一種產(chǎn)膽鹽水解酶副干酪乳桿菌大棗益生菌片的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種產(chǎn)膽鹽水解酶并具有降低血清膽固醇功效的大棗益生菌片的制備方法，適用于功能性益生乳酸菌活菌制劑等微生態(tài)制劑的生產(chǎn)。本發(fā)明大棗益生菌片的配方是由副干酪乳桿菌KL1-Liu益生菌菌粉與大棗粉、低聚果糖、木糖醇、蔗糖、檸檬酸、微晶纖維素、麥芽糊精等輔料組成；本發(fā)明利用產(chǎn)膽鹽水解酶的副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)KL1-Liu CGMCC No.7029，經(jīng)活化、擴大培養(yǎng)、高密度發(fā)酵、離心濃縮、加入凍干保護劑、預凍和冷凍干燥等工序制備益生菌菌粉；將經(jīng)過粉碎、過篩的輔料與益生菌菌粉混合后，壓制成大棗益生菌片。本發(fā)明制作的大棗益生菌片具有良好的貯藏穩(wěn)定性，4℃冷藏活菌保質(zhì)期至少1年以上，即可發(fā)揮產(chǎn)品降低血清膽固醇的保健功效，又可發(fā)揮大棗藥食同源的營養(yǎng)與保健功效。本發(fā)明制作的大棗益生菌片原料來源方便，工藝簡單，制作周期短，操作簡單，適于工業(yè)化生產(chǎn)。
CGMCC No.7029
20121225
【專利說明】一種產(chǎn)膽鹽水解酶副干酪乳桿菌大棗益生菌片的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種產(chǎn)膽鹽水解酶并具有降低血清膽固醇功效的大棗益生菌片的制 備方法，適用于功能性益生乳酸菌活菌制劑（片劑型、粉劑型）等微生態(tài)制劑的生產(chǎn)。

【背景技術(shù)】
[0002] 本發(fā)明涉及的副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei)KLl_Liu是從藏靈葫中 分離篩選得到的一種產(chǎn)膽鹽水解酶并具有降低血清膽固醇作用及調(diào)節(jié)腸道菌群平衡等功 效的益生乳酸菌。
[0003] 益生菌（Probiotics)是指一類通過腸道定殖作用改善宿主特定部位微生態(tài)平衡 并兼有若干其他有益生理功能的微生物。它們通過改善腸道微生物生態(tài)平衡，控制腸道感 染，降低血清膽固醇水平，提高乳糖不耐癥人對乳糖的利用，并能刺激特異性或非特異性免 疫反應，具有免疫增強的作用。益生菌制品的活菌應該代謝穩(wěn)定，活性較強，通過消化道后 大量存活，進入腸道后發(fā)揮益生菌作用。目前用于生產(chǎn)益生菌類產(chǎn)品的優(yōu)良菌種有雙歧桿 菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬中的乳酸乳球菌乳酸亞種等。
[0004] 大棗作為藥食同源應用已有2000多年的歷史，它具有補虛益氣，養(yǎng)血安神，健脾 和胃等功效，主要用于中氣不足、脾胃虛弱、體倦乏力、食少便溏、血虛萎黃等病癥的治療。 近年來藥理研宄發(fā)現(xiàn)，大棗中含有多種生物活性物質(zhì)，如大棗多糖、黃酮類、皂苷類、三萜 類、生物堿類、環(huán)磷酸腺苷（cAMP)、環(huán)磷酸鳥苷（cGMP)、三楂酸、維生素C、維生素P、B族維 生素等，對人體有多種保健防病功效。