一種生物酶法從牡丹皮中提取丹皮多糖的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于多糖提取【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種生物酶法從牡丹皮中提取丹皮多糖的方法。一種生物酶法從牡丹皮中提取丹皮多糖的方法，包括下述的步驟：（1）原料預(yù)處理；（2）酶解；（3）非水溶性多糖轉(zhuǎn)化；（4）離心分離；（5）可溶性多糖提取。采用酶作用條件溫和，采用各種不同的酶將牡丹皮中的脂肪、纖維素酶解，將其中的多糖提取出來，提高了牡丹皮的利用率，采用本發(fā)明的方法得到丹皮多糖不僅得率高，而且純度也高。
【專利說明】一種生物酶法從牡丹皮中提取丹皮多糖的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于多糖提取【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種生物酶法從牡丹皮中提取丹皮多糖的方法。
[0002]

【背景技術(shù)】
牡丹皮為毛莨科植物牡丹的根皮，載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有清熱涼血，活血化瘀的功效，用于治療溫毒發(fā)斑，癰腫瘡瘍，經(jīng)閉痛經(jīng)，跌撲損傷等癥，據(jù)《中藥大辭典》等文獻報道，牡丹皮中有效成分有丹皮原甙、牡丹酚、芍藥甙，羥基芍藥甙、苯甲酰芍藥甙、揮發(fā)油以及苯甲酸、植物留醇、蔗糖、葡萄糖、阿拉伯糖等。植物多糖在提高人體免疫力、降血糖、抗輻射等方面均有作用，有關(guān)優(yōu)選超聲波提取牡丹皮多糖條件工藝鮮見，同樣，將微波用于提取牡丹皮多糖的報道也鮮見，結(jié)合酶法與微波法提取丹皮多糖的報道尚未出現(xiàn)。
[0003]CN103045372B披露了牡丹餅柏的綜合利用方法，該方法中包括下述的步驟a.牡丹餅柏用粉碎機粉碎至40目，裝萃取釜，所述的牡丹皮是牡丹籽仁初榨后剩下的殘留柏渣；
b.用食品級C02，其純度為99.99%，流量為12L/小時，設(shè)定萃取壓力為20MPa、溫度為25°C，分離條件是:分離器I壓力lOKPa、溫度50°C，分離器II壓力4KPa、溫度
40°C，萃取時間0.5小時；
c.提取完畢，收集萃取物，得到牡丹籽油；
d.取步驟C中剩下的殘渣脫水處理至其水分含量為20%，得牡丹餅柏；
步驟d中得到的牡丹柏提取多糖，將粉碎的牡丹皮置入多功能提取罐中，加入原料10倍量的水，在提取罐夾套內(nèi)通入飽和水蒸汽，蒸汽壓力為2 — 2.5kg，開啟電機攪拌，待沸騰后，將蒸汽壓力降到1.5 — 2kg，保持沸騰狀態(tài)，并關(guān)閉攪拌電機，進行常壓蒸餾；
收集餾出液，將溜出液通過管道流入粗結(jié)晶罐中，開啟電機攪拌冷卻，粗結(jié)晶罐夾套中的循環(huán)鹽水溫度為-2—-5°C，直至餾出液中無白色渾濁液出現(xiàn)為止，此時收集的餾出
液重量約為餅柏量的5-10倍；即可得到粗多糖，粗品經(jīng)糖含量、蛋白含量測定后，力口水重新
溶解，加0.5倍體積的酒精搖勻，靜置片刻后，6000r/min離心15min，除去蛋白雜質(zhì)；上清液中再加入酒精，至乙醇體積分數(shù)約60%，搖勻后靜置，待沉淀后，小心將上清液倒出，沉淀中加入適量90%酒精和無水乙醇2次脫水，過濾后沉淀再用無水乙醇洗2次，
攤于平皿上，50°C烘干，得到多糖精品。
[0004]上述的方法主要是以牡丹皮為原料，進一步超臨界二氧化碳萃取，提取牡丹籽油，然后再對殘渣脫水處理，以得到的牡丹皮為原料提取多糖，其提取方法為熱水浸提。
