一種富鍺桑黃發(fā)酵產(chǎn)物的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種富鍺桑黃發(fā)酵產(chǎn)物的制備方法，包括：將活化的桑黃菌種接種于添加辣木提取物的液體種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)得桑黃液體菌種；先將桑黃液體菌種接入添加有汗麻葉酶解物、甜菜渣、富鍺酵母和茶籽餅的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)得富鍺桑黃固體培養(yǎng)物Ⅰ；再將桑黃液體菌種接入添加富鍺桑黃固體培養(yǎng)物Ⅰ、富鍺酵母和柳珊瑚降解物的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)得富鍺桑黃液體發(fā)酵產(chǎn)物。本發(fā)明通過(guò)在固體發(fā)酵和液體發(fā)酵階段添加有利于有機(jī)鍺和鍺多糖代謝生成的外源添加物，并將桑黃在固體發(fā)酵階段的培養(yǎng)產(chǎn)物作為外源添加物添加到液體發(fā)酵階段中循環(huán)利用，通過(guò)固體發(fā)酵和液體發(fā)酵兩階段的協(xié)同培養(yǎng)，大幅度提高了最終桑黃發(fā)酵產(chǎn)物中有機(jī)鍺、桑黃鍺多糖的含量和活性。
【專利說(shuō)明】一種富鍺桑黃發(fā)酵產(chǎn)物的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種富鍺桑黃發(fā)酵產(chǎn)物的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 桑黃（Phellinus igniarius)屬擔(dān)子菌亞門(mén)，層孔菌綱，銹革孔菌科，針層孔菌屬。 桑黃菌提取物在抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和防止癌癥手術(shù)后復(fù)發(fā)等的臨床應(yīng)用中具有顯著效果，是 目前國(guó)際公認(rèn)的生物治癌藥劑中有效率最高的一種藥用真菌。作為目前國(guó)際公認(rèn)的抗癌效 果最好的大型藥用真菌，桑黃抑制腫瘤的研究主要集中在藥理活性成分桑黃多糖上。
[0003] 鍺是一種具有高度生物活性的微量元素，是人體不可缺少的物質(zhì)之一。鍺主要以 化合物和絡(luò)合物的形式存在，分為無(wú)機(jī)鍺與有機(jī)鍺兩種，無(wú)機(jī)鍺毒性較大，對(duì)人體是嚴(yán)格禁 用的，有機(jī)鍺的藥理作用和保健功能已引起了人們的重視，尤其是富集在植物和草藥中的 有機(jī)鍺被認(rèn)為是發(fā)揮藥理作用和保健功能的主要因素。近年來(lái)研究表明：有機(jī)鍺可使人體 酶活化，增強(qiáng)細(xì)胞活力，促進(jìn)機(jī)體新陳代謝，具有抗腫瘤、消炎與免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗氧化、 抗衰老、降血脂、促進(jìn)植物和微生物的生長(zhǎng)、改善血液循環(huán)、增加攜氧量等多重功能，某些藥 物的醫(yī)療保健功能都與之有關(guān)。
[0004] 食藥真菌具有很強(qiáng)的富集微量元素的作用，是鍺元素的優(yōu)良載體生物。桑黃作為 富集鍺元素的載體，可通過(guò)菌絲細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝的轉(zhuǎn)化將鍺結(jié)合到大分子活性物質(zhì)上，形 成鍺多糖和鍺蛋白。富鍺桑黃多糖含有微量的天然有機(jī)鍺，是鍺與多糖的聯(lián)合體，集多糖和 鍺的優(yōu)點(diǎn)和生物活性于一身。
[0005] 鍺多糖既可作為免疫調(diào)節(jié)劑，又可作為防癌、抗病毒的保健品，其生物活性普遍高 于多糖和有機(jī)鍺，且更易于機(jī)體的吸收和利用。在清除活性氧自由基方面鍺多糖也有獨(dú)特 功能，從而可以使人體避免由氧自由基引起的如炎癥、衰老、腫瘤、免疫性損傷、某些藥物毒 性等100余種疾病。
[0006] 微生物發(fā)酵是一個(gè)十分復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng)過(guò)程。有些次生代謝產(chǎn)物的合成代謝 非常復(fù)雜，發(fā)酵過(guò)程的細(xì)微差別都會(huì)引起產(chǎn)物代謝的不同響應(yīng)。在真菌不同生長(zhǎng)階段用外 源添加物處理，其細(xì)胞生長(zhǎng)和次級(jí)代謝產(chǎn)物的積累程度不同。
