一種大豆圣豆9號(hào)GmNAC4基因鹽誘導(dǎo)啟動(dòng)子的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種大豆圣豆9號(hào)GmNAC4基因鹽誘導(dǎo)啟動(dòng)子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，本發(fā)明還公開了該基因啟動(dòng)子在鹽脅迫下提高報(bào)告基因在擬南芥和大豆中的表達(dá)的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)證明，在鹽誘導(dǎo)下，本發(fā)明所述的啟動(dòng)子能上調(diào)驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥和大豆原生質(zhì)體中的表達(dá)，此為GmNAC4基因耐鹽調(diào)控機(jī)制研究，為獲得通用型的鹽誘導(dǎo)型啟動(dòng)子提供了序列材料，也為其用于培育抗鹽作物品種提供了基礎(chǔ)。
【專利說明】-種大S圣9號(hào)GmNAC4基因鹽誘導(dǎo)啟動(dòng)子

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種啟動(dòng)子，尤其涉及一種大豆圣豆9號(hào)GmNAC4基因鹽誘導(dǎo)啟動(dòng)子。

【背景技術(shù)】
[0002] 大豆（Glycinemax.)含有豐富的植物蛋白、脂肪和多種對(duì)人體有益的活性物質(zhì)， 是重要的蛋白質(zhì)、油脂及保健品活性物質(zhì)的重要來源，同時(shí)是食品、飼料等多種加工工業(yè)的 優(yōu)質(zhì)原料，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中處于重要的地位。大豆，豆科（Fabaceae)，大豆屬（Glycine),屬于 淡土植物，耐鹽性較差，土地高鹽堿含量限制了大豆種植業(yè)的發(fā)展（王遵親等，1993)。
[0003] 轉(zhuǎn)錄因子通過與下游基因啟動(dòng)子上的順式作用相互作用調(diào)節(jié)基因的表達(dá)模式，參 與生物體的各項(xiàng)生理活動(dòng)，轉(zhuǎn)錄因子的研究對(duì)掌握生物體整個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有重要意義，植物 轉(zhuǎn)錄因子研究是功能基因組研究的一個(gè)重要方面。1997年Aida等首先報(bào)道了NAC結(jié)構(gòu)域， 發(fā)現(xiàn)在矮牽牛NAM基因、擬南芥ATAF1/2和CUC2基因編碼蛋白的N端包含一段保守的氨基 酸序列，取三基因首字母命名為NAC(Aidaetal.，1997)。后來在擬南芥、水稻、小麥、大豆 等物種中又相繼發(fā)現(xiàn)多種NAC轉(zhuǎn)錄因子。目前在擬南芥中共發(fā)現(xiàn)了 105個(gè)NAC成員，而水稻 中則發(fā)現(xiàn)了 75個(gè)（Ookaetal.，2003)。研究表明，NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、器官建 成、激素調(diào)節(jié)和防御抵抗多種生物和非生物脅迫等方面發(fā)揮著重要作用。2010年大豆全基 因組測(cè)序以來，與脅迫相關(guān)的大豆NAC轉(zhuǎn)錄因子的研究越來越多，一些大豆NAC轉(zhuǎn)錄因子參 與到干旱、鹽、滲透脅迫響應(yīng)和應(yīng)答過程，在大豆的抗逆過程中起作用。LucianoG.Fietto 2009發(fā)現(xiàn)GmNAC2、GmNAC3、GmNAC4對(duì)滲透壓脅迫強(qiáng)烈響應(yīng)，GmNAC3和GmNAC4對(duì)ABA、鹽及 JA響應(yīng)。
