一種開(kāi)發(fā)基因組ssr分子標(biāo)記的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種開(kāi)發(fā)基因組SSR分子標(biāo)記的方法，取兩個(gè)植物樣本，分別對(duì)樣本進(jìn)行DNA建庫(kù)，得兩個(gè)對(duì)應(yīng)的文庫(kù)；分別對(duì)文庫(kù)采用Illumina測(cè)序技術(shù)進(jìn)行測(cè)序，然后進(jìn)行微組裝，再?gòu)慕?jīng)過(guò)微組裝后得到的Contigs中尋找得樣本的SSR，篩選出兩樣本共有的SSR即染色體位置相同且重復(fù)單元相同的SSR，利用這些共有的SSR對(duì)兩樣本進(jìn)行多態(tài)性篩選，根據(jù)兩樣本的SSR重復(fù)次數(shù)不同判斷是否具有多態(tài)性。本發(fā)明既滿足了尋找大量SSR分子標(biāo)記的要求，又能達(dá)到低成本；SSR分子標(biāo)記以其多態(tài)性高、共顯性遺傳、廣泛分布、模板DNA需求少等優(yōu)勢(shì)可廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性分析、遺傳作圖、QTL定位、分子標(biāo)記輔助育種等。
【專利說(shuō)明】-種開(kāi)發(fā)基因組SSR分子標(biāo)記的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種關(guān)于基因組測(cè)序文庫(kù)中的SSR分子標(biāo) 記開(kāi)發(fā)的技術(shù)。

【背景技術(shù)】
[0002] DNA分子標(biāo)記是指能反映生物個(gè)體或種群間基因組中某種差異的特異性DNA片 段。與常規(guī)的形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記和生化標(biāo)記三類遺傳標(biāo)記技術(shù)相比，DNA分子標(biāo)記直接 具有如下優(yōu)勢(shì)：（1)以DNA的形式存在于動(dòng)植物的任何生長(zhǎng)階段，任何組織都可檢測(cè)到，不 受季節(jié)、環(huán)境的限制，不存在表達(dá)與否的問(wèn)題；（2)數(shù)量極多，基因組變異極其豐富，標(biāo)記的 數(shù)量幾乎是無(wú)限的，多態(tài)性高，利用大量引物、探針可完成覆蓋基因組的分析；（3)許多標(biāo) 記為共顯性，對(duì)隱性的性狀的選擇十分便利，能夠鑒別出純合的基因型與雜合的基因型，提 供完整的遺傳信息。由于以上的特點(diǎn)，DNA分子標(biāo)記發(fā)展成目前應(yīng)用最廣泛的分子標(biāo)記。
[0003] SSR是Simple Sequence Repeats的縮寫，即簡(jiǎn)單序列重復(fù)，亦稱微衛(wèi)星序列，是 近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的建立在PCR基礎(chǔ)上的第二代分子標(biāo)記。SSR由1-6個(gè)核苷酸不斷重復(fù)構(gòu) 成，同一類SSR可分布于整個(gè)基因組的不同位置上，每個(gè)座位上重復(fù)單位的數(shù)目存在差異， 因而造成了每個(gè)座位上的多態(tài)性。微衛(wèi)星在原核生物和真核生物基因組中隨機(jī)分布，而且 該標(biāo)記呈共顯性，符合孟德?tīng)栠z傳模式，易于操作，具有高度重復(fù)性和可靠性，顯示出較強(qiáng) 的多態(tài)性等優(yōu)點(diǎn)，使其在遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、基因定位與輔助選擇育種、系譜與進(jìn)化關(guān)系研 究、種質(zhì)資源鑒定、遺傳多樣性等研究領(lǐng)域有重要應(yīng)用，因此SSR被認(rèn)為是目前最好的分子 標(biāo)記之一。
[0004] 目前SSR的開(kāi)發(fā)策略可以分成兩大類，首先第一類是利用現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)開(kāi)發(fā)SSR。在 Genebank等數(shù)據(jù)庫(kù)中，含有許多物種的基因組序列及EST序列信息，通過(guò)這些序列就可以 方便地通過(guò)SSR搜素軟件獲得SSR。但是對(duì)于地球上存在的龐大的物種來(lái)說(shuō)，目前數(shù)據(jù)庫(kù)中 許多物種基因組DNA信息及其EST序列還非常有限或者根本沒(méi)有，這使得第一類方法的適 用性并不是很廣泛。第二類是通過(guò)建立DNA文庫(kù)，然后對(duì)文庫(kù)測(cè)序，進(jìn)行SSR開(kāi)發(fā)，這類策 略可適用于所有未知基因組DNA或EST序列的物種，主要包括如下三種方式：
[0005] (1)常規(guī)Sanger法，包括如下步驟：DNA提取、SSR富集、構(gòu)建TA克隆文庫(kù)、質(zhì)粒提 取、Sanger測(cè)序、引物設(shè)計(jì)、篩選多態(tài)位點(diǎn)；
