一種高效水解鞘脂制備溶血鞘脂的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高效水解鞘脂制備溶血鞘脂的方法。首先，本發(fā)明對(duì)于鞘脂神經(jīng)酰胺N-去酰基化酶SCDase G8進(jìn)行了改造，去除了N末端信號(hào)肽并截短了C末端，得到了高活力的SCDase G8的突變體SCDase G8-del，并針對(duì)宿主細(xì)胞對(duì)編碼基因進(jìn)行了密碼子優(yōu)化；通過蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化，提高了SCDase G8-del的可溶性表達(dá)量。在此基礎(chǔ)上建立了一種利用SCDase G8-del高效水解鞘脂制備溶血鞘脂的方法。該方法優(yōu)化了高活力的SCDase G8-del的可溶性表達(dá)條件，優(yōu)化了反應(yīng)體系中金屬離子濃度，優(yōu)化了表面活性劑的種類和濃度，提高了溶血鞘脂產(chǎn)率，并且優(yōu)化后的反應(yīng)體系對(duì)高濃度的鞘脂和不同種類的鞘脂都有較好的水解作用。
【專利說明】一種高效水解鞘脂制備溶血鞘脂的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種制備溶血鞘脂的方法，尤其涉及一種利用鞘 脂神經(jīng)酰胺N-去?；父咝馇手苽淙苎手姆椒?。

【背景技術(shù)】
[0002] 鞘脂（Sphingolipids)包括鞘糖脂（Glycosphingolipids)、鞘磷月旨 (Sphingomyelin)、神經(jīng)酰胺（Ceramide),具有著重要的生物學(xué)功能，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì) 胞粘附/識(shí)別、胞吞、細(xì)胞凋亡與自噬、腦老化、神經(jīng)退行性病變、神經(jīng)保護(hù)等生理過程 中起著重要作用（Merrill AH Jr, J Bio Chem, 2002, 277(29) :25843-25846 ;Hannun YA, et al. , Nat Rev Mol Cell Biol,2008, 9(2):139-150 ；Posse de Chaves E, et al. ,FEBS Lett, 2010, 584(9):1748-1759 ；Regina Todeschini A, et al.,Biochim Biophys Acta, 2008, 1780 (3) : 421-433 ；Lopez PH, et al. , Curr Opin Struct Biol，2009, 19(5) :549-557.)。溶血鞘脂是鞘脂N-去?；漠a(chǎn)物，在正常組織中，溶血 鞘脂的含量極低，但在一些溶酶體貯積癥中會(huì)累積。一些溶血鞘脂可以作為一些溶酶體貯 積癥的生物標(biāo)志分子，例如葡糖苷鞘氨醇（溶血葡糖苷神經(jīng)酰胺）是1型戈謝病（typel Gaucher disease)的分子標(biāo)志物；溶血鞘糖脂Gb3是法布瑞氏癥（Fabry disease)的分子 標(biāo)志物；溶血鞘糖脂 GM2 是 Tay-Sachs ?。═ay-Sachs disease)和 Sandhoff ?。⊿andhoff disease)的分子標(biāo)志物（Cox TM, et al·，J Pathol，2012,226(2):241_254;Dekker N，et al. ,Blood, 2011, 118(16) :ell8-127 ；Kodama T, et al. , PLoS One, 2011, 6 (12) : e29074 ； Aerts JM,et al·, Proc Natl Acad Sci U S A, 2008, 105 (8): 2812-2817·)。另外，溶血鞘脂 的一個(gè)非常重要的應(yīng)用是可以用來制備各種不同的鞘脂類似物，這些鞘脂類似物可用于合 成藥物（例如鞘糖脂GMl類似物L(fēng)IGA20)、研究鞘脂的生物學(xué)功能、以及應(yīng)用于血清學(xué)診斷 和酶活測定等方面（Manev H, et al.