一種丙型肝炎病毒感染個體化治療指導(dǎo)基因芯片的制備和用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種丙型肝炎病毒感染個體化治療指導(dǎo)基因芯片，其制備方法包括制備通用引物，制備HCV亞型核酸分型探針和人IL-28B rs12979860多態(tài)性檢測探針，制備寡核苷酸芯片，建立多重RT-PCR體系，建立雜交體系。利用本發(fā)明制備的基因芯片可同時甄別HCV的5個亞型，包括1b、2a、3a、3b和6a，并可檢測人rs12979860的CC、TT、CT 3種基因多態(tài)性。該基因芯片具有快速、準確、高通量、特異性高的優(yōu)勢，可為HCV臨床診斷及個體化治療提供指導(dǎo)。
【專利說明】一種丙型肝炎病毒感染個體化治療指導(dǎo)基因芯片的制備和 用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及丙型肝炎病毒感染個體化治療指導(dǎo)基因芯片的制備和用途，屬于基因 芯片檢測【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 丙型肝炎病毒（hepatitiscvirus,HCV)感染危害嚴重，全球有L7億患者感染 HCV，且每年新發(fā)300萬人。50-80 %的HCV感染者可發(fā)展為慢性狀態(tài)，其中20-30 %發(fā)展為 肝硬化或者肝癌。慢性丙型肝炎不同基因型或亞型感染的地理分布、抗病毒治療的效果及 疾病嚴重程度等均存在差異，人IL-28B的基因多態(tài)性與抗病毒治療的病毒應(yīng)答率有密切 關(guān)系，是丙肝患者治療成功與否的一項重要的預(yù)測因子。HCV感染的個體化治療可顯著提高 病毒應(yīng)答率，提高抗病毒治療效果。目前HCV基因分型已列為丙肝抗病毒治療必須檢測項 目之一；另外，人IL28B多態(tài)性檢測已被美國肝臟病學(xué)會列入丙肝治療的重點檢查項目。
[0003] 在基因分型技術(shù)方面，HCV分型檢測目前有以下幾種方法：
[0004] 1)血清學(xué)方法：目前常用于HCV分型檢測的為多肽ELISA、重組抗原ELISA等，它 們的敏感性、準確性較高，經(jīng)過對HCVRNA的C區(qū)、NS4區(qū)、NS5區(qū)等區(qū)段進行檢測，已經(jīng)能區(qū) 分HCV1-6型。血清學(xué)方法快捷簡便，成本低，臨床應(yīng)用廣泛，但當(dāng)出現(xiàn)病毒混合感染或病毒 變異時難以區(qū)分。
[0005] 2)直接測序法：使用PCR產(chǎn)物直接測序，是分型的金標準，但敏感度不足，受測序 儀器限制，不易在基層推廣。
[0006] 3)實時熒光定量PCR法：敏感性、特異性、重復(fù)性和便捷性等方面均優(yōu)于直接測序 法。但該方法需要專門的熒光定量PCR儀及配套試劑。
[0007] 4)巢式PCR法：使用兩對PCR引物擴增片段，第一對PCR引物擴增片段與普通PCR 相似，第二對引物為巢式引物，結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)，經(jīng)歷兩個PCR程序，擴增特異性增 強，靈敏度與可靠性優(yōu)于普通PCR，常用于低濃度的核酸擴增，其缺點是易污染。RFLP法：通 過提取及擴增靶基因，利用限制性酶切位點間的插入、缺失、重排、突變等原因而造成的基 因型間限制性片段長度的變異，進行適當(dāng)?shù)拿盖泻髲奶禺愋缘碾娪緢D譜觀察其多態(tài)性，借 以區(qū)分不同基因型。RFLP法敏感性較高，能同時鑒別出多個型別，減輕了工作量，適合于大 規(guī)模的篩查，但該方法穩(wěn)定性較差，重復(fù)性較低。