[0007] 中國(guó)專利申請(qǐng)CN201310339260. 7公開(kāi)了一種富鉻錳鍺硒硼靈芝菌絲體液體發(fā)酵 的方法，該方法包括：（1)將菌株轉(zhuǎn)接于斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)、活化，得到斜面菌種；（2) 將斜面菌種制成孢子懸液，接于液體培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)，得到液體菌種；（3)發(fā)酵培養(yǎng)基 高溫滅菌后冷卻，再將液體菌種接入，搖瓶培養(yǎng)，得到含菌絲體的發(fā)酵液；(4)通過(guò)過(guò)濾將 菌絲體及發(fā)酵液分離，純凈水沖洗菌絲，洗去培養(yǎng)基，收集菌絲體，烘至恒重，制得干菌絲 體。該方法的技術(shù)關(guān)鍵是在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加微量元素。
[0008] 中國(guó)專利ZL200910011338. 6公開(kāi)了一種富鍺靈芝菌絲體的生產(chǎn)方法，按以下步 驟進(jìn)行：制備富鍺玉米浸泡液；在富鍺玉米浸泡液中加入碳源、氮源、中量元素、豆油制備 培養(yǎng)基并滅菌、冷卻；在培養(yǎng)基中接種經(jīng)斜面培養(yǎng)的靈芝液體菌種，培養(yǎng)菌種至生成靈芝菌 絲體?？蓪⒂袡C(jī)鍺元素（玉米鍺）轉(zhuǎn)化為靈芝鍺生物大分子，明顯提高了靈芝中有機(jī)鍺含 量，使靈芝在有效發(fā)揮靈芝多糖作用的前提下，還可以充分發(fā)揮有機(jī)鍺的作用。
[0009] 上述技術(shù)一般僅單一采用液態(tài)或固態(tài)發(fā)酵方式，簡(jiǎn)單地模仿常規(guī)食藥用菌菌絲體 發(fā)酵的方式，以牛肉膏、蛋白胨或普通酵母粉為氮源，以蔗糖、葡萄糖或大米為主要碳源，在 培養(yǎng)基中添加二氧化鍺等無(wú)機(jī)鍺為主的鍺源，未考慮特定食藥用菌在發(fā)酵過(guò)程中對(duì)培養(yǎng)基 的特殊營(yíng)養(yǎng)要求，配方的組分缺乏針對(duì)性。由于食藥用菌液體培養(yǎng)時(shí)間有限，無(wú)機(jī)鍺等一般 不容易被菌絲體吸收，簡(jiǎn)單通過(guò)培養(yǎng)時(shí)間有限的液體發(fā)酵制備富鍺食藥用菌菌絲體會(huì)導(dǎo)致 菌絲體、發(fā)酵液中的有機(jī)鍺、鍺多糖等有效組分含量不高。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述技術(shù)問(wèn)題，提供一種富鍺桑黃發(fā)酵產(chǎn)物 的制備方法，該方法采用桑黃固體-液體發(fā)酵，安全可靠，可明顯提高有機(jī)鍺和桑黃鍺多糖 含量和活性。
[0011] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0012] 一種富鍺桑黃發(fā)酵產(chǎn)物的制備方法，包括步驟：
[0013] (1)桑黃液體種子液制備：將活化后的桑黃菌種接種于添加有辣木提取物的液體 種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天-7天，制備桑黃液體菌種（即桑黃液體種子液）；
[0014] (2)桑黃固體發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟（1)中的桑黃液體菌種按占固體培養(yǎng)基體積 5% -20%的用量接入固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天-20天后，將培養(yǎng)產(chǎn)物真空冷凍干燥粉碎后得 富鍺桑黃固體培養(yǎng)物I ;所述的固體培養(yǎng)基中含有汗麻葉酶解物、甜菜渣、茶籽餅和富鍺酵 母；
[0015] (3)桑黃液體發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟（1)中的桑黃液體菌種按占液體培養(yǎng)基體積 5% -20 %的用量接入液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3天-8天，得到富鍺桑黃發(fā)酵產(chǎn)物；所述的液體 培養(yǎng)基中含有富鍺桑黃固體培養(yǎng)物I、富鍺酵母和柳珊瑚降解物。
[0016] 本發(fā)明根據(jù)藥用真菌桑黃的發(fā)酵培養(yǎng)條件和富鍺特性，利用固體發(fā)酵培養(yǎng)狀態(tài)下 真菌微生物在接近于自然狀態(tài)下的生長(zhǎng)、代謝產(chǎn)物豐富以及液體發(fā)酵培養(yǎng)狀態(tài)下發(fā)酵均 勻、培養(yǎng)時(shí)間較短等各自的優(yōu)點(diǎn)，并通過(guò)在固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基中添加有利于有機(jī)鍺 和桑黃鍺多糖代謝生成的汗麻葉酶解物、柳珊瑚降解物等外源添加物，同時(shí)創(chuàng)造性地將桑 黃在固體發(fā)酵階段的培養(yǎng)產(chǎn)物作為外源添加物添加到液體發(fā)酵階段中循環(huán)利用，先固體發(fā) 酵、后液體發(fā)酵，通過(guò)固體發(fā)酵和液體發(fā)酵兩階段的協(xié)同培養(yǎng)，大幅度提高了最終桑黃發(fā)酵 產(chǎn)物中有機(jī)鍺、桑黃鍺多糖的含量和活性。