，J Pharmacol Ther, 1990, 252(1) :419-427 ;Mocche1:ti I.Cell Mol Life Sci, 2005, 62(19-20):2283-2294 ；Panasiewicz M, et al. , Biochemist ry, 2003, 42(21):6608-6619 ；Nakagawa T, et al. , J Lipid Res, 2005, 46(6):1103-1112 ； Nagatsuka T, et al.,ACS Appl Mater Interfaces,2013,5 (10) :4173-4180 ； Nakagawa T, J Biochem, 1999, 126 (3) :604-61L )。目前，有報(bào)道用化學(xué)方法水解 鞘脂來制備溶血鞘脂（Taketomi T，et al·，J biochem, 1996, 120 (3) :573-579; Taketomi T, et al. , J biochem, 1997, 121 (2):264-269 ；Valiente 0, et al. , J Lipid Res, 2001，42(8) : 1318-1324.)，但化學(xué)方法存在反應(yīng)條件劇烈、容易生成副產(chǎn)物、產(chǎn)品分離 純化困難等缺陷，使得產(chǎn)量低并且有一定污染。
[0003] 鞘脂神經(jīng)酰胺N-去?；福⊿CDase)能夠特異水解各種鞘脂，可以用來 制備溶血鞘脂。目前報(bào)道過的S⑶ase主要有兩種，分別來自假單胞菌TK4(S⑶ase TK4)和海藻希瓦氏菌G8的（S⑶ase G8)，這兩個(gè)酶氨基酸序列沒有同源性（Ito M, et al.,J Biol Chem, 1995, 270(41):24370-24374 ；Furusato M, et al. , J Bio Chem, 2002, 277 (19) : 17300-17307.)。目前酶法制備溶血鞘脂用的酶主要是SCDase TK4， 但該酶難以在大腸桿菌中可溶性表達(dá)，商品化生產(chǎn)SCDase TK4依賴于從原始菌的培養(yǎng)液 中提取，導(dǎo)致該酶價(jià)格非常昂貴，用來制備溶血鞘脂的成本相當(dāng)高。另外，由于該酶除水 解鞘脂的活性之外還可以催化其逆反應(yīng)合成鞘脂，使得溶血鞘脂產(chǎn)物的產(chǎn)率低。雖然有 報(bào)道用含有機(jī)溶劑的兩相體系優(yōu)化該酶的水解條件，提高了溶血鞘脂的產(chǎn)量，但該方法復(fù) 雜，并且不適用于溶血鞘脂的大量制備，難以滿足實(shí)際需要（Kurita T.，et al.，J Lipid Res, 2000, 41 (5) :846-851.)。SCDase G8有報(bào)道該蛋白可以在大腸桿菌中可溶性表達(dá)，但該 酶的可溶性表達(dá)量還是很低，使其應(yīng)用受到較大限制（Furusato M，et al.，J Bio Chem, 20 02, 277(19):17300-17307.)。
[0004] 因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員致力于開發(fā)一種能夠高效制備溶血鞘脂的方法，而此方 法的關(guān)鍵就是實(shí)現(xiàn)高活力的SCDase在宿主細(xì)胞中高效表達(dá)，并提高該酶水解鞘脂制備溶 血鞘脂的產(chǎn)率。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是尋找一種能夠在宿主 細(xì)胞中高效表達(dá)的鞘脂神經(jīng)酰胺N-去酰基化酶（SCDase)，并利用該酶高效水解鞘脂制備 溶血鞘脂。
[0006] 根據(jù)前人研究，C末端截短30kDa的突變體S⑶ase G8活性顯著高于長全的酶 (Furusato M，et al·，J Bio Chem, 2002, 277 (19): 17300-17307·)，但對(duì)于其高效表達(dá)條件 未見報(bào)道。本發(fā)明依照大腸桿菌密碼子偏好性，對(duì)SCDase G8基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，將去掉 N端信號(hào)肽及C端截短的S⑶ase G8(S⑶ase G8_del)基因構(gòu)建到載體中。將構(gòu)建好的重組 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中，通過蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化，增強(qiáng)了目的蛋白SCDase G8_del的可溶 性表達(dá)。