[0008] 5)基因芯片法：基因芯片上可以排列大量不同類別的探針以滿足不同需要，例如 聯(lián)合HCV的5'UTR區(qū)和C區(qū)可提高分辨力，擴大分型范圍。該法具有靈敏、高通量、集約 化、規(guī)?；⒔Y(jié)果準確等優(yōu)點，但因其技術(shù)要求高、常需要特殊檢測儀器，在推廣上還受到一 些限制。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于針對HCV分型及耐藥檢測領(lǐng)域存在的一些不足，研制一種高通 量、特異、敏感、快速的HCV基因分型及人IL-28Brsl2979860基因多態(tài)性檢測的基因芯片， 能同時檢測HCV常見的5種亞型（lb，2a，3a，3b，6a)和人rsl2979860的CC、TT、CT3種基 因多態(tài)性，為HCV感染個體化治療方案的制定提供指導(dǎo)。
[0010] 為了達到上述目的，本發(fā)明開發(fā)了丙型肝炎病毒感染個體化治療指導(dǎo)基因芯片， 其制備方法如下：
[0011] 1.步驟一：制備通用引物
[0012] 選擇HCV的5'UTR和NS5B基因作為檢測靶基因，可以通過一次反應(yīng)實現(xiàn)5種 HCV亞型（lb，2a，3a，3b，6a)的通用擴增；同時包括1對人IL-28B基因引物，擴增包含 rsl2979860的基因片段。另有1對外源性熒光素酶基因片段引物，用來監(jiān)測核酸提取、PCR 擴增及雜交反應(yīng)。優(yōu)選4對引物序列及其對應(yīng)的，如表1所示：
[0013] 表1弓丨物序列及對應(yīng)的擴增靶標
[0014]

【權(quán)利要求】
1. 一種檢測丙型肝炎病毒亞型和人IL-28B rsl2979860多態(tài)性的基因芯片，本發(fā) 明的基因芯片可以用于同時甄別HCV的5個亞型，包括lb、2a、3a、3b和6a，并可檢測人 rsl2979860的CC、TT、CT 3種基因多態(tài)性檢。其特征是包含檢測HCV病毒的4條通用引物 和12條特異性寡核苷酸探針；檢測rsl2979860的2條特異性引物和2條特異性寡核苷酸 探針；2條內(nèi)標探針和載體。上述探針分別分布在載體上。
表5檢測rsl2979860多態(tài)性的特異性寡核苷酸探針序列
2. 根據(jù)權(quán)利1所述的丙型肝炎病毒感染個體化治療指導(dǎo)基因芯片，其特征是所述的載 體為醛基化修飾的玻璃片、硅片、聚苯乙稀基片、尼龍基片。
3. -種丙型肝炎病毒感染個體化治療指導(dǎo)基因芯片的制備方法，包括以下步驟： 步驟一，探針的設(shè)計：首先從NCBI基因數(shù)據(jù)庫中下載HCV基因序列和人IL28B基因序 列，序列下載完成后，使用Vector NTI Advance lO(invitrogen)軟件包中的AlignX程序 按照默認的參數(shù)設(shè)置對各病原體基因序列進行全局比對。根據(jù)比對結(jié)果在基因序列的保守 位置設(shè)計特異性寡核苷酸探針、特異性引物。 步驟二，探針的合成，每條探針的3'端加入12個堿基T且3'末端T氨基修飾作為連 接臂，以使其能固定在醛基化修飾玻璃基片上；質(zhì)控探針除3'末端T進行氨基修飾外，5'端 同時標記生物素標記； 步驟三，芯片的制備：將合成后的探針用去離子水稀釋成100 U M，分別取10 y L探針溶 液，和10 U L體積芯片點樣液混勻，使探針點樣終濃度為50 ii M，裝于384孔板，將芯片表面 貼上10樣品孔陣列膜，用pixsys 5000芯片制備儀（Cartesian Technologies)，采用接觸 式點樣方式，將探針點制在載體上，點樣過程中保持一定濕度，點樣完成后將芯片置于干燥 器中避光常溫靜置48h，使探針和芯片表面醛基脫去1分子水后共價結(jié)合，點制好的芯片常 溫干燥保存。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的丙型肝炎病毒感染個體化治療指導(dǎo)基因芯片的制備方法， 其特征是步驟一中16條特異性寡核苷酸探針及8條引物，探針長度在18-28m，引物長度在 19_23nt 〇
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的丙型肝炎病毒感染個體化治療指導(dǎo)基因芯片的制備方法，其 特征是步驟三種所述的載體為醛基化玻璃片基或硅片、聚苯乙烯基片、尼龍基片。
