一種快速區(qū)分非嗜肺、嗜肺與嗜肺ⅰ型軍團(tuán)菌的三重pcr檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明一種快速區(qū)分非嗜肺、嗜肺與嗜肺Ⅰ型軍團(tuán)菌的三重PCR檢測(cè)方法，是一種軍團(tuán)菌屬多重PCR檢測(cè)方法，屬于微生物分子檢測(cè)領(lǐng)域。本發(fā)明利用分別針對(duì)軍團(tuán)菌屬、嗜肺軍團(tuán)菌種和嗜肺軍團(tuán)菌Ⅰ型的16SrRNA、danJ和ORF9基因的引物，對(duì)dNTPs和引物濃度比例以及退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，建立快速區(qū)分非嗜肺、嗜肺與嗜肺Ⅰ型軍團(tuán)菌的三重PCR方法。本發(fā)明方法簡(jiǎn)便、快捷、成本低、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可以對(duì)分離培養(yǎng)到的可疑軍團(tuán)菌菌株進(jìn)行快速有效的判定。
【專利說(shuō)明】—種快速區(qū)分非嗜肺、嗜肺與嗜肺I型軍團(tuán)菌的三重PCR檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]一種快速區(qū)分非嗜肺、嗜肺與嗜肺I型軍團(tuán)菌的三重PCR檢測(cè)方法，是一種軍團(tuán)菌屬多重PCR檢測(cè)方法，屬于微生物分子檢測(cè)領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002]90%以上的軍團(tuán)菌病是由嗜肺軍團(tuán)菌(Leg1nella Pneumophila, LP)引起,其中85%為L(zhǎng)Pl型軍團(tuán)菌肺炎，所以嗜肺軍團(tuán)菌和LPl型嗜肺軍團(tuán)菌是我們監(jiān)測(cè)的重點(diǎn)。依據(jù)WS394-2012《公共場(chǎng)所集中空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)衛(wèi)生規(guī)范》，所有公共場(chǎng)所集中空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)冷卻塔水和冷凝水中不得檢出嗜肺軍團(tuán)菌，該規(guī)范的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法為培養(yǎng)法。然而，傳統(tǒng)的培養(yǎng)法在對(duì)分離到的可疑軍團(tuán)菌菌落進(jìn)行判定時(shí)存在盲區(qū)，生化檢測(cè)的不確定性和血清學(xué)檢測(cè)的多交叉反應(yīng)性，導(dǎo)致一些可疑軍團(tuán)菌菌落不能被最終判別。本發(fā)明可以彌補(bǔ)生化和血清學(xué)鑒定檢測(cè)的不足，快速準(zhǔn)確的對(duì)分離培養(yǎng)到的可疑軍團(tuán)菌菌落進(jìn)行判定，且簡(jiǎn)單、方便、成本低。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于快速準(zhǔn)確的對(duì)分離培養(yǎng)到的可疑軍團(tuán)菌菌落進(jìn)行判定，以克服傳統(tǒng)培養(yǎng)法中生化和血清學(xué)鑒定檢測(cè)的缺點(diǎn)。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)方案:一種快速區(qū)分非嗜肺(非LP)、嗜肺(LP)與嗜肺I型(LPl)軍團(tuán)菌的三重PCR檢測(cè)方法，步驟為:
1、制備PCR模板，挑取待檢測(cè)可疑單個(gè)菌落于0.5mL滅菌無(wú)核酸酶的去離子水中，制備成菌懸液，100°C煮沸15min，冷卻后備用。
[0005]2、引物序列:
16S rRNA 基因:上游引物 5’ -AAGATTAGCC TGCGTCCGAT-3’，下游引物 5’ -GTCAACTTATCGCGTTTGCT-3’，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為654 bp ；
dan J 基因:上游引物 5 ’ -AGGTGGTTTT GGCGGATTTG G_3 ’，下游引物 5 ’ -TGAATTCTGACTTGCCCCAT G-3’，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為285 bp ；
0RF9 基因:上游引物 5 ’ -CAGGATTACC GCTCATTATT G-3 ’，下游引物 5 ’ -GTAATTCCCAGCCATTTACC AGATC-3’，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為561 bp ；
3、PCR反應(yīng)體系:1.6uL dNTP、三種上、下游引物(使用濃度均為2μΜ)均各2yL，模板DNA2yL、、rTaq酶0.08 μ LUOXbuffer緩沖液2 μ L，無(wú)核酸酶的去離子水補(bǔ)足至20μ L ；
4、擴(kuò)增條件:95°C預(yù)變性 5 min ；95 V 30 S，52 V 30 S，72 V 40 s 進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán)；72 1:終末延伸5 min ；
5、凝膠電泳:在1.5%瓊脂糖凝膠，0.5XTBE緩沖液中電泳，電泳后凝膠成像獲取結(jié)果； 6、判定方法:獲得3條目的條帶為L(zhǎng)Pl，兩條目的條帶為L(zhǎng)P，I條目的條帶為非LP，O條目的條帶為非軍團(tuán)菌。