[0007] 從而為實(shí)現(xiàn)高效制備溶血鞘脂的目的，本發(fā)明提供了一種高效水解鞘脂制備溶血 鞘脂的方法，該方法包括以下步驟：
[0008] 1)構(gòu)建SCDase G8截短突變體SCDase G8_del的表達(dá)載體；
[0009] 2)高效表達(dá)重組蛋白SCDase G8_del ;
[0010] 3)利用步驟2)中的重組蛋白S⑶ase G8-del水解鞘脂制備溶血鞘脂。
[0011] 其中，所述的突變體S⑶ase G8-del是去除了 N端的信號(hào)肽，截短了 C端30kDa，且 對(duì)其編碼基因依據(jù)大腸桿菌中密碼子使用頻率進(jìn)行了密碼子優(yōu)化的突變體，其基因序列如 SEQ ID NO: 1所示；蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0012] 進(jìn)一步地，步驟1)中構(gòu)建S⑶ase G8_del的表達(dá)載體的具體步驟包括：a.合成目 的基因片段；b. PCR擴(kuò)增目的基因片段；c.將目的基因片段插入表達(dá)載體質(zhì)粒中；其中優(yōu)選 地，PCR擴(kuò)增所使用的引物為：
[0013] 上游:5' 一GTACTTCCATATGACCACGCAAGCCGTCGATT - 3' (下劃線標(biāo)注的為 Nde I 酶 切位點(diǎn)）
[0014] 下游：5' - CCGCTCGAGATGGGCTTCCGCACGTT- 3，(下劃線標(biāo)注的為 Xho I 酶切位 點(diǎn)）；
[0015] 優(yōu)選的表達(dá)載體質(zhì)粒為pET_23b (+)。
[0016] 進(jìn)一步地，步驟2)中所述的高效表達(dá)是指將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞 中并通過一定的誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)增強(qiáng)蛋白的表達(dá)，包括但不限于利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)或利用 自動(dòng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)并在低溫條件下誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。
[0017] 優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌BL21 (DE3)。
[0018] 本發(fā)明還提供了一種高效水解鞘脂制備溶血鞘脂的反應(yīng)體系，包括：表面活性劑、 緩沖液、底物鞘脂、S⑶ase酶和金屬離子。
[0019] 優(yōu)選地，上述反應(yīng)體系中所述金屬離子包括但不限于：0&2+^11 2+、&)2+、1%2+，其中最 優(yōu)選為Ca2+。
[0020] 優(yōu)選地，反應(yīng)體系中金屬離子濃度為1-lOOOmM，其中最優(yōu)選Ca2+的濃度為100mM。
[0021] 優(yōu)選地，上述反應(yīng)體系中的表面活性劑包括但不限于Triton X-100、?；敲撗跄?酸鈉（TDC)、膽酸鈉或吐溫80,其中最優(yōu)選為牛磺脫氧膽酸鈉（TDC)。
[0022] 優(yōu)選地，上述反應(yīng)體系中表面活性劑的濃度為0. 01-2% (v/v或w/v)。
[0023] 優(yōu)選地，上述體系中的底物鞘脂為鞘糖脂、鞘磷脂或神經(jīng)酰胺。
[0024] 優(yōu)選地，上述反應(yīng)體系中的底物鞘脂濃度為0. 01_50mM，最優(yōu)選濃度為0. 5_8mM。
[0025] 優(yōu)選地，上述反應(yīng)體系中用到的酶為S⑶ase G8_del。