[0017] 本發(fā)明，所述的富鍺桑黃發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)過(guò)后續(xù)的分離處理可以得到桑黃鍺多糖。所 述的分離處理為本領(lǐng)域常規(guī)的分離方法，例如包括：可將所述的富鍺桑黃發(fā)酵產(chǎn)物用多層 紗布過(guò)濾，從過(guò)濾所得菌絲體中提取桑黃鍺多糖。具體的提取步驟包括：將菌絲體用水 沖洗干凈，在55°c -65°c干燥至恒重，粉碎得到菌絲體干粉，將菌絲體干粉按料液質(zhì)量比 1:10-15加入水，90°C _95°C浸提3h-3. 5h，提取兩次，合并提取液過(guò)濾收集濾液，50°C _55°C 下減壓濃縮，向濃縮液中加入占濃縮液4倍-5倍體積的無(wú)水乙醇，隔夜醇沉，離心，沉淀即 為桑黃鍺多糖。
[0018] 所述的桑黃菌種可采用任意一種桑黃菌種，可采用市售產(chǎn)品。例如桑黃 (Phellinus linteus)ACCC51181菌種購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心。
[0019] 為了達(dá)到更好的發(fā)明效果，進(jìn)行以下優(yōu)選：
[0020] 步驟⑴中，所述的辣木提取物的添加量為液體種子培養(yǎng)基體積的2% -8%。本 發(fā)明，添加的辣木提取物等會(huì)溶解于液體種子培養(yǎng)基中，因此添加辣木提取物前后的液體 種子培養(yǎng)基總體積不變。
[0021] 所述的辣木提取物可以選用市售產(chǎn)品，優(yōu)選采用以下制備方法制備的辣木提取 物，包括：
[0022] 稱取一定量的辣木，粉碎（優(yōu)選過(guò)40目-100目），先加占辣木重量8倍量-10倍 量的質(zhì)量百分濃度為70% -80%的乙醇水溶液在80°C -85°C浸提1. 5h-2h，過(guò)濾后得到上 清液，上清液濃縮真空冷凍干燥后得提取物II ;上述醇提后的辣木殘?jiān)诱祭蹦局亓?倍 量-10倍量的水在95°C -100°C下浸提2h-2. 5h，過(guò)濾后得到上清液，上清液濃縮真空冷凍干 燥后得提取物III ;合并所述提取物II和提取物III得辣木提取物。
[0023] 步驟（1)中，所述的活化后的桑黃菌種在添加有辣木提取物的液體種子培養(yǎng)基中 培養(yǎng)的溫度為自然環(huán)境溫度，優(yōu)選為20°C -30°C。一般1L添加有辣木提取物的液體種子培 養(yǎng)基中接入2cm2-5cm2大小的菌塊（即活化后的桑黃菌種）。
[0024] 步驟（1)中，桑黃菌種的活化方法為本領(lǐng)域常規(guī)的菌種活化方法，包括：將斜面保 藏的桑黃菌種接種到PDA平板培養(yǎng)基上，進(jìn)行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度22°C -30°C，培養(yǎng)時(shí)間4 天-10天。
[0025] 所述的PDA平板培養(yǎng)基和液體種子培養(yǎng)基均采用本領(lǐng)域種子培養(yǎng)常用的培養(yǎng)基， 可采用市售產(chǎn)品。進(jìn)一步優(yōu)選，所述的PDA平板培養(yǎng)基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g和瓊脂 15g-20g，用水定容至1000mL。進(jìn)一步優(yōu)選，所述的液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖5g-20g、酵母粉 4g、蛋白胨 3g、KH2P04lg 和 MgS040. 5g，用水定容至 1000mL。
[0026] 步驟⑵中，所述的固體培養(yǎng)基優(yōu)選由以下質(zhì)量百分比的組分組成： 1(2冊(cè)0 40.1%-0.2%、1^040 . 05%-0.1%、水40%-65%和余量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。所述的營(yíng)養(yǎng)物 質(zhì)優(yōu)選由以下質(zhì)量百分比的組分組成：汗麻葉酶解物40% -50%、甜菜渣20% -30%、茶籽 餅20% -30%和富鍺酵母10% -20%。
[0027] 步驟⑵中，所述的固體培養(yǎng)基的制備方法，包括：將K2HP04、MgS0 4和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充 分?jǐn)嚢杈鶆?，加水，使固體培養(yǎng)基中水的質(zhì)量百分比達(dá)到40% -65%，pH值自然，得到固體 培養(yǎng)基。
[0028] 步驟（2)中，所述的固體發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為自然環(huán)境溫度，優(yōu)選為20°C -30°C。