大棗中含有的多糖可作為免疫促進劑，具有控制細胞 分裂和分化、調(diào)節(jié)細胞的生長與衰老，以及具有清除人體內(nèi)氧自由基的作用；大棗中含有的 皂苷類、三萜類化合物具有抗腫瘤的生物活性；其含有的山楂酸亦具有抗癌作用；大棗中 含有的cAMP具有改善人體微循環(huán)，擴張冠狀動脈，增加腦和心臟的供血量，減慢心律，降低 心肌耗氧量而改善缺血心肌的代謝，故可防治心腦血管疾病；此外，cAMP還可調(diào)節(jié)細胞的 分裂增殖，有利于腫瘤細胞向正常細胞方向轉(zhuǎn)化，故有抗癌作用；大棗中富含的維生素C具 有對抗自由基的侵襲，抗氧化、抗衰老等作用；維生素P對健全毛細血管、維持血管壁彈性， 抗動脈粥樣硬化很有益；大棗中含有的B族維生素能保護心臟、減輕疲勞、增強心肌活力、 降低血壓；大棗中的黃酮類化合物具有鎮(zhèn)靜、催眠和降壓作用。
[0005] 本發(fā)明所用副干酪乳桿菌KLl-Liu是利用選擇培養(yǎng)技術(shù)從藏靈菇中篩選得到高 產(chǎn)膽鹽水解酶和胞外多糖的副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei)KLl_Liu。研宄發(fā) 現(xiàn)，該菌株具有較強耐受胃腸道逆環(huán)境（胃酸和膽鹽）能力，可以定殖于腸道內(nèi)發(fā)揮益生作 用；動物實驗研宄顯示，該菌株產(chǎn)生的膽鹽水解酶能夠顯著降低或調(diào)節(jié)血清膽固醇水平，其 產(chǎn)生的胞外多糖具有顯著抑制人結(jié)腸癌細胞的增殖作用；動物實驗研宄顯示，該菌株還具 有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、預防便秘、抗脂質(zhì)過氧化及護肝等功能。課題組系統(tǒng)研宄揭示了該菌 株降低血清膽固醇的機理是緣于副干酪乳桿菌KLl-Liu代謝產(chǎn)生大量高活力的膽鹽水解 酶（Bile Salt Hydrolase，BSH)。BSH是腸道中的雙歧桿菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬中的多 種乳酸細菌在生長過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。大量實驗證明，膽鹽水解酶能在肝腸循環(huán)中將 結(jié)合膽鹽分解，產(chǎn)生氨基酸與溶解度較低的游離膽鹽。后者能與膽固醇結(jié)合形成沉淀復合 物而排出體外，從而降低血清總膽固醇的含量。同時測定該菌株全長基因組序列，為副干酪 乳桿菌KLl-Liu菌株應用奠定理論基礎(chǔ)。
[0006] 益生菌對于人體的保健功效早已被世界所公認，益生菌產(chǎn)品已經(jīng)成為保健食品的 首選。該產(chǎn)品既具有豐富的營養(yǎng)價值，又具有特殊的生理功能，集營養(yǎng)與保健于一身。益生 菌片產(chǎn)品是干燥制品的典型形式之一，具有可直接咀嚼或吞服、食用攜帶方便、溶出和吸收 速度較快等特點。
[0007] 近年來隨著現(xiàn)代科技水平和食品加工技術(shù)的發(fā)展，國內(nèi)外相繼出現(xiàn)了一些關(guān)于 益生菌類產(chǎn)品的報道，例如陜西科技大學申請的"一種益生菌片的制備方法"，專利申請?zhí)?為：CN101843337 A ;陜西農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研宄院申請的"一種益生菌羊奶片及其制備方 法"，專利申請?zhí)枮椋篊N102742659 A ;王世義申請的"復合活性益生菌奶片"，專利申請?zhí)枮椋?CN102450331A。劉秀河等人研制的益生菌AB奶片的原始活菌數(shù)能達到10 9CFU/g ;周海軍和 樊兆武研制的益生菌奶片初始活菌數(shù)均只有l(wèi)〇6CFU/g左右。雖然上述專利和文獻有關(guān)于 利用益生菌制備片劑型食品的報道，但是關(guān)于利用分離篩選自藏靈菇中的產(chǎn)膽鹽水解酶并 具有降低血清膽固醇作用的副干酪乳桿菌KLl-Liu，以及利用大棗與益生菌相結(jié)合制備大 棗益生菌片的方法尚未見國內(nèi)外相關(guān)文獻報道和專利報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種利用產(chǎn)膽鹽水解酶并具有降低血清膽固醇功效的副干 酪乳桿菌KLl-Liu制備大棗益生菌片的方法。