[0026] 優(yōu)選地,上述反應(yīng)體系中酶的用量為不少于1U/L,最優(yōu)選用量為不少于30U/L。
[0027] 利用以上技術(shù)方案，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0028] 1、相比之前的方法，本發(fā)明獲得的SCDase G8_del表達(dá)量高、成本低，對(duì)于高濃度 的鞘脂和不同種類的鞘脂都有很好的水解作用。
[0029] 2、利用本發(fā)明提供制備溶血鞘脂的方法，具有操作簡便、成本低、鞘脂產(chǎn)率高、易 于大量制備等特點(diǎn)。
[0030] 以下將結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的構(gòu)思、【具體實(shí)施方式】及產(chǎn)生的技術(shù)效果作進(jìn) 一步說明，以充分地了解本發(fā)明的目的、特征和效果。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0031] 圖1是自動(dòng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基增強(qiáng)S⑶ase G8-del的可溶性表達(dá)；
[0032] 圖2是各種濃度的鈣離子對(duì)酶法制備溶血GMl的促進(jìn)作用；
[0033] 圖3是IOOmM的不同金屬離子對(duì)酶法制備溶血GMl的促進(jìn)作用；
[0034] 圖4是比較不同表面活性劑與高濃度鈣離子聯(lián)用對(duì)制備溶血GMl的促進(jìn)作用；
[0035] 圖5是高濃度表面活性劑TDC與高濃度鈣離子聯(lián)用對(duì)制備溶血GMl的促進(jìn)作用；
[0036] 圖6是不同反應(yīng)體系對(duì)不同濃度底物GMl的水解作用；
[0037] 圖7是比較優(yōu)化前后的反應(yīng)體系對(duì)不同鞘糖脂的水解。1，4,7 :鞘糖脂標(biāo)準(zhǔn)品；2， 5,8 :優(yōu)化前的反應(yīng)體系；3,6,9 :優(yōu)化后的反應(yīng)體系。

【具體實(shí)施方式】
[0038] 實(shí)施例I :S⑶ase G8截短突變體表達(dá)載體的構(gòu)建
[0039] (I) SCDase G8截短突變體基因的獲得
[0040] 通過以如的關(guān)于S⑶ase G8的報(bào)道，并通過NCBI進(jìn)彳丁檢索，可以犾得該蛋白基因 的全長序列（GenBank:AB079849. 1)。由于去掉C端30kDa的SCDase G8具有更高的活性， 因而截短的SCDase G8基因依據(jù)大腸桿菌中密碼子使用頻率進(jìn)行密碼子優(yōu)化，并合成基因， 合成的基因片段插入PUC18載體中。
[0041] (2)重組表達(dá)載體的構(gòu)建
[0042]目的基因通過PCR方法擴(kuò)增獲得，為有效表達(dá)重組蛋白，去掉了蛋白N端的信號(hào)肽 (38個(gè)氨基酸）?；騼啥说拿盖形稽c(diǎn)與表達(dá)載體pET-23b (+)的Nde I和Xho I相對(duì)應(yīng)， 用于將目的基因插入該表達(dá)載體。PCR產(chǎn)物經(jīng)PCR回收試劑盒純化回收，純化后的產(chǎn)物進(jìn)行 限制性雙酶切和Dpn I消化質(zhì)粒模板。在100 μ 1的反應(yīng)體系中含純化的PCR產(chǎn)物20 μ 1， Nde I 與 Xho I 各 5yl，Dpn I lyl，10Xbuffer 10μ1，水 59μ1。反應(yīng)混合液在 37°C中 水浴lh，然后純化回收，用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，測定其純度與濃度，于-20°C保存，備 用。
