[0042] 斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯培養(yǎng)基；
[0043] 種子培養(yǎng)基：糖蜜6.0%、高F值寡肽1.0%、山藥提取物1%，其余為水，pH自然；
[0044] 發(fā)酵培養(yǎng)基：糖蜜10 %、高F值寡肽1. 5 %，其余為水，pH自然；
[0045] 補(bǔ)料培養(yǎng)基：山藥提取物3. 0%，其余為水。
[0046] 2.培養(yǎng)方法
[0047] 挑取一環(huán)新鮮斜面生長的菌絲體，于液體種子培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速200rpm，培 養(yǎng)溫度為15_25°C，培養(yǎng)10天，菌絲體干重達(dá)到發(fā)酵液的0. 25%。
[0048] 以二級種子液體積15 %的接種量接種上述一級種子于二級種子罐，培養(yǎng)溫度為 15-25°C，轉(zhuǎn)速200rpm，通氣量為1:0. 5,培養(yǎng)周期7天，菌絲體干重達(dá)到發(fā)酵液的0. 7%。
[0049] 以發(fā)酵培養(yǎng)基體積20 %的接種量將二級種子接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為 15-25°C，轉(zhuǎn)速300rpm，通氣量：1:0. 7,罐壓力維持在：0. 05Mpa，培養(yǎng)2天后，間歇攪拌（4小 時靜止，4小時攪拌，依次循環(huán)），分別在發(fā)酵的第4、5、6、7、8、9、10、11、12、13天，每次流加 發(fā)酵液體積〇. 3 %體積的補(bǔ)料培養(yǎng)基，流加速度80mL/h，培養(yǎng)周期為15天，此時發(fā)酵液還原 糖含量消耗至〇. 18%，發(fā)酵結(jié)束后菌絲體干重得率達(dá)到1. 8%。
[0050] 實施例3中國被毛孢的液體培養(yǎng)
[0051] 1.培養(yǎng)基
[0052] 斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯培養(yǎng)基；
[0053] 種子培養(yǎng)基：糖蜜4.0%、高F值寡肽0.6%、山藥提取物0.7%，其余為水，pH自 鋏.
[0054] 發(fā)酵培養(yǎng)基：糖蜜7 %、高F值寡肽I. 0 %，其余為水，pH自然；
[0055] 補(bǔ)料培養(yǎng)基：山藥提取物2. 1 %，其余為水。
[0056] 2.培養(yǎng)方法
[0057] 挑取一環(huán)新鮮斜面生長的菌絲體，于液體種子培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為 20°C，培養(yǎng)7天，菌絲體干重達(dá)到發(fā)酵液的0. 4%。
[0058] 以二級種子液體積10 %的接種量接種上述一級種子于二級種子罐，培養(yǎng)溫度為 15-25°C，轉(zhuǎn)速150rpm，通氣量為1 :0. 3,培養(yǎng)周期5天，菌絲體干重達(dá)到發(fā)酵液的0. 8%。
[0059] 以發(fā)酵培養(yǎng)基體積15 %的接種量將二級種子接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為 15-25°C，轉(zhuǎn)速200rpm，通氣量：1:0. 5,罐壓力維持在：0. 05Mpa，培養(yǎng)2天后，以6小時靜止、 6小時攪拌，依次循環(huán)的間歇攪拌方式，分別在發(fā)酵的第4、5、6、7、8、9、10天，每次流加發(fā)酵 液體積0. 3%體積的補(bǔ)料培養(yǎng)基，流加速度120mL/h，培養(yǎng)周期為11天，此時發(fā)酵液還原糖 含量消耗至〇. 15%，發(fā)酵結(jié)束后菌絲體干重得率達(dá)到1.9%。
[0060] 實施例4中國被毛孢的液體培養(yǎng)
[0061] 1.培養(yǎng)基
[0062] 斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯培養(yǎng)基；
[0063] 種子培養(yǎng)基：糖蜜3.0%、高F值寡肽0.4%、山藥提取物0.6%，其余為水，pH自 鋏.