[0005]本申請將微波法與復(fù)合酶法相結(jié)合，提取丹皮多糖。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種得率和純度較高的生物酶法從牡丹皮中提取丹皮多糖的方法。
[0007]本發(fā)明生物酶法從牡丹皮中提取丹皮多糖的方法是通過下述的技術(shù)方案來實現(xiàn)的:
一種生物酶法從牡丹皮中提取丹皮多糖的方法，包括下述的步驟:
(1)原料預(yù)處理
牡丹皮經(jīng)烘干至其水分含量為2-4%，再粉碎至80-200目；
(2)酶解
將粉碎后的牡丹皮，加水混勻，牡丹皮與水的重量比例為1:6-12，并加入脂肪酶，脂肪酶的添加量0.3-0.5%，酶解溫度45°C，調(diào)pH 5.5，將上述的原料置于微波提取設(shè)備中提取，微波的功率為400-600W，頻率為800MHZ，酶解0.1-0.5h ；
再加入纖維素酶，纖維素酶的添加量為0.4-0.6%、酶解溫度40°C、pH值5，將上述的原料置于微波提取設(shè)備中提取，微波的功率為400-600W，頻率為800MHZ，酶解0.1-0.5h ；
再加入堿性蛋白酶，堿性蛋白酶的添加量為0.4-1.0%，酶解溫度為45°C，pH值8.2，將上述的原料置于微波提取設(shè)備中提取，微波的功率為400-600W，頻率為800MHZ，酶解0.1-0.5h ；
再加入無花果蛋白酶，無花果蛋白酶的添加量為0.1-0.7%，酶解溫度為50°C，pH值7.0，將上述的原料置于微波提取設(shè)備中提取，微波的功率為500W，頻率為800MHZ，酶解0.2h，酶解后在100°C下滅酶8min ；
再加入無花果蛋白酶，無花果蛋白酶的添加量為0.5%，酶解溫度為50°C，pH值7.0，將上述的原料置于微波提取設(shè)備中提取，微波的功率為500W，頻率為800MHZ，酶解0.2h，酶解后在10CTC下滅酶8min ；
(3)非水溶性多糖轉(zhuǎn)化
淀粉酶的添加量為1.0-1.2%、酶解溫度40°C、pH值5，酶解1.5-2.0h后，100_105°C滅酶 5-10min ；
(4)離心分離
將酶解后的牡丹皮，離心10-20 min，離心轉(zhuǎn)速為4500 rpm，將上清液與沉淀分別收集;
(5)可溶性多糖的提取
取步驟(5)中的上清液過濾去渣，過濾后得到的濾液在60-70°C下濃縮，濃縮至其濃度為60-70%，濃縮液按I:4比例加入95%乙醇沉淀靜置10-20小時、離心10-20 min，離心轉(zhuǎn)速為4500 rpm,收集沉淀并用乙醇反復(fù)清洗2_3次，冷凍干燥至水分含量為4_6%后，再在-1-4°C下進行粉碎，得可溶性多糖；
上述的加酶量均為酶占超微粉碎后的牡丹皮的重量百分比。
[0008]優(yōu)選的，脂肪酶的用量為0.4%。
[0009]優(yōu)選的，纖維素酶的用量是0.5%。
[0010]優(yōu)選的，淀粉酶的添加量為1.0%。
[0011]優(yōu)選的，一種生物酶法從牡丹皮中提取丹皮多糖的方法，包括下述的步驟:
(I)原料預(yù)處理牡丹皮經(jīng)烘干至其水分含量為3%，再粉碎至100目；
(2)酶解
將粉碎后的牡丹皮，加水混勻，牡丹皮與水的重量比例為1:8，并加入脂肪酶，脂肪酶的添加量0.4%，酶解溫度45°C，調(diào)pH 5.5，將上述的原料置于微波提取設(shè)備中提取，微波的功率為500W，頻率為800MHZ，酶解0.2h ；
再加入纖維素酶，纖維素酶的添加量為0.5%、酶解溫度40°C、pH值5，將上述的原料置于微波提取設(shè)備中提取，微波的功率為500W，頻率為800MHZ，酶解0.2h ；