[0043] pET_23b (+)質(zhì)粒載體用質(zhì)粒提取試劑盒從含pET_23b (+)質(zhì)粒的E. coli DH5 α 菌中提取，載體同樣用限制性內(nèi)切酶Nde I和Xho I雙酶切并用堿性磷酸酶去磷酸化。 30μl的反應(yīng)體系中包含有pET-23b(+)載體8μl，NdeI與XhoI各lμl，APaselμl， IOXbuffer 3μ 1，水16μ 1。反應(yīng)混合液置于37°C水浴，保溫lOmin，并用0. 8%瓊脂糖凝 膠電泳檢測。純化回收雙酶切后的線性質(zhì)粒大片斷，用0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，測定其 純度和濃度，分裝后于_20°C保存,備用。
[0044] 利用TAKARA快速連接試劑盒將酶切純化后的目的基因與酶切純化后的 pET-23b(+)線性載體進(jìn)行連接。20μ 1的反應(yīng)體系包含線性化的pET-23b(+)載體3μ 1，酶 切純化后的目的基因7μ1及solution I ΙΟμΙ。將反應(yīng)混合液置于16°C孵育30min,然后 于冰上放置5min，即可用于轉(zhuǎn)化。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入克隆菌株E. coli XL-Blue,選擇1-3個(gè) 陽性克隆進(jìn)行測序驗(yàn)證。將測序正確的含有目的基因的重組質(zhì)粒從E. coliXL-Blue中提取 出來。
[0045] 實(shí)施例2 :重組蛋白SCDase G8_del的表達(dá)
[0046] 利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主細(xì)胞E. coli BL21(DE3)中，挑 取單克隆于LB培養(yǎng)基（1% Tryptone，0. 5% Yeast Extract和1% NaCl)中培養(yǎng)，約培養(yǎng) 7-8h，將菌液I : 100轉(zhuǎn)至新鮮的LB培養(yǎng)基中于37°C繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)OD6c?達(dá)到0. 6-0. 8時(shí)，力口 入終濃度為〇. 2mM的IPTG，并轉(zhuǎn)移至16°C培養(yǎng)20h。
[0047] 自動(dòng)誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，將培養(yǎng)于LB培養(yǎng)基的菌液，I : 100接于自動(dòng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基 ZYM-5052(1% tryptone,0. 5% yeast extract,0.5% glycerol,0. 05% glucose,0.2% a-lactose，25mM Na2HP04,25mM KH2P04,50mM NH4Cl，5mM Na2SO4 和 2mM MgSO4)于 37°C繼續(xù) 培養(yǎng)，當(dāng)OD6c?達(dá)到2. 2-2. 4時(shí)（培養(yǎng)約3h)，降至16°C繼續(xù)培養(yǎng)20h。
[0048] 誘導(dǎo)后的菌液在4°C下8000rpm離心IOmin收集菌體，然后重懸于含500mM NaCl 和20mM咪唑的20mM Tris-HCl (pH 8. 0)裂解緩沖液中（lg濕菌用20ml裂解緩沖液重懸）。 重懸后的菌液用超聲破碎，并在4°C下12000rpm離心30min，收集上清，過0. 45 μ m濾膜，然 后使用鎳親和層析（Ni-NTA Agarose)進(jìn)行純化。具體步驟為：上清掛柱兩次，用10ml wash buffer(20mM Tris-HCl (pH 8.0)，500mM NaCl 和 40mM 咪唑）洗掉掛上的雜蛋白，用 IOml elute buffer (20mM Tris-HCl(pH 8.0)，500mM NaCl 和 80mM 咪唑）洗下目的蛋白。為比較 自動(dòng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基ZYM-5052與LB培養(yǎng)基對(duì)蛋白的可溶性表達(dá)的影響，取等量（Ig)濕菌，按 上述步聚純化蛋白，并跑SDS-PAGE膠，可以看到用自動(dòng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基，能顯著增加重組蛋白 的可溶性表達(dá)量（如圖1所示）。為水解鞘脂制備溶血鞘脂，按上述步驟純化的蛋白裝于透 析袋中，用含10%甘油的25mM TriS-HCl (pH 7.4)的緩沖液4°C透析兩次。透析后的酶液 分裝于1.5ml EP管中，于-80°C保存。