[0064] 發(fā)酵培養(yǎng)基：糖蜜5%、高F值寡肽0. 8%，其余為水，pH自然；
[0065] 補(bǔ)料培養(yǎng)基：山藥提取物1. 6%，其余為水。
[0066] 2.培養(yǎng)方法
[0067] 挑取一環(huán)新鮮斜面生長的菌絲體，于液體種子培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為 15-25°C，培養(yǎng)6天，菌絲體干重達(dá)到發(fā)酵液的0. 45 %。
[0068] 以二級種子液體積8 %的接種量接種上述一級種子于二級種子罐，培養(yǎng)溫度為 15-25°C，轉(zhuǎn)速130rpm，通氣量為1 :0. 2,培養(yǎng)周期5天，菌絲體干重達(dá)到發(fā)酵液的0. 9%。
[0069] 以發(fā)酵培養(yǎng)基體積10 %的接種量將二級種子接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為 15-25°C，轉(zhuǎn)速150rpm，通氣量：1:0. 4,罐壓力維持在：0. 05Mpa，培養(yǎng)2天后，以6小時靜止、 6小時攪拌，依次循環(huán)的間歇攪拌方式，分別在發(fā)酵的第4、5、6、7天，每次流加發(fā)酵液體積 0. 4%體積的補(bǔ)料培養(yǎng)基，流加速度150mL/h，培養(yǎng)周期為9天，此時發(fā)酵液還原糖含量消耗 至0. 14%，發(fā)酵結(jié)束后菌絲體干重得率達(dá)到2.0%。
[0070] 實施例5中國被毛孢的液體培養(yǎng)
[0071] 1.培養(yǎng)基
[0072] 斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯培養(yǎng)基；
[0073] 種子培養(yǎng)基：糖蜜5.0%、高F值寡肽0.8%、山藥提取物0.8%，其余為水，pH自 鋏.
[0074] 發(fā)酵培養(yǎng)基：糖蜜9%、高F值寡肽1.2%，其余為水，pH自然；
[0075] 補(bǔ)料培養(yǎng)基：山藥提取物2. 7%，其余為水。
[0076] 2.培養(yǎng)方法
[0077] 挑取一環(huán)新鮮斜面生長的菌絲體，于液體種子培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為 15-25°C，培養(yǎng)6天，菌絲體干重達(dá)到發(fā)酵液的0. 42 %。
[0078] 以二級種子液體積12 %的接種量接種上述一級種子于二級種子罐，培養(yǎng)溫度為 15-25°C，轉(zhuǎn)速180rpm，通氣量為1 :0. 4,培養(yǎng)周期6天，菌絲體干重達(dá)到發(fā)酵液的0. 85%。
[0079] 以發(fā)酵培養(yǎng)基體積18 %的接種量將二級種子接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為 15-25°C，轉(zhuǎn)速260rpm，通氣量：1:0. 6,罐壓力維持在：0. 05Mpa，培養(yǎng)2天后，以6小時靜止、 6小時攪拌，依次循環(huán)的間歇攪拌方式，分別在發(fā)酵的第3、4、5、6、7、8、9、10、11天，每次流 加發(fā)酵液體積〇. 3 %體積的補(bǔ)料培養(yǎng)基，流加速度100mL/h，培養(yǎng)周期為12天，此時發(fā)酵液 還原糖含量消耗至〇. 13%，發(fā)酵結(jié)束后菌絲體干重得率達(dá)到2. 1%。
[0080] 實施例6冬蟲夏草多糖含量的測定
[0081] 分別對發(fā)酵菌絲體粉和野生冬蟲夏草的蟲草多糖的含量進(jìn)行檢測。
[0082] 取IOg上述實施例待測樣，加 10倍體積的蒸餾水，沸水浴下浸提3h，反復(fù)浸提3次 并將濾液合并，濃縮至原體積的1/5,加入95 %乙醇至4倍體積并低溫沉淀過夜，離心取沉 淀，然后用乙醇和丙酮各洗滌2次，干燥，得粗多糖。
[0083] 精確稱取干燥至恒重的蟲草多糖各50mg，置于IOOmL容量瓶中，加蒸餾水定容至 刻度，搖勾。取樣品液I. OmL，蒸餾水補(bǔ)充至2. OmL，加入50g/L的苯酷I. OmL，濃硫酸5. OmL， 迅速振蕩搖勻，于室溫下顯色20min，測定OD488，平行測定3次.并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方 程，計算出液體培養(yǎng)的菌絲體粉的冬蟲夏草多糖含量為13. 6%，野生冬蟲夏草中冬蟲夏草 多糖的含量為7. 8%，菌絲體粉比野生冬蟲夏草中冬蟲夏草多糖含量提高了 74. 4%。