[0009] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0010] 本發(fā)明的大棗益生菌片配方組成（W/W，質(zhì)量分數(shù)）：副干酪乳桿菌KLl-Liu益生 菌菌粉0? 1%?1.0% [活菌數(shù)為（1.0?5.0)X10nCFU/g]，大棗粉40%?50%，低聚果 糖10%?20%，木糖醇4%?10 %，蔗糖0? 25%?5%，檸檬酸0? 25%?3%，硬脂酸鎂 0? 5%?5. 5%，微晶纖維素10%?20%，麥芽糊精25%?30%。
[0011] 所述方法中，畐[J干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei)KLl-Liu分離篩選自吉 林、呼和浩特市普通家庭的藏靈菇（又稱開菲爾粒），并已于2012年12月25日保藏于中國 微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏號為：CGMCCNo. 7029 (菌株KLl-Liu)。 在含有碳酸鈣和納他霉素的MRS選擇性培養(yǎng)基上，副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei) KLl-Liu菌株的菌落大小2?3mm，菌落有較高黏性，表面粗糙如雪花狀，邊緣 不規(guī)則，無光澤，扁平，灰白色，半透明；個體形態(tài)呈桿狀，長短不等，短鏈狀排列，G+無芽孢 桿菌。
[0012] 所述方法中，副干酪乳桿菌KLl-Liu益生菌菌粉為副干酪乳桿菌KLl-Liu活菌體 與復合凍干保護劑的混合物。
[0013] 所述方法中，副干酪乳桿菌KLl-Liu益生菌菌粉的制備步驟如下：
[0014] (1)采用立式高速冷凍離心機將經(jīng)過擴大培養(yǎng)與高密度發(fā)酵的副干酪乳桿菌 KLl-Liu發(fā)酵液于4°C條件下，6000r/min離心10?20min，棄上清液，收集得到菌泥。
[0015] (2)在滅菌凍干瓶中，按離心前發(fā)酵液1/10體積的量，加入10. 5%?20. 5%麥芽 糊精+11. 5%?1. 5%脫脂奶粉，與收集的菌泥混合均勻后，得到濃縮發(fā)酵劑。
[0016] 上述方法中，凍干保護劑組合配方為（W/V，質(zhì)量體積比濃度）：10. 5%?20. 5%麥 芽糊精+11. 5%?1. 5%脫脂奶粉（伊利牌高蛋白高鈣脫脂奶粉）。
[0017] (3)將濃縮發(fā)酵劑于_40°C預凍10h至完全凍結(jié)狀態(tài)，得到預凍發(fā)酵劑；利用美國 6L LABC0NC0真空冷凍干燥機將預凍發(fā)酵劑于-55°C、真空度0. 14mBar的條件下，凍干48h 至完全干燥狀態(tài)，得到副干酪乳桿菌KLl-Liu益生菌菌粉。
[0018] 所述方法中，副干酪乳桿菌KLl-Liu大棗益生菌片的制備步驟如下：
[0019] (1)采用鼓風干燥箱將大棗于70°C烘干72h后自然晾干、去核備用。
[0020] 上述方法中，大棗由甘肅新遠泰生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司提供。
[0021] (2)采用中藥粉碎機分別將去核大棗、木糖醇、蔗糖、檸檬酸等輔料進行破碎，過 80目篩子備用。