[0029] 步驟（2)中，所述的漢麻葉酶解物的制備方法，包括：將漢麻葉加水磨成漿液，滅 酶；調(diào)節(jié)漿液PH4. 5-6. 5,加入由纖維素酶和果膠酶構(gòu)成的第一復(fù)合酶，在45°C -55°C進(jìn)行 酶解反應(yīng)〇. 5小時(shí)-1. 5小時(shí)，滅酶后調(diào)節(jié)漿液pH5. 5-7. 0,加入由淀粉酶和中性蛋白酶構(gòu)成 的第二復(fù)合酶，于45°C -65°C進(jìn)行酶解反應(yīng)1小時(shí)-1. 5小時(shí)，滅酶后離心，上清液經(jīng)過(guò)濾、 濃縮和干燥，得到漢麻葉酶解物。
[0030] 所述的第一復(fù)合酶與漢麻葉的質(zhì)量比優(yōu)選為1 :30-50。
[0031] 所述的第二復(fù)合酶與漢麻葉的質(zhì)量比優(yōu)選為1 :25-45。
[0032] 所述的纖維素酶與果膠酶的質(zhì)量比優(yōu)選為1:2至3:1。
[0033] 所述的淀粉酶與中性蛋白酶的質(zhì)量比優(yōu)選為1:3至2:1。
[0034] 所述的中性蛋白酶的酶活力優(yōu)選為20. 0萬(wàn)U/g-30. 0萬(wàn)U/g、淀粉酶的酶活力優(yōu)選 為10. 0萬(wàn)U/g-20. 0萬(wàn)U/g、果膠酶的酶活力優(yōu)選為3. 0萬(wàn)U/g-5. 0萬(wàn)U/g、纖維素酶的酶 活力優(yōu)選為2. 0萬(wàn)U/g-3. 0萬(wàn)U/g。
[0035] 將漢麻葉加水磨成漿液的步驟中，漢麻葉與水的重量比優(yōu)選為1:5至1:10。所述 的漢麻葉可選用采摘后經(jīng)清洗、真空冷凍干燥后的漢麻葉，也可直接選用市售的干燥漢麻 葉。
[0036] 所述的滅酶的條件依據(jù)酶失活的條件，一般為：90°C -95°C下滅酶5分鐘-8分鐘。
[0037] 所述的漢麻葉酶解物的制備方法中，優(yōu)選：上清液用截留分子量為lkDa_4kDa的 超濾膜超濾，截留液真空濃縮后進(jìn)行冷凍干燥，得到漢麻葉酶解物。
[0038] 步驟（3)中，所述的液體培養(yǎng)基由以下質(zhì)量百分比的組分組成：富鍺桑黃固體培 養(yǎng)物I 2% -4%、葡萄糖1% -2%、富鍺酵母0.04% -0.4%、柳珊瑚降解物0.05% -0.4%、 K2HP04〇m、MgS040 . 05% -0· 1% 和余量的水。
[0039] 步驟⑶中，所述的柳珊瑚降解物的制備方法，包括：將金頂側(cè)耳接種在添加有柳 珊瑚的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天-15天（培養(yǎng)溫度可保持在自然的環(huán)境溫度，如21°C -28°C的環(huán) 境溫度），將培養(yǎng)物過(guò)濾，濾液經(jīng)滅菌、濃縮和真空冷凍干燥得到柳珊瑚降解物。
[0040] 所述的添加有柳珊瑚的培養(yǎng)基組成為：柳珊瑚15g/L-35g/L、葡萄糖15g/L、酵母 粉 3g/L、蛋白胨 4g/L、KH2P041. 5g/L、MgS040. 75g/L 和余量的水。
[0041] 所述的金頂側(cè)耳（Pleurotus citrinopileatus)，又名榆黃蘑、金頂蘑、玉皇蘑；菌 蓋草黃色至鮮黃色，光滑，漏斗狀，直徑3-10厘米。菌肉白色。柄偏生。所述的金頂側(cè)耳可采 用任意一種金頂側(cè)耳菌種，可采用市售產(chǎn)品。例如金頂側(cè)耳（Pleurotus citrinopileatus) CGMCC No. 5. 838購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。
[0042] 步驟（3)中，所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為自然環(huán)境溫度，優(yōu)選為20°C -30°C。
[0043] 所述的金頂側(cè)耳的菌種的接種量?jī)?yōu)選為3% -15%。
[0044] 本發(fā)明，所述的接種量指接入的菌種體積或接入的培養(yǎng)好的種子液體積與培養(yǎng)基 體積之比的百分?jǐn)?shù)。
[0045] 本發(fā)明所用的培養(yǎng)基均需滅菌后使用，滅菌的條件采用本領(lǐng)域的常規(guī)條件，例如 可在 120°C _125°C下滅菌 20min-30min。
[0046] 本發(fā)明中，所述的富鍺酵母中鍺含量?jī)?yōu)選為500mg/kg-900mg/kg。
[0047] 富鍺酵母集有機(jī)鍺生物活性和酵母本身豐富的營(yíng)養(yǎng)為一體，含有豐富的蛋白質(zhì)和 礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)因子。所述的富鍺酵母可以選用市售產(chǎn)品，優(yōu)選采用以下制備方法制備的 富鍺酵母，包括：將活性的啤酒酵母斜面菌種接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，22°C -28°C發(fā)酵培 養(yǎng)15h-20h，發(fā)酵終止后離心過(guò)濾，將沉淀真空冷凍干燥即得富鍺酵母。其中，所述的液體 發(fā)酵培養(yǎng)基由以下質(zhì)量百分比的組分組成：葡萄糖1% -2%，麥芽汁2 % -5%，玉米淀粉 2% -4%，Ge020 · 005% -0· 01%和余量的水。即每lkg液體發(fā)酵培養(yǎng)基中二氧化鍺（Ge02) 的用量為50mg-100mg。所述的啤酒酵母采用市售產(chǎn)品。