[0004] 利用逆境誘導(dǎo)型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)抗逆基因在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)是培育抗逆作物新品 種的有效方法。目前能應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因研究的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子仍然很少，對(duì)于新的抗逆相關(guān)啟 動(dòng)子的發(fā)現(xiàn)、克隆、順式作用元件分析以及與順式元件相互作用的轉(zhuǎn)錄因子的研究仍然是 今后研究的重點(diǎn)，將功能明確的抗逆啟動(dòng)子成功應(yīng)用到轉(zhuǎn)基因植物中調(diào)控抗逆基因的表達(dá) 是植物抗逆基因工程的研究方向。NAC家族中逆境相關(guān)基因往往對(duì)多種逆境脅迫響應(yīng)，這大 部分歸功與基因啟動(dòng)上含有多種逆境脅迫相關(guān)的順式作用元件，通過對(duì)逆境相關(guān)的NAC家 族基因啟動(dòng)子研究可以得到多種與脅迫相關(guān)的關(guān)鍵DNA片段和順式作用元件，對(duì)構(gòu)建有效 的逆境誘導(dǎo)型啟動(dòng)子有重要意義。目前研究較深入的有：脫落酸響應(yīng)元件（ABA-responsive element,ABRE)、乙烯響應(yīng)兀件（ethylene-responsiveelement,ERE)、茉莉酸類物質(zhì)應(yīng)答 兀件（jasmonate-responsiveelement,JRE)、低溫口向應(yīng)兀件（low-tempraturereponsive element,LTRE)和干旱應(yīng)答兀件（dehydration-responsiveelement,DRE)等。（朱_萍， 于壯，等.植物逆境相關(guān)啟動(dòng)子及功能.遺傳.2010, 32(3) :229-234)對(duì)植物啟動(dòng)子的研 究有助與了解基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達(dá)模式和其調(diào)控機(jī)制，且對(duì)特異性及誘導(dǎo)性啟動(dòng)子的研究， 有助得到正常高效的轉(zhuǎn)基因植物。
[0005] 本實(shí)驗(yàn)室前期工作中已經(jīng)證明來源于耐鹽品種--圣豆9號(hào)的GmNAC4基因?yàn)辂} 響應(yīng)基因，且對(duì)鹽脅迫為正調(diào)節(jié)作用（專利CN102660554A)。通過比較耐鹽大豆圣豆9號(hào)在 鹽和非鹽條件下的基因表達(dá)譜變化，發(fā)現(xiàn)了GmNAC4基因在鹽處理下上調(diào)表達(dá)，將該基因的 過表達(dá)載體轉(zhuǎn)入模式生物擬南芥中，使轉(zhuǎn)基因擬南芥獲得了非轉(zhuǎn)基因擬南芥所不具備的提 高抗鹽/耐旱性的能力。通過大豆萌動(dòng)胚真空滲透輔助的外源基因轉(zhuǎn)化方法將該基因的過 表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大豆中，經(jīng)過比較分析證明，轉(zhuǎn)基因植株比非轉(zhuǎn)基因植株的抗鹽/耐旱性顯 著地提高。然而，GmNAC4基因的上游調(diào)控基因和參與的信號(hào)通路并不明確，研究GmNAC4基 因鹽誘導(dǎo)啟動(dòng)子可以幫助更好地闡釋GmNAC4基因的功能，同時(shí)研究GmNAC4的鹽誘導(dǎo)特性 可為獲得通用型的鹽誘導(dǎo)型啟動(dòng)子提供重要參考，將來可用于轉(zhuǎn)基因耐鹽作物的培育。經(jīng) 過檢索，未見有關(guān)于GmNAC4基因鹽誘導(dǎo)啟動(dòng)子的相關(guān)報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種大豆圣豆9號(hào)GmNAC4基因鹽誘導(dǎo)啟動(dòng)子及其應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明所述的大豆圣豆9號(hào)GmNAC4基因鹽誘導(dǎo)啟動(dòng)子，其特征在于：所述啟動(dòng)子 的核苷酸序列是下列核苷酸序列之一：
[0008] a)序列表中SEQ ID No:1的DNA序列；