[0006]本發(fā)明的有益效果:本方法簡(jiǎn)便、快捷、成本低、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可以對(duì)分離培養(yǎng)到的可疑軍團(tuán)菌菌株進(jìn)行快速有效的判定，快速區(qū)分非嗜肺、嗜肺與嗜肺I型軍團(tuán)菌。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0007]圖1是29株軍團(tuán)菌PCR產(chǎn)物電泳圖譜。M:100bp DNA marker (最亮的條帶為500bp，向上、向下每條帶依次增、減100 bp) ;1、18為陰性對(duì)照,2為非嗜肺軍團(tuán)菌Z.Jordanis(ATCC33623)，3 為 LP6 (ATCC33216)，4 為 LPl (ATCC33152), 5?17、19?34 為分離到的 29 株軍團(tuán)菌。
[0008]具體實(shí)例方式
實(shí)施例1 一種快速區(qū)分非嗜肺、嗜肺與嗜肺I型軍團(tuán)菌的三重PCR檢測(cè)方法，步驟為、
1、制備PCR模板，挑取待檢測(cè)可疑單個(gè)菌落于0.5mL滅菌無(wú)核酸酶的去離子水中，制備成菌懸液，100°C煮沸15min，冷卻后備用。
[0009]2、引物序列:
16S rRNA 基因:上游引物 5’ -AAGATTAGCC TGCGTCCGAT-3’，下游引物 5’ -GTCAACTTATCGCGTTTGCT-3’，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為654 bp ；
dan J 基因:上游引物 5 ’ -AGGTGGTTTT GGCGGATTTG G-3 ’，下游引物 5 ’ -TGAATTCTGACTTGCCCCAT G-3’，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為285 bp ；
0RF9 基因:上游引物 5 ’ -CAGGATTACC GCTCATTATT G-3 ’，下游引物 5 ’ -GTAATTCCCAGCCATTTACC AGATC-3’，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為561 bp。
[0010]3、PCR反應(yīng)體系:1.6 yL dNTP、三種上、下游引物(使用濃度均為2μΜ)均各
2μ L，模板DNA 2 μ L、rTaq酶0.08 μ LUOXbuffer緩沖液2 μ L，無(wú)核酸酶的去離子水補(bǔ)足至20 μ L0
[0011]4、擴(kuò)增條件:95°C預(yù)變性 5 min ；95°C 30 s，52V 30 s，72°C 40 s 進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán)；72°C終末延伸5 min。
[0012]5、凝膠電泳:在1.5%瓊脂糖凝膠、0.5XTBE緩沖液中電泳，電泳后凝膠成像獲取結(jié)果。
[0013]6、結(jié)果判定:獲得3條目的條帶為L(zhǎng)Pl，兩條目的條帶為L(zhǎng)P，I條目的條帶為非LP，O條目的條帶為非軍團(tuán)菌。
【權(quán)利要求】
1.一種快速區(qū)分非嗜肺、嗜肺與嗜肺I型軍團(tuán)菌的三重PCR檢測(cè)方法，其特征在于步驟為: (1)制備PCR模板，挑取待檢測(cè)可疑單個(gè)菌落于0.5mL滅菌無(wú)核酸酶的去離子水中，制備成菌懸液，100°C煮沸15min，冷卻后備用； (2)引物序列: 16S rRNA 基因:上游引物 5’ -AAGATTAGCC TGCGTCCGAT-3’，下游引物 5’ -GTCAACTTATCGCGTTTGCT-3’，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為654 bp ； dan J 基因:上游引物 5 ’ -AGGTGGTTTT GGCGGATTTG G_3 ’，下游引物 5 ’ -TGAATTCTGACTTGCCCCAT G-3’，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為285 bp ； 0RF9 基因:上游引物 5 ’ -CAGGATTACC GCTCATTATT G-3 ’，下游引物 5 ’ -GTAATTCCCAGCCATTTACC AGATC-3’，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為561 bp ； (3)PCR反應(yīng)體系:1.6μ L dNTP、濃度均為2 μ M的三種上、下游引物均各2 μ L，模板DNA.2 μ L、rTaq酶0.08 μ L、10 X buffer緩沖液2 μ L，無(wú)核酸酶的去離子水補(bǔ)足至20 μ L ； (4)擴(kuò)增條件:95°C預(yù)變性5 min ；95°C 30 s，52°C 30 s，72°C 40 s 進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán)；.72 °C終末延伸5 min ；(5)凝膠電泳:在1.5%瓊脂糖凝膠、0.5XTBE緩沖液中電泳，電泳后凝膠成像獲取結(jié)果; (6)判定方法:獲得3條目的條帶為L(zhǎng)P1，兩條目的條帶為L(zhǎng)P，I條目的條帶為非LP，O條目的條帶為非軍團(tuán)菌。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK104313169SQ201410607389
【公開日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年11月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月3日
【發(fā)明者】張琦, 周偉杰, 范曉東, 嚴(yán)潔, 沈波 申請(qǐng)人:無(wú)錫市疾病預(yù)防控制中心, 無(wú)錫市人民醫(yī)院