[0048] 甜菜渣，是制糖的副產(chǎn)品，是甜菜塊根、塊莖經(jīng)過(guò)浸泡，壓榨提取糖液后的殘?jiān)?殘?jiān)胁蝗苡谒奈镔|(zhì)大量存在，特別是粗纖維全部保留。所述的甜菜渣可選用市售產(chǎn)品， 例如購(gòu)于甘肅武威黃羊鎮(zhèn)糖廠的甜菜渣。
[0049] 茶籽餅也叫茶柏，是油茶籽經(jīng)榨油后的渣餅，茶籽餅中含有茶皂素、蛋白質(zhì)、天然 茶油等。茶籽餅蛋白質(zhì)中含有18種氨基酸，其中蘇氨酸、谷氨酸、組氨酸和精氨酸等含量較 為豐富。所述的茶籽餅可選用市售產(chǎn)品，例如購(gòu)于衢州劉家香食品有限公司的茶籽餅。
[0050] 辣木（Moringa oleifera),又稱鼓植樹(shù)（Drumsticktree),為辣木科 (Moringaceae)辣木屬（Moringa)熱帶落葉喬木。辣木起源于印度北部的熱帶、亞熱帶。據(jù) 研究報(bào)道，辣木富含胡蘿卜素和維生素 C，鈣、鐵、鉀含量特別高，必需氨基酸組成優(yōu)于一般 蔬菜，是一種綜合營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的木本蔬菜。辣木根中含有豐富的蛋白質(zhì)，V。和多種微量元 素，本發(fā)明優(yōu)選辣木的根。
[0051] 漢麻屬于木蘭綱（Magnoliopsida)蕁麻目（Urticales)大麻科（Cannabinaceae) 大麻屬（Cannabis)大麻種（Cannabis sativa L.)的一年生草本植物。研究表明，漢麻植 物中含有多達(dá)600余種化學(xué)物質(zhì)，其主要活性物質(zhì)則為各種酚類。漢麻韌皮部占植物總重 的30%左右，韌皮中纖維素含量超過(guò)70%。漢麻葉有單葉和復(fù)葉，且多為掌狀復(fù)葉，葉序?yàn)?對(duì)生和互生，葉片綠色，上有短茸毛，容易脫落。葉子由葉柄支撐，葉柄長(zhǎng)度一般在3cm-15cm 之間。生長(zhǎng)旺盛時(shí)，葉子的質(zhì)量占整個(gè)植株質(zhì)量的24%-25% ;本發(fā)明選用漢麻的葉。
[0052] 柳珊瑚俗稱海扇（sea fan)、海鞭（sea whip)或海羽（seaplume)等，屬于腔腸動(dòng) 物門(mén)珊瑚綱Anthozoa八放珊瑚亞綱Octocorallia動(dòng)物，是一種常見(jiàn)的海洋生物。柳珊瑚 的化學(xué)成分主要包括萜類、留醇和生物堿三大類，此前還有脂肪酸等。柳珊瑚的生物活性研 究包括抗腫瘤（細(xì)胞毒）、抗炎、抗菌（金葡菌、結(jié)核桿菌等）、抗瘧疾、抗污損等方面。
[0053] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0054] (1)本發(fā)明根據(jù)藥用真菌桑黃的發(fā)酵培養(yǎng)條件和富鍺特性，利用固體發(fā)酵培養(yǎng)狀 態(tài)下真菌微生物在接近于自然狀態(tài)下的生長(zhǎng)、代謝產(chǎn)物豐富以及液體發(fā)酵培養(yǎng)狀態(tài)下發(fā)酵 均勻、培養(yǎng)時(shí)間較短等各自的優(yōu)點(diǎn)，并通過(guò)在固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基中添加有利于有機(jī) 鍺和桑黃鍺多糖代謝生成的汗麻葉酶解物、柳珊瑚降解物等外源添加物，同時(shí)創(chuàng)造性地將 桑黃在固體發(fā)酵階段的培養(yǎng)產(chǎn)物作為外源添加物添加到液體發(fā)酵階段中循環(huán)利用，先固體 發(fā)酵、后液體發(fā)酵，通過(guò)固體發(fā)酵和液體發(fā)酵兩階段的協(xié)同培養(yǎng)，大幅度提高了最終桑黃發(fā) 酵產(chǎn)物中有機(jī)鍺、桑黃鍺多糖的含量和活性。
[0055] 本發(fā)明方法可將鍺元素轉(zhuǎn)化為桑黃鍺多糖生物大分子，顯著提高了桑黃發(fā)酵產(chǎn)物 中有機(jī)鍺含量（可達(dá)8. 84mg/g)，使桑黃在有效發(fā)揮桑黃多糖作用的前提下，還可以充分發(fā) 揮有機(jī)鍺的作用。
[0056] (2)培養(yǎng)基中的富鍺酵母在起到補(bǔ)充氮源的作用同時(shí)，還是鍺的來(lái)源。傳統(tǒng)的富 鍺食藥用菌菌絲體在形成過(guò)程中，鍺的來(lái)源一般為無(wú)機(jī)態(tài)的二氧化鍺，發(fā)酵時(shí)要將培養(yǎng)基 中的無(wú)機(jī)鍺吸收后轉(zhuǎn)化為有機(jī)鍺，這個(gè)過(guò)程中鍺不易為菌絲體所吸收。而富鍺酵母攜帶的 鍺元素是有機(jī)鍺的形態(tài)，不含任何毒性，又更容易為菌絲體吸收，通過(guò)桑黃菌絲細(xì)胞內(nèi)物質(zhì) 的代謝，將底物中的鍺結(jié)合到大分子上轉(zhuǎn)化為有機(jī)鍺多糖和鍺蛋白，從而發(fā)揮鍺和桑黃固 有的協(xié)同生理作用。