再加入酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶，酸性蛋白酶的添加量為0.8%，木瓜蛋白酶的添加量為0.5%，酶解溫度為45°C，pH值5.0，將上述的原料置于微波提取設(shè)備中提取，微波的功率為500W,頻率為800MHZ,酶解0.2h ；
再加入無花果蛋白酶，無花果蛋白酶的添加量為0.4%，酶解溫度為50°C，pH值7.0，將上述的原料置于微波提取設(shè)備中提取，微波的功率為500W，頻率為800MHZ，酶解0.2h，酶解后在10CTC下滅酶8min ；
(3)非水溶性多糖轉(zhuǎn)化
淀粉酶的添加量為I %、酶解溫度40°C、pH值5，酶解1.8h后，100°C滅酶6min ；
(4)離心分離
將酶解后的牡丹皮，離心15 min，離心轉(zhuǎn)速為4500 rpm，將上清液與沉淀分別收集；
(5)可溶性多糖的提取
取步驟(5)中的上清液過濾去渣，過濾后得到的濾液在65°C下濃縮，濃縮至其濃度為65%，濃縮液按1:4比例加入95%乙醇沉淀靜置15小時、離心15 min，離心轉(zhuǎn)速為4500rpm,收集沉淀并用乙醇反復(fù)清洗2-3次，冷凍干燥至水分含量為5%后，再在_1_4°C下進行粉碎，得可溶性多糖；
上述的加酶量均為酶占超微粉碎后的牡丹皮的重量百分比。
[0012]酶解脂肪、纖維順序也是本發(fā)明的創(chuàng)新之處，由于將脂肪酶解以后，油脂不會包裹在牡丹皮外，從而有利于各種成分與酶相接觸，從而提高酶解的效率；因此，先酶解脂肪再酶解纖維素有利于脂肪和纖維的去除；
普通方法中對脂肪的處理方法一般是采用加有機溶劑的方式，有機溶劑雖然對油脂的去除也較為徹底，但是其作用的條件較強烈，而且后續(xù)的回收過程也較復(fù)雜，另外還容易造成有機溶劑危害環(huán)境的問題；另外采用有機溶劑去除油脂其成本也較高；
本發(fā)明采用酶作用于殘留在牡丹皮中的油脂上，作用條件溫和，而且對油脂的去除也較為徹底，并且不存在后續(xù)的有機溶劑回收及帶來環(huán)境污染的問題；
再加入纖維素酶將牡丹皮中的纖維素降解生成溶于水的葡萄糖；
將非可溶性的多糖酶解為可溶性多糖之后，糖類溶于水中，再取上清液，過濾，濃縮，醇沉，將其中的多糖提取出來。
[0013]本發(fā)明的酶的種類及用量的選擇及酶解順序的選擇并不是偶然的，而是發(fā)明人付出了創(chuàng)造性的勞動得到了，酶及各種比例的調(diào)整均會影響最終多糖的提取效果，只有采用本發(fā)明所給的酶及酶的相應(yīng)比例對牡丹皮進行處理，而且按照本發(fā)明的順序進行，才能得到本發(fā)明的結(jié)果，將酶進行替換或者是加酶順序替換，均得不到最大的多糖提取率。
[0014]因此，本發(fā)明中采用冷凍粉碎的方法對提取得到的多糖，保持了多糖的質(zhì)量不受影響。
[0015]本發(fā)明的有益效果在于，采用酶作用條件溫和，采用各種不同的酶將牡丹皮中的脂肪、纖維素酶解，同時從牡丹皮中提取多糖，最大限度的利用牡丹皮，而且采用本發(fā)明的方法得到的多糖，其得率和純度高。

【具體實施方式】
[0016]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作更進一步的說明，以便本領(lǐng)域的技術(shù)人員更了解本發(fā)明，但并不因此限制本發(fā)明。
[0017]以下的檢測方法，如無特殊說明，采用苯酚-硫酸法測多糖的含量。
[0018]實施例1
一種生物酶法從牡丹皮中提取丹皮多糖的方法，包括下述的步驟:
(1)原料預(yù)處理
牡丹皮經(jīng)烘干至其水分含量為3%，再粉碎至100目；
(2)酶解