[0049] 實(shí)施例3 :金屬離子對(duì)酶法水解GMl制備溶血GMl的促進(jìn)作用
[0050] 酶法水解GMl制備溶血GMl的反應(yīng)體系為：100 μ 1的反應(yīng)混合液中，有70 μ 1含 0· 1 % Triton Χ-100的50mM乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 5. 8)，10 μ 1的酶溶液（?74. 2mU)， 以及終濃度為ImM的鞘糖脂GMl和各種濃度的金屬離子Ca2+或IOOmM的金屬離子Ca2+、Mn 2+、 Co2+、Mg2+，以不加金屬離子的反應(yīng)體系作對(duì)照，反應(yīng)混合液于37°C孵育12h，充分水解GMl。 通過高效液相色譜（HPLC)檢測剩余GMl的含量來計(jì)算轉(zhuǎn)化率。HPLC的檢測條件如下：流動(dòng) 相為0.03%的三乙胺仏）和乙腈出），0-211^11用20%六和80%8,2-71^11用20%-15% A 和 80% - 85% B，7 - 9min 用 15% A 和 85% B，9 - 13min 用 20% A 和 80% B，流速為 Iml/ min，柱溫為30°C，紫外檢測波長為205nm，柱子為Eclipse Plus C18, HPLC儀器型號(hào)為 Agilent 1260。
[0051] 結(jié)果顯示，高濃度的金屬離子，可以顯著提高酶對(duì)GMl的水解率，使得溶血GMl產(chǎn) 率從40. 7%提高到81. 6% (如圖2和圖3所示）。
[0052] 實(shí)施例4 :表面活性劑對(duì)酶法水解GMl制備溶血GMl的促進(jìn)作用
[0053] 酶法水解GMl制備溶血GMl的反應(yīng)體系為：100 μ 1的反應(yīng)混合液中，有70 μ 1含 0.1|%不同表面活性劑（1'1'；[1:011乂-1000八）、10(](￥八）、膽酸鈉（￥八）、吐溫80〇八)）的 50mM乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 5. 8)，10 μ 1的酶溶液（?74. 2mU)，以及終濃度為ImM的鞘 糖脂GMl和IOOmM的金屬離子Ca2+，反應(yīng)混合液于37°C孵育12h，充分水解GMl。通過HPLC檢 測剩余GMl的含量來計(jì)算轉(zhuǎn)化率。HPLC的檢測條件如下：流動(dòng)相為0. 03%的三乙胺（A)和 乙腈（8)，0-211^11用20%六和80%8,2-711^11用20%-15%六和80%-85%8,7-911^11 用15% A和85% B，9 - 13min用20% A和80% B，流速為lml/min，柱溫為30°C，紫外檢測 波長為 205nm，柱子為 Eclipse Plus C18, HPLC 儀器型號(hào)為 Agilent 1260。
[0054] 結(jié)果顯示，在終濃度為IOOmM的Ca2+的基礎(chǔ)上，用含0. 07% TDC (w/v)的反應(yīng)混合 液，進(jìn)一步促進(jìn)GMl的水解，使溶血GMl產(chǎn)率達(dá)到88. 2 % (如圖4所示）。
[0055] 實(shí)施例5 :高濃度的表面活性劑TDC對(duì)酶法水解GMl制備溶血GMl的促進(jìn)作用
[0056] 酶法水解GMl制備溶血GMl的反應(yīng)體系為：100 μ 1的反應(yīng)混合液中，有70 μ 1含 不同濃度的表面活性劑TDC(w/v)的50mM乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 5. 8)，10 μ 1的酶溶液 (?74. 2mU)，以及終濃度為ImM的鞘糖脂GMl和IOOmM的金屬離子Ca2+，反應(yīng)混合液于37°C 孵育12h，充分水解GMl。通過HPLC檢測剩余GMl的含量來計(jì)算轉(zhuǎn)化率。HPLC的檢測條件 如下：流動(dòng)相為0. 03%的三乙胺（A)和乙腈（B)，0-2min用20%六和80%8,2-711^11用 20 % - 15 % A 和 80 % - 85 % B，7 - 9min 用 15 % A 和 85 % B，9 - 13min 用 20 % A 和 80 % B，流速為lml/min，柱溫為30°C，紫外檢測波長為205nm，柱子為Eclipse Plus C18, HPLC儀 器型號(hào)為Agilent 1260。