[0022] 上述方法中，80目篩子由鴻圩篩網(wǎng)有限公司提供沖藥粉碎機由江南歐川電機廠 提供，型號為Hc-280。
[0023] (3)采用三維多向運動混合機將大棗益生菌片配方中的各成分，在轉(zhuǎn)速為10? 20r/min，電機功率為0. 5KW條件下混合均勻，制成大棗益生菌片粗粉。
[0024] 上述方法中，三維多向運動混合機由上海天凡制藥機械廠提供，型號為HD20。
[0025] (4)采用單沖式壓片機將大棗益生菌片粗粉在最大壓力為18KN，壓片直徑為15? 20mm，每片重lg，硬度4?8N條件下，壓制成產(chǎn)膽鹽水解酶副干酪乳桿菌KLl-Liu大棗益生 菌片。
[0026] 上述方法中，單沖式壓片機由上海天凡制藥機械廠提供，型號為DP50。
[0027] 所述方法中，大棗益生菌片中的主要菌種為藏靈菇源副干酪乳桿菌KLl-Liu益生 菌。該菌粉具有良好的降低血清膽固醇功效，并有整腸作用，可在腸道內(nèi)建立一個有利于健 康長壽的微生態(tài)平衡系統(tǒng)，促進消化吸收，并有改善便秘作用，可以預防消費者的心血管疾 病、胃腸道疾病等病癥。
[0028] 上述得到的一種產(chǎn)膽鹽水解酶并具有降低血清膽固醇功效的副干酪乳桿菌 KLl-Liu制備大棗益生菌片的方法及其產(chǎn)品，以及專用生產(chǎn)菌株屬于本發(fā)明保護范圍。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0029] 產(chǎn)膽鹽水解酶副干酪乳桿菌大棗益生菌片制備工藝流程圖說明如下：
[0030] (1)副干酪乳桿菌KLl-Liu菌株益生菌：分離篩選自吉林、呼和浩特市普通家庭的 藏靈菇。⑵菌株活化、擴大培養(yǎng)與高密度發(fā)酵：將活化好的副干酪乳桿菌KLl-Liu菌株經(jīng) 改良MRS培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)與高密度發(fā)酵，得到較高活菌數(shù)的發(fā)酵液。（3)離心濃縮與添加 保護劑：將KLl-Liu菌株發(fā)酵液于4°C條件下，6000r/min離心10?20min，棄上清液，收集 得到菌泥；在滅菌凍干瓶中，按離心前發(fā)酵液1/10體積的量，加入10. 5%?20. 5%麥芽糊 精+11.5%?1.5%脫脂奶粉，與收集的菌泥混合均勻后，得到濃縮發(fā)酵劑。（4)預凍與真 空冷凍干燥：將濃縮發(fā)酵劑于_40°C預凍10h至完全凍結(jié)狀態(tài)，得到預凍發(fā)酵劑；利用美國 6LLABC0NC0真空冷凍干燥機將預凍發(fā)酵劑于-55°C、真空度0. 14mBar的條件下，凍干48h 至完全干燥狀態(tài)，得到副干酪乳桿菌KLl-Liu益生菌菌粉。（5)添加輔料：大棗粉40%? 50%，低聚果糖10%?20%，木糖醇4%?10%，蔗糖0? 25%?5%，檸檬酸0? 25%?3%， 硬脂酸鎂0.5%?5. 5%，微晶纖維素10%?20%，麥芽糊精25%?30%。（6)大棗干燥 與去核：采用鼓風干燥箱將大棗于70°C烘干72h后自然晾干、去核備用。（7)輔料破碎與過 篩：采用中藥粉碎機分別將去核大棗、蔗糖、檸檬酸、木糖醇等輔料進行破碎，并采用80目 的篩子過篩。（8)大棗益生菌片粗粉的制備：采用三維多向運動混合機將益生菌菌粉與輔 料混合均勾制成大賽益生菌片的粗粉，混合使用轉(zhuǎn)速為10?20r/min。（9)大賽益生菌片 的制備：壓片采用單沖式壓片機的最大壓力為18KN，壓片直徑為15?20mm，每片重lg，硬 度4?8N。（10)大棗益生菌片包裝與貯藏：將大棗益生菌片分裝于密封袋或塑料瓶中，壓 膜封口或壓蓋封口后，于4°C冰箱貯藏，產(chǎn)品活菌保質(zhì)期為一年。