將粉碎后的牡丹皮，加水混勻，牡丹皮與水的重量比例為1:8，并加入脂肪酶，脂肪酶的添加量0.4%，酶解溫度45°C，調(diào)pH 5.5，將上述的原料置于微波提取設(shè)備中提取，微波的功率為500W，頻率為800MHZ，酶解0.2h ；
再加入纖維素酶，纖維素酶的添加量為0.5%、酶解溫度40°C、pH值5，將上述的原料置于微波提取設(shè)備中提取，微波的功率為500W，頻率為800MHZ，酶解0.2h ；
再加入堿性蛋白酶，堿性蛋白酶的添加量為0.8%，酶解溫度為45°C，pH值8.2，將上述的原料置于微波提取設(shè)備中提取，微波的功率為500W，頻率為800MHZ，酶解0.3h ；
再加入無花果蛋白酶，無花果蛋白酶的添加量為0.4%，酶解溫度為50°C，pH值7.0，將上述的原料置于微波提取設(shè)備中提取，微波的功率為500W，頻率為800MHZ，酶解0.2h，酶解后在10CTC下滅酶8min ；
(3)非水溶性多糖轉(zhuǎn)化
淀粉酶的添加量為I %、酶解溫度40°C、pH值5，酶解1.8h后，100°C滅酶6min ；
(4)離心分離
將酶解后的牡丹皮，離心15 min，離心轉(zhuǎn)速為4500 rpm，將上清液與沉淀分別收集；
(5)可溶性多糖的提取
取步驟(4)中的上清液過濾去渣，過濾后得到的濾液在65°C下濃縮，濃縮至其濃度為65%，濃縮液按1:4比例加入95%乙醇沉淀靜置15小時、離心15 min，離心轉(zhuǎn)速為4500rpm,收集沉淀并用乙醇反復(fù)清洗2-3次，冷凍干燥至水分含量為5%后，再在_1_4°C下進行粉碎，得可溶性多糖；
上述的加酶量均為酶占超微粉碎后的牡丹皮的重量百分比。
[0019]采用苯酚-硫酸法測得所得的多糖中糖的含量為94.5% ；
多糖的提取率為:9.57%。
[0020]實施例2
一種生物酶法從牡丹皮中提取丹皮多糖的方法，包括下述的步驟:
(I)原料預(yù)處理牡丹皮經(jīng)烘干至其水分含量為2%，再粉碎至80目；
(2)酶解
將粉碎后的牡丹皮，加水混勻，牡丹皮與水的重量比例為1:6，并加入脂肪酶，脂肪酶的添加量0.3%，酶解溫度45°C，調(diào)pH 5.5，將上述的原料置于微波提取設(shè)備中提取，微波的功率為400W，頻率為800MHZ，酶解0.1h ；
再加入纖維素酶，纖維素酶的添加量為0.4%、酶解溫度40°C、pH值5，將上述的原料置于微波提取設(shè)備中提取，微波的功率為400W，頻率為800MHZ，酶解0.2h ；
再加入堿性蛋白酶，堿性蛋白酶的添加量為0.4%，酶解溫度為45°C，pH值8.2，將上述的原料置于微波提取設(shè)備中提取，微波的功率為400W，頻率為800MHZ，酶解0.1h ；
再加入無花果蛋白酶，無花果蛋白酶的添加量為0.2%，酶解溫度為50°C，pH值7.0，將上述的原料置于微波提取設(shè)備中提取，微波的功率為500W，頻率為800MHZ，酶解0.2h，酶解后在10CTC下滅酶8min ；
(3)非水溶性多糖轉(zhuǎn)化
淀粉酶的添加量為0.8%、酶解溫度40°C、pH值5，酶解1.8h后，100°C滅酶6min ；
(4)離心分離
將酶解后的牡丹皮，離心15 min，離心轉(zhuǎn)速為4500 rpm，將上清液與沉淀分別收集；
(5)可溶性多糖的提取
取步驟(4)中的上清液過濾去渣，過濾后得到的濾液在65°C下濃縮，濃縮至其濃度為65%，濃縮液按1:4比例加入95%乙醇沉淀靜置15小時、離心15 min，離心轉(zhuǎn)速為4500rpm，收集沉淀并用乙醇反復(fù)清洗2-3次，冷凍干燥至水分含量為5%后，再在_1_4°C下進行粉碎，得可溶性多糖；
上述的加酶量均為酶占超微粉碎后的牡丹皮的重量百分比。