[0009] b)與序列表中SEQ ID No: 1的DNA序列具有90%以上同源性，且具有相同功能的DNA序列。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種含上述大豆圣豆9號(hào)GmNAC4基因鹽誘導(dǎo)啟動(dòng)子的報(bào)告基因 ⑶S表達(dá)載體pGmNAC4: :pKGWFS7 ;以及含上述大豆圣豆9號(hào)GmNAC4基因鹽誘導(dǎo)啟動(dòng)子的報(bào) 告基因LUC表達(dá)載體pGmNAC4: :pGreenII-0800LUC。
[0011] 本發(fā)明所述大豆圣豆9號(hào)GmNAC4基因鹽誘導(dǎo)啟動(dòng)子受鹽脅迫誘導(dǎo)高效啟動(dòng)目標(biāo) 基因表達(dá)的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明首先在大ii圣ii9號(hào)植株中克隆到了GmNA(]4基因啟動(dòng)子；利用Gateway系 統(tǒng)，經(jīng)過BP、LR反應(yīng)，將GmNAC4基因啟動(dòng)子連接到⑶S報(bào)告基因表達(dá)載體pKGWFS7 (見圖2) 上；將pGmNAC4: :pKGWFS7載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株GV3101中，通過轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)入模式 植物擬南芥中，以驗(yàn)證GmNAC4基因啟動(dòng)子功能。
[0013] 本發(fā)明還通過酶切連接將GmNAC4基因啟動(dòng)子連接到pGreenII-0800LUC載體中， 通過擬南芥和大豆葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染體系，驗(yàn)證GmNAC4基因啟動(dòng)子受鹽誘導(dǎo)的 功能。
[0014] 實(shí)驗(yàn)證實(shí)：本發(fā)明所述圣豆9號(hào)GmNAC4基因啟動(dòng)子能夠在鹽誘導(dǎo)條件下上調(diào)目標(biāo) 基因的表達(dá)，可望用于轉(zhuǎn)基因耐鹽植物的培育。其中：所述植物優(yōu)選大豆或擬南芥。
[0015] 本發(fā)明有益效果體現(xiàn)在：利用PCR克隆技術(shù)，本發(fā)明首次克隆得到了大豆圣豆9號(hào) GmNAC4基因啟動(dòng)子，并驅(qū)動(dòng)GUS報(bào)告基因在擬南芥中進(jìn)行表達(dá)，使轉(zhuǎn)基因擬南芥獲得了非 轉(zhuǎn)基因擬南芥所不具備表達(dá)GUS基因的能力，且在鹽誘導(dǎo)條件下能更高地表達(dá)。通過擬南 芥和大豆葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染體系，經(jīng)過比較分析證明，轉(zhuǎn)基因擬南芥和大豆原生 質(zhì)體能在鹽誘導(dǎo)下較非鹽條件下能更高效的表達(dá)報(bào)告基因。預(yù)示本發(fā)明所述的基因可廣泛 用于培育抗鹽的植物品種。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1為PCR克隆大豆圣豆9號(hào)GmNAC4基因啟動(dòng)子電泳圖，其中：M為Marker，泳道 1、2、3為啟動(dòng)子DNA。
[0017] 圖2為pKGWFS7. 0載體示意圖。
[0018] 圖3為GmNAC4::⑶S轉(zhuǎn)基因擬南芥⑶S染色結(jié)果，其中，A為轉(zhuǎn)基因擬南芥全株的 染色結(jié)果，在根、根尖、側(cè)根起始部位、氣孔有GUS信號(hào)，B為根部，C為根尖，D為側(cè)根起始部 位，E為氣孔。
[0019] 圖4為GmNAC4::⑶S轉(zhuǎn)基因擬南芥在鹽和非鹽條件下⑶S染色對(duì)比圖，（鹽處理 下在轉(zhuǎn)基因擬南芥中根部的GUS信號(hào)增強(qiáng)）其中，MOCK為轉(zhuǎn)基因擬南芥正常培養(yǎng)6h對(duì)照， NaCl為 150mMNaCl處理 6h。
[0020] 圖5為pGreenII-0800LUC載體T-DNA插入?yún)^(qū)示意圖。
[0021] 圖6為GmNAC4啟動(dòng)子在鹽和非鹽條件下相對(duì)熒光素酶測(cè)定結(jié)果，其中，MOCK為轉(zhuǎn) 化原生質(zhì)體正常培養(yǎng)6h的相對(duì)熒光素酶活性，NaCl為轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體150mMNaCl處理6h的 相對(duì)熒光素酶活性。