[0031] 本發(fā)明制作的大棗益生菌片原料來源方便，工藝簡單，制作周期短，操作簡單，對 設(shè)備要求較低，成品大棗益生菌片活菌數(shù)量明顯高于同類產(chǎn)品，適于工業(yè)化生產(chǎn)。

【具體實施方式】
[0032] 下述實施例對本發(fā)明作進一步說明而不限制本發(fā)明的保護范圍。
[0033] 下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
[0034] 下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量體積比濃度（W/V)。
[0035] 實施例1、產(chǎn)膽鹽水解酶副干酪乳桿菌KLl-Liu大棗益生菌片的制備方法
[0036] (1)副干酪乳桿菌KLl-Liu菌株的活化、擴大培養(yǎng)與高密度發(fā)酵
[0037] 將活化好的副干酪乳桿菌KLl-Liu菌株經(jīng)改良MRS培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)與高密度發(fā) 酵，得到活菌數(shù)為（1. 0?5. 0) X 101(lCFU/mL的發(fā)酵液。
[0038] (2)副干酪乳桿菌KLl-Liu菌株的離心濃縮與冷凍干燥
[0039] 將發(fā)酵液于4°C條件下，6000r/min離心10?20min，棄上清液，收集得到菌泥；在 滅菌凍干瓶中，按離心前發(fā)酵液1/10體積的量，加入10. 5%?20. 5%麥芽糊精+11. 5%? 1. 5%脫脂奶粉，與收集的菌泥混合均勻后，得到濃縮發(fā)酵劑；將濃縮發(fā)酵劑于-40°C預凍 l〇h至完全凍結(jié)狀態(tài)，得到預凍發(fā)酵劑；利用美國6LLABCONCO真空冷凍干燥機將預凍發(fā) 酵劑于_55°C、真空度0. 14mBar的條件下，凍干48h至完全干燥狀態(tài)，得到副干酪乳桿菌 KLl-Liu益生菌菌粉。
[0040] (3)益生菌菌粉中副干酪乳桿菌KLl-Liu活菌數(shù)量的檢測
[0041] 稱取25g益生菌菌粉放入含有225mL滅菌生理鹽水中，采用拍擊式勻質(zhì)器以8 000?10 000r/min的速度處理lmin，充分振蕩后，制成KT1的均勻稀釋液；再以9mL滅菌 生理鹽水做10倍遞增稀釋至l〇_ n;取10 _9?10 _n的稀釋液各lmL置于無菌平皿中，倒入溶 化并冷卻至46°C的改良MRS培養(yǎng)基約15mL，迅速輕輕旋動平皿，使培養(yǎng)基與菌液充分混勻， 每個稀釋度3次重復。同時將改良MRS培養(yǎng)基注入加有l(wèi)mL無菌生理鹽水的滅菌平皿內(nèi)作 空白對照。待培養(yǎng)基凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置（36±1)°C溫箱中培養(yǎng)（48±2)h，待菌落長出后 即可計數(shù)。其平板菌落計數(shù)結(jié)果顯示，每lg益生菌菌粉中副干酪乳桿菌KLl-Liu的活菌數(shù) 量為（1. 0 ?5. 0) X10nCFU。
[0042] (4)大棗干燥與去核：采用鼓風干燥箱將大棗于70°C烘干72h后自然晾干、去核備 用。
[0043] (5)輔料破碎與過篩
[0044] 采用中藥粉碎機分別將去核大棗、木糖醇、蔗糖、檸檬酸等輔料進行破碎，過80目 篩子備用。目的是使益生菌菌粉與輔料更易混合均勻，壓片時顆粒均勻容易成型。
[0045] (6)大棗益生菌片粗粉的制備