[0021]采用苯酚-硫酸法測得所得的多糖中糖的含量為94.5% ；
多糖的提取率為:9.29%。
[0022]實施例3
一種生物酶法從牡丹皮中提取丹皮多糖的方法，包括下述的步驟:
(1)原料預(yù)處理
牡丹皮經(jīng)烘干至其水分含量為4%，再粉碎至200目；
(2)酶解
將粉碎后的牡丹皮，加水混勻，牡丹皮與水的重量比例為1: 12，并加入脂肪酶，脂肪酶的添加量0.5 %，酶解溫度45°C，調(diào)pH 5.5，將上述的原料置于微波提取設(shè)備中提取，微波的功率為600W，頻率為800MHZ，酶解0.5h ；
再加入纖維素酶，纖維素酶的添加量為0.6%、酶解溫度40°C、pH值5，將上述的原料置于微波提取設(shè)備中提取，微波的功率為600W，頻率為800MHZ，酶解0.5h ；
再加入堿性蛋白酶，堿性蛋白酶的添加量為1.0%，酶解溫度為45°C，pH值8.2，將上述的原料置于微波提取設(shè)備中提取，微波的功率為600W，頻率為800MHZ，酶解0.5h ；
再加入無花果蛋白酶，無花果蛋白酶的添加量為0.7%，酶解溫度為50°C，pH值7.0，將上述的原料置于微波提取設(shè)備中提取，微波的功率為500W，頻率為800MHZ，酶解0.2h，酶解后在10CTC下滅酶8min ； (3)非水溶性多糖轉(zhuǎn)化
淀粉酶的添加量為1.2%、酶解溫度40°C、pH值5，酶解1.8h后，100°C滅酶6min ；
(4)離心分離
將酶解后的牡丹皮，離心15 min，離心轉(zhuǎn)速為4500 rpm，將上清液與沉淀分別收集；
(5)可溶性多糖的提取
取步驟(4)中的上清液過濾去渣，過濾后得到的濾液在65°C下濃縮，濃縮至其濃度為65%，濃縮液按1:4比例加入95%乙醇沉淀靜置15小時、離心15 min，離心轉(zhuǎn)速為4500rpm，收集沉淀并用乙醇反復(fù)清洗2-3次，冷凍干燥至水分含量為5%后，再在_1_4°C下進行粉碎，得可溶性多糖；
上述的加酶量均為酶占超微粉碎后的牡丹皮的重量百分比。
[0023]采用苯酚-硫酸法測得所得的多糖中糖的含量為94.5% ；
多糖的提取率為:9.34%。
【權(quán)利要求】
1.一種生物酶法從牡丹皮中提取丹皮多糖的方法，包括下述的步驟: (1)原料預(yù)處理 牡丹皮經(jīng)烘干至其水分含量為2-4%，再粉碎至80-200目； (2)酶解 將粉碎后的牡丹皮，加水混勻，牡丹皮與水的重量比例為1:6-12，并加入脂肪酶，脂肪酶的添加量0.3-0.5%，酶解溫度45°C，調(diào)pH 5.5，將上述的原料置于微波提取設(shè)備中提取，微波的功率為400-600W，頻率為800MHZ，酶解0.1-0.5h ； 加入纖維素酶，纖維素酶的添加量為0.6-1.2%、酶解溫度40°C、pH值5，將上述的原料置于微波提取設(shè)備中提取，微波的功率為400-600W，頻率為800MHZ，酶解0.1-0.5h ； 加入堿性蛋白酶，堿性蛋白酶的添加量為0.4-1.0%，酶解溫度為45 °C，pH值8.2，將上述的原料置于微波提取設(shè)備中提取，微波的功率為400-600W，頻率為800MHZ，酶解0.1-0.5h ； 再加入無花果蛋白酶，無花果蛋白酶的添加量為0.1-0.7%，酶解溫度為50°C，pH值7.0，將上述的原料置于微波提取設(shè)備中提取，微波的功率為500W，頻率為800MHZ，酶解0.2h，酶解后在100°C下滅酶8min ； (3)非水溶性多糖轉(zhuǎn)化 淀粉酶的添加量為0.8-1.2%、酶解溫度40°C、pH值5，酶解1.5-2.0h后，100-105°C滅酶5-10min ;將上述的原料置于微波提取設(shè)備中提取，微波的功率為400-600W，頻率為800MHZ，酶解 0.1-0.5h，酶解后在 100_105°C下滅酶 5-lOmin ； (4)離心分離 將酶解后的牡丹皮，離心10-20 min，離心轉(zhuǎn)速為4500 rpm，將上清液與沉淀分別收集; (5)可溶性多糖的提取 取步驟(5)中的上清液過濾去渣，過濾后得到的濾液在60-70°C下濃縮，濃縮至其濃度為60-70%，濃縮液按1:4比例加入95%乙醇沉淀靜置10-20小時、離心10-20 min，離心轉(zhuǎn)速為4500 rpm,收集沉淀并用乙醇反復(fù)清洗2_3次，冷凍干燥至水分含量為4_6%后，再在-1-4°C下進行粉碎，得可溶性多糖； 上述的加酶量均為酶占超微粉碎后的牡丹皮的重量百分比。
2.如權(quán)利要求1所述一種生物酶法從牡丹皮中提取丹皮多糖的方法，其特征在于，所述的脂肪酶的用量為0.4%。
3.如權(quán)利要求1所述的一種生物酶法從牡丹皮中提取丹皮多糖的方法，其特征在于，所述的纖維素酶的用量是0.5%。
4.如權(quán)利要求1所述的一種生物酶法從牡丹皮中提取丹皮多糖的方法，其特征在于，所述的淀粉酶的添加量為1.0%。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的一種生物酶法從牡丹皮中提取丹皮多糖的方法，其特征在于，所述的方法包括下述的步驟: (1)原料預(yù)處理 牡丹皮經(jīng)烘干至其水分含量為3%，再粉碎至100目； (2)酶解 將粉碎后的牡丹皮，加水混勻，牡丹皮與水的重量比例為1:8，并加入脂肪酶，脂肪酶的添加量0.4%，酶解溫度45°C，調(diào)pH 5.5，將上述的原料置于微波提取設(shè)備中提取，微波的功率為500W，頻率為800MHZ，酶解0.2h ； 再加入纖維素酶，纖維素酶的添加量為0.5%、酶解溫度40°C、pH值5，將上述的原料置于微波提取設(shè)備中提取，微波的功率為500W，頻率為800MHZ，酶解0.2h ； 再加入堿性蛋白酶，堿性蛋白酶的添加量為0.8%，酶解溫度為45°C，pH值8.2，將上述的原料置于微波提取設(shè)備中提取，微波的功率為500W，頻率為800MHZ，酶解0.3h ； 再加入無花果蛋白酶，無花果蛋白酶的添加量為0.4%，酶解溫度為50°C，pH值7.0，將上述的原料置于微波提取設(shè)備中提取，微波的功率為500W，頻率為800MHZ，酶解0.2h，酶解后在1CTC下滅酶8min ； (3)非水溶性多糖轉(zhuǎn)化 淀粉酶的添加量為I %、酶解溫度40°C、pH值5，酶解1.8h后，100°C滅酶6min ； (4)離心分離 將酶解后的牡丹皮，離心15 min，離心轉(zhuǎn)速為4500 rpm，將上清液與沉淀分別收集； (5)可溶性多糖的提取 取步驟(5)中的上清液過濾去渣，過濾后得到的濾液在65°C下濃縮，濃縮至其濃度為65%，濃縮液按1:4比例加入95%乙醇沉淀靜置15小時、離心15 min，離心轉(zhuǎn)速為4500rpm，收集沉淀并用乙醇反復(fù)清洗2-3次，冷凍干燥至水分含量為5%后，再在_1_4°C下進行粉碎，得可溶性多糖； 上述的加酶量均為酶占超微粉碎后的牡丹皮的重量百分比。
【文檔編號】C12P19/04GK104313083SQ201410628516
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年11月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月11日
【發(fā)明者】遲宗磊, 藏偉功, 丁振洋 申請人:濟南凱因生物科技有限公司