[0057] (3)本發(fā)明在桑黃固體發(fā)酵階段以來(lái)源廣泛、價(jià)廉的甜菜渣、茶籽餅為原料，一方 面使生產(chǎn)成本大幅降低，另一方面甜菜渣、茶籽餅中的有益成分有利于桑黃有機(jī)鍺和鍺多 糖的生成，是一種極具工業(yè)化前景的生產(chǎn)方法。

【具體實(shí)施方式】
[0058] 以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0059] 下面結(jié)合部分具體實(shí)施例對(duì)本
【發(fā)明內(nèi)容】
進(jìn)行進(jìn)一步闡明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不僅 限于下面的實(shí)施例。
[0060] 桑黃（Phellinus linteus)ACCC51181菌種購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中 心。
[0061] 金頂側(cè)耳（Pleurotus citrinopileatus) CGMCC No. 5. 838購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保 藏管理委員會(huì)普通微生物中心。
[0062] 甜菜渣購(gòu)于甘肅武威黃羊鎮(zhèn)糖廠，茶籽餅購(gòu)于衢州劉家香食品有限公司。
[0063] 啤酒酵母購(gòu)于安琪酵母股份有限公司。
[0064] 實(shí)施例1
[0065] 一、材料準(zhǔn)備
[0066] 中性蛋白酶（酶活力為20. 0萬(wàn)U/g)、淀粉酶（酶活力為10. 0萬(wàn)U/g)、果膠酶（酶 活力為5. 0萬(wàn)U/g)、纖維素酶（酶活力為3. 0萬(wàn)U/g)，由廣西龐博生物工程有限公司提供。
[0067] PDA平板培養(yǎng)基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g和瓊脂15g，用水定容至1000ml，自然 pH，在 121°C 下滅菌 20min。
[0068] 外源添加物的制備：
[0069] a.漢麻葉酶解物的制備：將采摘的漢麻葉清洗、真空冷凍干燥后，稱量100g加 500mL水，磨成漿液，95°C滅菌5min，使各種酶失活；調(diào)節(jié)漿液pH5. 0,加入由lg纖維素酶和 lg果膠酶構(gòu)成的復(fù)合酶，在45°C進(jìn)行酶解反應(yīng)1. 0小時(shí)，在95°C下滅酶6分鐘；然后調(diào)節(jié) 漿液PH6. 0,加入由1. 75g淀粉酶和1. 75g中性蛋白酶構(gòu)成的復(fù)合酶，于55°C進(jìn)行酶解反應(yīng) 1. 5h，在95°C下滅酶5分鐘，得到酶解液；離心酶解液，取上清液用截留分子量為lkDa的超 濾膜超濾，截留液真空濃縮后進(jìn)行冷凍干燥，獲得漢麻葉酶解物。
[0070] b.柳珊瑚降解物的制備：將金頂側(cè)耳按15%的接種量接種在添加有柳珊瑚的培 養(yǎng)基中25°C培養(yǎng)10天后收獲培養(yǎng)物，再將培養(yǎng)物過(guò)濾得濾液，進(jìn)行高壓滅菌，濃縮后真空 冷凍得到柳珊瑚降解物。
[0071] 添加有柳珊瑚的培養(yǎng)基組成為：柳珊瑚28g/L、葡萄糖15g/L、酵母粉3g/L、蛋白胨 4g/L、KH 2P04l. 5g/L、MgS040. 75g/L 和余量的水，pH 自然。
[0072] c.辣木提取物的制備：稱取一定量的辣木根，粉碎過(guò)40目，先加占辣木根重量8 倍量質(zhì)量百分濃度為70%的乙醇水溶液在80°C浸提1. 5h，過(guò)濾后得到上清液，上清液濃縮 真空冷凍干燥后得提取物II ;上述醇提后的辣木根殘?jiān)诱祭蹦靖亓?倍量水在95 °C下 浸提2h，過(guò)濾后得到上清液，上清液濃縮真空冷凍干燥后得提取物III ;合并所述提取物II 和提取物III得辣木提取物。
[0073] d.富鍺酵母的制備：將活性的啤酒酵母斜面菌種接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，25°C 發(fā)酵培養(yǎng)18h，發(fā)酵終止后離心過(guò)濾，將沉淀真空冷凍干燥即得富鍺酵母，富鍺酵母中鍺含 量為700mg/kg。其中，液體發(fā)酵培養(yǎng)基由以下質(zhì)量百分比的組分組成：葡萄糖2%，麥芽 汁2%，玉米淀粉4%，Ge0 20. 008%和余量的水；即每lkg液體發(fā)酵培養(yǎng)基中Ge02的用量為 80mg〇
[0074] 二、富鍺桑黃發(fā)酵產(chǎn)物的制備