[0084] 實施例7其他營養(yǎng)成分的測定
[0085] 分別對發(fā)酵菌絲體粉和野生冬蟲夏草的其他營養(yǎng)成分的含量進(jìn)行檢測。
[0086] L蟲草酸測定
[0087] 采用液相色譜法進(jìn)行蟲草酸的測定，色譜柱為Inertsil 0DS-3 (4. 6mmX 250mm， 5μπι)，柱溫30°C。檢測器為示差折光檢測器。流動相為乙腈：水= 80:20,梯度洗脫，流速 0. 8mL/min〇
[0088] 測定液體培養(yǎng)的菌絲體粉的蟲草酸的含量為8. 2%，野生冬蟲夏草中蟲草酸的含 量為7. 5 %，菌絲體粉比野生冬蟲夏草中蟲草酸含量提高了 9. 3 %。
[0089] 2.蟲草素測定
[0090] 采用液相色譜法進(jìn)行蟲草素的測定，色譜柱為Inertsil ODS-3 (4. 6mmX 250mm， 5μπι)，柱溫30°C。檢測器為二極管陣列紫外檢測器，檢測波長260nm。流動相乙腈：水= 80:20，流速 0. 8mT,/min。
[0091] 液體培養(yǎng)的菌絲體粉中蟲草素的含量為0. 60%，野生冬蟲夏草中蟲草素的含量為 0. 48 %，菌絲體粉比野生冬蟲夏草中蟲草素含量提高了 25. 0 %。
[0092] 此外，對該菌絲體粉的其他各項營養(yǎng)成分與野生冬蟲夏草進(jìn)行了比對，總結(jié)如下 表。
[0093]

【權(quán)利要求】
1. 一種提高冬蟲夏草多糖產(chǎn)量的方法，其特征在于，采用中國被毛孢菌種M-010,已于 2014年5月29日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號：CGMCC No. 9046,按如下步驟進(jìn)行： (1) 固體斜面培養(yǎng)斜面培養(yǎng)基選用馬鈴薯培養(yǎng)基；接種中國被毛孢菌種M-010于馬 鈴薯培養(yǎng)基斜面，在15_25°C條件下培養(yǎng)5-15天； (2) 種子培養(yǎng)接種步驟（1)菌絲至一級搖瓶種子培養(yǎng)基中，以100-200rpm轉(zhuǎn)速培 養(yǎng)5-10天，然后按5-15% (V/V)的接種量接種搖瓶種子液至二級種子罐培養(yǎng)，通氣量： 1:0. 1-0. 5,培養(yǎng)4-7天；所述種子培養(yǎng)溫度為15-25°C ; 種子培養(yǎng)基：糖蜜2-6%、高F值寡肽0. 2-1. 0%、山藥提取物0. 5-1. 0%，其余為水，pH自 鋏. (3) 發(fā)酵培養(yǎng)按5-20% (V/V)接種量接種步驟（2)的種子罐菌液至發(fā)酵培養(yǎng)基中，培 養(yǎng)轉(zhuǎn)速為100-300rpm，通氣量為1:0. 2-0. 7,于15-25°C條件下培養(yǎng)2天后，采用在間歇攪拌 下分3-10次流加共計0. 1-0. 3% (V/V)的補(bǔ)料培養(yǎng)基，培養(yǎng)周期為7-15天； 發(fā)酵培養(yǎng)基：糖蜜4-10%、高F值寡肽0. 5-1. 5%，其余為水，pH自然； 補(bǔ)料培養(yǎng)基：山藥提取物1-3% ; (4) 抽濾將步驟（3)發(fā)酵培養(yǎng)所得發(fā)酵液經(jīng)板框過濾棄去濾液，獲得濕菌絲體； (5) 烘干將步驟（4)獲得的濕菌絲體通過50-70°C烘干粉碎后得菌絲體粉。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種提高冬蟲夏草多糖產(chǎn)量的方法，其特征在于，步驟（3)所述 間歇攪拌指每隔2-6h攪拌2-6h，如此循環(huán)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種提高冬蟲夏草多糖產(chǎn)量的方法，其特征在于，所述冬蟲夏 草菌粉中多糖的提取方法為：取冬蟲夏草菌粉，加入菌粉10倍數(shù)量體積的蒸餾水，沸水浴 下反復(fù)浸提并合并濾液，濃縮至原體積的1/5,加入95%乙醇并低溫沉淀過夜，離心取沉淀， 然后用乙醇和丙酮分別洗滌，干燥后得粗多糖。
【文檔編號】C12P19/04GK104480158SQ201410664857
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年11月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月19日
【發(fā)明者】高艷華, 任明, 袁博 申請人:濟(jì)南國力生物科技有限公司