[0057] 結(jié)果顯示，在終濃度為IOOmM的Ca2+的基礎(chǔ)上，隨著TDC的濃度的增加，溶血GMl 產(chǎn)率進(jìn)一步增大，當(dāng)反應(yīng)混合液中TDC的濃度達(dá)到0. 28%時(shí)，產(chǎn)率達(dá)到94. 7%，進(jìn)一步增加 TDC濃度至0. 7 %，產(chǎn)率基本保持不變（如圖5所示）。
[0058] 實(shí)施例6 :酶法水解高濃度GMl制備溶血GMl
[0059] 酶法水解GMl制備溶血GMl的反應(yīng)體系為：100 μ 1的反應(yīng)混合液中，有70 μ 1含不 同濃度的表面活性劑TDC (w/v)的50mM乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 5. 8)，10 μ 1的酶溶液（? 74. 2mU)，以及終濃度為IOOmM的金屬離子Ca2+和不同濃度的鞘糖脂GMl (0. 5-8mM)，反應(yīng)混 合液于37°C孵育12h，充分水解GMl。通過HPLC檢測剩余GMl的含量來計(jì)算轉(zhuǎn)化率。HPLC 的檢測條件如下：流動(dòng)相為0.03%的三乙胺（A)和乙腈（B)，0-2min用20% A和80% B， 2-7min 用 20% -15%A 和 80% -85%B，7-9min 用 15%A 和 85%B，9-13min 用 20% A和80% B，流速為lml/min，柱溫為30°C，紫外檢測波長為205nm，柱子為Eclipse Plus C18, HPLC 儀器型號(hào)為 Agilent 1260。
[0060] 結(jié)果顯示，在終濃度為IOOmM的Ca2+的基礎(chǔ)上，高濃度的TDC有利于高濃度的GMl 的水解，當(dāng)反應(yīng)混合液中TDC的濃度為0. 56%時(shí)，即使底物GMl濃度達(dá)到8mM，溶血GMl產(chǎn) 率仍然達(dá)到91. 3% (如圖6所示）。
[0061] 實(shí)施例7 :酶法高效水解不同鞘糖脂制備對(duì)應(yīng)的溶血鞘糖脂。
[0062] 酶法水解不同鞘糖脂制備溶血鞘糖脂的優(yōu)化前的反應(yīng)體系為：100 μ 1的反應(yīng)混 合液中，有7〇μ 1含0. 1% (ν/ν)表面活性劑Triton Χ-100的50mM乙酸-乙酸鈉緩沖液 (pH 5·8)，10μ1的酶溶液（?74.2mU)，以及終濃度為0.2mM的不同鞘糖脂（GM1，GM3， Sulfatide)，反應(yīng)混合液于37°C孵育12h，充分水解鞘糖脂，通過薄層層析（TLC)來檢測鞘 糖脂的水解程度；優(yōu)化后的反應(yīng)體系為：1〇〇μ 1的反應(yīng)混合液中，有70μ 1含0. 8% (w/ v)表面活性劑TDC的50mM乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 5. 8)，10 μ 1的酶溶液，以及終濃度為 0. 2mM的不同鞘糖脂（GM1，GM3, Sulfatide)和IOOmM的金屬離子Ca2+，反應(yīng)混合液于37°C 孵育12h，充分水解鞘糖脂，通過TLC來檢測鞘糖脂的水解程度。TLC的展開劑為氯仿、甲 醇、0.02% CaCl2 (5:4:1)，顯色試劑為地衣酚-硫酸（Orcinol-H2SO4)試劑（使用前將7.5ml 60% H2SO4加到Iml的1. 6%的地衣酚水溶液中）。
[0063] 結(jié)果顯示，優(yōu)化后的反應(yīng)體系能顯著提高酶對(duì)不同鞘糖脂的水解率（如圖7所 示）。