【具體實(shí)施方式】
[0022] 實(shí)施例1大豆GmNAC4基因啟動(dòng)子的獲得
[0023] 根據(jù)NCBI網(wǎng)站上查到的GmNAC4基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)ATG上游2000kb序列，設(shè)計(jì) 啟動(dòng)子引物（F:5,-ACCGTCGTGITCACAAATC-3，，R:5,-ITTITCAAAAACACAATT TCG-3'）。利用CTAB法提取圣豆9號(hào)基因組DNA，將提取的基因組DNA稀釋到100ug/ul，用 作擴(kuò)增啟動(dòng)子模板。利用高保真酶HIFI(Takara)，擴(kuò)增GmNAC4基因啟動(dòng)子。
[0024] 1. 1圣豆9號(hào)基因組DNA提取
[0025] (1)將CTAB提取液水浴預(yù)熱到65°C;
[0026] (2)將圣豆9號(hào)植物材料放入研缽中，利用液氮將其研磨成粉末；
[0027] (3)等液氮揮發(fā)后，立即將100_200mg植物粉末轉(zhuǎn)入到1. 5ml離心管中，然后迅速 的加入lml預(yù)熱的CTAB提取液，輕柔顛倒混勻，65°C水浴30min;
[0028] (3) 12,OOOrpm，離心lOmin，將0? 6ml上清液轉(zhuǎn)移到新的1. 5ml離心管中，待提取液 降低到室溫，再加入0.36ml酚/氯仿/異戊醇（24:23:1)輕柔混勻5min，室溫放置lOmin 使液體分層；
[0029] (4) 12,OOOrpm，離心lOmin，將0? 4ml上清液轉(zhuǎn)移到新的1. 5ml離心管中，再加入 0. 4ml異丙醇，輕柔上下翻轉(zhuǎn)15次混勻溶液，室溫放置15mim;
[0030] (5) 12,OOOrpm，離心lOmin,棄上清，加入lml75 %的乙醇洗漆沉淀，彈起沉淀， 12,OOOrpm，離心5min，重復(fù)兩次；
[0031] (6)棄上清，開蓋干燥DNA約lOmin，加入50iil滅菌水，在60°C中充分溶解 RNAlOmin；
[0032] (7)用紫外分光光度計(jì)測(cè)RNA樣品的0D值和濃度，A260/A280達(dá)到1. 7-2. 0，A230/ A260達(dá)到2. 0-2. 2,并將提取的DNA吸取10yl濃度稀釋到100yg/yl用作PCR模板，其 他放置_20°C備用。
[0033] 1 ? 2GmNAC4基因啟動(dòng)子克隆
[0034] 高保真酶HIFI擴(kuò)增的反應(yīng)體系如下（20ii1體系）：
[0035]
[0036]

【權(quán)利要求】
1. 一種大豆圣豆9號(hào)GmNAC4基因鹽誘導(dǎo)啟動(dòng)子，其特征在于：所述啟動(dòng)子的核苷酸序 列是下列核苷酸序列之一： a) 序列表中SEQ ID No: 1的DNA序列； b) 與序列表中SEQ ID N〇:l的DNA序列具有90%以上同源性，且具有相同功能的DNA 序列。
2. 含有權(quán)利要求1所述大豆圣豆9號(hào)GmNAC4基因鹽誘導(dǎo)啟動(dòng)子的報(bào)告基因⑶S表達(dá) 載體 pGmNAC4: :pKGWFS7。
3. 含有權(quán)利要求1所述大豆圣豆9號(hào)GmNAC4基因鹽誘導(dǎo)啟動(dòng)子的報(bào)告基因LUC表達(dá) 載體 pGmNAC4: :pGreenII-0800LUC。
4. 權(quán)利要求1所述大豆圣豆9號(hào)GmNAC4基因鹽誘導(dǎo)啟動(dòng)子受鹽脅迫誘導(dǎo)高效啟動(dòng)目 標(biāo)基因表達(dá)的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/84GK104342442SQ201410621142
【公開日】2015年2月11日 申請(qǐng)日期:2014年11月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月6日
【發(fā)明者】向鳳寧, 楊丹, 宋顯偉, 李朔, 劉振華 申請(qǐng)人:山東大學(xué)