[0075] (1)桑黃液體種子液制備：將斜面保藏的桑黃菌種接種到PDA平板培養(yǎng)基上，進(jìn)行 活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25°C,培養(yǎng)時(shí)間7天，然后取2cm 2大小的菌塊（即活化后的桑黃菌種） 接種于添加有辣木提取物的液體種子培養(yǎng)基，1L添加有辣木提取物的液體種子培養(yǎng)基組成 為辣木提取物5% (辣木提取物與液體種子培養(yǎng)基的體積百分比）、葡萄糖10g/L、酵母粉 4g/L、蛋白胨3g/L、KH2P0 4lg/L、MgS040.5g/L和余量的水，pH自然；25°C培養(yǎng)4天，制備桑 黃液體菌種。
[0076] (2)桑黃固體發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟（1)中的桑黃液體菌種按占固體培養(yǎng)基體積10% 的用量接入固體培養(yǎng)基中25°C培養(yǎng)10天后，將培養(yǎng)產(chǎn)物真空冷凍干燥粉碎后得富鍺桑黃 固體培養(yǎng)物I。
[0077] 固體培養(yǎng)基由以下質(zhì)量百分比的組分組成：Κ2ΗΡ040· 1%、MgS040 . 05%、水65% 和余量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)由以下質(zhì)量百分比的組分組成：汗麻葉酶解物40%、甜菜渣 20 %、茶籽餅20 %和富鍺酵母20 %。
[0078] 固體培養(yǎng)基的制備方法，包括：將K2HP04、MgS04和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充分?jǐn)嚢杈鶆?，加水?使固體培養(yǎng)基中水的質(zhì)量百分比達(dá)到65%，pH值自然，得到固體培養(yǎng)基。
[0079] (3)桑黃液體發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟（1)中的桑黃液體菌種按占液體培養(yǎng)基體積15% 的用量接入液體培養(yǎng)基中，25°C培養(yǎng)5天，得到富鍺桑黃發(fā)酵產(chǎn)物。
[0080] 液體培養(yǎng)基由以下質(zhì)量百分比的組分組成：富鍺桑黃固體培養(yǎng)物I 3%、葡萄糖 1.5%、富鍺酵母0.1%、柳珊瑚降解物0.1%、1(2冊(cè)040.1%、1^0 40 . 05%和余量的水，？!1自 然。
[0081] 三、測(cè)定
[0082] (1)菌絲生物量的測(cè)定
[0083] 發(fā)酵后菌絲體經(jīng)8層紗布過(guò)濾，菌絲體用蒸餾水沖洗3次，然后置60°C烘箱中烘干 至恒重,稱重。
[0084] (2)鍺多糖含量的測(cè)定
[0085] 稱取適量菌絲體干粉，置于燒杯中，按料液比1:10(質(zhì)量比）加入蒸餾水，90°C浸 提3h，提取兩次，減壓過(guò)濾收集濾液，50°C下減壓濃縮，濃縮液加入4倍體積無(wú)水乙醇，隔夜 醇沉，3000r/min、20min離心后，沉淀即為粗多糖。將沉淀用蒸饋水定容至50mL，用苯酚-硫 酸法測(cè)定發(fā)酵液中多糖含量，重復(fù)測(cè)定3次求平均值，即鍺多糖含量。
[0086] (3)鍺的測(cè)定方法：參照GB/T5009. 151-2003食品中鍺的測(cè)定方法。
[0087] (4)鍺多糖對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定
[0088] 取2mL 5mg/mL待測(cè)樣品于試管中，加入2mL 0· 2mmol/L的DPPH乙醇溶液（用質(zhì) 量百分濃度95%乙醇水溶液配制），充分搖勻，室溫靜置35min，在517nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光 值。以V。為對(duì)照，每組做3個(gè)重復(fù)，求其平均值。計(jì)算公式如下：
[0089] 清除率（％)=

【權(quán)利要求】
1. 一種富鍺桑黃發(fā)酵產(chǎn)物的制備方法，其特征在于，包括步驟： (1) 桑黃液體種子液制備：將活化后的桑黃菌種接種于添加有辣木提取物的液體種子 培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天-7天，制備桑黃液體菌種； (2) 桑黃固體發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟（1)中的桑黃液體菌種按占固體培養(yǎng)基體積5% -20% 的用量接入固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天-20天后，將培養(yǎng)產(chǎn)物真空冷凍干燥粉碎后得富鍺桑黃 固體培養(yǎng)物I ;所述的固體培養(yǎng)基中含有汗麻葉酶解物、甜菜渣、茶籽餅和富鍺酵母； (3) 桑黃液體發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟（1)中的桑黃液體菌種按占液體培養(yǎng)基體積5% -20% 的用量接入液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3天-8天，得到富鍺桑黃發(fā)酵產(chǎn)物；所述的液體培養(yǎng)基中含 有富鍺桑黃固體培養(yǎng)物I、富鍺酵母和柳珊瑚降解物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（1)中，所述的辣木提取物的添 加量為液體種子培養(yǎng)基體積的2% -8%。