6. 丙型肝炎病毒感染個體化治療指導(dǎo)基因芯片的使用方法，其特征是包括以下步驟： 1) 步驟一，HCV RNA和人基因組DNA的提取，使用市售商品化病毒基因組RNA提取試劑 盒和人基因組DNA提取試劑盒提取HCV RNA和人基因組DNA ; 2) 步驟二，RT-PCR/PCR擴增：擴增使用TaKaRa的一步法RT-PCR試劑，以1管多重 RT-PCR擴增體系同時擴增HCV的2種靶基因、人rsl2979860靶基因和內(nèi)標熒光素酶基因， 使用引物見表1-3 ;擴增按以下循環(huán)參數(shù)進行擴增：42°C逆轉(zhuǎn)錄5min，94°C變性2min ;擴增 45個循環(huán)，94°C變性20s，53°C退火20s，72°C延伸20s ;72°C延伸2min，4°C保存或進行下一 步實驗； 3) 步驟三，芯片雜交：將基因芯片分別置0.2% SDS和去離子水中分別清洗30S，離心 干燥；將步驟二得到的擴增產(chǎn)物在95°C變性5min后立即置于冰浴中5min，取變性的產(chǎn)物 5ii L與5ii L雜交液混勻，使用加樣器加于芯片加樣孔使其均勻覆蓋于陣列表面，將基因芯 片放入雜交盒內(nèi)在45°C雜交Ih ; 4) 步驟四，雜交后清洗基因芯片：基因芯片雜交完成后，從雜交盒中取出芯片，并立即 依次在洗液1XSSC+0.2% SDS、0.2XSSC和0? IXSSC中各清洗30S，最后將基因芯片表明 液體離心干燥； 5) 步驟五，樣品標記：向芯片加入15 y 1標記液，用移液器涂勾后將芯片放回雜受盒中 置37°C水浴中反應(yīng)30min，取出芯片以PBST清洗10s，離心干燥； 6) 步驟六，掃描：向芯片反應(yīng)區(qū)加入剛剛I : 1混合的發(fā)光液A和B的混合溶液，用移 液器涂勻后立即置化學(xué)發(fā)光成像儀中掃描，成像模式為觸發(fā)模式，曝光參數(shù)511，增益參數(shù) 300,曝光時間10s，觸發(fā)次數(shù)1次； 7) 步驟六，數(shù)據(jù)分析：成像結(jié)束后使用化學(xué)發(fā)光分析軟件進行芯片探針信號分析。每 條探針的信號取其三個重復(fù)點的平均值，根據(jù)探針Cutoff值，探針信號值>該探針Cutoff 值的判讀為該探針信號陽性。本發(fā)明使用方法的步驟二中RT-PCR使用的反向引物修飾分 子為生物素。本發(fā)明使用方法步驟三中使用的雜交液組分為8XSSC，0. 6% SDS，10%甲酰 胺，10 X Denhardt。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的丙型肝炎病毒感染個體化治療指導(dǎo)基因芯片的使用方法，其 特征是步驟二中使用的用于擴增HCV的2種靶基因、人rsl2979860靶基因和內(nèi)標熒光素酶 基因的反向引物5'端進行修飾。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的反向引物5'端修飾分子可以是CY3、CY5、生物素。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的丙型肝炎病毒感染個體化治療指導(dǎo)基因芯片的使用方法，其 特征是步驟三中使用的雜交液組分為8 X SSC，0. 6% SDS，10%甲酰胺，10 XDenhardt。
10. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的丙型肝炎病毒感染個體化治療指導(dǎo)基因芯片的使用方法， 其特征是步驟六中使用的掃描方法，根據(jù)權(quán)利要求8中反向引物修飾分子的不同，掃描方 法包括熒光掃描，可視化掃描，化學(xué)發(fā)光成像。
【文檔編號】C12Q1/70GK104357584SQ201410609090
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月4日
【發(fā)明者】王升啟, 劉琪琦, 王孌孌, 陳蘇紅, 張敏麗, 孫曉彥 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所