[0006] (2)二代測(cè)序法（需要富集），包括如下步驟：DNA提取、SSR序列富集、構(gòu)建二代測(cè) 序文庫(kù)、二代測(cè)序、組裝、尋找SSR、引物設(shè)計(jì)、篩選多態(tài)位點(diǎn)；
[0007] (3)二代測(cè)序法（不需要富集），包括如下步驟：DNA提取、構(gòu)建二代測(cè)序文庫(kù)、二 代測(cè)序、組裝、尋找SSR、引物設(shè)計(jì)、篩選多態(tài)位點(diǎn)。
[0008] Sanger法是單個(gè)片段序列測(cè)定，要構(gòu)建大量的TA克隆文庫(kù)，所以很耗費(fèi)時(shí)間以及 人力，因此遠(yuǎn)不如后兩種使用二代測(cè)序的方法來(lái)的便捷。SSR按照重復(fù)單元堿基來(lái)分類，可 以分為單堿基重復(fù)（共4 1種），二堿基重復(fù)（共42種），三堿基重復(fù)（共43種），四堿基重復(fù) (共4 4種）等等，只計(jì)算單、雙、三堿基重復(fù)的SSR種類數(shù)就達(dá)七+#+# = 84種之多，而富集 SSR的策略是通過(guò)探針雜交來(lái)進(jìn)行的，而探針的種類又不可能設(shè)計(jì)那么多，而往往設(shè)計(jì)幾種 即可，這樣便只能得到幾種SSR，因此，富集SSR的種類和數(shù)目上都遠(yuǎn)比不上不富集SSR的文 庫(kù)，表1列出了文章中出現(xiàn)的通過(guò)二代測(cè)序法開(kāi)發(fā)SSR的利用情況。綜合考慮，使用二代測(cè) 序法，且不做SSR富集，直接建庫(kù)測(cè)序開(kāi)發(fā)SSR的方法最為優(yōu)良。目前二代測(cè)序使用最多的 就是454測(cè)序技術(shù)和Illumina測(cè)序技術(shù)，454測(cè)序技術(shù)采用的是磷酸測(cè)序法，Illumina測(cè) 序技術(shù)采用的是可逆終止法的邊合成邊測(cè)序技術(shù)；相對(duì)于454測(cè)序技術(shù)，Illumina測(cè)序技 術(shù)可以更低廉的價(jià)格獲得基因組序列；但是，目前通過(guò)二代測(cè)序法（不需要富集）開(kāi)發(fā)基因 組SSR，利用的是454測(cè)序技術(shù)，而對(duì)于Illumina測(cè)序技術(shù)，還未見(jiàn)報(bào)道開(kāi)發(fā)基因組SSR，只 有開(kāi)發(fā)轉(zhuǎn)錄本SSR，如表1所示。這是因?yàn)椋?54測(cè)序技術(shù)，可得到的Reads數(shù)目平均讀 長(zhǎng)為500bp，可以在這些Reads中直接進(jìn)行SSR尋找。
[0009] 表1目前二代測(cè)序法開(kāi)發(fā)SSR分子標(biāo)記的情況
[0010]

【權(quán)利要求】
1. 一種開(kāi)發(fā)基因組SSR分子標(biāo)記的方法，其特征在于：取兩個(gè)植物樣本即樣本A和樣 本B，分別對(duì)樣本A和樣本B進(jìn)行DNA建庫(kù)，得兩個(gè)對(duì)應(yīng)的文庫(kù)A和文庫(kù)B ;分別對(duì)文庫(kù)A和文 庫(kù)B采用11 Iumina測(cè)序技術(shù)進(jìn)行測(cè)序，然后進(jìn)行微組裝，再?gòu)慕?jīng)過(guò)微組裝后得到的Cont igs 中尋找得樣本A的SSR和樣本B的SSR，篩選出樣本A和樣本B共有SSR即染色體位置相 同且重復(fù)單元相同的SSR，利用所述的共有SSR對(duì)樣本A和樣本B進(jìn)行多態(tài)性篩選，根據(jù)樣 本A和樣本B的SSR重復(fù)次數(shù)不同判斷是否具有多態(tài)性，從而直接在數(shù)據(jù)分析的層面進(jìn)行 預(yù)篩選步驟，直接得到多態(tài)性的SSR，而不需要再進(jìn)行繁瑣的實(shí)驗(yàn)操作。
2. -種開(kāi)發(fā)基因組SSR分子標(biāo)記的方法，其特征在于所述多態(tài)性的判斷方法如 下：當(dāng)同一重復(fù)單元在兩個(gè)樣本中重復(fù)次數(shù)不一致時(shí)，則認(rèn)為該SSR分子標(biāo)記具有多態(tài) 性，便可以進(jìn)行引物設(shè)計(jì)并驗(yàn)證其多態(tài)性；例如，AG重復(fù)單元在樣本A中重復(fù)了 10次， AGAGAGAGAGAGAGAGAGAG，而在樣本 B 中重復(fù)了 11 次，AGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAG，我們認(rèn)為該 SSR分子標(biāo)記具有多態(tài)性。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104313146SQ201410550682
【公開(kāi)日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年10月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月16日
【發(fā)明者】劉宇婧, 郭鈺, 龍春林, 吳沿友, 付為國(guó), 邢德科, 張川 申請(qǐng)人:江蘇大學(xué)