[0046] 將大棗粉40%?50%，低聚果糖10%?20%，木糖醇4%?10%，蔗糖0. 25%? 5%，檸檬酸0. 25%?3%，硬脂酸鎂0. 5%?5. 5%，微晶纖維素10%?20%，麥芽糊精 25%?30%等輔料與添加量為0. 1%?1. 0%的副干酪乳桿菌KLl-Liu益生菌菌粉[活菌 數(shù)為（1. 0?5. 0) X 10nCFU/g]，采用轉(zhuǎn)速為10?20r/min，電機功率為0. 5KW的三維多向 運動混合機充分混合均勻，制成大棗益生菌片粗粉。
[0047] (6)大棗益生菌片的制備
[0048] 采用單沖式壓片機將混合均勻的大棗益生菌片粗粉壓制成大棗益生菌片，單沖式 壓片機最大壓片壓力為18KN，壓片直徑為15?20mm，每片重lg，硬度4?8N。
[0049] (7)大棗益生菌片的感官評價
[0050] 評定小組由專業(yè)評價人員構(gòu)成（即由受過專業(yè)感官評價培訓的人員組成），共有 15人，采用描述性的檢測方法分別對樣品的質(zhì)地、口感、風味、外觀、色澤、進行細致的描述， 評分標準被分為三檔：好、中、差三個檔次，以感官評價的結(jié)果作為大棗益生菌片配方正交 試驗的評定標準。大棗益生菌片的感官評定標準及評價指標見表1。
[0051] 表1副干酪乳桿菌大棗益生菌片的感官評定標準

【權(quán)利要求】
1. 副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei)KL l_Liu CGMCC No. 7029。
2. 一種利用產(chǎn)膽鹽水解酶副干酷乳桿菌（Lactobacillus paracasei)KLl_Liu CGMCC No. 7029菌株制備大棗益生菌片的方法，其特征在于：（1)大棗益生菌片配方組成：包括副 干酪乳桿菌KLl-Liu益生菌菌粉0. 1%?1.0%，大棗粉40%?50%，低聚果糖10%? 20%，木糖醇4%?10%，蔗糖0? 25%?5%，檸檬酸0? 25%?3%，硬脂酸鎂0? 5%? 5. 5%，微晶纖維素10%?20%，麥芽糊精25%?30%; (2)KLl-Liu益生菌菌粉的制備：將 經(jīng)過擴大培養(yǎng)與高密度發(fā)酵的副干酪乳桿菌KLl-Liu發(fā)酵液于4°C條件下，6000r/min離心 10?20min，棄上清液，收集得到菌泥；在滅菌凍干瓶中，按離心前發(fā)酵液1/10體積的量， 加入10. 5%?20. 5%麥芽糊精+11. 5%?1. 5%脫脂奶粉，與收集的菌泥混合均勻后，得到 濃縮發(fā)酵劑；將濃縮發(fā)酵劑于_40°C預凍10h至完全凍結(jié)狀態(tài)，得到預凍發(fā)酵劑；利用美國 6LLABC0NC0真空冷凍干燥機將預凍發(fā)酵劑于-55°C、真空度0. 14mBar的條件下，凍干48h 至完全干燥狀態(tài)，得到副干酪乳桿菌KLl-Liu益生菌菌粉；（3)大棗益生菌片的制備：采用 鼓風干燥箱將大棗于70°C烘干72h后自然晾干、去核備用；采用中藥粉碎機分別將去核大 棗、木糖醇、蔗糖、檸檬酸等輔料進行破碎，過80目篩子備用；采用三維多向運動混合機將 大賽益生菌片配方中的各成分，在轉(zhuǎn)速為10?20r/min，電機功率為0. 5KW條件下混合均 勻，制成大棗益生菌片粗粉；采用單沖式壓片機將大棗益生菌片粗粉在最大壓力為18KN， 壓片直徑為15?20mm，每片重lg，硬度4?8N條件下，壓制成產(chǎn)膽鹽水解酶副干酪乳桿菌 KLl-Liu大棗益生菌片。
【文檔編號】A23L1/29GK104450562SQ201410640032
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月14日
【發(fā)明者】劉慧 , 張紅星, 熊利霞, 張晶, 金君華, 高秀芝, 謝遠紅 申請人:北京農(nóng)學院