[0064] 以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的較佳具體實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員無 需創(chuàng)造性勞動(dòng)就可以根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思作出諸多修改和變化。因此，凡本【技術(shù)領(lǐng)域】中技術(shù) 人員依本發(fā)明的構(gòu)思在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上通過邏輯分析、推理或者有限的實(shí)驗(yàn)可以得到的 技術(shù)方案，皆應(yīng)在由權(quán)利要求書所確定的保護(hù)范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1. 一種高效水解鞘脂制備溶血鞘脂的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟： 1) 構(gòu)建S⑶ase G8截短突變體S⑶ase G8-del的表達(dá)載體； 2) 高效表達(dá)重組蛋白SCDase G8_del ; 3) 利用步驟2)中的重組蛋白SOTase G8_del水解鞘脂制備溶血鞘脂。 其中，所述的突變體S⑶ase G8_del是去除了 N端的信號(hào)肽，截短了 C端30kDa，且對(duì)其 編碼基因依據(jù)大腸桿菌中密碼子使用頻率進(jìn)行了密碼子優(yōu)化的突變體，其基因序列如SEQ ID NO: 1所示；蛋白的氨基酸序如SEQ ID NO:2所示。
2. 如權(quán)利要求1所述的高效水解鞘脂制備溶血鞘脂的方法，其特征在于，步驟1)中構(gòu) 建S⑶ase G8_del的表達(dá)載體的具體步驟包括：a.合成目的基因片段；b. PCR擴(kuò)增目的基因 片段；c.將目的基因片段插入表達(dá)載體質(zhì)粒中。
3. 如權(quán)利要求2所述的高效水解鞘脂制備溶血鞘脂的方法，其特征在于，步驟b中PCR 擴(kuò)增所使用的引物為： 上游：5，- GTACTTCCATATGACCACGCAAGCCGTCGATT- 3' 下游：5，- CCGCTCGAGATGGGCTTCCGCACGTT-3,。
4. 如權(quán)利要求1所述的高效水解鞘脂制備溶血鞘脂的方法，其特征在于，步驟2)中所 述高效表達(dá)是利用IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。
5. 如權(quán)利要求1所述的高效水解鞘脂制備溶血鞘脂的方法，其特征在于，步驟2)中所 述高效表達(dá)是利用自動(dòng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)并在低溫條件下誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。
6. -種高效水解鞘脂制備溶血鞘脂的方法，其特征在于，所述水解的反應(yīng)體系包括： 表面活性劑、緩沖液、底物鞘脂、SCDase酶和金屬離子。
7. 如權(quán)利要求6所述的高效水解鞘脂制備溶血鞘脂的方法，其特征在于，所述金屬離 子為 Ca2+、Mn2+、Co2+ 或 Mg2+。
8. 如權(quán)利要求6所述的高效水解鞘脂制備溶血鞘脂的方法，其特征在于，所述反應(yīng)體 系中的表面活性劑為Triton X-100、?；敲撗跄懰徕c（TDC)、膽酸鈉或吐溫80。
9. 如權(quán)利要求6-8任一項(xiàng)所述的水解鞘糖脂制備溶血鞘糖脂的方法，其特征在于，所 述底物鞘脂為鞘糖脂、鞘磷脂或神經(jīng)酰胺。
10. 如權(quán)利要求6-8任一項(xiàng)所述的水解鞘糖脂制備溶血鞘糖脂的方法，其特征在于，所 述SCDase酶為SCDase G8-del酶，其基因序列如SEQ ID N0:1所示；蛋白的氨基酸序如SEQ ID NO:2 所示。
【文檔編號(hào)】C12N9/80GK104293843SQ201410508221
【公開日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年9月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月28日
【發(fā)明者】楊廣宇, 馮雁, 黃鋒濤, 韓云賓 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)