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，所述的辣木提取物的制備方 法，包括：稱取一定量的辣木，粉碎，先加占辣木重量8倍量-10倍量的質(zhì)量百分濃度為 70%-80%的乙醇水溶液在801：-851：浸提1.511-211，過(guò)濾后得到上清液，上清液濃縮真 空冷凍干燥后得提取物II ;上述醇提后的辣木殘?jiān)诱祭蹦局亓?倍量-10倍量的水在 95°C -10(TC下浸提2h-2. 5h，過(guò)濾后得到上清液，上清液濃縮真空冷凍干燥后得提取物III ; 合并所述提取物II和提取物III得辣木提取物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（2)和步驟（3)中，所述的富鍺 酵母中鍺含量為500mg/kg-900mg/kg。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（2)中，所述的固體培養(yǎng)基由以 下質(zhì)量百分比的組分組成：K2HP0 40. 1% -0. 2%、MgS040. 05% -0. 1%、水40% -65%和余量 的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；所述的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)由以下質(zhì)量百分比的組分組成：汗麻葉酶解物40% -50%、甜 菜渣20% -30%、茶籽餅20% -30%和富鍺酵母10% -20%。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的制備方法，其特征在于，所述的漢麻葉酶解物的制備 方法，包括：將漢麻葉加水磨成漿液，滅酶；調(diào)節(jié)漿液PH4. 5-6. 5,加入由纖維素酶和果膠 酶構(gòu)成的第一復(fù)合酶，在45°C -55°C進(jìn)行酶解反應(yīng)0. 5小時(shí)-1. 5小時(shí)，滅酶后調(diào)節(jié)漿液 pH5. 5-7. 0,加入由淀粉酶和中性蛋白酶構(gòu)成的第二復(fù)合酶，于45°C -65°C進(jìn)行酶解反應(yīng)1 小時(shí)-1. 5小時(shí)，滅酶后離心，上清液經(jīng)過(guò)濾、濃縮和干燥，得到漢麻葉酶解物。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述的第一復(fù)合酶與漢麻葉的質(zhì)量 比為1 :30-50 ;所述的第二復(fù)合酶與漢麻葉的質(zhì)量比為1 :25-45。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（3)中，所述的液體培養(yǎng)基由 以下質(zhì)量百分比的組分組成：富鍺桑黃固體培養(yǎng)物I 2% -4%、葡萄糖1% -2%、富鍺酵母 0· 04% -0· 4%、柳珊瑚降解物 0· 05% -0· 4%、Κ2ΗΡ040· 1% -0· 2%、MgS040. 05% -0· 1%和 余量的水。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1或8所述的制備方法，其特征在于，所述的柳珊瑚降解物的制備方 法，包括：將金頂側(cè)耳接種在添加有柳珊瑚的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天-15天，將培養(yǎng)物過(guò)濾，濾液 經(jīng)滅菌、濃縮和真空冷凍干燥得到柳珊瑚降解物。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于，所述的添加有柳珊瑚的培養(yǎng)基 組成為：柳珊瑚15g/L-35g/L、葡萄糖15g/L、酵母粉3g/L、蛋白胨4g/L、KH 2P041.5g/L、 MgS040. 75g/L和余量的水。
【文檔編號(hào)】C12P19/04GK104232727SQ201410458820
【公開(kāi)日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年9月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月11日
【發(fā)明者】程俊文, 賀亮, 魏海龍, 胡傳久, 付立忠, 李海波, 鄒景泉 申請(qǐng)人:浙江省林業(yè)科學(xué)研究院